Variasi Metode dan Alat

Pemeriksaan SARS CoV-2

Septyana Cahyaningsih, S.Tr.TLM
RSUD dr. Kanujoso Djatiwibowo Balikpapan
 COVID-19
• Caused by SARS-CoV-2
(Betacoronavirus)
(formerly known as
nCoV-2019)
• Genome: positive-sense
RNA virus
• Attach to Angiotensin
Converting Enzyme 2
(ACE2) receptor

Pathogens 2020, 9(3), 231;

https://doi.org/10.3390/pathogens9030231
 The
genomic
organization
of SARS-
CoV-2

Alanagreh et al,
Pathogens 2020, 9, 331;
doi:10.3390/pathogens90
50331
 Bagaimana mendeteksi
virus SARS-CoV-2?
Serologi

Antibodi IgM anti-SARS-CoV-2.

Antibodi IgG anti-SARS-CoV-2.

 Metode molekuler

Real-time quantitative PCR  standar baku emas

Sequencing  untuk kepentingan riset.

Kultur virus (di fasilitas laboratorium khusus BSL3, tidak

dilakukan rutin).
 Pemeriksaan mikrobiologi
berbasis molekuler
 Untuk mendeteksi RNA virus ,yaitu dengan
metode RT-PCR (dengan atau tanpa
sequencing)
 Metode Molekuler :
1. RT-PCR Open System ekstraksi
manual,RT-PCR Konvensional
2. RT-PCR Close System  TCM
(Rapid Close System)

MS Hakim et al. (under

review)
Pemeriksaan RT-PCR untuk deteksi Covid-19
Open System
Ekstraksi, purifikasi, dan
amplifikasi materi genetik
dilakukan manual. Melibatkan
banyak proses “buka-tutup”
tabung PCR, sehingga beresiko
kontaminasi
RT-PCR konvensional
Close System
Ekstraksi, purifikasi, dan
amplifikasi materi genetik
dilakukan otomatis, sehingga
proses “buka-tutup” tabung
terjadi sangat minimal.
Ekstraksi otomatis, mixing,,
TCM
 Test Molecular Scope Limit of Blanks
Targets

E gene First-line screening 3.9 copies × reaction

RdRp gene Confirmatory testing 3.6 copies × reaction
WHO

N gene Additional confirmatory testing N/A

N1 and N2 Combined assay 1.0–3.2 copies/μL

genes
CDC RNase P gene Control assay N/A

E gene, envelop gene; N gene, nucleocapside gene; RdRp gene, RNA-

dependent RNA polymerase gene; RNase P gene, human RNase P gene.

Lippi et al, Clin Chem Lab Med 2020; aop

 RT-PCR
Specimen acceptance and rejection

Specimen management (collection, Pre-

preservation, transportation)
analytic Staffs’ skill or competence

RNA extraction

Real time PCR mix

Reporting results
Post- Intra-
analytic Analytic Real time PCR

Result analysis
Potential preanalytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis
of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using (real time) reverse
transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR).

Collection of
inappropriate or
inadequate
Inadequate material for
procedures for quality or volume
specimen (e.g. swab)
collection, handling, Presence of
transport and storage interfering
substances

Lack of
Manual
identification/ (pipetting)
mis Preanalytic errors
identification

ModifiedfromLippi et al, ClinChemLabMed2020; aop

 Reagen RT-PCR SARS CoV 2
• Menggunakan minimal 2 target gen spesifik untuk SARS CoV 2
yang berbeda (multiplex) + kontrol + reagen ekstraksi (manual)

Target Gen Kontrol

E (Envelope) E Positif
N (Nucleocapsid) N, N1,N2 Negatif
Orf (open reading Orf1, orf1ab,
Kontrol ekstraksi
frame) orf1a, orf1b,
RdRp

Gen E umumnya digunakan untuk

skrining sedangkan gen N dan orf untuk Reagen harus
konfirmasi. diujikan terlebih
dahulu
 Interpretasi
Cut off untuk seluruh target:

Saat interpretasi pastikan untuk melihat grafik PCR dan riwayat pasien

Hasil Interpretasi
Seluruh target gen terdeteksi Positif SARS CoV 2
Seluruh target gen tidak terdeteksi Negatif SARS CoV 2
Tidak semua target gen terdeteksi, contoh: Probable/Inconclusive
Dari 2 target hanya 1 gen yang terdeteksi
Dari 3 target hanya 1 atau 2 gen yang terdeteksi

• Atau sesuai petunjuk Kit

• Beberapa Kit: 1 target terdeteksi (kecuali gen E saja) : Positif
 Interpretasi
Interpretasi Ket
Positif SARS CoV 2 Sertakan nilai CT, dapat menjadi panduan saat follow up
waktu pengambilan sampel follow up 7-10 hari, setelah
hasil negatif dapat diulang segera setelah hasil keluar.

