TP2 de microbiologie

4éme année technologie alimentaire

RACHEDI kaoutar

SAIDOUN chahinez

OURAMDANE meriem

2021/2022
Travail à faire :
I. Dénombrement coliformes totaux et thermorésistants :
 Ensemencer a partir d’un échantillon de l’ben de plusieurs dilution
plusieurs tubes VBL
 Après incubation lire les résultats et déterminer le nombre de
coliformes totaux par ml
 À partir des tubes VBL positifs qui contiennent les coliformes totaux on
ensemence d’autres tubes VBL mais incubation à une température
différente pour révéler la présence de coliformes thermorésistants
II. Recherche d’E-coli :
 Effectuer le test de mackenzie pour révéler la présence d’E-coli.

Plan :
Introduction
I. Dénombrement coliformes totaux et thermorésistants
a) But
b) Dénombrement des coliformes totaux :
 Mode opératoire
 lecture des résultats
 Résultats et discussion
c) Coliformes thermorésistants
 mode opératoire
 lecture des résultats
 résultats et discussion
II. Recherche d’E-coli
a) But
b) Principe
c) Mode opératoire
d) résultats
III. Conclusion
 Introduction :

Les coliformes totaux c’est des entérobactéries  qui incluent des espèces bactériennes qui vivent
dans l’intestin des animaux homéothermes, mais aussi dans l’environnement en général (sols,
végétation et eau). Ce groupe bactérien est utilisé comme indicateur de la qualité microbienne.
Aussi les coliformes fécaux c’est un sous-groupe  des coliformes totaux capables de fermenter le
lactose à une température de 44,5 °C. L’espèce la plus fréquemment associée à ce groupe bactérien
est l'Escherichia coli (E. coli) et, dans une moindre mesure, certaines espèces des
genres Citrobacter, Enterobacter et Klebsiella.
La présence de ces bactéries dans les aliments indique un manque d’hygiène et de contrôle de la
qualité l’objectif du TP c’est de révéler et dénombrer la présence de ces bactéries pour déterminer la
qualité de notre échantillon de l’ben.

I. Dénombrement coliformes totaux et thermorésistants.

a) But :
On dénombre les coliformes totaux et thermorésistants pour déterminer la qualité hygiénique de
notre échantillon de l’ben car les coliformes totaux et thermorésistants sont des témoins d’absence
d’hygiène de contamination fécale et indicateur de la présence potentielle de germes pathogènes.

b) Les coliformes totaux :

 Mode opératoire :
-1 -4
On effectue des dilutions de l’ben de 10 à 10 (1ml de l’ben dans 9ml d’eau physiologique on obtiens la
dilution 10-1 à partir de celle-ci prendre 1ml et la mettre dans 9ml d’eau physiologique pour obtenir la
dilution 10-2) on ensemence 12 tubes de VBL qui contiennent des cloches de durham a l’aide d’une anse on
prélève quelque gouttes de chaque dilution et on la met dans le tube VBL pour chaque dilution on
ensemence 3 fois puis on incube de 24h à 48h pendant 37°C.

 Lecture des résultats de coliformes totaux :

Après incubation de 24 à 48h pendant 37°C on observe l’apparition ou non d’un gaz, signe de la présence
de coliformes totaux. S’il y a dégagement d’un gaz qui occupe au moins 1/10 de la cloche on dit que le
résultat est positif (présence de coliformes totaux)

On compte le nombre de tubes positives par exemple on a 3 tubes positive pour la 1ére dilution 3 tubes
pour la deuxième 3 tubes et pour la 3éme dilution on a 2 tubes positives pour la dernière dilution on a un
nombre de 3 3 2 et grâce a la table de NPP le nombre le plus probable on déduit le nombre de bactéries qui
est par exemple pour 332 110 pour 1ml nous on a par exemple 10 -2  110×1/10-2 11000 qui est le nombre de
bactéries dans 1ml.

