PCT ORGANIZACION MUNDIAL. SOLICITUD INTERNACIONAL PUBLICADA AL PUBLICADA Wo 960399941 (51) Clasifcacién Internacional de Patentes 6: (11) Niimero de publicacién internacional: WO 96/03999 AGIK 35/78 AL] (45) peena de pub internacional: 15 de Febrero de 1996 (15.02.96) (QU) Solicitud internacional: PCT/ES9S/00097 | (81) Estados designados: JP, US, Patente europea (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE). (22) Fecha de la presentacién Internacior 3 de Agosto de 1995 (03.08.95) Publicada Con informe de bisqueda internacional. (30) Datos relativos Ia prioridad: P 9401737 '3 de Agosto de 1994 (03.08.94) ES 9500912 11 de Mayo de 1995 (11.05.95) ES (71) Solickante (para todos los Estados designados salvo US): ‘AS.A.C, PHARMACEUTICAL INTERNATIONAL, ALLE. (ESVES}; Sagitario, 12, F-03006 Alicante (ES). (72) Inveatores; € (75) Inventores/solictantes (s6lo US): QUINTANILLA ALMA- GRO, Eliseo [ES/ES]; Avda. Federico Soto, 11, E-03003 Alicante (ES). DIAZ’ ALPERI, Joaquin [ES/ES]; Eusebio Sempere, 1, F-03003 Alicante (ES). (74) Mandatario: UNGRIA LOPEZ, Javier, Ungria Patentes y Marcas, $.A., Avenida Ramon y Cajal, 78, E-28043 Madrid 5), (64) Title: METHOD FOR OBTAINING APOLAR AND POLAR EXTRACTS OF CURCUMA AND APPLICATIONS THEREOF ($4) Titulo: PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE EXTRACTOS APOLARES Y POLARES DE CURCUMA Y APLICA- CIONES DE LOS MISMOS (57) Abstract ‘The process for obtaining the apolar extract comprises: (a) extracting the shizomes with an organic solvent; (b) filtration and ‘evaporation to dryness of the extract; (c) dissolution of the oleoresin obtained in hot conditions, precipitation while allowing to cool down, and filtation of the solid; (4) drying and recrystallizing the solid in order to obtain a product having a purity in curcuminoids higher than 90 %. Obtaining the polar extract comprises: (a) extraction of the shizomes with water at $0-70 *C and (b')filration and evaporation of the water. Application to the fabrication of compositions and preparations useful as catchers of fre radicals and antageing agents, as well as reducing agents to reduce the plasma levels of lipid peroxides in human beings, (67) Resumen La obtencién del extracto apolar comprende: (a) extraccién de los rizomas con un disolvente orgénico; (b) fllracién y evaporacin a sequedad del extracto; (c) disolucién de la oleoresina resultant en caliente, precipitacién dejando enfriary iltraciGn del soli; (d)secado ¥ recristalizacién del s6lido para obtener un producto con una pureza en curcuminoides superior al 90 %. La obtencién del extacto polar ‘Comprende: (a') extraccién de los rizomas con agua a $0-70 *C y (b’) fitrado y evaporacién del agus. Aplicacin en la fabricacicn de ‘composiciones y preparados tiles como eaptadores de radcales libres y agentes antienvejecimiento, as{ como agentes reductores de Ios niveles plasmiicos de per6xidos lipdicos en humanos.UNICAMENTE PARA INFORMACION (Cédigos uilizados para identiicar a los Estados pane en el PCT en las pins de portad de los folletos en los cuales se publican la solicitudes internacionales en el marco del PCT. AT Asia GB Reino Undo MR Mauriania AU Atala OE Ceogis MW Maid BB Batu GN Gunes NE Neer BE eigen GR Onin NL Pater Bae BF Bains Feo HU Mungse NO Nomepe 3G Bulgaria ante NZ Neve Zeania By Bee mle PL Poin BR Brat Pte PT Porugal BY Beas XE Kem RO Rumania CA Comat KG uit RU Fedencin Rae CF Repies Cente AE Reptica Pople SD Sadia Congo Dewocie fe Cre SE Sues cH gas Xx epics de Coen St Baovenis Chee Xz Kean Sk Bara cM Caner Lichen SS Seep CN Chine uk Stuns ™ Gua CS Checatvagit WW Loembuge TC Too Cz Reba Ceca ty Leone Tainan DE Aknanis MC Mirae TT Tiida y Tago DK Damas MD Repti de Molson CA Vermin 1S Epa MG Matar US Bandon Union de Ants FL Filia ML Mai UZ Unekate FR Pema MN Mongo WN VetNen GA Ge10 15 20 25 30 35 ‘WO 96103999 PCT/ES9S/00097 TLTULO DE LA _INVENCION Procedimiento para la obtencién de extractos apolares y polares de Curcuma y aplicaciones de los mismos- CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La presente invencién se encuadra dentro del campo técnico de la obtencién de extractos de plantas con diferentes aplicaciones medicinales, cosméticas, dietéti- cas, etc. Més especialmente, 1a presente invenci6n proporciona un procedimiento para 1a obtencién de extractos apolares y polares de Curcuma que tienen importantes aplicaciones como agentes captadores de radicales libres y agentes antienvejecimiento. ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR A LA INVENCION La curcumina y otros curcuminoides, asi como aceites esenciales obtenidos de extractos de plantas del género Curcuma y en general de la familia de las Zingibera~ ceas son tiles para el tratamiento y profilaxis de diversas enfermedades. A titulo de ejemplo, se pueden citar: EP568.001 (agentes antivirales), EP440.885 (antiin— flamatorios), EP319.058 (contra la caida del cabello), EP256.353 (tratamiento de sindromes de malabsorcién), USS. 108.750, US4.906.471, US4.842.859 (agentes antiagregan- tes plaquetarios y anticolesterol), W088/05304 (contra hepatitis By sida), W088/08713 (tratamiento de desérdenes neurolégicos), US4.568.546 (antiveneno). ‘También son conocidas las propiedades antioxidantes y colorantes de la curcumina y sus derivados por lo que suele emplearse ampliamente en alimentacién y cosmética como conservante natural (US5.266.344, KK KOBE SEIKO SHO). Por otra parte, se sabe que el exceso de oxigeno reactive y de radicales libres en los tejidos produce alteraciones que conducen