Construcción de un conmutador genético en Escherichia coli

Se ha propuesto que los circuitos reguladores de genes con prácticamente cualquier propiedad
deseada se pueden construir a partir de redes de elementos reguladores simples. Estas
propiedades, que incluyen multiestabilidad y oscilaciones, se han encontrado en circuitos
genéticos especializados como el bacteriófago l switch2 y el oscilador circadiano de
cianobacterias3. Sin embargo, estos comportamientos no han sido demostrados en redes de
componentes regulatorios no especializados. Aquí presentamos la construcción de un
interruptor de palanca genético, una red reguladora de genes biestable y sintética, en
Escherichia coli y proporcionamos una teoría simple que predice las condiciones necesarias
para la biestabilidad. La palanca se construye a partir de dos promotores reprimibles
dispuestos en una red inhibidora mutua. Se alterna entre estados estables mediante inducción
térmica o química transitoria y exhibe un umbral de conmutación casi ideal. Como dispositivo
práctico, el interruptor de palanca forma una unidad de memoria celular direccionable y
sintética y tiene implicaciones para la biotecnología, la bioinformática y la terapia génica. Una
teoría con capacidad predictiva facilitaría enormemente el diseño y la construcción de redes
reguladoras de genes sintéticos. El trabajo anterior que utilizó un sistema enzimático
reconstituido4 demostró que las matemáticas no lineales pueden predecir comportamientos
cualitativos de las redes de reacciones bioquímicas, incluidas la multiestabilidad y la histéresis.
Sin embargo, una teoría práctica de las redes reguladoras de genes ha quedado rezagada con
respecto a las redes reguladoras de enzimas. En el pasado se han utilizado una variedad de
enfoques físicos y matemáticos, que incluyen formulaciones lógicas (discretas)5±10, lineales
por partes11, no lineales12±14, estadísticas±mecánicas15,16 y estocásticas17±19 de la
dinámica bioquímica subyacente. Debido a la dificultad de probar sus predicciones, estas
teorías, en general, no han sido verificadas experimentalmente. Aquí hemos integrado la
teoría y el experimento al construir y probar un circuito genético biestable sintético basado en
las predicciones de un modelo matemático simple. El interruptor de palanca se compone de
dos represores y dos promotores constitutivos (Fig. 1). Cada promotor es inhibido por el
represor que es transcrito por el promotor opuesto. Seleccionamos este diseño para el
interruptor de palanca porque requiere la menor cantidad de genes y elementos reguladores
en cis para lograr un comportamiento biestable robusto. Por robusto, queremos decir que el
conmutador muestra biestabilidad en una amplia gama de valores de parámetros y que los dos
estados toleran las fluctuaciones inherentes a la expresión génica (el conmutador no cambiará
aleatoriamente entre estados). Aunque la biestabilidad es teóricamente posible con un solo
promotor autocatalítico, sería menos robusto y más difícil de ajustar experimentalmente.
Además, el diseño de palanca elegido no requiere promotores especializados, como el
promotor PR/PRM del bacteriófago l. La biestabilidad es posible con cualquier conjunto de
promotores y represores siempre que cumplan con el conjunto mínimo de condiciones
descritas en el Cuadro 1 y la Fig. 2.
Figura 1 Diseño de interruptor de palanca. El Represor 1 inhibe la transcripción del Promotor 1
y es inducido por el Inductor 1. El Represor 2 inhibe la transcripción del Promotor 2 y es
inducido por el Inductor 2.

La biestabilidad de la palanca surge de la disposición inhibidora mutua de los genes represores.