Negatif SARS CoV 2 Ulang bila perlu sesuai status pasien

Probable/Inconclusi -Pasien baru: Ulang dengan sampel baru

ve -Pada pasien FU menunjukkan load virus sedikit
(tetap dianggap positif) ulang dengan sampel baru
sampai dua kali negatif.
Penyebab inconclusive: Load virus sedikit, masalah di
reaksi PCR (contoh:Penguapan), mutasi.
 CT value

CT (Cycle Threshold)  akumulasi sinyal fluorescens (jumlah siklus yang

diperlukan agar sinyal fluorescens dpt melewati ambang
Nilai CT berbanding terbalik dengan load virus
Dengan cut off 40 siklus: Semakin mendekati 40  semakin rendah load kuman
Development of viral load during Infection of SARSCoV- 2, clinical course
and positivity of rRT-PCR assays

Lippi et al.: Vulnerabilities in the diagnosis of COVID-19 Clin Chem Lab Med 2020; aop
% Positif SarsCov-2 pada berbagai spesimen RT-PCR

No. Jenis Spesimen Persentase

Positif
1 Cairan Bronchoalveolar lavage 93%
(BAL)
2 Biopsi Fibrobronchoscope brush 46%
3 Sputum 72%
4 Swab nasal (nasofaring) 63%
5 Swab faring (orofaring) 32%
6 Feses 29%
7 Darah 1%
8 Wang,
UrinW. et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Spesimens.
0% JAMA.
2020.
Tes Cepat Molekuler (TCM)

• Alat diagnostik otomatis dengan

prinsip kerja Tes amplifikasi asam
nukleat (NAAT)
• Real-time PCR
• Menggunakan kartrid sekali pakai
yang digunakan pada alat
GeneXpert
• Diimplementasikan di Indonesia
sebagai alat diagnosis TB/TB RO
sejak 2012 sesuai rekomendasi
WHO.
• Selain TB, alat TCM dapat
dipergunakan sebagai alat
diagnosis HIV, HepC, dll.
 LATAR BELAKANG
• Salah satu alat diagnosis covid -19 yaitu menggunakan
mesin Test Cepat Molekuler yang dimiliki oleh program
TB.
• Pemeriksaan menggunakan cartridge Xpert Express
SARS-Cov-2
• Hasil pemeriksaan dapat diperoleh dalam 45 menit
• Akuntabilitas hasil pemeriksaan dan pengelolaan logistik
 Sebaran 421 alat TCM di 34 provinsi
(per April 2020) 8

Sebaran
Alat TCM
Sebaran Lab TCM Covid-19 di 341
421 Fasyankes
Covid-19
Kabkota
Sumatera 91 Kabkota
Jawa 106 Kabkota
Bali & Nusa Tenggara 31 Kabkota 413 Rumah Sakit
Kalimantan 27 Kabkota
Sulawesi 51 Kabkota 7 B/BLK, BTKL
Maluku & Maluku Utara 17 Kabkota
Papua & Papua Barat 18 Kabkota 1 RSDC Wisma
Atlit
 Xpert Xpress SARS-CoV-2

Cartridge
GeneXper
t

Penyimpanan 2-280C
Lid hanya dibuka bila uji sudah siap dilakukan Jangan
gunakan cartridge yang basah atau bocor
  self-contained, kontaminasi silang antar spesimen
<<
Cartridge
 Kontrol terdiri dari:
Xpert  Sample Processing Control (SPC):
Xpress  Spesimen diproses dengan adekuat
SARS-CoV-  Monitor adanya inhibitor reaksi RT-PCR
 Memastikan bahwa kondisi reaksi RT-PCR (temperature
2 dan waktu) sesuai untuk reaksi amplifikasi
 Reagen RT-PCR berfungsi

 Probe Check Control (PCC):

 memastikan reagent rehydration
 Pengisian tabung untuk reaksi PCR
 Konfirmasi bahwa semua komponen terdapat
dalam cartridge
 Monitor integritas probe dan stabilitas zat warna
Prosedur Pemeriksaan
Pengambilan Spesimen
 PENGEPAKAN/PENGIRIMAN
1. Masukkan cryo tube berisi swab dan serum ke
dalam plastik klip per Spesimen. (per
pasien/spesimen)
2. Jika tidak ada plastik klip, dapat digunakan
wadah lainnya (Antibocor)

