DAI HQC DA NANG TRUONG DAI HQC BACH KHOA. ——______KHoa H6a BAI GIANG CONG NGHE LEN MEN BIEN SOAN: GV. NGUYEN THI LAN ANH DA NANG, 2021DAI HQC DA NANG TRUONG DAI HOC BACH KHOA. KHOA HOA BAI GIANG CONG NGHE LEN MEN Bién soan: GV. Nguyén Thj Lan Anh DA NANG, 2021MUC LUC MUC 1 Chong 1 LEN MEN: NGUYEN LY VA UNG DUNG... soe 1.1. KHAINIEM LEN MEN VA NGUYEN LY CO BAN CUA! CONG NGHE LEN MEN 3, 1.11. Lénmen 3 4 4 1.1.2, Cong nghé lén men . 12. CACGIAIDOAN CUA QUA TRINH 1.2.1. Giai doan trade lén me 1.2.2, Giai doan lén men... 1.2.3. Giai dogn sau lén men. 13. VAI TRO CUA LEN MEN...... 14. UNG DUNG CUA LEN MEN wooo 1.4.1. San phim trao déi chat so cap ( Bac 1) 1.4.2. San phim trao déi chat thit cap ( Bac 2)... Sinh KhOi vi sinh Vt. o.sccccsseesnser sae San pham tai té hgp. Cae san phdm vi sinh quan trong khdc. Chwong 2. VISINH VAT TRONG LEN MEN 2.1. TIEU CHi CHON GIONG VI SINH VAT KY THUAT PHAN LAP, SANG LOC VI SINH VAT THUAN CHUNG 13 . Ky thuat phan lap..... 4 Phuong php phan 1g 15 KY THUAT CAI TIEN, TAO GIONG VI SINH VAT TRONG CONG NGI 17 Tai t6 hop di truyén hoge chuyén gen...... 17 . Dot bién...... ssenenennntenenenennnenenenennnennneniesess seseneneneete ID Kj thugt di truyén 22 NHAN GIONG VI SINH VAT ; esnnnnnnniesnnnnnnnsnnsinnnsenn DD KY THUAT BAO QUAN GIONG VI SINH VAT 23 . Bao quin 6 nbiét 46 thap 24 Bao quan 6 dang tach nude. seonnnnnnnseennnntnesnnsnnnnseee 2 2.5.3. Quan ly chat lugng cia céc chiing gidng bao quan. 26 Chwong 3. MOI TRUONG DINH DUONG CHO VI SINH VAT TRONG LEN MEN CONG 21 Tidu chi lua chon méi trung lén MEN... neon seven BT 3.1.2. Vai trd eda méi trading lén men... 28 3.1.3. Phan loai méi truéng lén men. 28 3.1.4, Yéuté can thiét khi thiét ké méi trang lan MeN... esses ssecessesesnecenneeenneeenneeees 30. 3.2. THANH PHAN CUA MOI TRUONG: 30 3.2.1, Nuée evtnntnnnnnnsinnnnnnsnnnnsnnnne SL 3.22, Ngudn ning long va dinh dung s....0ssooswsnnovovnnnnnrsenennnnsonesnconnne 3 Céc nguén nito chinh 33 3.2.3, Cac nhan t6 ting trr6ng.......ccsecssssssessisessssnsssnsssneseeunseennseenseennsenneenneeenseeees 36 3.2.4. Chat dém pH 36. 3.2.5. Chat tién than 37 3.2.6, Chat kim B&m....cccssotsnennenaneneneninnennnennannnennananeneennennnennenenens $7 3.2.7. am t 38 3.2.8, 393.3. GIGLTHI J THANH PHAN MOT SO MOI TRUONG LEN MEN TRONG CONG NGHIEP TIEU BIEU 39 BiB, Ngudn carbon.......cssssesssssesssuesssiesesissssnsesisssinssennssennsernseenseesnseesnneeenseeesseeees 40. 3.3.2. Nguén nito 41 Chuong 4 KHU' TRUNG TRONG LEN MEN CONG NGHIEP ... seeeeeeanee 44 4.1. LY DOCAN KHU TRUNG THIET BI VA MOI TRU 44 4.2, PHUONG PHAP KHU TRUNG. 45, 4.2.1, Phuong phap vat ly. 48 4.2.2. Phuong phap héa hoc. 43. KHU TRUNG MOI TRUONG VA THIET BI 51 43.1, Khir tring méi tradng....... sonnnnnnninninsnnnnnsnnn SL 43.2. Khir tring thiét bj én men va he thong truyén din 54 4.3.3. _Kiém tra trang thai vé tring. 54 Chwong 5 THIET BI LEN MEN 56 5.1. MOT SO YEU CAU TRONG THIET KE VAL 56 5.2. THIET BI LEN MEN MOI TRUONG LONG 56 5.2.1, Hé théng lén men c6 khudy 790... senses SB 5.2.2. Binh lén men c6vbong béng (column/ bubble fermenter! bioreactor) 62 5.2.3. Hé lén men vong (loop fermenter)... sotensnnniininnnsennnnssenss OB 5.24. Hg lén men ed dinh sinh hoe (packed-bad bioreactor). 64 5.2.5. Hé lén men quang sinh hoc (photo bioreactor) 65 5.3. HELEN MEN CHAT RAN 5.3.1. Hé théng lén men khay 5.3.2. Hé lén men cé dinh vi sinh vat ........ 5 H6 lén men dang tréng quay va tréng khuay...., 5.3.4. Hé lén men cé trén va sue khi cudng bite 5.4, LUU Y TRONG THIET KE VA VAN HANH HE THONG LEN LEN. 2 Chuang 6 THU. HOI, TINH SACH VA HOAN THIEN SAN PHAM SAU L 76 6.1. THU HOI SAN PHAM. 76 6.1.1, Phuong php logi bo 18 ih vat va chat rin 1 6.2. PHUONG PHAP VA KY THUAT TINH SACH SAN PHAM 84 6.2.1. Gidi thigu chung 84 6.2.2. Giai doan dau cia tinh sqch sin phim ....00nsssesonsonsoone sevens BS 6.2.3. Tinh sach sin pham bang ky thuat sic ky 95 63. KY THUAT HOAN THIEN SAN PHAM......ocs:nsnnnunnnnsnnssnnnnnns 99 63.1, Kéttinh 100 63.2. Sdy 101. Chong] LEN MEN: NGUYEN LY VA UNG DUNG. 1.1. KHAINIEM LEN MEN VA NGUYEN LY CO BAN CUA CONG NGHE LEN MEN 11.1, Lénmen Khdi nigm chung ciia Ién men 14 qua trinh chuyén héa trong té bao ciia vi khudn, nam men hode cdc vi sinh vat khac dé chuyén d4i cc thite an hitu co thanh cdc chat don gian va ning hong (ATP) can thiét cho vi sinh vat. Trong linh vue thre phim, lén men la qua trinh chuyén hod cée hydratcarbon (tinh b6t, duéng...) duéi tac déng cua vi sinh vat (théng qua hé enzyme) dé tao ra cdc sin pham nhuw bia, rugu, acid hitu co, nim men banh mi,... va giai phéng ra cdc khi va cdc chat khac nhau, (Qué trinh 1én men ¢6 ¥ nghia khée nhau trong nganh héa sinh va vi sinh hoe céng ny Trong héa sinh, lén men lién quan dén viéc tao ra nang lugng bang sy dj héa cia céc hgp chat how ca, con trong vi sinh hoc céng nghiép, ¥ nghia ctia né c6 xu huéng rong hon nl Lén men eting duge sit dung rong rai hon trong su tang sinh khéi ciia vi sinh vat trén méi trudng sinh truéng, sy tich Idy cdc san phim trao d6i chat hitu ich cho con ngwdi trong qué trinh, nudi cy vi sinh vat ‘Vi sinh vat sir dung m6t sé con duéng trao déi chat, dé chuyén hoa glucose va cée duéng khdc thanh céc sin phdm trung gian la cde acid pyruvic, sau dé cdc phan tit nay lai tiép tuc bi oxy hod cho cdc chu trinh chuyén hod tiép theo. Trong cdc chu trinh chuyén héa, chu trinh Embden- Meyerhof-Parnas (EMP) va dic biét 18 chu trinh Krebs ¢é vai trd trong tm vi nhiing chu trinh nay dap img dur ye cae yen cu vé ngudn nang lugng, nguén carbon va nguén cac chat hitu co 1a nhing 6 rat can thiét dé duy tri cdc hoat dong song cila té bio. Pyruvic acid chinh ld san phim 6 trung gian quan trong nhat trong qué trinh hé hap hiéu khi cing nhu yém khi. Sau d6 hai qué trinh di theo hai huréng khde nhau (hinh 1.1). ‘Trong diéu kién hiéu khi, su oxy héa acid pyruvic xay ra do su chuyén dién tir théng qua hé théng cytochrome tao thanh CO2 va H20, trong dé oxy déng vai trd chat nh4n dign tir cudi cing, Trong diéu nay dign ra cing vai sy khir cia mot hgp chat hitu co ma thudng la san pham trung gian eta qua trinh phan giai. Déi véi hoat dng cia ndm men trong méi trudng dich chiét qua va dich e! malt, NADH duge hinh thanh bing sy khit acid pyruvic thanh ethanol. Cac ching vi sinh vat khac nhau c6 kha nang khit pyruvate thanh mét loat cde san phim cuéi cing khdc nhau va rat da dang, Qué trinh dé duge minh hoa tom tit hinh 1.1. in yém khi, acid pyruvic 6 thé 1a cht nbn dién tir cudi cing va qua trinhDefiuctose 16 bisphosphate Glyceraldehydes- 3-phosphate 77 xav- \ nape saps sgn NAD@)} NAD(P)H Dinyoloxy-acetone- phosphate 7 NAD NADH Glycerol phosphate Glycerol Hinh 1.1. Con ducing chuyén héa glucose 6 Saccharomyces cerevisiae ‘Thuat ngit lén men trong sinh héa 1a qua trinh sinh nang Iugng trong dé cée hop chat hau co déng vai trd vira 1a chat cho vita Ia chat nhan dién tir, ‘Thuat ngir trong vi sinh hoc, lén men la qua trinh chuyén hoa co chat ctia cde té bao vi sinh vat kém theo su phat trién sinh khdi va tong hop ec: pham trao ddi chat. Qua trinh nay da duge thurc hign tir rét lau va tao ra san pham trao déi chat tir vi sinh vat. Céc nha vi sinh hoc cong nghiép d& m6 rng khai nigm ctia qué trinh Ién men dé mé ta bat ky qué trinh san xuat ndo ma san pham duge tao ra nho nudi cdy vi sinh vat. Tir dé cé céc khai niém nhw lén men hiéu khi néu nhu qua trinh nuéi cy vi sinh vat dign ra trong diéu kign cé oxy, va lén men ky khi néu nhu qué trinh nudi vi sinh vat dién ra trong diéu kign khéng c6 oxy. Lén men cing duge xay ra trong hé tigu héa cla nguai va déng vat. Héi chimg nha may bia cing da gap khi da day chira nam men, ching lén men trong ruét co chat tinh b6t, dudng thanh cén di vao trong mau ma gan khéng cé kha nang phan giai, gay nén hién tuong mét méi, chong, mit, ruét kich img (hdi chimg hiém gap). 