UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDIŞ DIN ARAD

MASTERAT

ANALIZE DE LABORATOR UTILIZATE ÎN

DOMENIUL BIOMEDICAL

REFERAT

MIJLOACE TEHNICE UTILIZATE ÎN CULTURI DE CELULE

Masterand
Clejan (Şaitiş) Maria
Tipuri celulare întâlnite în organismul uman.

Proliferare şi diferenţiere celulară, culturile celulare

Toate tesuturile sunt constituite din celule si substanta intercelulara. Substanta intercelulara
poate fi reprezentata într-o cantitate ce difera în functie de tesut: foarte redusa cum întâlnim în
tesutul epitelial sau abundenta în tesutul conjunctiv. La tesutul conjunctiv în aceasta substanta
se gasesc si elemente fibrilare. Atât substanta intercelulara cât si fibrele sunt produse de
elaborare ale celulelor tisulare locale. Astfel devine clar ca elementul constitutiv de baza al
fiecarui tesut este celula, care reprezinta unitatea morfologica si functionala a oricarui tesut.

Dimensiunile celulei sunt particulare fiecarei localizari tisulare în diferite organe:

-4-5 microni (celulele granulare din cerebel),

-7-8 microni (limfocite, eritrocite),

-30-40 microni (neuronii din coarnele anterioare ale maduvei spinarii),

-180-200 microni (ovulul).

Forma celulelor

Este dependenta de functia lor si de modul de agregare, din care cauza celulele în preparatele
histologice se prezinta sub forme variate:

-celula sferica: ( ovocit, leucocit, adipocit, condrocit, etc),

Celula sferică. Adipocitul (celula grasa). Are un 22522f521w contur sferoidal, continând un
nucleu turtit si situat spre periferie, sub plasmalema si putina citoplasma.

Celula poliedrică (celulele spinoase din epiteliul malpighian –epiderm, epiteliul bucal),

Celule poliedrice. Celulele stratului spinos epidermic sunt prevazute cu multe laturi, au nucleul
sferic si situat central, 1, iar între ele lasa spatii intercelulare. Celulele nu sunt lipite una de alta
si se leaga între ele prin spini intercelulari, 2, (desmozomi).

Celula pavimentoasă (celulele endoteliale, celulele mezoteliale),

Celula turtita (pavimentoasa) cu citoplasma putina si întinsa iar nucleul discoidal proemina în
zona centrala. Limitele celulare se evidentiaza prin impregnare argentica , se coloreaza în negru.
Celula stelată (neuronul – celulele nervoase).Corpul celulei prezinta prelungiri periferice care
sunt mai intens impregnate la origine dând celulei aspect stelet. Nucleul este rotund, slab
colorat, cu nucleol situat central.

Celula fuziformă. Celula musculara neteda. Celula are forma alungita, (de aici si numele de
fibra) si ascutita la cele doua capete, (forma de fus). Nucleul alungit este situat central.

Celula flagelata. Spermatozoidul. Se remarca la o extremitate a celulei capul spermatozoidului

ovalar, intens colorat (contine nucleul) si o prelungire subtire si usor flexuoasa-coada (flagelul)
spermatozoidului.

Celula piriformă(celula Purkinje,din scoarta cerebeloasa).

Celula cubică ( celulele epiteliului tiroidian, celulele plexurilor coroide, celulele din epiteliul
canaliculului biliar din spatiul Kiernan), Celula are forma cubica, nucleu sferic situat central.

Celula cilindrică (celula epiteliului mucoasei gastrice, celula epiteliului mucoasei intestinale,
celula epiteliului mucoasei uterine), Celule cilindrice, înalte, ce prezinta doi poli (pol bazal si pol
apical). La polul apical apar fine striatii, platoul striat. Nucleul este ovalar situat în treimea
inferioara.

Celula caliciformă (celula mucoasa din epiteliul mucoasei intestinale si din epiteliul mucoasei
respiratorii),Celula caliciforma ( are forma unui caliciu de floare sau a unei cupe de sampanie)

Celula piramidală (neuronii piramidali din scoarta cerebrala, celula secretorie din acinii serosi),

Celula cu prelungiri mult ramificate dându-i un aspect neregulat (Ex: celula pigmentara,
melanocitul). Pigmentul secretat de melanocit este melanina, ce confera citoplasmei aspectul
brun închis.Celula pigmentara ce prezinta prelungiri mult ramificate dându-i celulei un aspect ce
nu-i permite încadrarea în nici o forma bine precizata, din care cauza i se spune ca este de
forma neregulata. Este colorata prin pigmentul sau.

Celula discoidală (hematia), sau echivalente celulare. Este anucleata, vazuta din fata este
rotunda si mai slab colorata la mijloc, vazuta din lateral apare ca un disc biconcav.

Plasmodiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata dintr-o singura celula prin
cresterea citoplasmei si înmultirea nucleilor. Ex: Fibra musculara striata.Se remarca forma de
panglica a fibrei musculare striate în a carei citoplasma bogata si eozinofila se gasesc numerosi
nuclei ovalari, dispusi în periferie. Sub sarcolema, aspectul striat al citoplasmei, este dat de
structura specifica a miofibrilelor fibrei musculare.