al envejecimiento celular prematuro y a la aparicién de diversas enfermedades. Dada la creciente preocupacién por este fenémeno, no resulta10 15 20 25 30 35 Wo 96103999 PCT/ES95/00097 -2- sorprendente que existan numerosos documentos sobre preparacién de extractos vegetales con efectos antioxidan- tes, captadores de radicales libres y por lo tanto dtiles en la prevencién del envejecimiento celular. Sin embargo, en el caso concreto de extractos de Curcuma longa el némero de documentos recuperados no es muy abundante, correspon- diendo ademas en su mayor parte a literatura no patente. Entre las referencias bibliogréficas de las patentes de mayor interés que se encuentran recogidas en los bancos de datos, destaca la solicitud FR2.655.054 (PACIFIC CHEMICAL) sobre agentes de proteccién celular que contienen curcuminoides (curcumina, 4-hidroxicinamoil (feruloil) metano, bis (4-hidroxicinamoil) metano, etc) obtenidos de Curcuma longa, 4cido ascérbico y/o superéxido dismutasa (SOD). Los curcuminoides poseen un conocido efecto antioxidante, asi como el 4cido ascérbico y la SOD que ejercen un efecto sinérgico. Por otra parte, la actividad antiinflamatoria de los curcuminoides también puede resultar de su efecto antioxidante. En este sentido, la solicitud EP550.807 (STEIGERWALD ARZNEIMITTELWERK) describe preparaciones de Curcuma longa Gtiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias asociadas con la produccién excesiva de leucotrienos y prostaglandinas (enfermedad de Crohn, asma bronquial, psoriasis, etc). Segin este documento, la curcumina ejerce su acci6n antiinflamatoria por una parte participando en las reacciones de eliminacién de oxigeno activo y de radicales libres y por otra inhibiendo la ciclooxigenasa y 1a lipooxigenasa, enzimas responsables de la sintesis de prostaglandinas y leucotrienos respectiva- mente. En relaci6n con los procedimientos de extrac- cién de las fracciones polar y apolar de los rizomas de ccuma_longa, se trata de procedimientos convencionales que utilizan disolventes usuales (1iquidos en condicionesNA octicead PCTYES9S/00097 10 1s 20 25 30 35 -3- normales) o bien CO, 0 NO, liquidos o en condiciones supercriticas, lo que es igualmente usual para la extrac- cién de aromas y aceites esenciales de plantas(“Carbon dioxide extracted ingredients for fragances", Flavours & Fragances 0-54385P, North Albert Road, Reigate, Surrey RH2 9 ER, Inglaterra). No obstante, es un campo de notable interés en el que todavia sigue siendo deseable la obtencién de extractos més puros el descubrimiento de posibles nuevas aplicaciones de los mismos en el campo médico-farmacéutico, en el cosmético, en el dietético, etc. En esta linea, la presente invenci6n propor- ciona unos extractos apolares y polares de Curcuma longa con importantes propiedades como agentes captadores de radicales libres y, consecuentemente, agentes antienvejeci- miento celular. Asimismo, estos extractos han mostrado capacidad para reducir los niveles plasmaticos de peréxidos lipidicos en humanos. Por otra parte, segiin los datos bibliogrAficos es conocido que los radicales oxigenados generados en las células son controlados por los sistemas de defensa celular. La excesiva generacién de tales radicales puede exceder la capacidad protectora del sistema de defensa y conducir a 1a oxidacién de los componentes celular, proteinas, lipidos y DNA. Estos procesos oxidativos son relevantes en la patogénesis de enfermedades tales como arterioesclerosis y artritis reumatoide. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invencién, tal y como se indica en su enunciado se refiere a un procedimiento para la obten- cién de extractos apolares y polares de Curcuma y las aplicaciones de estos extractos. Las plantas del género Curcuma y, en especial, la Curcuma longa son plantas tropicales conocidas desde la antigiiedad que pertenecen a la familia de las Zingiber&ceas‘Wo 96703999 PCTIES9§/00097 10 15 20 25 30 35 a y son originarias de Asia. Los rizomas de Curcuma secados ya se utilizaba en Asia como condimento alimentario y como colorante textil. También se empleaban en medicina popular para el tratamiento de afecciones estomacales. En los Gltimos afios, en la literatura cienti- fica han aparecido nuevas aplicaciones farmacolégicas: actividad antibacteriana, antiinflamatoria, capacidad de peroxidacién lipidica, antihepatéxico y antitumoral. Los extractos de Curcuma son pigmentos amari- llos denominados curcuminoides, fundamentalmente constitui- dos por: curcumina (diferuloilmetano), desmetoxicurcumina (hidroxicinamoilferuloil-metano) y bisdesoxicurcumina (dihidroxicinamoilmetano) . El procedimiento de la presente invencién, para la obtencién del extracto apolar de Curcuma longa, se caracteriza porque comprende las siguientes operaciones: a) someter a un proceso de extraccién en continuo durante unas 48 horas, los rizomas de Curcuma previamente cortados, secados y pulverizados, empleando un isolvente de disolvente org4nico en una relaci6n rizoma:! 