1.1.2. Cong nghg lén men ‘Céng nghé lén men 1a qua trinh chuyén héa co chat dudi tac déng ciia vi sinh vat dé tao ra cdc san phim cé gid tri thuong mai & quy mé Ién. 1.2. CAC GIAI DOAN CUA QUA TRINH LEN MEN (Qué trinh Ién men nao ciing duge chia thanh 3 giai don chinh (hinh 1.2). ~ Trude lén men (upstream process - USP); Lén men (fermentation, production product);~ Sau lén men (downstream process). 1.2.1, Giai doan truée lén men. ‘Cac céng doan cn chuan bi la: - Xae dinh céc thanh phan cia méi truong duge sit dung dé nudi cay vi sinh vat qué trinh lén men, Khir tring méi trudng, thiét bj va dung cy Ién men; ir dung cho = Hoat hoa gidng géc sau dé nhan gidng thu dug sé long vi sinh vat di lon dé cdy vao thiét bj 1én men, Méi trudng nuéi cay, lén men cé thé 1a 1m cA méi truéng tang sinh (nhan ging tao sinh khéi ban dau) va méi trudng lén men. M@i trudng tang sinh yéu eau tong déi khat khe vé dinh dudng, sao cho vi sinh vat phat trién nhanh nhat trong khoang théi gian ngdn. Méi truéng lén men [i méi truémg cde vi sinh vat sinh truéng, phat trién va tao ra cdc sin phim trao d6i chat mong muén, méi trudng nay yéu cau vi sinh vat phai sir dung duge cc nguén carbon va nito ré tién, c6 thé la san phdm thai ciia quy trinh céng nghiép nhu ri duéng, san pham phan giai ciia protein (peptone, peptide...), muéi ammone, nitrate, nit phan tir, purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide. Trude khi lén men, vi sinh vat tao ra san pham mong muén phai duge chon lgc, cai tao (néu can) va nudi cdy dé tao duge chat Iuong va sé luong dap img yéu cau thuong mai. ‘TRC LEN MES T TEN MEN T SAU LES MEN UPSTREAM PROCESS ' [FERMENTATION ' DOWNSTREAM PROCESS Pe - A) [ona enas Ging née Binh ie Binh nin ging Di ati Hinh 1.2. So dé tong quét cho qué trinh lén men dién hinh 1.2.2. Giai dogn lén men. Giai doan nay can thiét lap diéu kign ti wu dé cho vi sinh vat sinh truéng phat trién tao ra nhiéu san phim nhat bao gém tdi wu héa cdc yéu t6 vat ly, hoa hoc nhu nhiét d6, pH, lugng oxy, thanh phan dinh duéng (nguén carbon, nite, khoang...) cla méi truéng lén men. Dé duy tri cdc didu kign nghiém ngat nay, vi sinh vat duge nudi trong cdc binh lén men (bioreactor). Dung tich cia binh lén men cé thé thay ddi tir 10 lit dén 100.000 lit tay thuéc vao san phim cudi cing mong,6 muén, Ngoai ra eting c6 nhiéu logi binh Ién men dung tich nhé hon phye vy cho quy mé nghién iru trong phong thi nghiém. 1.2.3. Giai dogn sau lén men. ‘Thu hdi va tinh sach cae sn phdm lén la mét trong nhig Khia canh quan trong nat cua qua trinh 1én men eéng nghigp. Vige Iya chon quy trinh thu héi va tinh ché phii hgp phy thude vio ban chat ciia san phdm cuéi cing, néng 46 cia ching, sin phim phy hign tai, tinh én dinh cua sin phim va mite d6 tinh ché. Tuy nhién. Giai doan nay cé ba phan chinh: - Thu héi dich hoe sinh khéi; - Cé die va phan doan; - Tinh sach. Bang 1.2. Céc phn co ban the hign sau lén men Phan toai Phan thye hi Phuong phap Dich lén men Loai bé sinh khdi va cac chat can khac | Ly tam, I9c, lang, sang Sn phim thé Két tia va phn doan Chi, tra0 dBi ion, hép phy, Két tia, chung ct ‘San phim tinh Tinh sech ‘Sde kj, chung et, Khir mu, KEL tinh, Iam Kho ‘Thu hdi san pham 1a qua trinh phic tap do san pham tao ra thuémg & ndng d6 thap trong hn hop da dang. Day thuc chat la qua trinh lam ting néng dé va tinh sach chat mong muén nao dé. Tinh tan cia sin pham thé anh hudng rat lén dén tinh chat va phuong phép thu héi. Dung dich chat hda tan cao (cé higu qua kinh té hon) sé cé d6 nhét va 4p suat tham thdu Ién (khé khan, vé mat ky thuat hon). Quy trinh thu hdi va tinh sach chat duge Iya chon can phai nhanh, don gin, chinh xc v. aid thanh thdp. Gid thanh thu hdi sin phim trong thye té e6 thé chiém ti hon 50% gid thanh san pham. Gia ban sé phy thugc rat nhiéu vao chi phi cia phuong phap/céng nghé str dung trong giai doan nay. 1.3. VALTRO CUA LEN MEN ‘Lén men thuc phdm da duoc ap dung ti rat lau dai trén cdc nguyén ligu rau, qua, thit, sita. Nhé c6 téc dng cia hé vi sinh vat, nhimg thay déi sinh hoa duge dién ra va lam thay doi dang ké vé tinh chat ctia thuc phim. Thue phim lén men thudng cé nhiéu loi thé so véi nguyén ligu thé ma ching duge tao ra Hai qua trinh 1én men phé bién va phat trién rong nhat la lén men lactic va lén men rugu. Lén men lactic duge thye hign béi mhiéu vi khudn, thu’mg do vi khuén lactic nhur Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides... The pham duge san xuat bang lén men lactic bao gm sita chua, phomat va rau qua mudi chua. Cac loai dau ngoai lén men nhé vi khuan lactic con durge lén men nhé ndm méc Aspergillus oryzae dé lam tuong, hay vi khuan Bacillus natto dé lam nato. Lén men rugu duge sit dung két hgp ciia cdc loai nam méc Mucor, Rhizopus va nam men dé l&n men cae loai ngii céc tao ra cde dé udng chita cén. Nam men cdn duge tmg dung dé u vei Gt my tng dung trong sin xuat cdc logi binh.Qua trinh lén men cé tac dung cai thign tinh chat cia nguyén ligu ban dau cé thé ké dén nhu: - Tang huong, vi, két cdu cho san pham thye phim; - Tao su da dang thuc pham theo khdu vi riéng cia timg dan t6c: - Kéo dai thdi gian bao quan do san pham chia lactic acid, acetic acid, cn... [am giam pH hay tao chat sat khuan, tre ché duge sy hoat dong va phat trién ca cde mam gay bénh; - Tang cursng chat dinh dudng, chat rin héa tan théng qua viée tao ra amino acid, vitamin; - Lam giam cac chat phan dinh duéng, chat gay di img hod ting cuéng kha nang str dung, sin phim sita déi véi nhiing ngudi khéng dung nap durge duéng lactose; - Tang cuémg kha nang dé tiéu héa cua thye pham; = Cé thé cung cdp thém cac vi sinh vat cé loi cho hé vi sinh vat duéng rudt; “6 thé sinh ra cae chat khang khuan sinh hoc an toan nhu nisin, drge tmg dung rong ri nhu chat bao quan sinh hoe, UNG DUNG CUA LEN MEN ‘Trai v6i tu duy la vi sinh vat thug cé hai cho con ngudi, phan Ién cdc vi sinh vat déu v6 hai hog tao ra cae san phim 6 lgi cho con nguai. San phdm céng nghé lén men dya trén tg dung ctia vi sinh vat da hién dién trong nhiéu linh vue ciia cudc séng nhu y té, thuc phim, néng nghiép, céng nghiép héa chat, méi truéng. Cac sin phim nay e6 thé duge phan logi thanh bén nhém chinh (Bang 1.3). Bang 1.3. San phém tit vi sinh vat cé tam quan trong trong céng nghiép Phan logi ‘San phim Enzyme, amino acid, nucleotides, acid hou ec, ethanol CChat chuyén héa so ep (sn phim chinhy | EMME ‘Chat chuyn héa thir cp (san phém phy) _[ChAt khang sinh, gibberellins, hormones, chat mau, alkaloid ‘Nim men tong e6ng nghigp lam banh, protein den bao (SCP)| ‘Sinh khdi vi sinh vat problole, vacee Ingulin, streptokinase, interferon, interleukin, hormone tang) ‘San pham tai t hop tnvéng, vaccine 1.4.1. San pham trao déi chit so cp ( Bac 1) Cang véi cdc giai doan tang truéng, sy thay déi trong qua trinh nudi cay mét ching vi sinh vat c6 thé duge mé ta thong qua sin phdm ma ching sinh ra trong pha khe nhau cia dung cong ting trdng, G pha log, sin phim duge sinh ra chii yéu la phue vu cho ting trudmg cia té bao, bao g6m cdc amino acid, nucleotide, lipid, carbohydrate... Nhiing sin phim nay duge xem 1a sin ip cia sy trao déi chat, pha nay durge goi la trophophase - pha sinh trudng (hinh 1.3a), Rat nhiéu san pham so cap c6 gid tr kinh té cao va duge san xuat bang phuong phdp lén men. Su ting hop cdc chat trao ddi so cp ching vi sinh vat hoang dai chi di cho nhu cau trong té bio cia chiing. Do vay, nhigm vy cia ede nha vi sinh vt hge cng nghigp la phai lam sao cai bién céc ching nay va cung cy cin thiét dé cai thign nang suat sinh téng hgp ede chat nay. 1.4.2. San phdm trao déi chat thit cp ( Bac 2) Trong pha én dinh, mét sé ching téng hop ra cdc hop chat ma ching khéng ting hop duge trong pha log, cdc chat nay khéng cé vai tro ré rang déi véi qua trinh trao déi chat cua té bao va8 ching duge xem 1a chat trao déi thir cp, va pha nay Boi la idiophase - pha sin xudt (hinh 1.3b). Vi sinh vat tang truéng trong mai truvng ty nhién 6 tc a6 thép khién ngwoi ta cho ring, tong ty nhign thi idophase chiém wu thé hon trophophase. Khéng phai toan bé vi sinh vat déu c6 trao déi chat thir cdp. Truéng hop vi khuan Enterobacteriaceae thi khéng tim thay ¢é san pham thar