Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

Laboratorio de Biología Molecular presencial 2:

Extracción de ADN vegetal

Objetivos:
General: Extraer ADN genómico vegetal de buena calidad.
Objetivos específicos:
- Conocer las bases moleculares que sustentan los diferentes pasos de cada uno de los protocolos utilizados en
la extracción así como la función de algunos reactivos.
- Familiarizarse con las técnicas y protocolos básicos de extracción de ADN genómico.
- Aplicar las normas de seguridad en el laboratorio (riesgos químicos, físicos y biológicos).

Introducción:

I. DNA vegetal.

El aislamiento y purificación de moléculas de ADN de alto peso molecular a partir de tejidos vegetales presenta
algunas dificultades adicionales respecto a otros organismos eucariotas o procariotas:
a. Riesgo de degradación parcial o completa de ADN por la acción de un gran número de nucleasas endógenas
b. Contaminación con otras moléculas abundantes en tejidos vegetales como polisacáridos, los cuales pueden inhibir
reacciones enzimáticas posteriores
c. Contaminación con ácidos orgánicos, polifenoles, látex y otros compuestos secundarios, lo cual dificulta la
obtención de un ADN puro y de buena calidad e integridad (no degradado).

Dificultades similares pueden también presentarse en la extracción de ADN de muestras como suelo, heces,
alimentos, etc…como las que se emplean en estudios de microbiomas.

Dado que la composición química de los tejidos vegetales varía considerablemente según el tipo de planta, es
prácticamente imposible disponer de un único protocolo para la extracción de ADN de diferentes especies de plantas
(herbáceas, leñosas, entre otras).
Aún al trabajar con especies vegetales relacionadas, se hace necesario realizar modificaciones a los protocolos ya
definidos. Existen en la actualidad numerosos protocolos para la extracción de ADN total, referido al ADN nuclear,
de mitocondrias y cloroplastos. Los protocolos para extracción de ADN a partir de plantas difieren principalmente
en aspectos como la ruptura de los tejidos y células, la composición de los buffers de extracción, procedimientos de
lisis y los procesos para eliminar compuestos como proteínas, membranas, polisacáridos, o polifenoles.
En la mayoría de los métodos de extracción se recomienda que el tejido sea pulverizado con nitrógeno líquido,
utilizando un mortero o dentro del tubo Eppendorf. Es importante no permitir que la preparación se descongele
antes de agregar el buffer de extracción, para aumentar la eficiencia de la pulverización, así como evitar la acción de
las enzimas que degradan el ADN o su oxidación.
También puede emplearse tejido fresco, sin necesidad de usar nitrógeno líquido. En este caso, debe macerarse
directamente dentro del buffer de extracción.
La lisis celular, combina generalmente una acción mecánica utilizando vórtex y calentamiento en baño María, lo cual
también contribuye a desnaturalizar proteínas como las DNAsas y otras fuertemente unidas con el ADN como las
histonas y otras proteínas nucleares.

Etapas generales en la extracción de ADN a partir de tejido vegetal:

a. Lisis de pared y membranas: la lisis de paredes y membranas y la posterior liberación de ADN del núcleo y
organelos ocurre durante o inmediatamente después de la maceración mecánica y homogenización. El buffer de
extracción o lisis generalmente contiene:

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- Detergente catiónico (CTAB) o aniónico (SDS)

- Un estabilizador de pH (Tris generalmente) para mantener el pH del homogenizado a valores básicos, incluso tras
liberación de ácidos orgánicos, y evitar la degradación del ADN por acidez, así como la actividad de enzimas
degradantes (DNAsas).
- Altas concentraciones de sales (NaCl >0.5M) para disociar proteínas nucleares (histonas), y mantener los
polisacáridos en solución durante la precipitación final del ADN con etanol
- Agentes antioxidantes como el β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) o ácido ascórbico evitan degradaciones
oxidativas del ADN.
- Agentes quelantes de cationes divalentes ( Mg++) como el EDTA, que inhiben la acción de DNasas dependientes de
dichos cationes.

b. Remoción de proteínas y RNA: las proteínas son disociadas del ADN y denaturadas por acción de detergentes
(SDS, CTAB…) en el buffer de lisis. Adicionalmente se logra una precipitación gradual de proteínas con altas
concentraciones de sales durante o después de la lisis. También pueden ser utilizados solventes orgánicos como fenol
o mezclas de fenol:cloroformo o de cloroformo:isoamilalcohol para lograr una mayor extracción de proteínas, o
inclusive un tratamiento con proteinasa K. En la mayoría de los casos la presencia de RNA interfiere igualmente en
algunas reacciones, por lo cual muchos protocolos constan de un paso de tratamiento con RNAsa.

c. Remoción de fenoles y otros compuestos orgánicos:

- La albúmina de suero bovina (BSA) y la polivinilpirrolidona (PVP) se utilizan para absorber fenoles, terpenos,
alcaloides y flavonoides presentes en algunas especies vegetales que contribuyen a degradar el ADN por oxidación, o
al quedar copurificados con éste, o que inhiben reacciones enzimáticas posteriores (amplificación por PCR,
restricción, etc…).
- Ácido dietilditiocarbámico (DIECA) actúa como inhibidor de las fenoloxidasas.
- Compuestos antioxidantes como el bisulfito de sodio, la cisteína, el ditiotreitol (DTT) o el ß-mercaptoetanol, son
también utilizados en el búfer de extracción

d. Remoción de polisacáridos: el más comúnmente utilizado es el detergente CTAB. Otro método empleado es la
precipitación alcohólica del ADN en presencia de altas concentraciones de NaCl las cuales mantienen solubles los
polisacáridos.

e. Eliminación de la acción de DNAsas endógenas y exógenas: el empleo de EDTA es universal ya que al quelar los
iones magnesio, se inhibe la actividad de DNasas dependientes de magnesio.
Otras alternativas de extracción de ADN incluyen el empleo de “Kits” comerciales aunque no siempre se logra
obtener ADN de buena calidad.