1:7 peso/volumen, llev4ndose a cabo el proceso en régimen estacionario para evitar pérdidas de disolvente, para lo cual se va regulando la temperatura del calderin de extracci6n; b) filtrar la mezcla de extraccién resultante de la etapa (a) y evaporar el disolvente del filtrado obtenido a presién reducida obteniéndose como residuo seco una oleorresina marr6n de olor caracteristico; c) disolver la oleorresina resultante de la etapa (b) en acetato de etilo caliente, en una proporcién del 50% p/p y seguidamente dejar enfriar la disolucién hasta la temperatura ambiente durante unas 24 horas aproximadamente, apareciendo un precipitado anaranjado que se separa por filtracién; d) secar a presi6n reducida el filtrado‘WO 96103999 PCT/ES9S/00097 10 15 20 25 30 35 aS procedente de la etapa anterior para obtener una segunda oleorresina més oscura que la anterior, cuyo contenido en curcuminoides oscila entre 20 y 25%; e) recristalizar el precipitado resultante en acetato de etilo al 50% (p/p) para obtener un sélido con una pureza en curcuminoides superior al 90%. Por su parte, el procedimiento de la presente invencién para la obtencién de extracto polar de cdrcuma longa, se caracteriza porque comprende las siguientes operaciones: a) someter a un proceso de extraccién con agua los rizomas de Curcuma longa, previamente cortados, secados y pulverizados, manteniéndolos en maceracién durante unas 24 horas a una temperatura comprendida entre 50 y 70? C; b) filtrar la mezcla de extraccién resultante de la etapa (a) y evaporar el agua del filtrado ast obtenido a presién reducida, para obtener un residuo que es un s6lido higroscépico correspondiente al extracto polar de cCurcuma longa. Asimismo, el procedimiento de la presente invencién se puede llevar a cabo mediante extraccién supercritica, para lo cual el rizoma de Curcuma, previamen- te cortado, secado y pulverizado se extrae con etanol/CO, y a.una presién de aproximadamente 260 bar, para obtener el correspondiente extracto apolar con una pureza en curcumi- noides del 90%. El extracto apolar asi obtenido es idéntico al obtenido mediante la extraccién con disolventes segin lo demuestran sus datos espectroscépicos y cromatogr&ficos. De la misma forma, pero empleando agua como codisolvente se obtiene el extracto polar cuya cromatografia en capa fina es totalmente coincidente con la del extracto obtenido por maceracién en agua indicado anteriormente. Preferentemente la obtencién del extracto apolar mencionado anteriormente, mediante extraccién supercritica, se lleva a cabo en las siguientes condicio-Wo 96103999 PCTIES95/00097 10 15 20 25 30 35 eo nes = Secado de la Curcuma longa troceada a una temperatura de 50°C; = Triturado del rizoma en particulas entre 0,1 y 1 mm - Extraccién del rizoma de Curcuma longa utilizando etanol, modificado con una pequefia cantidad de co, , como disolvente, a 250 bares y 508C; - Extraccién del etanol presente en la oleorresina con CO, a 280 bares y 508C. Los extractos apolar y polar de Curcuma asi obtenidos tienen capacidad captadora de radicales libres, en concreto, de radicales hidroxilo OH’ y super6xido 0; , como se demuestra mas adelante por los estudios llevados xealizados por los inventores al respecto. Adem4s, dichos extractos, como también se demuestra ms adelante, tienen capacidad reductora de los niveles plasm4ticos de peréxidos lip{dicos en humanos. Consecuentemente, también tienen efectos beneficiosos en patologias relacionadas con la oxidacién celular tales como la arterioesclerosis y la artritis reumatoide. La presente invencién incluye también composi- ciones y preparados con capacidad captadora de radicales libres, los cuales son efectivos contra los procesos de envejecimiento, proteccién del material genético y capaci- dad antimutagénica. Asimismo, incluye composiciones y preparados con capacidad reductora de los niveles plasmati- cos de peréxidos lipidicos. Las referidas composiciones o preparados contienen como principios activos los extractos polar o apolar de rizoma de Curcuma longa obtenidos por el procedi- miento de la invencién o mezclas de los mismos, junto con excipientes de calidad farmacéutica apropiados para la administraci6n por via oral. Estos preparados orales pueden presentarse en10 15 20 25 30 35 WO 96103999 PCT/ES9S/00097 ee forma s6lida (polvos, comprimidos, grageas, capsulas, etc) © liquida (jarabes o suspensiones) - De acuerdo con lo expuesto anteriormente, los presentes inventores muestran como agente protector © captador de radicales libres, ademas del extracto apolar de curcuma longa, en el que estén los curcuminoides, el extracto acuoso o polar de Curcuma longa en el cual no hay curcumina ni curcuminoides. Adem4s, los estudios realizados por los citados inventores, demuestran que el extracto acuoso de Curcuma longa es por si solo un potente captador de radicales libres, en especial, superéxido (02). La aplicaci6n relativa a la disminucién de los niveles de peréxidos lipidicos plasméticos, esta basada fundamentalmente en la capacidad captadora de radicales libres de los referidos extractos. Dentro del campo del estudio del envejecimien- to, se deben evaluar distintas variables que pertenecen a los 4mbitos de la fisiologia, de la bioquimica y de la psicologia. Los trabajos encaminados hacia 1a gerontologia preventiva han desembocado en la confeccién del perfil de la edad biolégica y estilo de vida, que pretenden ser una herramienta que evalte de la forma m&s rigurosa y sencilla posible los parémetros més sensibles en lo referente a hbitos vitales como: Tratamiento farmacolégico, tabaco, alcohol, ejercicio, suefio, percepcién de la propia salud y stress. Al margen del modo de vida de la poblacién en general existen parémetros bioquimicos como colesterol total, triglicéridos, glucosa, Acido Grico, y HDL/coles- terol, que también se consideran importantes en la evalua- cién del grado de envejecimiento. En este sentido, por la gran cantidad de informaci6n que genera, es interesante incluir en el perfil de la edad biolégica, un parémetro bioquimico, que