En ausencia de inductores, son posibles dos estados estables: uno en el que el promotor 1
transcribe el represor 2 y otro en el que el promotor 2 transcribe el represor 1. El cambio se
logra introduciendo transitoriamente un inductor del represor actualmente activo. El inductor
permite que el represor opuesto se transcriba al máximo hasta que reprime de forma estable
al promotor originalmente activo. Todos los interruptores de palanca se implementan en
plásmidos de E. coli que confieren resistencia a la ampicilina y contienen el origen de
replicación pBR322 ColE1. Los genes del interruptor de palanca están dispuestos como un
plásmido de tipo IV, como se muestra en la Fig. 3. Aunque todos los genes y promotores están
contenidos en un solo plásmido, en principio podrían dividirse en dos plásmidos separados sin
alterar la funcionalidad del interruptor de palanca. . Se construyeron dos clases de plásmidos
de interruptor basculante: la clase pTAK y la clase pIKE. Ambas clases utilizan el represor Lac
(lacI) junto con el promotor Ptrc-2 para un par promotor± represor. Para el segundo par
promotor±represor (P1, R1 en la Fig. 3), los plásmidos pTAK usan el promotor PLs1con junto
con un represor l sensible a la temperatura (cIts), mientras que los plásmidos pIKE usan el
promotor PLtetO-1 junto con el Tet represor (tetR). Los plásmidos pTAK cambian de estado
mediante un pulso de isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG) o un pulso térmico. Los
plásmidos pIKE cambian de estado mediante un pulso de IPTG o un pulso de
anhidrotetraciclina (aTc). Los promotores utilizados en la alternancia son PLtetO-1 (ref. 20)
(TetR reprimido), Ptrc-2 (LacI reprimido) y PLs1con (CI reprimido). El orden clasificado de las
eficiencias transcripcionales de los promotores es PLs1con. Ptrc-2. PLteto-1. En todas las
variantes del interruptor de palanca, la secuencia de los tres promotores no cambia. Las tasas
de síntesis de los represores (a1 y a2 en el modelo) o los genes informadores se modifican
intercambiando los sitios de unión al ribosoma (RBS) corriente abajo. Las secuencias del
promotor y RBS y sus fortalezas relativas se describen en la Información complementaria. En
todos los plásmidos toggle, el gen21 gfpmut3 está dispuesto como el segundo cistrón corriente
abajo del promotor Ptrc-2. Por lo tanto, la transcripción de Ptrc-2 y, por lo tanto, la represión
de P1, da como resultado la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) mut3. Para
mayor claridad, este estado se denomina estado 'alto'. El estado opuesto, en el que se
transcribe P1 y se reprime Ptrc-2, se denomina estado "bajo". A menos que se indique lo
contrario, gfpmut3 es el informador utilizado en todos los plásmidos. Para investigar las
condiciones requeridas para la biestabilidad, se construyeron seis variantes del interruptor
basculante (cuatro plásmidos pTAK y dos plásmidos pIKE) mediante la inserción de secuencias
RBS de diferentes intensidades en el sitio RBS1. Los cuatro plásmidos pTAK exhibieron
biestabilidad, mientras que solo un plásmido pIKE (pIKE107) exhibió biestabilidad. La
demostración de biestabilidad se ilustra en la Fig. 4. En este experimento, los plásmidos toggle
y control se cultivaron en E. coli cepa JM2.300 durante 23,5 h. A las 6, 11 y 18 h, las muestras
se lavaron y diluyeron en medio fresco con o sin inductores, según correspondiera. Las células
se cultivaron inicialmente durante 6 horas con IPTG 2 mM, induciendo la expresión de
GFPmut3 en todos los conmutadores y el plásmido de control pTAK102 inducible por IPTG. Las
células se cultivaron durante 5 horas adicionales sin IPTG. Los cinco plásmidos de alternancia
biestables, que se habían cambiado al estado alto, continuaron expresando GFPmut3 en
ausencia de inductor, mientras que el plásmido de control pTAK102 y el plásmido de
alternancia monoestable pIKE105 volvieron al estado bajo. A continuación, las células se
cultivaron a 42 °C (plásmidos pTAK únicamente) o en presencia de 500 ng ml-1 de aTc
(plásmidos pIKE únicamente). Después de 7 h de crecimiento, se detuvo la expresión de
GFPmut3 en todos los conmutadores, mientras que se activó la expresión de GFPmut3 en el
control pTAK106 inducible térmicamente y el control pIKE108 inducible por aTc. Las células se
devolvieron a la temperatura estándar (ver Métodos) sin inductores. Después de 5,5 h
adicionales, los cinco plásmidos de alternancia biestables permanecieron en el estado bajo,
mientras que los controles pTAK106 y pIKE108 volvieron, como se esperaba, a su condición no
inducida. La figura 4c muestra la estabilidad a largo plazo de los dos estados del plásmido
toggle pTAK117. En este experimento, un solo cultivo de células pTAK117 (inicialmente en
estado bajo) se dividió en dos cultivos. El primer grupo creció en medio sin inductores,
mientras que el segundo grupo creció en medio con IPTG 2 mM. Después de 6 h, las células se
lavaron y diluyeron en medio nuevo sin inductor. Ambos grupos de células se cultivaron
durante 22 h adicionales, se tomaron muestras y se diluyeron en medio fresco cada 6±8,5 h.
Los dos grupos de células pTAK117 permanecieron en sus estados altos o bajos iniciales
durante las 22 h completas.
Figura 2 Estructura geométrica de las ecuaciones toggle. a, Una red de alternancia biestable
con fuerzas promotoras equilibradas. b, Una red de palanca monoestable con fuerzas
promotoras desequilibradas. c, La región biestable. Las líneas marcan la transición (bifurcación)
entre biestabilidad y monoestabilidad. Las pendientes de las líneas de bifurcación están
determinadas por los exponentes b y g para grandes a1 y a2. d, Reduciendo la cooperatividad
de la represión (b y g) se reduce el tamaño de la región biestable. Las líneas de bifurcación se
ilustran para tres valores diferentes de b y g. La región biestable se encuentra dentro de cada
par de curvas.