cdp. Dai khi rat khé dé phan biét mét san phim Ia so edp hay thit efp va ding hge sinh téng hgp ela nhing hgp chat nhat dinh ¢6 thé thay bi tiy thude vao ca digu kin nudi c: Thi gan —> Sé tong bio Tit gan Sin phim sb togng tbo Hinh 1.3: Méi twong quan gitta sy phat trién vi sinh vGt va san pham chuyén héa (@) chuyén ha so cp, (b)chuyén hoa thir cp Vai tro sinh ly cia trao d6i chat ther cp trong cde 16 bao vi sinh vat durge tranh lun nhigu, nhung nguéi ta quan tim su sic hon vai trd quan trong cua cée chat trao d&i trung gian. C5 nhiéu chit trao d6i thir cp cé hogt tinh khang khudn, 1d ede enzyme ite ché, mét s6 chat thic ddy ting truéng va nhiéu chit cé duge tinh. Do vay, sin phim ctia bién duéng nén co sé cia nhiéu qui trinh len men khée nhau ing nhu trudng hop d6i th cdp da hinh think i cac chat trao doi so cdp, cdc ching vi sinh vat hoang dai cé Khuynh huéng ting hop cae chat trao déi thir cdp véi néng dé thap va su ting hop nay duge ki phan héi Bang 1.4. So sénh sw khdc nhau git n soat boi su cam img, su ite ché di héa va hé théng, sdn phim trao doi so cap va thit cap So sinh ‘San phim trao 46i so cp ‘San phdm trao 46i thir cp Y nghia Burge tao ra a8 thuc hign chite nang sinh Iva hé tro sy phat trién cua té bao duoc g9i a cdc chat chuyén héa chink La san phm cubi cing qua Wink chuyén hod so ep, khéng cn thiét cho sy tang trvéng va duy tri chire nang cia #8 bao Giai doan chuyén ho Pha sinh truéng Pha san xudt Giai doan sinh trusng té bao Pha phat tién Pha én dinh Buge san xudt voi s6 lwong én, Khai ‘Buge san xudt voi sé luang nhé, va ‘San phdm chinh déng vai tr quan trong trong tang truéng, va phat trién té bao. San wuat thae rt a dang. kina thdc kh6 khan, Phan bd Giéng nhau & moi joa c6 nahia'& chiing | Kae nau 6 cdc loai Khée nhau. {a0 ra cae san phém ging nau. ‘uge sir dung trong cde nganh cng | - Chat chuyén héa thir ep nhu khang Vaitro Iighigp voi muc dich khac nhau. sinh, gibbereli ~ Gian tiép hd tro té bao, duy tri su séng trong mét thai gian dai. 1.4.3. Sinh khdi vi sinh vat.Céng nghiép san xuat sinh khdi vi sinh vat thuong mai cé thé duge chia thanh hai quy trinh chinh: (1) sin xuat nim men duge sir dung trong nginh céng nghiép banh mj, va (2) san xuat té bao vi sinh vat duge sir dung lam thite an cho con ngudi hoe thite &n chan nudi (protein don bao). ‘Nam men banh my duge san xuat trén quy mé Ién tir dau nhitng nim 1900 va nam men duge sin nhu thye pham cho nguéi & Dire trong Chién tranh thé gidi thir nhat. Tuy nhién, dén nhimg nam 1960, viée san xuat sinh khdi vi sinh nhu la m6t ngu6n protein thyc pham méi duge khai thic va phat trién manh mé. Nam 1970, céc quy trinh lén men lién tue theo qui mé céng nghiép da i vi sinh vat phye vu lam thite an chan nuéi. Bang 1.5. San xudt sinh khéi vi sinh vat ‘San phdm Visinh vat ng dung Nam men banh my Saccharomyces cerevisae _| Sin xuat ban my, Protein don bao Pruteen “Methylophyius methylotrophus [Protein don bao Protein téo Spirulina Spirulina maxima Protein don bao Chat gc sinh hoe Thiobacilus ferrooxidans __| Hoa tan kim loa tt quing Thue dist cbn ting sinh ge | Bacilus thuriengensis Kim soat ebn tring Sinh khéi vi sinh vat cé img dung céng nghiép dugc liét ké trong bang 1.5, dién hinh la viée san xuat cdc protein don bao. Trong thuc té, toan bé té bao cia Spirullina (mdt loai tao), Saccharomyces (m6t loai nam men) va Lactobacillus (m6t loai vi khuan) duge sit dung nhu nguén protein don bao giau amino acid nhur lysine, threonine, methionine, leucine, isoleucine 1.4.4. San phdm tai té hop. Su phat trién cia céng nghé DNA tdi to hop da mé rong tiém nang img dung cia cOng nghé Ién men, tgo ra cde sin phim lén men kha nhau phuc vu cho cudc séng eta con ngudi (bang 1.6). Bang 1.6 . Cac chdt tdi té hop quan trong trong cong nghigp Gen Nguén géc Gen thé hign trén ‘Si dung Insulin Tuy ngudi E. coll, Pichia pastoris Kiém soat tigu duéng Chymosin Da day bé E. coli ‘Sn xudt phomat Hormone tang trvéngnguéi | Tuyén yén nguéi E.coli Tang truéng chiéu cao Chat lam dong mau (clotting [18 bao mau S. cerevisae, Pichia pastoris | Ngan chay mau Chat hoat héa plasminogen mé | Té bao mau S. cerevisae, Pichia pastoris | Tan huyét khéi Sueptokinase Swopiocoesus | pena pastors Tan mpl Gen ciia sinh vat bac cao c6 thé sé duge dua vao té bao vi sinh vat va cdc ching nay cé kha nang téng hgp ra cdc protein ngoai. Cé nhiéu ching vi sinh vat khéc nhau duge ding lam té bao chi cho nhing hé théng. gém E. coli, S. cerevisiae va céc nam sgi, San phim duge sinh ra tit chiing duge bién déi di truyén nhu trén gdm: interferon, insulin, albumin cia huyét thanh ngudi, cée nban t6 ting truéng biéu bi, chymosin ciia bé, somatostatin cila bd. 1.4.5. Cae sin pham vi sinh quan trong khac. Ngoai cac san phim vi sinh da dé cap 6 trén, tir bang 1.7 dén 1.11 sé cho thay nhimg ing dung cua vi sinh vat va san phim cia ching trong linh vue thuong mai.1.5.5.1. Enzyme tie vi sinh vit. 10 Enzyme duge tong hop tir vi sinh vat phan lén duge tg dung trong thye pham va nganh céng nghigp lién quan (bang 1.7, bang 1.8). Qué trinh nudi cay vi sinh vat dé sin xudt enzyme duge kiém soat chat ché, Ngdy nay, mgt s ky thuat sinh hoe phan tt durge str dung dé tang cuong ig sudt san xudt cia ching nhu tang cudng chit cam img, dét bién gen, ky thuat tai té hop gen. Bang 1.7. Enzym cong nghigp tic vi sinh vt sit dung voi luyng lin Rhizopus Enzyme Visinh vat Ting dung Protease Bacilus, Lactococeus, ‘San xudt chal ty rira sinh hos, san xudt bia, san xual phomat “Aspergilus, Rhizomucer _| lam mém da, lam mém tht, thu héi bac ti trang phim anh Upases Bacilus, Aspergillus ‘San xudt chat ty ria sinh hoo, loal bo chat bao trong qua trinh Rhizopus, Rhodotorulla _| thu6c da, lam chin va tang huong cia phomat amylase Bacilus, Asperailus ‘San wut chdt ty ria sinh hos, thay phim tinh bolrong aud tinh lam bia, banh my, ang dung trong céng nghiép dét may Bamylase Bacillus, Streptomyces, | Thay phdm tinh bat rong qué tinh lam bla, banh my, san wut siro maltose Glucoamylase ‘Aspergillus, Rhizopus Thy phdm tinh bot trong qué trinh lam bia, Banh mj, san xut siro glucose, ruvgu vang va nuée qua Lactase (B-D- galactosidase) Bacillus, Kluyveromyces, Candida ‘San xudt siro whey, stra va san phim ché bin sita, sén xudt kem ‘Glucose isomerase ‘Actinoplanes, Arthrobacter, ‘Sdn xudt sio fructose néng a cao Bacillus Streptomyces Invertase Kuayveromyees, ‘San xu cht tao ngot va ede san phim banh Keo nhu san Saccharomyces phém o6 sdcéla mém & trung tam Peatinase ‘Aspergilus, Peniclium | Chun bi dich qua, chit wuBt du va dich ta thyc pharm, lon mon cate Galllases Tricoderma, Peniclium, | Ghé bin 661 98, ché phim nube ép qué, mach nha Hemicelulases Cryptococcus, Trichosporon ‘GhE bign 66t GB, san xudt bia, the Gn gia slic, chat dinh duvéng Catalase ‘Aspergils, Micrococcus | Tay wang hang dé, ché bign photmat Corynebacterium, Phylase Pichia ‘San wut thie an chan nubs BB sung Urease Tactobacitus San wudt wou vang, sin xubt gm Peniilin @ Ecol, Basis ‘Ghuyén ha sinh hos peniallin G thanh €-amino penicllanie acid acylase Bang 1.8. Ung dung vi sinh vat trong lén men thuc phim va dé uéng San phim Visinh vat ng dung Enzyme cho a® ung 6 cBn nhir bia, nygu vang, rugu whisky: amylase Bacilus, Aspergilus ‘Thiyy phan tinh bot B-amylase Bacillus, Streptomyces, Rhizopus | Thy phan tinh b6t Glucoamylase Aspergillus, Rhizopus Thay phan tinh bot Protease Aspergilus niger Ngan ngwa sw hinh thanh chat gay duc ‘Glucose oxidase Aspergilus riger Loaibé oxy wong bia ‘cid acetic (gid) ‘Acetobacter aceti, Gluconobacter | Chuyén héa nrou thanh acetic oxydans acidSan phim Vi sinh vat Ung dung Stra chua ‘Streptococcus thermophilus, Hinh thanb lactic acid Lactobacillus delbrueckii Phomat ‘Streptococcus thermophilus, Hinh thanh latie acid, chat tao Lactobacillus, Lactococcus, huong va lam én dinh phomat Propionobacterium, Penicilium Probiotics Lactobacillus, Saccharomyces | Tang cwéng hé mién dich, dieu corevisae, Bifidobacterium hoa hé vi sinh vat duréng rut