puede medirse con cierta facilidad en sangre periférica: los‘WO 96103999 PCT/ES95/00097 10 15 20 25 30 35 -8- peréxidos lipidicos, resultado de la oxidacién por parte de los radicales libres derivados del oxigeno, sobre los fcidos grasos poliinsaturados que forman parte de los fosfolipidos de membrana. Este proceso oxidativo con frecuencia excede la capacidad homeostética de la célula, pudiendo ocurrir un proceso de oxidacién anormal e incontrolado con una destrucci6n masiva de la membrana celular. Es sabido que en la homeostasis de la peroxidacién intervienen antioxidantes como los beta-carotenos y los tocoferoles. Por tanto, parece légico pensar que la administraci6én exégena de una sustancia antioxidante, pueda ser itil para el restableci- miento de este equilibrio celular. Los presentes inventores, han estudiado la capacidad antioxidante de composiciones farmacéuticas 4 base de los extractos polar y apolar de Curcuma longa, por su acci6n sobre los niveles séricos de malonaldehido (MDA) en humanos, como indicador de su capacidad de bloqueo de la acci6n de los radicales libres de 1a membrana celular. Las conclusiones obtenidas de este estudio son las siguientes: 1.+ Curcuma longa es un extracto natural que disminuye los peréxidos lipidicos plasm4ticos, lo que implica un mecanismo protector de la membrana celular. 2.- No presenta toxicidad alguna; la toma durante 105 dias de Curcuma longa no modifica las pruebas hematol6égicas hep&ticas y renales. 3.- El efecto a nivel de los per6xidos lipidicos es répido: a los 45 dias ya se detecté un descenso de los mismos, précticamente en todas las décadas y en ambos sexos. 4,- La inhibicién de los peréxidos lipidicos y la captacién de los radicales libres, propiedades fundamentales de 1a Curcuma longa, son una de las bases donde se apoyan las teorsas de envejecimiento.‘WO 96703999 PCT/ES95/00097 10 15 20 25 30 35 -9- BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Pigura 1: Valores de los indices de peréxidos Lipidicos para los Varones del estudio. Figura 2: Valores de los indices de peréxidos lipidicos para las Mujeres del estudio. MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION La presente invencién se ilustra adicionalmen- te mediante los siguientes Ejemplos, los cuales no preten- den ser limitativos de su alcance. EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la obtencién del extracto apolar de Curcuma de la presente invencién. Se extrajeron 13-14 kg rizoma de Curcuma seco y molido, en continuo, utilizando 70 litros de diclorometa~ no. La temperatura del calderin se regul6 hasta obtener el xégimen estacionario. La extracci6n se consider6 agotada después de 48 horas. El extracto se filtré y el disolvente se evaporé a presién reducida (0,5 torr) hasta su total eliminacién. El rendimiento de oleorresina utilizando este procedimiento oscil6 entre 12-15% en base a peso de rizoma seco de partida. La oleorresina asi obtenida se disolvié en acetato de etilo caliente (50% peso) y se dejé estar a temperatura ambiente durante 24 horas, en el transcurso de las cuales fue apareciendo un precipitado anaranjado (curcuminoides) que se separé por filtracion. El filtrado se sec6 a presién reducida hasta obtener una segunda oleorresina m4s oscura que la anterior cuyo contenido en curcuminoides oscilé entre el 20% y 258. El precipitado se recristaliz6 en acetato de etilo (50% en peso) siguiendo los pasos mencionados anteriormente, obteniendo as{ curcuminoides con una pureza superior al‘Wo 96703999 PCT/ES95/00097 10 15 20 25 30 35 10 908. EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra 1a obtencién del extracto polar de Curcuma de la presente invencién. Se extrajeron 30 Kg de rizomas de Curcuma longa molidos con 300 litros de agua a 70eC en maceracion durante 24 horas. La solucién se filtr6 a través de placa filtrante y el disolvente se evaporé a presién reducida (0,5 bar) obteniéndose 240 gr de un s6lido higroscopico. Rendimiento 88. EJEMPLO 3 En este Ejemplo se pone de manifiesto como se ha optimizado el proceso de extraccién utilizando fluidos en estado supercritico, estudiando los siguientes paréme- tros: - Estabilidad térmica de los curcuminoides. - Estudio de la temperatura de extracci6n. = Estudio de la presién de alimentacién. - Estudio del tamafio de particula. - Estudio de la humedad de la matriz de partida. - Estudio del caudal del fluido supereritico. - Estudio del uso de etanol como cosolvente. - Extracci6n por técnicas combinadas. A partir de los resultados experimentales se han evaluado los costes siendo el proceso 6ptimo, en el cual estén las siguientes fases: = Secado de la Curcuma longa troceada a una temperatura de 509C. - Triturado del rizoma en particulas entre 0,1 y lm. - Extraccién del rizoma de Curcuma longa utilizando etanol, modificado con una pequefia cantidad de Co, como disolvente a 250 bares y 508C. - kExtraccién del etanol presente en la10 15 20 25 30 35 WO 96103999 PCT/ES95/00097 -1l- oleorresina con CO, a 280 bares y 508C. La novedad de esta técnica radica en la utilizacién de etanol modificado con CO, para 1a extracci6n de la Curcuma longa y por otra parte este método reduce los costes para la extraccién de curcumina frente a las técnicas convencionales, extraccién con disolventes y/o extracci6n supercritica con diéxido de carbono. Este método de extraccién aumenta la selecti- vidad de la extraccién de curcumina frente a los otros curcuminoides. - Estabilidad en la curcumina La curcumina presente en la fraccién apolar muestra una degradaci6n