Aunque todos los plásmidos de alternancia contienen la misma configuración de elementos,

un plásmido, pIKE105, no presenta biestabilidad. Este resultado probablemente se deba a la
menor eficiencia del represor Tet en relación con el represor l. Para mantener la biestabilidad,
la eficiencia reducida requiere una disminución correspondiente en la fuerza del promotor
PLtetO-1 en relación con el promotor PLs1con (ver Cuadro 1). El promotor PLtetO-1 en el
plásmido pIKE105 no tiene la fuerza suficientemente reducida para lograr la biestabilidad. Sin
embargo, la reducción de fuerza proporcionada por el promotor PLtetO-1 en el plásmido
pIKE107 es suficiente. Una predicción cualitativa del modelo de alternancia es que una
alternancia genética tendrá umbrales de conmutación casi ideales. La inducción por IPTG, aTc
o calor altera el equilibrio dinámico entre los promotores que compiten, de modo que la
palanca se empuja hacia una región de monoestabilidad. La transición de biestabilidad a
monoestabilidad se produce de forma brusca y discontinua debido a la existencia de una
bifurcación. Esta bifurcación ocurre cuando uno de los estados estacionarios estables es
aniquilado por el estado estacionario inestable. El umbral ideal, o bifurcación, en el interruptor
de palanca pTAK117 se ilustra tanto teórica como experimentalmente en la Fig. 5. En este
experimento, pTAK117 (inicialmente en el estado bajo) y pTAK102 (como control) se cultivaron
en 13 concentraciones diferentes de IPTG. durante 17 h hasta el estado estacionario,
diluyéndose dos veces (a las 6 y 12,5 h) en medio fresco con la misma concentración de IPTG.
La inducción del control pTAK102 tiene la forma sigmoidal familiar. Por el contrario, el
conmutador de pTAK117 sigue la curva de inducción de pTAK102 hasta una concentración de
IPTG de 40 mM, momento en el que cruza la bifurcación y muestra un salto casi discontinuo al
estado de alta expresión. Debido a las fluctuaciones naturales en la expresión génica, la
bifurcación no es una discontinuidad perfecta como lo predicen las ecuaciones deterministas
de alternancia. La naturaleza estocástica de la expresión génica provoca variabilidad en la
ubicación del umbral de conmutación y, por lo tanto, difumina el punto de bifurcación. Cerca
de la bifurcación, esta borrosidad se realiza como una distribución bimodal de células (Fig. 5c).

Figura 3 El plásmido interruptor de palanca. Los promotores están marcados con rectángulos
sólidos con puntas de flecha. Los genes se indican con rectángulos sólidos. Los sitios de unión
al ribosoma y los terminadores (T1T2) se indican mediante recuadros delineados. Se utilizan
diferentes promotores P1, sitios de unión al ribosoma RBS1 y/o represores R1 para los diversos
interruptores de palanca. Los tipos de plásmido I ± III, utilizados en la construcción y prueba de
los componentes de palanca, se describen en la Información complementaria.

