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  • Ut6 Adn Recombinante

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    UT6 ADN RECOMBINANTE_08f10f6b75a4717a1b57d159241505e8

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    ada negativamente? ite @ 20 mM de HEPES-«K KOI arose, se elaye coe Oe oncentracién de 200 mM KC}, Proteinas esti mas cargada de las 2 proteinas tiene mas 1 qué tipo de electroforesis lentidad de secuencia uencia en u @ absorcién a la longitud de westra una débil absorcién, CON UN peso molecular de ectroforesis en condiciones da y expresada en E. cof, €olumna de DEAE. Hemos uestra reaccién enzimatica Como interpretarias log que seguir para recuperar amatogratia en columna, “de la columna. Cuando € queda retenida el resto ado de cuantificacién de PARTE 3 CLONACION DE ACIDOS NUCLEICO TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE ‘Inotce De conrento0s 7.1 enziMas OF RESTRICCION 7.2 vecrores 7.2.1 pLAsmipps 7.2.2 sacterioracns Lamapa ¥ M13 7.2.3 COSmIDOS YIVECTORES TRANSBORDADORES 7.2.4 CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS 7.2.5 vacs Extras Ejemplos Cuestiones i Osierivos Aplicar normas de bioseguridad y de proteccién ambiental 2 la hora de Tanipular dcidos fucleicos. Reconocar al ADN recombinante. Isenicar 1s pesos para la obtenciin del ADN recornbinante en un vector. | Icentticar ios posos genersies en el proceso de clonaje. | conocer tas enzimas de reteiclén ms importantes, Conecer ios diferentes tipos de vectores més vtilzados en biotecnologis. Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, afladen, elimina’ transfieren informacion genética, los bidlagos moleculares abrieron el camino para el desard de sus propias manipulaciones genéticas. En los dltimos afios, se han desarrollado técnicas d han permitido abordar el andlisis y Ia manipulacion del ADN en una forma antes Inimaginable. ‘Cuando los investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran tamajio y la complejidad ADN, Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, debia aislarse del resto del genoms Para avanzar hacia un estudio mas detallado del ADN fue necesaria una metodologla pal ‘obtener grandes cantidades de fregmentos especificos de ADN. Estos fragmentos podian’ ADN genémico, ADN complementario 0 ADN obtenidos a partir de oligonuclestidos sintéticos. menudo, antes de que un determinado fragmento de ADN o de ARNm pueda ser manipulado d ‘cualquier modo, debe primero ser localizado?, Con el desarrollo de técnicas para cortar moléculas de ADN y ‘multiplicar tos fragmentos hay es posible, en principio, determinar la secuencia de nucledtidos de cualquier fragmento aisiado de acide nucleico, En los comienzos de la investigacién del ADN recombinante, los bidlogos se dieron cuenta que los segmentos de ADN que codifican Ciertas proteinas (particularmente las de importancia médica 0 agricola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados. EI término ADN recombinante hace referencia a la creacién de Nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural. Los procedimientos bésicos para e! aislamiento de secuencias especificas de ADN a partir de una poblacion de secuencias mezcladas incluyen una serie de pasos detallados en la figura 7.1; ‘Cromosoma de la célla huésped EF —, | 3g) SaaS ESE) 1on ectnaan ota nina ani resin AON plasmicico ND [—) =.) {cars ELADN plasmicico se asia \e "gan tos dos ADN deta cde vactenana y se \ 288 obtener na forte con una enzima de _rolecula recombinants restricein o. Se introduce en une céluia hudsped y se Seleccionan las células portadoras da plasmidos recombinantes Fig. 7.1 Esquema general de clonaje ‘Para el alsiaiento de un geno ae fagmentos mas pequefos, el ADN debe ser ragmentago * Para localiza fragmentos especincas se utlza ia técnica de hibritacin de deidos mucoieas. R procesan, afiaden, eliminan ¥el.camina para el desarrolla lan desarrollado técnicas quel forma antes inimaginabie. 1 tamafio y la compl lejidad del larse del resto de! genomat, stos fragmentos podian sox an se liganuciedtidos sintéticos. m pueda ser manipulace de de restriceién 4, Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de estriccion, que reconocen y cortan las moléculas de ADN en secuencias nucleotidicas especifices. 