térmica en funci6n del tiempo. Los resultados indican una pérdida de curcumi- noides al aumentar la temperatura, sobre todo al sobrepasar los 508c. Inicialmente se produce una mayor degradacién que se estabiliza a partir de 24-48 horas de exposicion. La degradacién se mantiene en un 2% para temperaturas inferio- res a los 508C y un 4% a B0SC. = Estudio de la temperatura de extraccién. Se ha estudiado el rendimiento de extraccién a 250 bar con un caudal de 3 Kg/h de CO, y un tamafio de particula entre 0,1 y 1 mm a 358C, 409C, 508C, 558C, obteniéndose los mejores rendimientos a 558C. = Estudio de la presién de alimentacién. Se ha estudiado el rendimiento de extraccion a distintas temperaturas (309C, 408C, 508C) y distintas presiones (100 bar, 150 bar, 200 bar, 250 bar) con un caudal de 3 Kg/h de CO, y un tamafio de particula entre 0,1 y 1 mm, Para todas las temperaturas estudiadas el rendi- miento m&ximo obtenido ha sido a 250 bares de presién. - Estudio del tamafio de particula. Se ha estudiado el rendimiento de extraccién a 50C, 250 bar, y un caudal de 3 Kg/h de CO, para distin-‘WO 96103999 PCTIES9S/00097 10 15 20 25 30 35 -12- tos tamafios de particula. El maximo rendimiento se obtuvo para tamafios de particula entre 0,1 y 1 milimetro. - Estudio de la humedad de la matriz de partida. Se ha estudiado el rendimiento de extraccién a partir de distintas muestras de rizoma de Curcuma con diferente grado de humedad (80%, 50%, 8%). El mayor rendimiento en curcumina se obtiene trabajando con una humedad en la matriz de partida de 8%, por lo que para la obtencién de la fraccién apolar el proceso de extraccién se efectiia con el sistema deshidratado. - Estudio del caudal del fluido supercritico. Se ha observado que conforme disminuye el caudal de disolvente la aparicién de efectos difusionales se retrasa, aumentando el efecto de solubilidad e incremen- tando el rendimiento de extraccién. Por otro lado, caudales excesivamente pequefios y/o grandes aumentan el tiempo de extraccion. - Extracci6én mediante etanol y di6xido de carbono supercritico. Se ha estudiado el rendimiento en curcuminoi des extrayendo la Curcuma con diferentes proporciones de cosolvente (etanol) en CO;. £1 mayor rendimiento en oleorresina se obtuvo utilizando etanol al 96% con un 4% de CO, , obteniéndose un rendimiento en oleorresina del 11,42% (con un 43% en curcuminoides) que significa un 98% de la cantidad total de la oleorresina en el producto inicial y un rendimiento del 100% en curcuminoides totales. - Extracci6én mediante técnicas combinadas. A partir de extracciones supercriticas a partir de oleorresinas de Curcuma longa obtenidas por extraccién con disolvente. Se observé que la extraccién era muy répida al principio pero que iba ralentizandose conWO 96103999 PCT/ES9S/00097 10 15 20 25 30 35 Bih5 el tiempo por solidificacién de la oleorresina. Este sélido ten{a un aspecto apelmazado y estaba formado por particulas muy finas. El extracto tenia como principal componente el disolvente utilizado en la extraccién. En estos ensayos se observé la existencia de un efecto cosolvente grande, ya el extracto obtenido se volvié a introducir en el equipo para ver si se podia fraccionar y se observé que era muy poco soluble en CO, supercritico. Se obtuvo una oleorresina con etanol y CO, 96- 4% a 250 bar y a 508C y posteriormente esta oleorresina se extrajo a 280 bar, 50%C y usando un caudal de 3 Kg/h de cO,. La oleorresina s6lida obtenida mostré un rendimiento similar al rendimiento obtenido por métodos convencionales pero se aumenté6 en la selectividad de la extraccién de la oleorresina en la extraccién con etanol frente a la extraccién con disolventes orgénicos. Los resultados se muestran a continuacién. Curcumina $ Demetoxi Bisdemetoxi * Oleorresina 34,508 29,508 36,008 obtenida por métodos con- vencionales Oleorresina 72,368 17, 76% 9,888 obtenida con EtOH - Estimacién de costes. A partir de los estudios anteriores se ha realizado una estimacién de costes estudiando diferentes supuestos, calculando el coste por Kg de curcumina. Los diferentes supuestos son: a.- Partiendo de Curcuma longa y extrayendo la oleorresina10 1s 20 25 30 35 WO 96103999 PCT/ES9S/00097 -ue mediante CO, en estado supercritico. 1.+ Caudal de 3 Kg/h y densidad aparente de la Curcuma de 0,413 Kg/l. Supuesto 1.1. 2.- Caudal de 3 Kg/h y densidad aparente de la Curcuma de 0,573 Kg/1. Supuesto 1.2. 3.+ Caudal de 1 Kg/h y densidad aparente de la Curcuma de 0,413 Kg/1. Supuesto 1.3. b.- Utilizando como materia prima la Curcuma longa y extrayendo la oleorresina mediante un proceso en lotes utilizando como disolvente una mezcla de etanol/diéxido de cArbono a presién elevada. Supuesto 2. c.- Partiendo de oleorresina extraida con disolventes orgénicos por métodos convencionales y extrayendo los disolventes presentes mediante CO, en estado supercritico. De esta manera se obtiene una oleorresina s6lida més concentrada en curcumina. Supuesto 3. d.- Partiendo de oleorresina extraida con etanol/Co, a alta presién y extrayendo el etanol presente mediante CO, en estado supercritico. De esta manera se obtiene una oleorre- sina s6lida todavia m&s concentrada en curcumina que la anterior. Supuesto 4. e.- A partir de Curcuma longa y extrayendo la oleorresina utilizando etanol en una extraccién soxhlet. Supuesto 5. £.- A partir de Curcuma longa y extrayendo la oleorresina mediante CO, SC modificado con etanol. 1.- Proporcién de etanol en el disolvente del 17%. Supuesto 6.1. 2.