Banh my ‘Saccharomyces cerevisae, Lam phBng né banh my Rau muéi chua Lactobacillus, Leuconostoc Hinh than lactic acid plantarum Bang 1.9. Ung dung cia vi sinh vat trong san xudt phu gia thc phim va chat bd sung ‘San pham Visinh vat Ung dung Glutamic acid, Lysine | Corynebacterium glutamicum | San wuat chat BB sung cho thre an chan B-carotene Biakesiea tispora ‘San wud chat mau sinh hoo Astaxanthine Mycobacterium lacticola ‘San wut chat mau sinh hee Vaniln ‘Saccharomyces spp. ‘San ua chit tao hong Monosodium glutamate | Corynebacterium glutamicum | San xuat chdt tao vi Ascorbic acid ‘Acetobacter suboxydans ‘San wut vitamin © Riboflavin ‘Ashbya gossypii ‘San ut vitamin Bie Citic acid Aspergius niger San wat Acid Xanthan “Xanthomonas compesiis | San xudt chat lam dae va On Ginh cho the phim Nisin Lactococcus lactis ‘San xudt chat khang Khuan 15.5.2.Vi sinh vit an toan. D6i véi bat ky vi sinh vat nao duge sit dung & cap d6 thuong mai, diéu bit bude 1a khong duoc gay bénh va sin phim tinh ché cuéi cing khéng duge cé chit déc hai. MOt sé vi sinh vt da duge phan loai la GRAS (Generally Recognized As Safe - thutng duge coi la an toin) (Bang 1.10), Bang 1.10. Vi sinh vit an toan (GRAS) Vi khuan Nim men Nim soi Bacillus subtilis Candida utils Aspergilus niger Lactobacillus bulgaricus | Kluyveromyces marvianus | Aspergillus oryzae Tactobacilus lactis ‘Kluyveromyces lactis ‘Mucor javanieus Leuconastoc osnos ‘Saccharomyces cerevisae Penicilium roqueforti Co quan chtte nang khéng cin cp phép khi sir dung vi sinh vit GRAS 6 cp d6 cong nghiép, mién 1a cdc vi sinh vat nay duge nudi edy trong cde diéu kign quy dinh, ll12 Chwong2 VI SINH VAT TRONG LEN MEN 2.1, TIEU CHi CHON GIONG VI SINH VAT DUNG TRONG LEN MEN CONG NGHIEP- ‘Trong [én men céng nghiép, ngoai digu kign cén c6 mét quy trinh céng nghé hgp ly thi van 4 giéng la khdu quan trong, quyét dinh gid tri kinh qué trinh sin xudt. Giéng vi duge sir dung trong lén men céng nghigp la mét phé réng rai gdm nhiéu loai nhur vi khudn, xa Khuan, vi khudn lam, nam men, ndm méc, téo. ching vi sinh vat duge coi la gidng tét trong san xudt can phai cé nhiéu dac diém uu vigt r6 rét. Trude hét ching phai cé kha nang sinh tong hgp manh m6t chat nao d6 hay tao sinh khéi voi higu suat cao, ngoai ra con phai héi tu duge nhing die diém sau: phai thudn, khéng chita vi sinh vat gay nhiém khdc; - Khong hod rit it bi bién ddi dac tinh trong qua trinh san xuat lau dai; - Cé kha nang tao thanh san pham véi nang suat cao, chat long tét, khéng tao ra san pham phu khéng mong muén; - C6 kha nang str dung higu qua nguén nguyén ligu. sm va ré tién; = C6 kha nang tach dé - Khéng min cm vo ig té bao hay san pham tgo ra trong qua trinh lén men.; vi sinh vat tap nhiém va thye khudn thé; = Cé kha nang thay déi dic tinh bing cdc ky thuat dét bién, ky thuat gen dé khéng ngimg nang cao nang suat; - Khéng chtta dc tinh, on giéng khéng phai bao gid cing dap img day du cdc tigu chi trén, vi du khi kich thud té bao lén thi dé tach ra khdi dich nudi cay nhung hoat tinh lai khéng cao (cudmg dé trao d6i chat ciia vi sinh vat thuéng ti 1é nghich véi kich thudc té bao). Tuy nhién, khong phai cdc tiéu chuan trén luén luén gan lién voi nhau va cing ton tai 6 d6i tuong vi sinh vat nao 46. Cac vi sinh vat thuéc nhém nhan chun hau hét cé kich thude té bio lén hay da bao dang sgi. Do vay, viée tach ching khoi méi trudng dinh duéng rat dé dang bang cc phuong phap Ioe, ly tim thuéng. Mae di vay, 6 nhém vi sinh vat nay thudmg t8n tai mgt quy luat chung - dé 1a kich thude té bao ti 1é nghich vdi hoat tinh trao déi chat. Dé cé gidng vi sinh vat cé hoat tinh cao, ngudi ta phai tim céch hoan thién kiéu gen bing cach chon loc, lai tao, gay d6t bién trong vat chat di truy: trao d6i chit. Trong vai thap nin gén day, ky thudt di truyén hign dai da duge sir dung dé tao ee ching giéng 68 nhimg dic tinh mong muén mot eéch cha dng, vi vay, edie ching giéng duge diing trong cng nghigp ngay mt hoin hao hon, dap img tt hon yéu cau cia con ngudi “Trong sin xuit, vige hoat héa gidng va thudmg xuyén kiém tra chat lung gidng la digu hét site cn thi nu sau: éi véi céng téc gidng, can phai liu ¥ cdc phan vig ~ Kidm tra d6 thudn khiét cia gidng tude khi lén men; - Kiém tra kha ning héi bién cia giéng. Hau hét cdc ching vi sinh vat ding trong céng nghiép déu 1 nhimg ching dot bién. G cde ehiing dot bién, kha nang hdi bién (tré vé tinh chat cla ching gc) la hign twong rat hay xay ra;- Hoat héa giéng sau mdi théi gian sir dung. Dé hoat héa giéng, nguoi ta sir dung méi trudng 6 thanh phan giiu cée chat kich thich sinh truéng nhu dich cao ndm men, nurée chiét ca chua, hén hop vitamin, acid béo; - Gitt giéng bing nhimg phuong phap thich hop dé cé thé duy tri tinh chat cn cé ciia ching gidng 2.2. KY THUAT PHAN LAP, SANG LOC VI SINH VAT THUAN CHUNG Nganh céng nghigp lén men da khai thae sur da dang hé vi sinh vat bang ech phan lap cée ching tir méi truéng tw nhién dé tao ra sin phim cé gid tri thuong mai. Thai ki hoang kim vao nhiing nm 1950-1960, khi cde nhém khang sinh da durge thu nhgn ti vi sinh vat dat va hign dang duge sit dung cho dén ngay nay. Sang loc cé hai bude 1a sang lc so cp (primary screening) va sing loc thir cap (secondary sereening). Sang Igc so cp cho phép Jogi bé nhiéu vi sinh vat khéng c6 d3c tinh quan tam, ding, thai cho phép phat hign dé dang vi sinh vat hitu ich c6 trong quan thé véi s6 luong rit it. Sang loc so cdp xéc dinh vi sinh vat nao c6 thé tgo ra hgp chat ma khdng cung cp nhiéu ¥ tuémg vé tiém nang sin xuit hoe nang sudt cia sinh vt. Cée bude thy hign co ban gém: mau duge thu thép, pha loaing va phan lip trén cdc méi trudmg chon loc. Trong sing loc so edp, cée vi sinh vat chi duge phat hién va phan lp nhung trong sang loc thir cp sé phan loai thém cdc vi sinh vat thu dugc tir sang loc so cp bing cdc quy trinh chon loc cao hon. Vi sinh vat c6 gid tri thye sy d6i véi cde guy trinh céng nghiép sé duge la chon va loai bo nhiing vi khudn thiéu tiém nang, Sang lge thir edp edn cung c4p thong tin vé vige dénh gi tiém nang thy su ciia vi sinh vat tng dung trong céng nghigp. Nhting diém cn quan tam trong qué trinh sang loc: - Dic diém cde ching khi duge hanh nuéi cy trén cdc méi truéng phan tich nhu trén dia thach, trong binh tam gide hoe thiét bj lén men nhé chita méi trudng long. ~ San phim quan tam cé thé duge dinh tinh hodc dinh long trong sang loc thir c4y ~ Théng tin can thiét dé phn loai va xac dinh sinh vat dé c6 gay bénh hay khong? nh vat cé thye sy tao ra cdc hgp chat hoa hoc méi chua duge mé ta truée diy hay - Diéu kién pH, suc khi hodc cdc diéu kién nuéi cdy khac lién quan dén su phat trién cia sinh vat phan lap cho si sinh téng hgp cdc sin phdm héa hoe. - Tinh én dinh di truyén trong méi truéng nudi cdy vi sinh vat. ~ Thanh phan mdi trudng bj thiéu hode c6 thé, ¢6 déc hai d6i véi sy phat trién cia sinh vat hay kha ning tich ly cdc sin phdm Ién men ctia vi sinh vat phan lap. 6 ~ San phar tin nay chwa c6 sin. tre don phan tir, phitc tap hay thdm chi la cdu tric dai phan tir néu théng - Tinh én dinh héa hoc ciia sin phim va d6 héa tan cia san phim trén cde dung méi hitu eo khée nhau. ~ San pham cé cae tinh chat vat ly nhu hap thu tia UV hoae huynh quang hode tinh chat hoa hoc c6 thé duge sit dung dé phat hién hgp chat trong qué trinh sir dung sic ky gidy hoac cdc phuong phép phan tich khdc va ciing c6 thé c6 gid tri trong vige dir doan cdu tric cia hgp chat?14 ~ Sin phim Ién men c6 dc tinh véi dng vat, thye vat hay con ngudi hay khong, dae biét Ja néu né duge sir dung (nhu 1a khang sinh) trong diéu tri bénh. - Vi sinh vat 6 thé thay d6i héa hoc hoge thm chi pha hity cde san phim én men cia chinh né hay khéng? San phim do qua trinh Ién men trong mdi trudng nudi cdy & nhiéu dang héa hoc hay khéng? d6 la vat ligu e6 hoat tinh quang hoc hay sinh hoc hi sang loc thir cp? Trong sang loc, mét trong nhimg vi sinh vat tét nhat duge chon cé thé mang lai nang suat san phim téi da. Ky thuat va phuong phap phan lap, sang