Prelaboratorio:
Dando continuidad a lo discutido en el ejercicio del laboratorio remoto pasado, investigue para qué sirven cada uno
de los reactivos utilizados durante la extracción de ADN con este protocolo y qué se logra con cada paso.

ADVERTENCIA DE SEGURIDAD: ES INDISPENSABLE PARA EL INGRESO AL LABORATORIO EL USO DE

ELEMENTOS DE PROTECCION PERSONAL (GUANTES NUEVOS; TAPABOCAS NUEVOS; BATA DE MANGA
LARGA), ASI COMO USAR ZAPATOS CERRADOS Y TENER CABELLO RECOGIDO.
ESTOS PROTOCOLOS HACEN USO DE SUSTANCIAS ÁCIDAS e IRRITANTES: MANIPULAR CON CUIDADO
SIEMPRE ENCIMA DEL MESÓN Y LEJOS DE ELEMENTOS PERSONALES COMO CUADERNOS, CELULARES,
TABLETAS o COMPUTADORES.
EL LAVADO DE MANOS SE REALIZARÁ TANTO AL INGRESO COMO A LA SALIDA DE LA PRÁCTICA.
INTENTAR MANTENER DISTANCIAMIENTO DURANTE LA PRÁCTICA.

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MATERIALES Y MÉTODOS
I. Extracción de DNA de brotes de soya:
- Material vegetal: brotes de soya germinados.
- Materiales necesarios: morteros en porcelana, espátulas delgadas, micropipetas, puntas y tubos Eppendorf (1.5 mL)
estériles, toallas de papel, recipientes colectores para desechos líquidos, neveras con hielo.
- Reactivos:
Buffer de Extracción (BE):
Tris HCl pH = 8.0 100 mM
EDTA 20 mM
NaCl 500 mM
SDS 1.5% (p/v)
Metabisulfito de Sodio 20 mM
Acetato de potasio 5M.
Isopropanol frío (grado analítico)
Etanol al 70 % (v/v) frío
H2O milliQ
Equipos: baño María, vortex, microcentrífuga refrigerada
Metodología:
1. Colocar 2 brote de soya en un mortero, y añadir 1000 μl de buffer de extracción (BE) frío (esto es por
persona, si se requiere compartir morteros, multiplicar estas cantidades por número de personas).
2. Macerar rápidamente el tejido vegetal con ayuda del pistilo y por medio de movimientos circulares.
3. Transferir 500 uL del macerado a un tubo Eppendorf nuevo y añadir 250 uL de buffer BE. Mezclar bien, agitando
el tubo vigorosamente (vórtex).
4. Centrifugar a 13 000 rpm durante 3 minutos a 4ºC.
5. Recuperar el sobrenadante vertiéndolo a un tubo nuevo (no es necesario recuperarlo todo).
6. Incubar a 65ºC durante 10 minutos agitando cada 5 minutos en vórtex.
7. Agregar 100 μl de acetato de potasio 5 M, mezclar e incubar en hielo durante 5 minutos.
8. Centrifugar a 13 000 rpm durante 5 minutos a 4ºC.
9. Recuperar el sobrenadante vertiéndolo a un tubo nuevo (no es necesario recuperarlo todo).
10. Añadir 0.6 mL de isopropanol frío.
12. Mezclar por inversión e incubar en hielo por 5 minutos.
13. Centrifugar a 13 000 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
14. Descartar el sobrenadante, eliminando remanente sobre toalla de papel.
15. Lavar el sedimento de ADN con 500 μl de etanol al 70% (v/v) frío.
16. Centrifugar a 13000 rpm durante 5 minutos a 4ºC.
17. Descartar el sobrenadante, eliminando remanente sobre toalla de papel.
Dejar secar bien el sedimento de ADN dejando los tubos invertidos durante 10 min. a temperatura ambiente sobre
una toalla de papel.
18. Resuspender en 50 μl de agua desionizada estéril.
20. Almacenar a -20 ºC y cuantificar por espectrofotometría (DO260).
21. Evaluar calidad mediante electroforesis (se realizará en la práctica de electroforesis).

Referencias:
Dellaporta, S.L., Wood, J. & Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation. Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1
(14): 19-21.
Mc Couch, S.R., Krochert, G., Yu, H., Wang, Z.Y., Khush, G.S., Coffman, W.R. &Tanksley, S.D. 1988. Molecular mapping
of rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 76:815-829.

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Weising, K., Nybom, H., Wolf, K. & Kahl, G. 2005. DNA Fingerprinting in Plants. Principles, Methods and Applications.
Second Edition. Ed. Taylor & Francis Group. 444p.