- Proporci6n de etanol en el disolvente del 34%. Supuesto 6.2. Operacion. Para realizar la estimaci6n de costes, se ha considerado una eficacia del 90% del total de la operacién.‘PCT/ES9S/00097 ‘WO 96103999 - 15 - jeez, ozsy Lees ovo oz erez 08 osz Z:9 o1sending| see t98zi Lees 6e% o ov'sz, os ose 9 ojsending JeOLz osee 906S ost est oe 08 ‘ '¢ ojsending} p91 oze ove zt ee e892, 0s 082 voysendng jezs lst zav vz 9 969%, 0s 08% ¢ ojsendns| 1901 oust Lees wi ve 0s ose Zoysendns pice suse” eleve ot e we os ose, €'| ojsending| L068 89685 zsvut ee 09 ved os: ost Z'1 ojsending| veto wezce eizve vst ee ive 0s osz UL oysending| n/vid) aD o w yb — ByU/BY) COWL Goad — Bek cael NS eg aque _PEMOMD MORRIS Sone “ 3 a 8 a a aWo 96103999 ‘PCTIES9S/00097 10 15 20 25 30 35 = 16 - Se observa que el supuesto m&s favorable es el supuesto ndmero 4 en el que se extrae el rizoma de Curcuma longa con etanol a presién y posteriormente la oleorresina se purifica por extraccién con CO, Instalacién. Para poder llevar a cabo la obtencién de curcumina a partir de su oleorresina, se necesitan dos extractores y dos separadores, provistos de camisas de calefaccién. £1 equipo deber4 ir equipado con una bomba con refrigeracién interna, capaz de suministrar presiones de 300 bar. Adem&s, se necesita un refrigerador para licuar el co, que sale del segundo separador y asi poder recircular el CO, abaratando costes de operacién. El hecho de tener dos extractores es para poder realizar un proceso semicontinuo de extraccién, ya que durante los tiempos muertos de carga y descarga y presurizacién de la unidad, el proceso puede seguir funcionando con el otro extractor. La planta deber& ir equipada con un sistema de control de presién y temperatura en el extractor y separa- dores, caudal y temperatura del refrigerador. Ademés, se deberé instalar un sistema de alarmas de presién y tempera- tura en los extractores, separadores y camisas de calefac- cién, asi como el refrigerador para evitar cualquier accidente. EJEMPLO 4 Este Ejemplo ilustra una composicién de acuerdo con la presente invencién, para su administracién por via oral, en forma de comprimidos constituida por: = Curcuminoides......+++ seveee 15 mg = Extracto acuoso de Curcuma........, 175 mg - Avicel pH 102....++++- seveee 489 mg = Almid6n. eee ee ee ress ee eee vee 45 mg - Estearato de magnesio...... pe OLWo 96103999 10 15 20 25 30 35 PCT/ES9S/00097 -17- = Primogel....sseeeeeeeees 3mg = EM compres....+.++++ 15 mg EJEMPLO 5 Este Ejemplo ilustra una composici6n liquida, de acuerdo con la presente invencién, para su administra- cién por via oral, en forma de emulsién, constituida por: - Curcuminoides... ++ 20 mg - Extracto acuoso de Curcuma.. = 200 mg junto con cantidades variables de agentes edulcorantes (por ejemplo, sacarosa o fructosa) y de agentes saborizantes (por ejemplo, esencias de menta o de fresa) y de aceites vegetales en cantidad suficiente para 100 ml de emulsion. Los siguientes Ejemplos corresponden a los estudios efectuados sobre los extractos de la invencién, dirigidos a determinar y evaluar su capacidad captadora de radicales libres, asi como su capacidad reductora de per6xidos lipidicos. EJEMPLO 6 Estudi AC: ci 1 Ci super6xido (0° ) por el método del pirogalol. Se ha estudiado 1a autoxidacién del pirogalol tras un periodo de induccién de 20 segundos, y durante 2 minutos, tiempo en el que el incremento de absorbancia es lineal a 420 nm. Se emplea la inhibicién de la autoxidaci6n del pirogalol por los extractos de cércuma, para determinar la capacidad captadora sobre el radical 0,” . La experiencia se realiza a 252 C. El piroga~ gol se vehiculiza en 4cido clorhidrico 10 mM. La reaccién se inicia cuando se afiade a una solucién tamp6n Tris-&cido cacod{lico saturada con aire, pH 8,2 que contiene 1 mM de DTPA el pirogalol. El DTPA es utilizado como quelante para eliminar posibles interferencias de iones como hierro, cobre o manganeso. Para los extractos apolares de circuma se encontré un porcentaje de inhibici6n del 40,928 + 0,00210 15 20 25 30 35 wo PCT/ES9S/00097 Sita (p < 0,01) a una concentracién de 16, 129},g/mL en curcumi- noides, mientras que la inhibicién de la SOD es del 95%. ‘EJEMPLO 7 Estudi A 1 idx e Capacidad captadora del radical hidroxilo por el test del DMSO. $e ha estudiado la capacidad captadora de radicales libres hidroxilo (OH*) por medida del formaldehi- do generado durante la oxidaci6n del DMSO; potente captador de radicales hidroxilo por el sistema 4cido ascérbico/Fe”> La oxidacién se desencadena por el ascorbato y se cataliza de por el Fe a 372 C. La mezcla de reacci6n esté formada de EDTA (0,1 mM), complejo Fe** EDTA (1:2) (167MM) DMSO (33 mM), extracto problema y tamp6n fosfato 50 mM pH 7,4 en un volumen final de 3 mL. Se adiciona el &cido asc6érbico (2 mM) y después de 30 minutos de incubaci6n a 372 C, la reacci6én se detiene con 1 mL de &cido trifluoracético al 17,5% (p/v), y se mide en una alicuota de 1,5 mL mediante espectrofoto- metria. Se utiliza la competencia entre el extracto problema y el DMSO por el radical hidroxilo (OH") generado procedente del sistema ascérbico/hierro, para la estimacién de la actividad captadora del radical hidroxilo OH* de la sustancia problema, expresandola como el porcentaje de inhibicién de la produccién de formaldehido. El protocolo seguido es el siguiente: EDTA Bcpl CH Bpph Pp Fe" EDTA 250 250 250 250 DMSO 250 250 250 250 VEHICULO 500 500 --- = EXTRACTO --- --- 500 TAMPON FOSFATO 250 --- —— ASCORBATO --- 250 250WO 96103999 PCT/ES9S/00097 10 15 20 25 30 35 = 19 - Be: Blanco del control c: Control Bp: Blanco problema P: Problema El formaldehido producido se mide en la reaccién anterior por adicién de 2 mL de una mezcla reactiva de acetato am6nico y acetil acetona en tampon fosfato 50 mM pH 7,4, sobre una alicuota de 1,5 mb. La mezcla se incuba a 582 C durante 5 minutos y seguidamente las muestras se sumergen en un bafio de hielo, y se mide la 3,5-diacetil-1,4-dihidrolutina formada a 412 nm. Los resultados obtenidos fueron: para la mezcla de curcumoides, extracto apolar, fue del 95,13 + 2,46% (P < 0,01, n = 6) siendo la concentracién de la muestra 16,129 ps/at- EJEMPLO 8 Estudio de Ja capacidad captadora del radical supe: lo (0° todo _NADH=: ato- Q.