 Résultats et discussions :
Pour les coliformes totaux le résultat selon le schéma ci-dessous
En additionnant les chiffres correspondant au nombre de tubes positifs, on obtient un nombre
caractéristique correspondant à trois dilutions successives : ici 332
En se référant à la table de NPP, on trouve qu’à 332 correspond le nombre 110
Pour trouver le nombre total de colonies, il suffit de multiplier 110 par le taux de dilution qui représente
l’inverse de la 1ère dilution qui a donnée 2 chiffres, ainsi :
Nombre de coliformes totaux = 110 x 1/ 10-2
= 11000 de coliformes dans
1ml

Dans ce l’ben on a trouvé 11000 coliformes totaux le

nombre est allarmant il faut rechercher la présence
potentielle de coliformes fécaux qui sont des coliformes
totaux mais qui existe dans les issues des humains des
animaux si on trouve les tests positifs faut faire un test de
mackenzie.

Schéma du résultat de la recherche des coliformes

totaux dans les tubes VBL.

c) Coliformes thermorésistants :
 Mode opératoire :

Pour les coliformes fécaux a partir des tests positifs on ensemence avec l’anse (qui se termine avec
cercle) d’autres tubes VBL a partir de 10 -2 on laisse cette fois ci incuber pendant 24h a 44°C pour
révéler les coliformes fécaux qui sont thermorésistantes

 Lecture des résultats :

Pour la lecture des résultats de la même façon que pour les coliformes totaux si ces derniers
fermentent le lactose du milieu on aura production de gaz dans la cloche de durham si elle occupe
plus de 1/10éme du tube c’est positif après on détermine le nombre le plus probable avec la table
NPP

 Résultats et discussion :

Pour nous c’était 331 ce qui veut 45 pour dénombrer le nombre totale on multiplie par 1/10 -2
Ce qui donne 4500 de coliformes fécaux par ml
Parmi les 11000 coliformes totaux on trouve 4500 coliformes fécaux
Puisque on a trouvé des coliformes fécaux faut détecter la présence d’Escherichia coli notre produit
est très contaminé si on révèle la présence de E-coli c’est grave.

II. Recherche d’Escherichia coli.

a) But :
Détecter la présence d’Escherichia coli dans un échantillon de L’ben afin d’évaluer si le produit a subit
une contamination fécale et si il est dangereux pour la consommation.

b) PRINCIPE : Le test de Mackenzie repose sur le fait que seule Escherichia coli est capable à la
température de 44°C de produire l’indole par dégradation des peptones et de fermenter le
lactose avec production de gaz.
 c) Mode opératoire :
On ensemence à l’aide d’une anse bouclée une goutte de culture VBL + Cloche de durham dans un
tube d’eau peptonnée exempte d’Indole et on incube à 44°C pendant 24h. Après 24h d’incubation,
on ajoute dans le tube 1 à 2 gouttes du réactif de Kovacs, on agite et laisse reposer quelques
minutes. La détection de l’Indole repose sur la réaction chimique entre L’indole et le réactif de
Kovacs. S’il y a apparition d’un anneau rouge en surface, cela est signe de la présence d’Indole,
caractéristique du noyau du tryptophane.

d) Résultats :
Test Indole Positif. On a vu l’apparition d’une coloration rouge sous l’aspect d’un anneau à la surface
du bouillon. Cela signifie que la bactérie a dégradé le tryptophane de la peptone, signe de la
présence d’Escherichia coli dans l’échantillon prélevé.

Schéma de résultat du test de mackenzie .

III. Conclusion 
Pour les coliformes totaux : Le dénombrement des coliformes totaux a démontré la présence d’une
forte charge microbienne dans l’échantillon : 11000 colonies par ml de L’Ben.

Pour les coliformes fécaux : Leur dénombrement a révélé un nombre de 4500 colonies par ml.

Ces groupes bactériens sont considérés comme des indicateurs techniques de la maîtrise générale de
l’hygiène (contamination fécale) et des systèmes de nettoyage. 

Pour Escherichia coli :  

Dans le domaine agro-alimentaire, l'utilisation de ces critères microbiologiques en tant qu'indicateur

d'une contamination fécale est progressivement remplacée par le dénombrement d’Escherichia coli,
considérée comme l’indicateur ultime d’une contamination fécale. Le test de Mackenzie a révélé la
présence de cette bactérie. On en conclue donc que ce L’Ben est impropre à la consommation.

Par ordre de spécificité on classera les indicateurs dans l'ordre suivant :