loc duge trinh bay cu thé trong phin duéi day. 2.2.1. Kg thudt phin lp. Kf thuat phan lap gdm cé: Iva chon nguén phan lap, Iva chon co chat, la chon phuong phap xac dinh va tinh sach vi sinh vat. 2. |. Lua chon nguén phan lap: Nguén miu sang loc duge lay nhu khéng khi, nuéc, dat, thuc pham, sita hodc phan bén... Mau thu thap tir mét ngudn cu thé can duge pha lodng. Kj thuat pha loang néi tiép duge sir dung dé pha loang cdc mau da thu thap. Viée giam ugng vi sinh vat tir mau ban dau duge goi li pha long. Mau pha long sé duge thu hign theo ti Ig 10% (wiv) d6i véi mu rin va 10% (v/v) doi v6i mau long véi nude v6 tring (hofe nude mudi sinh ly 0,9%, hoje nuée muéi-pepton v6 tring). Mau d6i chimg la 10ml nude v6 tring, Cée miu pha lodng nay sé duge cdy trén méi truémg thach bing ky thudt edy ria hay trang cdy. 2.2.1.2.Lya chon co chdt: Cac chat dinh duéng can thiét va cac yéu t6 ting truéng can duge cung cp cho su phat trién cia vi sinh vat mong muén. Nuéi 6 nhiét dé pha hgp trong mét khoang, thai gian thich hgp 1a rat can thiét dé co duge khuan lac phan lap tét, Vide phan lap cé thé dugc thuc hién trén méi truéng long hodc méi trung ran. a.Phén lap trén méi truéng ling. Vi sinh vat cing ¢6 thé duge phan lap trong méi trong long. Giéng nhy méi trudng rin, méi trudng léng c6 thé nuéi cdy trén méi truéng khéng chon loc hoac chon loc. Sy phat trién ctia vi sinh vat rat dé phat hign khi chat léng trong sudt chuyén sang mau duc, thuong trong vong 24 dén 48 gid, nhung thdi gian u cé thé cin phai kéo dai dén 14 ngay hoc hon. Uu diém ciia phan lap trén méi long 1a ting duge sé lugng vi sinh vat quan tim hon so vi nudi truc tiép trén méi truéng thach. Nhuge diém 1a khong dé dé xac dinh riéng timg loai vi ‘vat cé mat hay cé thé su phat trién hén hop da xay ra. Trong hau hét cdc truéng hop, méi trong, léng nudi phai duge edy vao cdc dia thach rin. Diéu nay gay ra mét su cham tré bé sung trong két qua phan lap. Do vay méi truéng long thuéng duge ding lam méi trudng ting sinh déi véi cae mau vat 6 sé lugng vi sinh vat it. h Nuéi cdy ting sinh bing méi truong long thudng duge thye Tuy nhién, si ting trung cia vi sinh vat mong muén tir mgt mau hén hop sé lim thay d6i thanh phn méi trusng va vi sinh vat khae s& phat trién. Bé chon loc lai eée vi sinh vat mong muén, méi trudng ting sinh s duge dua thém vao. Vige nay ¢6 thé duge lap di lip lai nhigu Lan truée khi sinh vat tri duge phan Ip bing cach cy truyén mét phn nhé ca méi trudmg da ting sinh Ién mdi tru’ng thach. Thai gian nudi cy ting sinh kha quan trong va phai twong img véi thoi diém ma sinh vat mong muén chiém wu thé Su phat trién nhanh cla mét sinh vat trong nudi d6 tang truéng cu thé téi da cua né so véi téc dé tang truéng cy thé tdi da cla cdc sinh vat khaccé Kh nang tang trudng trong méi trudng nudi cay. Trong diéu kién méi trudng tang sinh durge dua vao ding thoi diém, sinh vat chiém wu thé sé 1a loai phat trién nhanh nhat trong sé nhimg loai cé kha nang tang truéng. Tuy nhién, trong thye té, vi sinh vét phat trién tét nhat khéng phai sinh vat hitu ich nhat. Cac van dé trén c6 thé duge khdc phuc bing cach sit dung nudi cdy lign tuc, trong dé mdi trudng “tuoi” duge thém vao qua trinh nudi cay véi tc d6 khong déi. Trong diéu kién nhu vay, luc chon loc duge duy tri 6 mite khéng déi va sinh vat chiém uu thé sé duge chon trén co s6 ai Iye ca né d6i voi chat nén gidi han thay vi téc d6 tang trudng tdi da cla nd, b. Phan lap trén méi truéng rén. Phuong phap chinh 4é phan l4p vi sinh vat tir ede mau vat 1a nudi edy trén moi truémg nudi cay rin, Vi sinh vat phat trién trén bé mat mdi truéng nudi cay dé tao ra cdc khuan lac riéng biét. Cie vi sinh vat khdc nhau tgo ra cdc khuan lac dic trung khéc nhau, cho phép xéc dinh sém, dé dang cée dic diém va kha ning ota vi sinh vat cén phan lp. Cé nhiéu loai mdi tru’ng chon loc khae nhau, Thach (agar) duge sir dung lim chit tgo dong, nhiéu logi chit dinh dudng tir ngudn carbon, nito duge bé sung nhur mau, peptone. dudmg... va cae yéu té khée nhu chat khodng, chat dém, mudi va chat chi thi Mét sé mai truémg nudi cdy khéng chon loc nhwr méi trusng MPA, LB gidu dinh durdng sé phat trién nhiéu logi vi khudn, Trong kh mi trudng chon loc nhu MacConkey (bd sung muéi mét) tao digu kign cho vi Khudn e6 kha ning chju mat duge tim thy trong rudt gid nh Escherichia coli va Enterococcus faecalis phat trién, MacConkey agar bé sung lactose nhu chat chi thj xe dinh coliforms Ién men dung sita nhu Escherichia coli, Klebsiella va tir coliforms khéng lén men dudng sita nhu Morganella sp., Salmonella sp. Cac méi truéng Iya chon cé thé duge thém khang sinh hoae cac chat ire ché khac. Hé théng chi thj c6 thé cho phép dé dang phat hién vi sinh vat can phan lap tir céc quan thé vi sinh vat. Méi truéng rin (thach) cing duge str dung dé phan lap mét sé vi sinh vat sinh enzyme nhat djnh. Thanh phan méi trudng thudng chita co chat cla enzyme mong muédn. Cée loai Bacillus dugc phan lap tir dat cé kha nang sinh enzyme protease kiém. Dat cé 46 pH khac nhau duge sit dung lim mu phn Ip. Sau khi duge tang sinh, mau duge cdy trang trén bé mat mai trudng thach 6 pH 9-10 cé chita ngudn protein khéng tan. Khuan lac tao ra ving sang do sy sit dung protein kh6ng héa tan va sinh ra enzyme protease kiém. Kich thude cita khudn lac khéng néi lén kha nang sinh enzyme vi Khéng ¢6 méi twong quan tuyét déi gitta kich thuée ela Khudin Ige va kha ning sinh enzyme protease. Diéu nay cho thay tim quan trong cia viée lua chon nguyén ligu ban dau, vige sit dung cde chat dinh dudng dac trung va két hyp thir nghiém chan dodn so b9. 2.2.1.3.Lya chon phuong phdp xéc dinh: Vigc phan lap va phat hién vi sinh vat mong mu6n la rat quan trong. M6t trong nhing phuong php phat hign va chi thj tot nhat duge sir dung Ja hé théng phat hién pH. Méi truong thach thich hop voi hé théng chi thi pH duge sir dung dé phat hién vi sinh vat tao ra acid hoae kiém. 2.2.1.4.Tinh sack vi sinh v@t: Tinh sach cac khuan lac phan lap duge thyc hign bing céch nudi lai cde khudn lac phan lp trén méi trudng thach thich hop. Tai cde néng 4 pha loang ma khi nudi cay c6 mat d6 tir 25 dén 200 khuan lac trén mét sé duge Iya chon dé lay cdc khuan lac quan tam dé tinh sach. 2.2.2. Phuong phap phin lip 1516 Hai phuong phap phan Ip vi sinh vat duge trinh bay duéi day gém: phan lp dura trén die tinh mong muén va phan lap dua theo nén tang Waksman. 2.2.2.1.Phiin lap dia trén dic tinh mong muén. Phuong phap nay sir dung truc tiép mdi truéng nudi chon loc (selective media) dé phan lap chinh xac vi sinh vt da biét hodc méi trudng phan biét (differential media) c6 chtta co chat dic , hode chat cam img dé biét duge kha nang chuyén hod ciia vi sinh vat chua duge nghién etru, i sinh vat duge lam giau trong méi trudmg dinh dudng day dit digu kign nhigt d6, 9 am, pH thuan Igi. Cé thé sir dung méi truémg long hay méi truéng ran dé phan MGi trading chon loc va phan biét durge sit dung dé phan lap hode xac dinh ede sinh vat cu thé, cho phép mét sé loai sinh vat phat trién va kim ham sy phat trién ctia cdc sinh vat khac. Su chon Ige duge thye hign theo nhiéu cach nhu cde sinh vat c6 thé sir dung mét loai duéng nhat dinh 6 thé dé dang sang loc bing cach bién duéng dé thinh nguén carbon duy nhit trong méi trudng, Mat khac, ¢6 thé dat duge sy tre ché chon loc mét sé loai vi sinh vat bing cach thém thuéc nhudm, khang sinh, mudi hode chat tre ¢ higu anh huéng dén qua trinh trao ddi chat hodc hé thong, enzyme cia sinh vat. Vi dy, méi truéng chita kali tellurite, natri azua hoc thallium acetate (6 néng d6 0,1-0,5 g/l) sé tre ché sy phat trién cia vi khuan Gram am, M6i trudng bé sung penicillin (5-50 don vi/ml) hodc tinh thé tim (2 mgy/l) sé wre ché su phat trién cua vi khudn Gram duong. Do d6, tellurite agar duge str dung dé chon vi khuan Gram duong va agar dinh duéng b6 sung penicillin c6 thé duge sit dung dé chon cho vi khuan Gram am. 2.2.2.2.Phéin lap, sing loc theo nén ting Waksman. Rat khé dé thu duge cdc chat chuyén hoa