-azul de nitrotetrazolio (NBT: ‘Se estudia 1a capacidad captadora de radicales libres super6xido por la inhibicién de la formacién de diformarén, compuesto altamente coloreado que presenta un m&ximo de absorcién a 560 nm. La mezcla de reaccién est& compuesta por tamp6n fosfato 19 mM pH 7,4 NADH (90KM), NBT (43 MM), extracto a ensayar (vehiculo para el blanco), pH 5 (2,7pM), todo ello en un volumen de 3/2 mb. La reaccién de reduccién del NBT se inicia con la adicién del PMS y es seguida espectrofotométicamente, por medida de la absorban- cia a 560 nmy a 20° C durante 2 minutos para calcular el incremento de absorbancia por ( AA/min). El siguiente esquema muestra el protocolo seguido: Be (Me) c Cpt) Bp (pL) P (KE) 250 'TAMPON FOSFATO 250 250 250 NADH 100 100 100 100 NBT 100 100 100 10010 1s 20 25 30 35 ‘Wo 96703999 PCT/ES9S/00097 EXTRACTO -- --- 100 100 VEHICULO 100 100 -- —— PMS 100 -- 100 Bc: Blanco del control Cc: Control Bp: Blanco problema P: Problema Se obtienen los porcentajes de inhibicién para el extracto polar de Smilax Lundeli para 5 muestras con una concentracién de 500},9/nl, que es del 99,6 + 0,1 % para p< 0,01. EJEMPLO 9 3 $) po: ina-i Se ha estudiado la capacidad captadora del radical superéxido de la fraccién polar de Curcuma longa por el método de la xantina-xantina oxidasa produciéndo: una inhibicién del 77,95% para una concentraci6n final de 1,25 j4g/mb en curcuminoides. Se ha comprobado que el extracto no inhibe a la enzima, indicando esto que este extracto es un poderoso captador de radicales super6xido. EJEMPLO 10 0} e de re s_niv i i sangre en humanos. Este ejemplo pretende demostrar la accién, sobre los niveles plasm&ticos de peréxidos lipidicos, de una composicién farmacéutica a base de extractos polares y apolares, de Curcuma longa, cuando es administrada por via oral, en forma de dos comprimidos diarios conteniendo de 7 a 14 mg de curcumina por comprimido y de 150 a 175 mg de extracto acuoso de Curcuma longa, a un conjunto de sujetos de ambos sexos sanos, durante un perfodo de dos meses y medio.10 15 20 25 30 35 ‘Wo 96103999 PCT/ES9S/00097 El COMPOSICION DE LOS COMPRIMIDOS DEL PRESENTE EJEMPLO ng/comprimido Extracto apolar de Curcuma longa ..--- 60* Extracto polar de Curcuma longa ..--- 175 Avicel pH 102 0 seeseeeseeeeeeeeeeeees 489 Almid6n de maiz .. see peer 45 Estearato de magnesio - 8 Primogel ..-.eeeeeeeee 3 EM Compress ....eseeeeeeeeeeees po0 15 * Equivalente a 12,5 mg de Curcuminoides METODO Se ha estudiado una poblacién de 19 varones y 13 mujeres de edades comprendidas entre 27 y 74 afios, tal y como se indica en la siguiente Tabla 1: 2 0 de suiet i i edades y sexo. Hombres Edades Frecuencia 25-30 3 31-40 3 41-50 4 51-60 7 60-70 2 Mujeres Edades Execuencia 30-40 3 41-50 4 51-75 6 A estos sujetos, se les extrajo sangre periférica para la determinacién del hemograma completo, de los parémetros de evaluacién de la funcién hepatica y renal; asimismo se realiz6 la determinaci6n de la tasa de Aipidos y de peréxidos lipidicos en suero. Tras el conocimiento de los resultados, se inicié el tratamiento consistente en dos comprimidos10 15 20 25 30 35 ‘WO 96703999 PCT/ES95/00097 -22- diarios de extracto de Curcuma longa, con el siguiente protocolo: segunda extraccién a los quince dias tras la administracién, con la determinacién de los parémetros antes citados. Se mantuvo el seguimiento del protocolo, repitiendo la analitica a los cuarenta y cinco y setenta y cinco dias del inicio del estudio. Tras cumplirse este protocolo se procede a un periodo de descanso en la administracién, de treinta dias de duracién, tras los que se vuelven a determinar los parémetros. antes resefiados. METODOS ANALITICOS £1 hemograma fue realizado en un analizador H-1 de Technicon (USA). Los parémetros bioquimicos fueron realizados siguiendo los métodos estandarizados con reactivos de Boehringer-Mannheim (Alemania), con un autoanalizador Hitachi 717 (Jap6n). Los per6xidos lipidicos se determinaron como malonaldehido (MDA) por el método de Ohkama, Ohishi y Yagi (Analytical Biochem. 