El tiempo de cambio del plásmido pTAK117 del estado bajo al alto y del estado alto al bajo se
muestra en la Fig. 6. En este experimento, las células pTAK117 en el estado bajo se diluyeron
en medio nuevo y se indujeron con IPTG 2 mM. . Se cultivaron cultivos separados durante 35
min a 6 h antes de lavarlos y diluirlos en medio fresco sin inductor. El crecimiento se continuó
hasta 10,25 h después del comienzo del experimento y las células se ensayaron en el citómetro
de flujo. Por el contrario, las células pTAK117 en el estado alto se diluyeron en medio fresco sin
inductor. Se cultivaron cultivos separados a 41 ± 18 °C durante 35 min a 6 h antes de diluirlos
en medio nuevo sin inductor. El crecimiento se continuó a temperatura estándar hasta 10,25 h
después del comienzo del experimento y las células se analizaron en el citómetro de flujo.
Como se muestra por la aparición de una distribución bimodal a las 4 h (Fig. 6), el plásmido
pTAK117 comienza a cambiar al estado alto después de 3±4 h de inducción con IPTG. A las 5 h
la conmutación está casi completa y a las 6 h está completa. Por otro lado, el cambio del
estado alto al estado bajo se completa en 35 minutos o menos. El principal determinante del
tiempo de conmutación es la tasa de eliminación de las proteínas represoras. El cambio de
bajo a alto requiere la dilución gradual, por crecimiento celular, del represor Lac unido a IPTG.
Por otro lado, el cambio de alto a bajo se efectúa por desestabilización térmica inmediata del
represor l sensible a la temperatura. Por lo tanto, cambiar al estado bajo es sustancialmente
más rápido que cambiar al estado alto. Además, la configuración del plásmido pTAK117 (la tasa
de síntesis del represor Lac es más de un orden de magnitud mayor que la tasa de síntesis del
represor l) sugiere que el estado bajo es más estable que el estado alto.
Figura 4 Demostración de biestabilidad. El sombreado gris indica períodos de inducción
química o térmica. Las líneas en ayb, que son aproximaciones de la dinámica de conmutación,
se incluyen para mayor claridad. a, pTAK cambia plásmidos y controles. b, pIKE cambia
plásmidos y controles. c, Demostración de la estabilidad a largo plazo de los estados de
expresión separados en pTAK117.

Nuestro enfoque para la construcción de un interruptor de palanca genético representa una

desviación significativa de la ingeniería genética tradicional en la que nos basamos
principalmente en la manipulación de la arquitectura de la red, en lugar de la ingeniería de
proteínas y otros elementos reguladores, para obtener los comportamientos deseados.
Además, el acuerdo razonable entre la teoría de alternancia y el experimento indica que el
diseño teórico de redes genéticas complejas y prácticas es un objetivo realista y alcanzable.
Además, el interruptor de palanca genético ejemplifica un enfoque de ingeniería avanzada
para el estudio de la regulación de genes en el que los circuitos de genes sintéticos sirven
como modelos altamente simplificados y altamente controlados de redes de genes naturales.
Como dispositivo práctico, el interruptor basculante, que sólo requiere inducción transitoria en
lugar de sostenida, puede encontrar aplicaciones en terapia génica y biotecnología.
Finalmente, como una unidad de memoria celular, la palanca forma la base para los 'applets
genéticos': circuitos genéticos sintéticos, programables y autónomos para el control de la
función celular.
Figura 5 Umbral de inducción del interruptor de palanca. a, Expresión génica en estado
estacionario después de 17 h de inducción. El plásmido de alternancia pTAK117 (círculos rojos)
muestra un salto casi discontinuo al estado alto, mientras que el plásmido de control pTAK102
(triángulos azules) muestra una curva de inducción sigmoidal. El punto 1 se toma de
experimentos separados que miden el estado alto de pTAK117 sin inductor. Los puntos 3a y 3b
son los modos alto y bajo de una población celular distribuida bimodalmente. La bimodalidad
ocurre debido a las fluctuaciones naturales en la expresión génica y la proximidad del
interruptor de palanca a su punto de bifurcación. Las curvas teóricas se calculan a partir de la
ecuación (1) con el término u=…1 ‡ ‰IPTGŠ=K † h , donde K es la constante de disociación de
IPTG de LacR y h es la cooperatividad de la unión de IPTG, reemplazando u en el denominador
de la ecuación (1b). Las curvas rojas muestran los estados estacionarios estables y la curva
naranja muestra el estado estacionario inestable de la palanca. La curva azul muestra el estado
estacionario del plásmido de control inducible por IPTG. Los parámetros del modelo para las
curvas teóricas son a1 156:25, a2 15:6, b 2:5, g 1, h 2:0015, K 2:9618 3 10 2 5 . b, Fracción de
celdas basculantes en el estado alto a varias concentraciones de IPTG. El cambio repentino al
estado alto es más claramente visible. Las poblaciones de células altas y bajas se dividieron
como se describe para c a continuación. c, Gráficos de dispersión (gráficos de la izquierda) e
histogramas (gráficos de la derecha) que ilustran la condición de las celdas de alternancia en
los puntos 2, 3 y 4 (de a) cerca del punto de bifurcación. Las poblaciones de células de estado
alto y estado bajo se dividen por la línea roja en los diagramas de dispersión. Los dos estados
de la palanca son claramente evidentes en las celdas distribuidas bimodalmente (punto 3).
Figura 6 Tiempo de conmutación de pTAK117. a, b, La fracción de células en el estado alto se
representa en función del tiempo de inducción. Las células se dividieron entre estados alto y
bajo como en la Fig. 5c. c, Cambio de células pTAK117 del estado bajo al alto por inducción con
IPTG. La población de células se ilustra en cuatro puntos de tiempo. Las células comienzan a
cambiar entre 3 y 4 h como se muestra por la aparición de una distribución bimodal. La
conmutación se completa a las 6 h.