thir cép mét cach c6 chon loc khi phan lap bing ting sinh. Do dé, vi sinh vat sau khi duge phan lip sé duge sing loc dé chon duge vi sinh vat mong muén. Nam 1940, Selman Waksman 1a ngwdi dau tién str dung sang loc dé kham pha hoat tinh khang khuan tir streptomycin ctia ching Streptomycete khi thay cdc vang tng ché sy phat trién cia vi khudn gay bénh. Cach tigp cn nay dugc goi la nén tang Waksman va da duge cdc c6ng ty duge phim trén khdp thé gidi p dung va da tgo ra théi hoang kim cla khdng sinh, Tuy nhién, higu qua thu nhdn cdc chit mong muén da gidm do viéc tai té hop cdc ching da duge sing loc nhiéu lan trude dé. Nguyén ly etia phurong phap nay 18: ‘Trude hét ngudi ta kiém tra so b6 hén hgp cdc gidng vi sinh vat tir mau ty nhién (thye pham, at, nuéc...), lam cdc huyén phit pha loang réi cdy trang trén bé mat thach dinh dudng, déng thoi iy mét ching vi sinh vat kiém dinh cé tac dung déi khang. Chi cé nhiing vi sinh vat nao sinh chat d6i khang véi chung kiém dinh, nghia 1a cé tinh chat khang sinh thi sau khi nudi sé tao ra ving tte ché dic higu. Tach khudn lac va dem nudi cay, thir chat sinh ra va dinh lugng tiép theo. ang loc cho phép xc dinh nhanh dugc tinh khang khuan, khang nam... ky thuat: Phuong phap m6t ching duge phan lap. Phuong phap nay thuréng ding hai ki - Ldy mét miu thir dé khao sat tac dung voi nhiéu ching kiém dinh. - Lay nhiéu mau thir dé khdo sat tic dung véi mt ching kiém dinh. Cy nhiing ching di duoc phan lap bing nhiing duéng vach trén mat thach dinh duéng trong hp petri. Sau dé cay ching kiém dinh theo duéng song song hodc vudng géc v vach cia chiing nghién ecu, Dat hép petri vao tii 4m v6i nhigt dé thich hgp véi chiing kiém dinh. ‘Tac dung khang sinh cia mau thir s€ duge xac dinh & ving mt thach khéng bj ma tai cdc giaodiém dudng cay cla chiing bj tre ché, Phuong phap nay chi yéu duge sit dung trong vige tim ching sinh chat khang sinh. Tir nguyén ly co bn, phuong phap d& duge cai tién va ngay mét phong phii hon. Dé chon. cée chiing |, ngudi ta da sit dung kiéu chon loc theo ky thuat penicilin. Trong phuong phap nay cc digu kign duge Iya chon sao cho té bao vi sinh vat c6 thé phat trién trong méi truming dinh dudng thiéu mt amino acid nio a6. Dé phan lap nhiing ching cé tinh chat dac biét (nhu chuyén hoa steroit), ngudi ta ding hén hgp cia nhiéu ching vi sinh vat dem nuéi cay trong cing mét mdi trudng c6 chat ma ta muén thye hign sir bién di, Sau khi nudi, chiét xudt sin phim va phan tich theo phuong phap sic ky. Phan lap c6 thé thyc hign tir cée mau trong méi truéng ty nhién. Tuy nhién, viée nay mat nhieu thoi gian va cong stte. Ngay nay, céc nha vi sinh vat hoc thyc hién sing loc vi sinh vat mong muén tir cdc ap giéng d da cé, , mang nhimg Et diém da bit nung khong ¢ chia tanning s in vat sé haw mua mot ching vi sinh vét sé kinh té hon so véi phan Lip tir cdc nguén ty nhién va ¢6 thé durge sit dung lam m6 hinh phat trién ky thuat nudi edy, xét nghiém, dinh gid, 2.3. KY THUAT CAI TIEN, TAO GIONG VI SINH VAT TRONG CONG NGHIEP. ‘Trong cong nghiép, vi sinh vat duge lua chon bing cach str dung quy trinh sang loc khéc nhau dé dam bao san xuat thuong mai san pham cé nang suat san pham cao lién tuc, c6 hiéu qua kinh té dé o6 thé canh tranh véi cdc nginh cOng nghiép khde. Trong chuong trinh edi tao ching gidng, diéu kign nudi cay khaéc nhau cing duge diéu chinh dé tang nang suat san pham. Diéu kign nudi cdy nhu pH, nhiét d6, thanh phan mdi trudng, suc khi, khudy tron, mite 46 ‘v6 tring dugc diéu chinh va su thay déi 6 cdc mite nay durgc kiém tra dé ting nang sudt cua sin pham, Tuy nhién, sy thay déi trong diéu kién nudi cdy khong mang lai ning suat lén va higu qua cia chiing vi sinh vat str dung. Do vay cn str dung cae chwong trinh cdi tgo va Iya chon ching nang suat cao nhat dé san xuat san pham & quy mé céng nghiép. Su cai tao ching cia vi sinh vat duge str dung trong qué trinh Ién men durge thyc hién bing cach thay déi céu tric di truayén cia ching, chon ching ning suat cao nhit tir cc ching cai tao khde nhau va diéu dé lim tang nang suat sin phim, Sau chuong trinh cai tao, chiing c6 tinh di truyén én dinh sé dugc chon. Ching duge chon sé tao ra san phim mong muén véi sé luong lon va sin pham khong mong mu6n véi s6 lugng it hon, c6 kha nang tao ra nang suat cao so véi ching bé me. Cau tric di truyén cia ching da chon c6 thé duge thay déi bing cach sir dung cac phuong phép sau: - Tai to hgp di truyén (Genetic recombinantion) hoac chuyén gen (Gene tranfer); - Dot bién (Mutation); - Ky thudt di truyén (Genetic engineering), 2.3.1. Tai to hyp di truyén hoc chuyén gen. Ca ché tai t6 hop di truyén tén tai 6 cde ching vi khudn khac nhau va mét s6 xa khuan. Trong co ché tai t6 hop di truyén cua mét gen tir m6t logi vi sinh vat nay sang mot loai vi sinh vat khde dign ra, Sy tdi 16 hgp & vi sinh vat xay ra théng qua ba qué trinh t4i t6 hop: bién nap, tiép hp va tai nap (hinh 2.1). Wwida mp Lyi cde © Theo > gidi phéng: b . DNAvio ‘TBahin es. | @ DNA cia té bio cho xm ‘hip vio t€ bio ohn Hinh 2.1. Ba hinh thite chuyén gen xdy ra trong tdi t6 hop di truyén cua vi sinh vat ‘Tiép hop Tain ie ie) thie rae Plasmid clia ‘Xiim abiém thye os eit oe GO Gc: @ ae TB cho vin chuydn gene Ly git bao cho. Cie doan i truyén cho TB nhiin DNA duge thu th§p va vin thing ua Eng tidy bp auyén bg hye Khudn thé mae era ‘truyén cho TB niin bing sy vx nhiém thye khudin thé 18. Chuyén gen cé thé duge thyc hién bing phan img dung hgp té bao tran ciia hai chiing higu qua khac nhau va ching cai tién méi cé thé duge phat trién (hinh 2.2). Oo T vith J rye nan te tyblgensme wo biota Teepe hile eth Ming sinh chit. ‘Thanh i bio (© Trong dung dich té bio tn dye rl plystylene yea! 1 Teo edn age dung op YO nant se eet Té bio ti 18 hop bo pp ia ih © tanh ching wlan Hinh 2.2. qua chu ky sinh san cn tinh (parasexual cycle) va phan bao nguyén phan 1 Ching nai Quy trinh dung hgp té bao tran & vi khuan (mitotic cell division) rét quan trong va ¢6 gid tri lon trong vige cai thign ching (hinh 2.3). Cai tao giéng di truyén cing cé thé thuc hién trong cac chi khéc nhau cia nam men. Bing cach sit dung ky thuat tai t6 hop va chuyén gen, c6 thé két hgp cae ky ty mong muén tir hai ching khéc nhau cia ciing mét loai bing cach nhan giéng xen ké va thu dugc mét ching higu qua cé thé tao ra nang suat sin phim cao & quy mé céng nghiép.‘TaitBhop phin bio Mit nhidm si thé neu nhién we \ Hinh 2.3. Sw tai t6 hop cua nhiém séc thé trong chu kp sinh san can tinh. theo déi tir bd me don bGi 6 trén dén cdc phan ly don bGi bén dui, théng qua qué trinh luéng béi, tai té hop phan bao va mat nhiém sic thé. Ba nhiém sac thé duc 2.3.2. Dot bién Dot bién cé thé dugc dinh nghia la su thay d4i cdu trac di truyén cta vi sinh vat. Kha nang vi sinh vat tao ra san phi 6 thé duge ting cudng bang qué trinh dét bién. Trong, qua trinh dét bién, ching én dinh va hiéu qua nhat dugc tiép xtc voi d6t bién bing cach sit dung tae nhan gay dot bién khac nhau. Tac nhan gay dét bién cé thé Ia tac nhan vat ly nhu ion héa, bire xa cue tim... va téc nhan hoa hge nhu acid va kiém. Tac nhan gay d6t bién duge sit dung néng. 46 phi hop sao cho sé Iuong té bao chét téi da do cac tac nhan gay d6t bién va chi nhimg té bao. 6 kha nang thue hign d9t bién va chiu d\mg mite 46 cla eée tée-nhan gay dt bién mei e6 thé tn tai. Tir cdc cdc té bao da trai qua d6t bign t8 bao sdng s6t ed kha ning tgo ra nang suat cao ca sin pham lén men duge chon. 2.3, Diie diém cia chon Ipc thong qua dgt bién Vigc la chon té bao dét bién la nhiém vu rat kho khan. Bat cit khi nao cde té bao vi sinh vat bj dét bién, c6 hai kha nang d6t bién xay ra cé thé 14 d6t bién chinh hoac d6t bién nhé. Ching trai qua d6t bién mong muén nén duge Iva chon can than, cach ly va duy tri dung cach. Ching dét bién duge chon Igc véi cée dic diém hinh thdi va sinh héa thay déi hign 1a ching tao ra ning suat cao cla sin pham mong muén. Ching duge chon cai tién nén duge kiém tra bang cdc thi nghiém 6 quy mé phéng thi nghiém, sau