24
 PENGEPAKAN/PENGIRIMAN
3. Masukkan seluruh spesimen dimasukkan ke dalam
cool box yang berisi Ice pack yang terlebih dahulu
dibekukan. Suhu pengiriman dijaga 2-8°C
4. Ice packs sebaiknya ditempatkan pada sisi kiri-
kanan (ditambahkan juga bagian atas-bawah jika
memungkinkan).
5. Harus dapat dipastikan bahwa spesimen tetap
terjaga kondisi suhunya tetap dingin saat diterima di
laboratorium
26
Alur Pemeriksaan dengan TCM
 GeneXpert Xpert Xpress SARS-CoV-2

Proses pengolahan specimen dilakukan

di dalam BSC :
1. Pastikan tutup VTM rapat.
Homogenisasi dengan memipet
perlahan VTM (+ 5 kali).
2. Transfer sampel dengan menggunakan
pipet yang telah disediakan
masukkan ke dalam catridge.
3. Tutup catridge dengan rapat.
4. Swab catridge dengan alkohol swab
(kecuali bagian segitiga dibelakang),
sebelum keluar dari BSC.
Algoritme
Deteksi
Interpretasi Hasil
SARS-CoV-2 POSITIVE

Materi genetik target (SARS-CoV-2)

terdeteksi

•Sinyal pada kedua target (N2 dan E) atau

hanya N2 terdeteksi.

•SPC: NA. SPC (kontrol internal) dapat

diabaikan pada hasil positif karena target
(SARS-CoV-2) terdeteksi.

•PCC (kontrol probe): PASS.

SARS-CoV-2 PRESUMPTIVE POSITIVE

Materi genetik target (SARS-CoV-2)

kemungkinan terdeteksi

• Sinyal pada target E terdeteksi.

• SPC: NA. SPC (kontrol internal) dapat

diabaikan pada hasil positif karena target
(SARS-CoV-2) terdeteksi.

• PCC (kontrol probe): PASS.

• Selama pandemi, hasil presumptive positif

dianggap positif sehingga tidak perlu diulang
SARS-CoV-2 NEGATIVE

• Materi genetik target (SARS-CoV-2) tidak

terdeteksi

• Tidak ada sinyal probe yang terdeteksi.

• SPC (kontrol internal): PASS.

• PCC (kontrol pobe): PASS.

INVALID

• SPC (kontrol internal): FAIL

• PCC (control probe): PASS

• Penyebab :
o Cara pengumpulan dan
penyimpanan spesimen tidak sesuai
prosedur.
o Kualitas spesimen yang buruk
ERROR

SARS-CoV-2: NO RESULT

SPC (kontrol internal): NO RESULT

PCC (kontrol probe) – FAIL

Penyebab :
Kendala teknis pada katrid atau
mesin TCM
NO RESULT

SARS-CoV-2: NO RESULT

SPC (kontrol internal): NO RESULT

PCC (control probe): NA (not

applicable)

Penyebab :
Gangguan koneksi atau listrik
Pemeriksaan dihentikan secara
manual oleh operator
  SARS-CoV-2 Presumptive positive

 INVALID: SPC negative menandakan spesimen

tidak diproses dengan sempurna, karena
adanya inhibitor reaksi

 ERROR: pemeriksaan dibatalkan (aborted),

Pengulanga karena:
n Test  PCR tube tidak terisi dengan baik
 Terdapat masalah reagent probe integrity
 Terlampauinya batas ekanan maksimum
didalam cartridge

 NO RESULT: data yang dikumpulkan tidak cukup,

misalnya operator menghentikan running atau
software terttutup
 Penggunaan pada spesimen lain belum
pernah diuji

Penggunaan pada swab nasal dan mid-

Keterbatasan turbinate “dianggap” dapat digunakan hanya
untuk pasien gejala spesifik COVID-19

Hasil negative palsu: pengambilan dan

penanganan spesimen tidak sesuai atau
jumlah virus yang tidak adekuat

Seperti halnya metode molekuler lain: bila

terdapat mutasi pada gen target

Uji ini tidak dapat menyatakan bahwa tidak

terdapat infeksi oleh virus lain atau bakteri
 Limit of Detection (LoD) Xpress SARS-C0V-2 dibandingkan
AccuPlex SARS-CoV2 Reference material

Uji Kualitas
Limit of Detection (LoD) Xpress SARS-C0V-2 dibandingkan
Live SARS-CoV2
 Alat Pelindung Diri

Pemeriksaan spesimen
 Masker N95
 Sarung tangan tidak bertepung
(non-powdered gloves)
 Jas lab bukaan belakang (gown)
 Pengaman mata (goggles) atau
pelindung muka (face shield)
 Penutup kepala (cover head)
 Penutup sepatu (cover shoes)
Contoh APD di layanan kesehatan untuk COVID-19.
Sumber: Presentasi pencegahan dan pengendalian infeksi (PPI) untuk
Novel Coronavirus (COVID-19), Hindra Irawan Satari, Pokjanas
Pencegahan dan Pengendalian Infeksi, Kemkes RI
  risk assessment