Métodos Numéricos Todas las curvas teóricas se calcularon numéricamente a partir de la

ecuación (1) (Cuadro 1) usando Matlab (Mathworks), XPP-AUTO, software para simulación y
análisis de ecuaciones diferenciales (GB Ermentrout, Universidad de Pittsburgh, disponible en
http://www .pitt.edu/,fase/), o AUTO, un paquete de bifurcación incluido en el software XPP-
AUTO (E. Doedel, Universidad McGill). Construcción de plásmidos Los plásmidos se
construyeron usando técnicas básicas de clonación molecular como se describe en los
manuales estándar de clonación22,23. Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs
y Promega; La polimerasa PfuTurbo era de Stratagene; todas las demás enzimas eran de New
England Biolabs; todos los oligonucleótidos sintéticos eran de Operon Technologies. Todos los
genes, promotores y terminadores de la transcripción se obtuvieron mediante amplificación
por PCR utilizando la polimerasa correctora PfuTurbo y cebadores sintéticos con extremos
salientes que contenían los sitios de restricción apropiados. Los sitios de unión al ribosoma se
incluyeron en los extremos salientes de los cebadores. Las mutaciones del sitio se realizaron
utilizando Stratagene QuickChange o ExSite. Los genes, promotores y terminadores de la
transcripción se obtuvieron como sigue: Ptrc-2 de pTrc99a (AP Biotech); PL de pXC46 (ATCC);
pLtetO-1 por síntesis total según la secuencia publicada20; lacI de pTrc99a; cIts de pGW7
(ATCC); tetR de pcDNA6/TR (Invitrogen); gfpuv de pGFPuv (Clontech); gfpmut3 de pJBA111
(obsequio de J. B. Andersen, Universidad Técnica de Dinamarca); y terminadores rrnT1T2 de
pTrc99a. Todos los plásmidos contenían la región de resistencia a la ampicilina y ColE1 y el
origen de replicación del plásmido pTrc99a. Toda la clonación se realizó mediante
transformación TSS22 en la cepa de E. coli JM2.300 (CGSC), JC158 (CGSC) o TAP106 (ATCC). La
secuenciación del ADN se realizó con un secuenciador Perkin-Elmer ABI Prism 377. Cepas,
condiciones de crecimiento y productos químicos La célula huésped para todos los ensayos de
promotores y experimentos con interruptor basculante fue la cepa de E. coli JM2.300 (l-, lacI22
rpsL135 (StrR), thi-1) (cepa CGSC 5002). JM2.300, que contiene pocas mutaciones, es una cepa
de rápido crecimiento que puede tolerar una sobreexpresión enorme de genes unidos a
plásmidos. Debido a que JM2.300 no contiene represor l y lleva un represor Lac no funcional
(lacI22), es un anfitrión ideal para el interruptor de palanca. Todas las células se cultivaron en
medio LB (Difco) con 100 mg ml-1 de ampicilina más inductores como se indica en el texto.
Todos los plásmidos de la serie Tipo I y pIKE se cultivaron a 37 6 1 8C, a menos que se indique
lo contrario. Todos los plásmidos de la serie pTAK se cultivaron a 32 6 1 8C excepto durante la
inducción térmica. La inducción térmica se llevó a cabo a 42 6 1 8C, a menos que se indique lo
contrario. Para todas las pruebas de expresión, las células se mantuvieron en fase de
crecimiento logarítmico mediante una dilución periódica de 500 ± 1000 veces en medio fresco.
Ampicilina e IPTG eran de Sigma. La anhidrotetraciclina era de ACROS Organics. Todos los
demás productos químicos eran de Fisher.