dé 1a thyc nghiém tai nha may va tiép tuc sit dung & quy mé thuong mai, Ching cudi cing sé duge Iya chon, tinh ché va duy tri. Tat ea thir nghiém va thi nghiém nén duge thue hién véi d6 chinh xac cao vi quy trinh nay rat tn thi gian va tén kém, Hon nita, khi cdc chting nay duge sit dung & quy mé céng nghiép. Phuong php nay cé dac diém: ~ Thu nh§n két qua rat nhanh; - Chi jénh gia sin phdm thu dugc, khéng quan tam céc bién déi sinh If, sinh hod; - Tao ra céc chiing o6 nang suat cao; ~ Khac phyc mt s6 nhuge diém cua ching ban = Lam bién déi ban chat hod hoc cia cé At trong chiing ban dau. 1920 Qua trinh chon giéng cac ching Penicillium chrysogenum & Mf cé thé lay lam vi du dién hinh cho phuong php nay. Tir dong ban dau cé san lugng 60mg/l, chon loc cdc d6t bién ngdu nhién duge déng 150 mg/l va sau dé str dung cae dét bién nh§n do tac dong tia X va UV. Vige chon loc theo nguyén lay déng cé sin Iugng cao nhat dem gay d6t bién rdi chon ching Penoicillium chrysogenum nang suat cao nhat. Qua nhiéu buée trung gian, cudi cng tao duge dong E.15.1 c6 sn Iugng 7000 mg/l. Phuong phap chon gidng dét bién due sir dung dé tao ra cac ching san sinh ra nhiéu amino acid (nhu glutamic acid) hay céc nucleotid. Ngoai ra con c6 thé nhan cae d6t bién lién quan dén co ché diéu hoa trao déi chat. - Cae d9t bién co cau (constitutive mutants): tao sin pham khéng can chat cam tng (inducer). - Cae dét bién khang tre ché ngugc: tao san pham nhiéu ma khéng bi ite ché béi san pham cudi (end product repression). 2.3.2.2. Téc nhan gay dot bién Tae nhan gay d6t bién duge chia thanh hai nhém: tac nhan vat ly va tac nhan héa hoc. ‘Tae nhan vat li: bao gim nhiét va phéng xa. Phong xa la tac nhdn gay dot bién du tién duge bao céo vao nim 1920. Tac nhan phéng xa ion hoa (ionizing radiation) nhu tia X va bui phéng xa e6 thé lam tach electron ra khdi cde nguyén tir do dé tgo nén ede ion bj thay déi dién tich. Khi cdc ion nay nim canh hodc trong edu trite ciia AND, ching c6 thé thie day phan img hoa hge lam thay déi cp cla DNA. Tac nhan phong xa ion hod nay cting c6 thé lam pha vo edu trie nhan phéng xa khéng ion hod (nonionizing radiation) khong lam thay Gi dign tich cita cde nguyén tt nhung lam cho cae electron ¢6 thé nhay tir quy dao trong ra quy dao ngoai cla nguyén tt, lam nhing nguyén tir nay tro nén khéng én dinh vé mat hod hoe. Tia X 1a mét trong nhimg loai bite xa ion héa phé bién nhat duge sir dung trong nhiéu thyc hanh y 18 cho ede mye dich Khée nhau. Né tham chi c6n duge str dung trong thye hanh khir tring 48 tigu diét vi sinh vat. G cdp 46 phan tir, liéu tia X gay chét ngwdi (350-500 rems) pha v6 lién két phosphodiester gitta DNA va do dé dan dén dirt sgi, dan dén viée x6a m6t phan cia DNA gay d6t bién. Néu su dint gay sgi xay ra & ca hai soi, né sé gay chét cho té bao. Nhiét 1 mét tac nhan gay dét bién khdc trong DNA. Khi lam nong DNA, & mét mute 6 nhat dinh (> 95°C), DNA sé bj bién tinh - hai chudi DNA don duge tao ra tir chudi kép DNA. Ngoai ra, nhiét 46 cue cao cing lim hong DNAva pha vé cdc lién két phosphodiester. Tac nhan hoa hoe: M6t s6 cac hod chat ciing cé thé gay ra d6t bién do cé cdu trac tuong ty cae cap cua DNA purine va pyrimidine, ching duge goi li cae cp tuong déng (base analog). 5- bromouracil va aminopurine la hai chat trong ty co ban phé bién duge lip vao DNA thay vi cde bazo théng thung trong qué trinh sao chép. 5-bromouracil li hoa chat ting hop nhan tao duge sit dung trong nghién ciru di truyén, Nhém methyl cia thymine, bromouracil chtta nhém Br - rat gidng véi thymine. G dang keto két hyp véi adenine giéng nhu thymine va gay dot bién. Co ché hoat dng cia 5-bromouracil kha thi vi, trong qué trinh sao chép, 6 dang enol tgo ra guanine két hgp véi cytosine. Vi ip co sé TA duge thay thé bing eo sé GC 6 cudi ban sao va diéu nay sé xay ra do sy dich chuyén 5-bromouracil dang enol sang dang keto.W H 5-BU (keto form) Adenine 5-BU (enol form) Guanine Hinh 2.4. So sénh céu triic phan ti ciia S-bromouracil va thymine va kha nang bat cap cia S-bromouracil dang keto va enol Nitrous acid (HNOz): La chat gay dot bién manh, tac dong lén DNA bat ké phan tit nay dang sao chép hay khong sao chép. Do c6 tinh oxy héa manh lam logi nhém amin (NH2) ra khéi bazo nito A, G va C. Phan img nay lam thay déi dang amino thanh dang keto va lam thay d6i kha nang tao lién két hidro cia cdc bazo nay. Chat alkyl héa cé thé chuyén nhém alkyl ctia chang cho hop chat khac. Ching bao gdm methylhydrazine, temozolomide, dacarbazine, busulfan, thio-TEPA, carmustine, lomustine, dimethyl sulphate, ethyl ethane sulphate. Cac hgp chit nay cé thé gay ra nhiéu dang dét bién khac nhau, Ethylnitrosourea, khf mi tat va vinyl clorua 1a nhiing tac nhan kiém héa phé bién, ¢6 chuyén nhém alkyl vao DNA va lam héng n6. Tée nhan gay ra 16i bit cp bing cach ting ion héa va tao ra cdc khoang tréng trong chudi DNA. Ding tac nhn hod hoc c6 thé téi mute cdc thé d6t bién can tim xuat hign trong khoang 10° 10° té bao. Néng 6 hoa chat va théi gian tac déng 1A do thu nghiém xc dinh, sao cho chi cdn mét lugng nhé té bao vi sinh vat chju duge dot bién séng s6t. Nhimg ching sau khi chju téc dung cia tac nhan gay d6t bién duge rita bing nude ding truong v6 khuan va sau nhiéu lién tiép duge cay chuyén nhiéu lan trén dia petri dé khao sat dic tinh mdi ciia ching. 2.3.2.3.Phdt hién cic thé dpt bién cb jeu qué Muén phat hién cae dét bién cé higu qua cdn c6 hé théng chon loc dé tim thay cae dét bién hiém hoi trong khéi rat 1én ede dang khéng d6t bién, Cac hé théng chon loc dot bién phy thuge nhigu vao eée d6t bién khée nhau, Lién quan dén chon loc d6t bién 6 vi sinh vat, ngudi ta dura ra khai nigm lye phan gidi, Khai nigm nay ciing dé chi kha nang phat hign cdc dot bién rat hiém so v6i khéng dt bién. a.Phuong phdp dé khdng: G vi khuan, cdc tac nhan chon loc thug 1a thudc va phage. Céc d6t bién duge dé dang phat hign trén méi trudng agar c6 thuéc hay phage 6 dang cc khuan lac duge moc lén. b.Phucong phap lam gidw chdm: Vige phat hign d&t bién khuyét durdmg khé khan hon. Dung dich vi khudn pha loang durge edy 1én bé mat mdi truémg agar t6i thigu dé moe ri thanh khudn lac. Mét lop moi trudng tuong ty duge dé lén trén mét lép mong. U dé cdc khuan Igc binh thueng 2122 moe lén, Sau dé, dé phi thém m6t lép méi trudng dinh duéng cé chat bé sung va u tiép cho chat bé sung khuéch tan. Cac d6t bién khuyét dudng sé moc sau khi cé chat bé sung, nén khudn lac nhé hon do moc cham. Phuong phap lam giau han ché: La vi khuan duge cay trén mdi trudng tdi thiéu cé it chat bd sung. Trong diéu kién d6, cae dot bién khuyét duéng moc dén khi hét chat dinh dudng bé sung thi dimg, nén tao ra khudn lac nh6. Cac vi khudn binh thuéng tiép tuc moc khuan lac to. 4. Phuong php Iam gi nhé penicillin: Duge 4p dung cho eae vi khuan binh thudng Khi phan chia. Cée vi khuin duge cho vio méi truéng t6i thiéu c6 penicillin, Céc vi khuan dang ting trudng bj diét, chi té bao d6t bién khdng ting trudng con sdng sét. Sau dé hén hgp duge c: méi trudng khéng cé penilicilin thi cae d6t bién khuyét dudng moe lén voi ty 18 tuong déi cao hon e.Phwong phép chon loc: Duge sit dung dé chon loc cdc d6t bién khuyét dudng 6 ndm sgi. Dung dich cée bao tir nuéi trong méi trudng dinh dudng thiéu chat bé sung. Cac dot bién thiéu chat bé sung khéng moe duge, ede dang binh thudmg moe ra nhidu sgi. Khi loc qua mang loc soi thuy tinh, cde dang binh thurdng nhigu sgi bi dang dt bién di qua ming loc. Dung dich c6 nhigu dang dét bién duge cdy trén méi trong c6 chat b6 sung va kim tra tim dét bién Phuong phdp in: Cac vi khudn duge moe ri timg khudn lac trén méi trang dinh dug t6i thiéu. Cac khuan lac dét bién khéng moc lén duge. Can eiu vao d6t bién khéng moe 6 ban sao tach cae dot bién khuyét duomg. 