95 351-358 (1979)), modificado para suero. LTA Los pacientes no refirieron a lo largo del protocolo ninguna de las siguientes manifestaciones: disfagia, pirosis, nauseas, vémitos, diarrea o estrefiimien- to. No se observaron alteraciones ni en el hemograma ni en los parémetros bioquimicos, en toda la poblacién estudiada, sin distincién de sexo ni edad. Se observé que los enzimas marcadores de 1a funcién hepatica, (Gor, GPT, GGT, fosfatasa alcalina) como indicadores de la toxicidad del producto y la bilirrubina total, directa e indirecta, no se ven alterados a lo largo de todo el proceso, como puede apreciarse en la siguiente Tabla 3. En dicha Tabla 3 se muestran los valores iniciales y finales de GOT, GPT, GGT y fosfatasa alcalina distribuidos por10 15 20 25 30 35 Wo 96103999 PCT/ES9S/00097 23 - grupos de edad en funcién del sexo. Se indican la media y la desviacién standard. Las unidades en dicha Tabla son las siguientes: (a) Tiempo Inicial = Tiempo 0 (b) Tiempo Final = a los 105 dias del inicio (c) Valores de referencia para el método analitico indica- do. TABLA 3: Cor GPT osbre | va ©) [s- inteial (@)]t- tion (| [7 amici [7 final, Fed. Medin Hedi Deor- Media [Deav-¢| Hedia Dost =| 25-30 | 0-30 _| 213 22.31 31 | o40| 190 | 52 [183 | 35 31-40 | 0-30 | 243 | 10,4 | 20,7 | 40 | 0-40 [23,7 | 66 | 193 | 43 41-50] 0-30 | 23.0 | 5,1 | 26,0 | 1,7 | 0-40 [30,8 | 16,9 | 33,0 | 11,3 34-60 | 0-30 | 20,0 | 80 | 23.0 {7.7 | 040 [ 21.0 | 10.7 | 21,8 | 4.0 0-70 | 0-30 | 21.0 | 28 | 23.0 | 42 | 040 | 200 | 57 [17.0 [ 42 Bajer Eaed 0:30 | Fede posta] SE] 0-40 | Nedia Desv-a] edie Posy. 30-40 | 0-30 | 21,3 | 11.0 | 27,7 | 165 | 0-40 | 27.0 | 269 | 32,3 | 344 41-50 [0-30 | 150 | 221155 | 07 | o4o| 110 | 26 [100 | 00 31-78 | 0-30 | 167 | 30 | 20,0 | 26 | o40 | 157] 30 | 120 | 57 [13,9 [98-270] 135.0 “8,5 | 29,6 | 98-270] 123,3 | 20.6 5.2 | 7.5 | 61.8 [98-270] 160.8 | 61.810 15 Wo 96103999 PCT/ES9S/00097 = 24 = Como se refleja en la Figura 1, a los 15 dias del tratamiento, se observé en los varones una disminucién en torno al 8% en la tasa de peréxidos lip{dicos, mientras que a los 45 dias del comienzo del tratamiento, la disminu- cién alcanza un valor medio de 34%, de manera que la variacién con respecto a la situacién a los 15 dias del conjunto de los varones sujetos al estudio seré de 59%. En las mujeres, a los 15 dias se encontr6 un aumento medio en la tasa de peréxidos lipidicos (de un 26%), (Fig. 2): sin embargo, al cabo de los 45 dias, la disminucién de la tasa de peréxidos es m&s evidente (disminuye un 11¢ de prome- dio), abarcando prdcticamente a la totalidad de los sujetos; estos resultados implican una disminuci6n promedio a los 45 dias con respecto a la situacién de las mujeres sujetas al estudio a los 15 dias, de un 80%.10 15 20 25 30 35 Wo 96103999 PCT/ES9S/00097 -25- REIVINDICACIONES: 1.- Procedimiento para la obtencién de extractos apolares y polares de Curcuma, caracterizado porque (I) para la obtencién del extracto apolar de Curcuma longa se efecttan las siguientes operaciones: (a) someter a un proceso de extraccién en continuo durante unas 48 horas, los rizomas de Curcuma previamente cortades, secados y pulverizados, empleando un disolvente orgénico en una relaci6én rizoma:disolvente de 1:7 peso/volumen, llevandose a cabo el proceso en régimen estacionario mediante regulacién de la temperatura; (b) filtrar la mezcla de extraccién resultante de la etapa (a) y evaporar el disolvente del filtrado obtenido a presién reducida obteniéndose como residuo seco una oleorresina marr6n de olor caracteristico; (c) disolver la oleorresina resultante de la etapa (b) en acetato de etilo caliente, en una proporcién del 50% p/p aproximadamente y seguidamente dejar enfriar la disolucién hasta la temperatura ambiente durante unas 24 horas aproximadamente, apareciendo un precipitado anaranja- do que se separa por filtracién; (d) secar a presién reducida, el filtrado procedente de la etapa anterior para obtener una segunda oleorresina més oscura que la anterior, cuyo contenido en curcuminoides oscila entre 20 y 25%; recristalizar el precipitado resultante en acetato de etilo al 50% (p/p) aproximadamente, para obtener un s6lido con una pureza en curcuminoides superior al 90%; y porque (II) para la obtenci6n del extracto polar de Curcuma longa se efectéan las siguientes operaciones: (a') someter a un proceso de extraccién con agua los rizomas de Curcuma longa, previamente cortados, secados y pulverizados, manteniéndolos en maceracién durante unas 24 horas a una temperatura comprendida entre 50 y 702 C;WO 96103999 PCT/ES9S/00097 10 15 20 25 30 35 = 26 - (b') filtrar 1a mezcla de extraccién resultan- te de la etapa (a) y evaporar el agua del filtrado asi obtenido a presién reducida, para obtener un residuo que es un s6lido higrosc6pico correspondiente al extracto polar de Curcuma longa; y porque (III) también es posible llevar a cabo las extracciones mediante la técnica de extracci6n supercritica empleando etanol/CO, y a una presién de aproximadamente 260 bar para obtener el correspondiente extracto apolar con una pureza en curcuminoides del 90%; 0 empleando agua como codisolvente en las mismas condiciones para obtener el extracto polar. 2.- Procedimiento segin la reivindicacién 1, caracterizado porque la extraccién supercritica del extracto apolar se efecttéa con rizoma de Curcuma longa secado a unos 509C y triturado a un tamafio de particula de 0,1-1 mm, llevéndose a cabo la extraccién con etanol, modificado con una pequefia cantidad de CO, como disolvente a 250 bares y 508C. 3.- Aplicaci6n de los extractos apolar y polar obtenidos por el procedimiento de la reivindicacion 1, para la fabricacién de composiciones y preparados Gtiles como agentes captadores de radicales, y agentes antienvejeci- miento. 4. Aplicaci6n segin la reivindicacién 3, del mencionado extracto polar, para la fabricacién de composi- ciones captadoras de radicales super6xido. 5. Aplicaci6n de los extractos apolar y polar obtenidos por el procedimiento de la reivindicacién 1, para la fabricacién de composiciones y preparados tiles como agentes reductores de los niveles plasm&ticos de peréxidos lipidicos en humanos. 6.- Aplicaci6n de los extractos apolar y polar obtenidos por el procedimiento de la reivindicaci6n 1, para la fabricacién de composiciones y preparados con efectos