Recuadro 1 El modelo de palanca

El comportamiento del interruptor de palanca y las condiciones de biestabilidad se pueden

entender utilizando el siguiente modelo adimensional para la red:

donde u es la concentración del represor 1, v es la concentración del represor 2, a1 es la tasa

efectiva de síntesis del represor 1, a2 es la tasa efectiva de síntesis del represor 2, b es la
cooperatividad de represión del promotor 2 y g es la cooperatividad de la represión del
promotor 1. El modelo anterior se deriva de una formulación de ecuación de velocidad
bioquímica de expresión génica 24±27. La forma final de las ecuaciones de alternancia
conserva los dos aspectos más fundamentales de la red: la represión cooperativa de los
promotores transcritos constitutivamente (el primer término de cada ecuación) y la
degradación/dilución de los represores (el segundo término de cada ecuación). Los parámetros
a1 y a2 son parámetros agrupados que describen el efecto neto de la unión de la ARN
polimerasa, la formación de complejos abiertos, la elongación de la transcripción, la
terminación de la transcripción, la unión del represor, la unión del ribosoma y la elongación del
polipéptido. La cooperatividad descrita por b y g puede surgir de la multimerización de las
proteínas represoras y la unión cooperativa de multímeros represores a múltiples sitios
operadores en el promotor. Se necesita una modificación adicional a la ecuación (1) para
describir la inducción de los represores (Fig. 5). La estructura geométrica de la ecuación (1),
ilustrada en las Fig. 2a y b, revela el origen de la biestabilidad: las nulasclinas (du=dt ˆ 0 y dv=dt
ˆ 0 en la Fig. 2) se intersecan en tres puntos, produciendo uno inestable y dos estados
estacionarios estables. De la Fig. 2a yb, se hacen evidentes tres características clave del
sistema. Primero, las nulasclinas se intersecan tres veces debido a su forma sigmoidea, que
surge para b, g. 1. Así, la biestabilidad del sistema depende de la represión cooperativa de la
transcripción. En segundo lugar, las tasas de síntesis de los dos represores deben estar
equilibradas. Si las tasas no están balanceadas, las inclinaciones nulas se intersecarán solo una
vez, produciendo un único estado estacionario estable. Esta situación surge en el plásmido
pIKE105. En tercer lugar, la estructura de la red alterna crea dos cuencas de atracción. Por lo
tanto, una alternancia con una condición inicial en cualquier lugar por encima de la separatriz
se establecerá en última instancia en el estado 1, mientras que una alternancia que comience
por debajo de la separatriz se establecerá en el estado 2. Las condiciones para una red de
alternancia biestable se ilustran en las figuras 2c y d. A medida que aumentan las tasas de
síntesis del represor, aumenta el tamaño de la región biestable. Además, las pendientes de las
líneas de bifurcación, para grandes a1 y a2, están determinadas por b y g. Así, para obtener la
biestabilidad, al menos uno de los inhibidores debe reprimir la expresión con una
cooperatividad superior a uno. Además, la cooperatividad de orden superior aumentará la
solidez del sistema, lo que permitirá que los promotores más débiles alcancen la biestabilidad
y produzcan una región biestable más amplia.