2.3.3. Ky thugt di truyén Kg thuat ky thuat di truyén a ky thuat thanh céng nhat duge sir dung cho chuong trinh cai thién ching & quy mé céng nghiép. Né cing duge goi la cong nghé AND tai té hop va trong qua trinh nay, ¢6 si thay déi cde dac tinh di truyén cila té bao va do dé dan dén sy thay déi dic diém h cia té bao. Trong ky thuat nay, mét loai gen mong muén duge dua tir mét té bao vi khudn sang cdc té bao vi sinh vat khac bing cch str dung cdc vecto nhan ban, nhu plasmid, phage, cosmid. Kf thuat di truyén hign dat day cho phép phat trién cdc ching san xuat cdc cht chuyén. so cdp & vi sinh vat, Co s@ ly Iuan cho vige tao ra ching nay 1 két hgp ede de diém thich hop ng cdc ky thuat DNA tai té hop in vitro. Diéu nay dac biét cé gid tri trong cdc sinh vat c6 hé théng sinh tng hgp phitc tap, trong dé vige bai bé hé théng ban dau sé lién quan dén nhieu thay 46i di truyén. 2.4. NHAN GIONG VI SINH VAT Mue dich cia qua trinh nhan gidng la tang sé long té bao gidng. Trong qué trinh Ién men, véi cée vi sinh vat khée nhau sé can gidng duéi cde dang khée nhau. Thuéng sit dung hai dang gidng 1a té bao ih dung va bao tit. - Truong hop gidng la té bao sinh dudng, trung dim bao t6i uu cho sw sinh trudng, phét trién ma khéng tao ra sn pham trao Trung hop nay sir dung phuong php nudi cdy dich thé (nudi cdy chim). in tgo didu kign vé trang thdi, thanh phan moi chat) - Trung hop giéng Ia bao tir (déi véi xa khuan va nm méc), thudng nhan gidng thu bao tir trén méi trudng xép (nudi cdy xdp c6 sir dung cam, bét bap, thée, tréu...).Bao ti duge hinh thanh bing céch nudi cdy nm méc, xa khudn trong m6t thoi gian dai Bio tir duge thu nhén bing nhiéu cach nhu ding may hit (nhu may hat bui) hay ding choi long mém a tidt tring quét lén bé mat cua méi trudng ban ran, Bao tir thu duge & dang khé, durge dung trong cdc binh kin gan paraffin, bao quan noi sach va mat. Véi kiéu nay ta c6 thé gitr duge giéng dig dan hang nam. Tay theo qué trinh Ién men ma e6 qua trinh nhan té bao gidng véi sé long nhiéu, it khac nhau. Qua trinh nhan gidng vi sinh vat cho san xuat 6 quy m6 céng nghiép thuéng duoc tién hanh qua cde buée sau: 2.4.1. Giai doan phdng thi nghiém: Day 1a giai doan cy gidng vi sinh vat tir dng gidng thuan khiét vao mdi truéng dinh dudng v6 tring va nudi ching trong diéu kign phong thi nghiém 2.4.2. Giai doan & xwéng san xudt: Nudi cdy giéng trong giai doan nay duge thuc hién qua miét sé lin nhn giéng nhim ting lugng giéng thu duge - thuéng duge goi la nhan giéng cp 1, 2, 3... Ti lé giéng cdy trong nhan gidng ciing twong ty nhu trong lén men, dao déng tir 1-10% thé tich méi truéng dinh dudng tiy timg ching gidng. Théng thudng thi ham lugng carbon 6 mdi trudng nhan giéng thip hon mdi trudng lén men, nhung cac thanh phan khac thi giau hon, dic biét la cdc chit sinh truéng dé phuc vu cho sinh sin ‘va phat trién cia gidéng vi sinh vat. Ché a6 nudi dic biét 1a nhiét 46 gitta nhan giéng va lén men cing khdc nhau. Néu ciing ché d6 nhiét d6 thi khéng u. Néu nhiét d6 lén men thap (nhu lén men bia) thi can phai nhan giéng véi nhiét 46 gidm dan dé khi vao lén men, giéng khéng bi choang séc. Ché 46 suc khi & cdc céng doan nay ciing khac nhau, thuéng thi trong théi gian nhan gidng nhu cau vé oxy cao nhur trong pha sinh trudng cia 1én men hoge cao hon, ‘N6i chung mét ching vi sinh vat nhén gidng dé dua vao lén men can dam bao cac yéu cau céng nghé nhu sau: - Dich gidng khéng duge tap nhiém, dac biét li nhiém thuc khudn thé (bacteriophage); - Cac té bao dam bao 6 d6 tudi sinh li ¢ thoi gian sinh trudng tét nhat, c6 hoat tinh cao nhat, thudng Ia ntra sau ctia pha lily thira; - Can kiém tra sé lugng va chat lugng giéng truée khi dua vao thiét bij lén men. 2.5. KY THUAT BAO QUAN GIONG VI SINH VAT Git gidng vi sinh vat 1a c6ng vige hét site cn thiét khéng phai chi véi cae trung tam gitt gidng quéc t8, quée gia ma ngay cd déi véi timg phong thi nghiém nhé. Giéng vi sinh vat rit dé bj thodi héa néu khdng durge bao quan ding ky thuat, Ching gidng la ti sin quan trong trong mét céng ty, vige gidt duge cde die tinh mong muén cia ching la mét viée lim rt quan trong. Ngoai ra, méi trudng nuéi cy sir dung dé bat dau qui trinh Ién men phai kh6ng bj nhiém, Do dé, nudi edy vi sinh vat trong eéng nghigp phai duge bao quin theo céch dé tranh sy bién di di truyén, trénh tap nhiém va duy tri kha nang séng cita vi sinh vat. Vé mat ly thuyét, cdc vi sinh vat va té bao trong nudi cdy cé thé duge duy tri bing cach cdy truyén sang méi trang méi, nhung 6 mdi lan phan chia té bao, sé cé mét xdc xudt nhd xudt hign d6t bién, vi vay viée cy truyén Lip lai nhiéu lan sé din dén nhimg kha nang ching giéng bj thoai hoa, Ngoai ra, viée cdy truyén nhiéu lin sé lam ting nguy co tap nhiém. Do d6, cac k¥ thuat bao quan da duge phat trién dé duy tri trang thai ngimg hoat dng tam thoi cia vi sinh vat trong méi trudng nudi cay, cdc phuong phap c6 thé ké tdi nhu bao quan 6 nhiét d6 thap hoac &24 dang téch nuée. Diéu quan trong khéng kém vige bao quan dé chinh la viée quan ly cae mau bio quan, can cé mét hé théng kiém tra higu suat va d6 tinh khiét ctia cdc ching duge lu trit thuéng, xuyén, 2.5.1. Bao quan & nhiét d@ thap 2.5.1.1.Béo quan lanh trén méi trwéng thach, dinh kj cy truyén ‘Nudi cdy ching gidng vi sinh vat trén dng thach nghiéng (d6i véi vi sinh vat hiéu khi) hode chich sdu vao thach ding (d6i véi vi sinh vat ki khi). Cac éng giéng duge bao quan ti lanh voi nhigt d6 4-6°C, duge dinh ky ey truyén, Thai gian cdy truyén c6 sy khac nhau 6 cae nh6m vi sinh vat (vi Khuan, ném men, nm méc...) nhung nim trong gi6i han t6i da la ba thing, Phuong phap bao quan gidng nay rit don gin, tuy nhién higu qua bao quin khéng cao vi dic diém ching giéng dé bj thay d6i qua nhigu lin edy truyén, phai tén nhieu cdng site cho vige ruyén va vige bao quan chiém nhieu dign tich. Dé khac phuc nhuge diém cilia phuong phap cy truyén thudng xuyén, cy thé 1a han ché sy phat trign ciia vi sinh vat trong thai gian bao quan, tranh cho lép thach chia méi truémg bi kh, ngudi ta phai phi én mdi truéng thach 3 ¢6 vi sinh vat phat trién mot lop diu khong nh paraffin long. Lép paraffin nay han ché duge sy tiép xtc cita vi sinh vat véi oxy trong khéng khi, han ché su thoat hoi nude cia méi trudng thach, do vay éng giéng cé thé bio quan dugc 1 nam ma giéng khéng bi thoai héa va tap nhiém. V6i phuong phap nay, giéng cé thé bao quan 6 tii lanh & mhigt d6 4-6°C hay 6 nhiét d6 phong. 2.5.1.2.Béo quan bang lanh sau fe tre Git giéng theo phuong php nay dva trén nguyén é su phat trién cia vi sinh vat bing céch dura ching vio diéu kign lanh sau 6 6 cdc thang nhiét d6 khde nhau nur -20°C, -30°C, -40°C, -70°C, -140°C va -196°C. Bé bio dim cho té bao vi sinh vat khong bj pha vo va chét khi bj Lim lanh sau, ngudi ta can tron sinh khdi cua giéng can bao quan véi cdc chat lam han ché toc 46 lanh su va Lim tan nhanh nhu glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), huyét thanh ngya (logi khéng cho chat bao quan), dung dich glucose hofc lactose 10%... Dé han ché vige té bao bi pha v6, viée lam lanh duge tién hanh tir tir. Khi d6 lanh dat -20°C, viée tiép tu lam lanh can dat tbe 9 1-2°C phat. Phuong phap nay cing cn cdy truyén va lam lai nhung théi gian gitta cdc lan cdy truyén duge kéo dai hon so véi phuong phap dau. Thai gian cay truyén nhu sau: ~ Néu gitt 6 nhiét dé tir -15°C dén -20°C : 6 thang cy truyén va lam lai mét Lin - Néu gitt & nhiét 6 1a -30°C: 9 thang cy truyén va lam lai mét lin mét lain - Néu gitt & nhiét 46 1a -40°C: 1 nam cdy truyén va lim - Néu gitt & nhiét d6 tir -S0°C dén -60°C: 3 nim cdy truyén va lam lai mét in - Néu git & nhiét d6 1a -70°C: 10 nam cay truyén va lam lai mét lan ie biét, phuong phap bio quan lanh sau trong nite léng la phuong phap t6t hon cd, thich hop véi nhiéu déi tong vi sinh vat khée nhau nh vi khudn, ndm sgi, nm men, virus, tio va ¢@ cde dang té bio déng vat. Tuy nhién, phuong phip nay cing e6 mt s6 nhuge diém nhw dau wr kinh phi cho thiét bj va dign, nito long hodc rii ro nhu chay né... Bac bigt né khong thich hop véi céc chiing vi sinh vat thuring xuyén ding dén, Nhin chung phuong phép nay thudng duge ding véi ching vi sinh vat ¢6 nhimg dic tinh qui ma kh6ng thich hgp véi phuong phap ding khé.