BSL 2
Sarana yg perlu diperhatikan Ventilation system
terkait SARS CoV 2: • Mechanical ventilation
• BSC : Minimal Class II A systems that provide an
• Autoclave : pengolahan inward flow of air without
limbah recirculation to spaces
• Untuk pengaturan udara  outside the laboratory
Portable Hepafilter
www.CDC.Gov/24-7
WHO. Laboratory biosafety manual. 20
Sarana yg perlu diperhatikan

BSC : Minimal Class II A

Autoclave :
pengolahan limbah

Portable Hepafilter/plasma ion generator  Untuk pengaturan udara

bila diperlukan

Semua harus terpelihara dan

terkalibrasi
 Pembuangan Limbah
• Selesai bekerja, segel materi yang
Semua materi yang telah terkontaminasi (seperti pot dahak
digunakan, dianggap telah bekas, pipet dan cartridge bekas) ke
terkontaminasi! dalam kantong bertanda biohazard, dan
otoklaf atau insenerasi atau kubur
dengan segera.
– Perhatian: membakar plastik
dapat melepaskan toksin yang
berbahaya bagi pernafasan.
• Dekontaminasi pipet transfer
menggunakan disinfektan yang sesuai
sebelum dibuang.
 Pembuangan Limbah

Setelah selesai diautoklaf , limbah di Incenerator /

Pihak ke 3

Bila menggunakan Pihak Ke 3

• Pastikan Pengangkut teregistrasi di Kemen LH
• Memiliki perizinan pengangkutan limbah
berupa dokumen manifest
• Lakukan evaluasi pengangkut limbah 
apakah benar limbah terkirim telah di
musnahkan  tanggung jawab si
pembuang dan pengangkut
 Pemantapan Mutu Internal (PMI)

• Pra analisis:
1. SPO pengumpulan spesimen
2. SPO pengelolaan spesimen
3. SPO pemeriksaan TCM
4. SPO penyimpanan reagensia dan katrid
5. SPO Keamanan dan Keselamatan Kerja
6. SPO Pengelolaan Limbah
7. SPO Pencatatan dan Pelaporan

• Analisis : Internal Quality Control (SPC, PCC)

• Pasca Analisis : Pencatatan, pelaporan, dokumentasi

 Pemantapan Mutu Eksternal (PME)

• PME untuk pemeriksaan COVID-19

menggunakan TCM dilakukan dengan
mengirimkan sisa VTM dari:
– 5 spesimen positif pertama
DAN
– 10 spesimen negatif pertama
Dikirim ke Puslitbangkes
Pemanfaatan TCM untuk pemeriksaan COVID-19

Prioritas:
a. ODP, PDP, Follow up
b. OTG :
1) OTG Nakes yang merawat pasien COVID-19
2) OTG dengan hasil rapid test positif (+)
3) OTG kontak dekat dengan pasien COVID-19
konfirmasi positif (+)
Alur Pemeriksaan TCM untuk Terduga COVID-19 (PDP/ODP)

Hasil pemeriksaan TCM

Terduga (PDP/ODP) berupa Presumtive
Positive digolongkan
sebagai hasil Positif.

Pemeriksaan TCM

Pengulangan untuk
hasil Invalid, Error, dan
Negatif Invalid, Error, No Result Positif No Result Hanya
diperbolehkan satu
kali.dengan sampel
yang baru

Apabila hasil
Pemeriksaan ulang TCM pengulangan tetap
tidak berupa hasil
positif atau negatif,
maka tetap laporkan
hasil pemeriksaan TCM
untuk tindak lanjut oleh
dokter pengirim

Negatif Positif

Bukan COVID-19 Kasus konfirmasi

48
Alur Pemeriksaan TCM untuk kasus konfirmasi

Kasus konfirmasi

Paling cepat hari

ke-7 dan 9 setelah
Tidak Bergejala tes positif terakhir

dengan hasil RT-PCR Bergejala

Positif

Pemeriksaan TCM FU 2 kali dengan

Pemeriksaan TCM FU 2 kali pada hari
selang waktu > 24 jam setelah
Ke-14 dengan selang waktu > 24 jam
klinis membaik

Pemeriksaan TCM Pemeriksaan TCM

Semua Negatif Semua Negatif
pertama Positif pertama Positif

Pemeriksaan TCM Pemeriksaan TCM

Sembuh dari ulang setelah 7 Sembuh dari
ulang setiap
COVID-19 hari (hari ke-21 COVID-19
2 hari sekali
dan 22)

Semua Negatif Semua Negatif

TAMPILAN MODUL COVID DI SITB
 TERIMA KASIH
Semoga Bermanfaat