2. Los fragmentos producidos mediante digestion con enzimas de restriccién '€ unen 2 otras moléculas de ADN que 3, la molécula de ADN recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de ADN Insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de ADN binante se replica, produciendo docenas de copias Idénticas conacidas como “clones”. 4. Al replicarse las células huésped, las células descendlentes heredan e! ADN recombinante, Greandose una pobiacién de células idénticas que llevan todas la secuencia clonada 5. Los segmentos de ADN clonados pueden recuperarse de las células huésped, purifcarse y analizarse. 6. Potencialmente, el ADN clonado puede transcribirse, su ARNm puede traducirse, y el producto (nico puede aislarse y examinarse. El desarrollo de las técnicas de AON recombinante ha dado un impulso al desarrollo de la naciente Industria biotecnolégica, que esta suministrando un nimero creciente de productos al mercado, 7.1 ENZIMAS DE RESTRICCION la piedra angular de la tecnologia del ADN recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucieasas de restriccion, que aisiadas en bacterias, reciben este nombre debido 2 que imitan o previenen las infecciones viricas degradando el Acido nucleico invasor. Las enzimas de Festriecién reconocen una secuencia especifica de nucleétidos (denominada sitio de restriccién) de tna molécula de ADN de doble cadena, y cortan ei ADN por esa secuencia (Fig. 7.2). Fig. 7.2 Enzima de restriccién EcoRI, que reconoce y se une a la secuencia palindrémica GAATTO A elcorte del ADN en este sito produce cols de cadena sencila complementaras. Las clas de cadena sencilaresutantes pucton unirse con colascomplementanas de otros fragmentos de ADN para formar molesulas de ADN recombinant, a Hay dos tipos de enzimas de restriccién: » Enzimas ve Tipo I: cortan las dos cadenas del AON en una posicién aleatoria 3 ci distancia del sitio de restriccién. No se utilizan normalmente en la investigacién de AD recombinante ya que él sitio de corte no es preciso. + Enzimas ve Tipo II: reconocen una secuencia especifica y cortan las dos cadenas fa molécula de AON con absoluta precisién dentro de la secuencia reconocida. Se us ampliamente en investigacion de ADN recombinante puesto que cortan en sitios especifcg Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo Il son simétricas (“palindrémicas"), es dee la secuencia de una de las cadenas leida en direccién 5° - 3‘ es la misma que la secuencia de cadena complementaria ieida también en direccion 5° - 3” EJEMPLO Q La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de recanocimial ejendo extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotidicas idénticg son "pegajosas” (cohesivas), ya que pueden unirse a colas complementarias de otros fragment de AON mediante puentes de hidrégeno. Si moléculas de AON de diferente origen comparteu! mismos sitios de reconocimiento pafindrémicos, ambas tendrdn colas complementarias de cate sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccién. Si estos fragmentos se pont Juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de ADN de distinto origen pueden Fert moléculas recombinantes estableciendo puentes de hidrégeno entre los extremos cohesig Luego se utiliza la enzima AON ligasa para unir covalentemente los esqueletos azicar-fosfato los dos fragmentos, produciéndose asi una molécula de ADN recombinante, + Para formar moléculas de 71s eas ADN de distintas fuentes con see rn alates 6 ieeiiceeee cere ap utiliza la enzima ADN ligase: mri ATT-C ory 2 Feat par enereamenea dees || aa unios cvalentemente ore Se ae toi ‘*TT-CITT Ly enzima ADM figasa sella las | i 1 tl ‘das nebras covalentemente ee Otras enzimas de restriccién de Tipo 11, cortan el ADN formando fragmentos romos. EIEMPLO IQs La enzima Smal es una de elias. Los fragmentos de AON con extremes romos tambill pueden unirse y formar moléculas recombinantes, pero primero deben modificarse, La enzim desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para crear extremos de cadena sencilla mediar la adicion de

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