2
Sinciţiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata prin contopirea mai multor
celule. Ex. Osteoclastul, sincitiul trofoblastic, etc. Apare ca o celula voluminoasa cu citoplasma
bogata, cu contur neregulat continând multi nuclei sferoidali.

Metode de studiu ale biologiei celulare

Culturile de celule

Dezvoltarea organismului uman este rezultatul unor procese de diviziune, crestere, înmultire si
diferentiere celulara care duce la dobândirea unor functii si structuri morfologice specifice
tipurilor de celule. Mecanismele cresterii si proliferarii celulelor au fost urmarite experimental
prin cultivarea de celule « in vitro ».

Definiţie: termenul general de "culturi de celule" desemneaza totalitatea tehnicilor prin care
un organ, un tesut sau celule dispersate (natural sau prin tehnici de laborator) sunt mentinute
în viata sau multiplicate în afara organismului ("in vitro").

Prin culturile de celule, se poate studia comportamentul celulelor în conditii strict definite:

-se adauga sau se extrag molecule specifice (de exemplu factori de crestere) si se determina
efectele asupra comportamentului celular;

-se obtin populatii omogene de celule pentru analize biochimice; pe culturi mixte, se studiaza
interactiunile între tipurile celulare.

Pe lânga scopurile de cercetare, culturile de celule sunt folosite si pentru producerea

vaccinurilor virale.

A. Clasificarea culturilor de celule :

Dupa felul substratului, pot fi: 3
- pe suport organic nutritiv;

- pe suport organic nenutritiv;

- pe suport anorganic;

- în suspensie în mediu lichid.

Dupa tipul de material biologic cultivat se disting doua mari categorii de culturi:

1. Culturi de organe (organocultura) - reprezinta întretinerea, de obicei fara multiplicare, în

medii nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee, rinichi).

În general, cultura de organe "in vitro" este dificila si necesita medii nutritive complexe si
conditii tehnice speciale.

2. Culturi de celule - reprezinta multiplicarea "in vitro" a celulelor din:

-fragmente de tesut (explante); in jurul explantului se formeaza o coroana de celule care se

multiplica;

-suspensii de celule naturale sau obtinute prin dispersarea în laborator.

În prezent, se pot obtine culturi celulare în linie continua, mentinute de-a lungul a 15-20 de
pasaje fara a se transforma sau degenera, precum si linii celulare stabilizate, care îsi mentin
nealterati parametrii morfologici si fiziologiei initiali dupa multiple diviziuni.

Clonarea reprezinta separarea unei singure celule si multiplicare a ei separata rezultând o linie
celulara uniforma din punct de vedere genetic.

În organism, celulele se gasesc sub influenta mecanismelor de conservare si control. Odata

scoasa din mediul natural de viata, celula are nevoie, pentru a supravietui si a se multiplica "in
vitro", de o serie de conditii de ordin fizic, chimic, bioenergetic care sa mimeze cât mai mult
situatia "in vivo".

Reusita culturilor de celule "in vitro", depinde în mare masura de:

-folosirea instrumentarului steril;

-aplicarea unor tehnici aseptice;

-utIlizarea unor medii de cultura care sa asigure celulelor cultivate "in vitro" conditii apropiate
de acelea pe care le ofera organismul viu. 4
Deosebirile esentiale dintre aceste doua modalitati de viata si de multiplicare celulara sunt:

- "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin si influentei tesuturilor din
vecinatate; aportul de substante nutritive si eliminarea produselor de metabolism se face
continuu prin sânge si limfa;

- "in vitro", celulele nu sunt supuse acestui control; aportul si eliminarea sunt periodice.

B. Mediile de cultură
Se pot clasifica dupa mai multe criterii:

după consistenţă - sunt medii lichide si semilichide;

după compoziţie - exista medii naturale, semisintetice si sintetice;

după valoarea nutritivă şi scopul urmărit - se cunosc medii de crestere, care asigura
proliferarea celulelor din cultura, medii de mentinere utilizate pentru întretinerea culturilor
ajunse la dezvoltare maxima si care pastreaza toate activitatile celulare si medii defective,
testarea celulelor în conditii speciale de crestere.

Mediile de cultură celulară trebuie să asigure:

-echilibrul ionic obtinut cu solutii izotone (pentru pastrarea continua a presiunii osmotice); pH-
ul optim (pH 7.2 - 7.4) mentinut cu substante tampon (tampon fosfat sau bicarbonat de sodiu –
CO2); în mediu exista si un indicator de pH;

-temperatura optima, continutul de 02 si de CO2 favorabil;

-elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidrati de carbon (glucoza), proteine

animale (din lichide biologice - plasma, ser, lichid amniotic) si aminoacizi esentiali, grasimi,
vitamine, hormoni, substante stimulatoare ale cresterii;

-evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice (penicilina,

streptomicina) si antifungice (stamicin, micostatin);

-stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugarea de extracte embrionare.

5
Mediile nutritive conţin:

-o solutie salina (solutie tampon si indicator);

-elemente proteice (ser sau plasma sau lichid amniotic, aminoacizi);

-elemente stimulatoare ale cresterii (extracte tisulare de origine embrionara sau adulta);

-vitamine;

-antibiotice.

C. Tehnica culturii celulare

Se desfasoara în mai multe etape, în toate etapele se respecta riguros regulile de asepsie.

a. Reeditarea - se face din cele mai varitate tesuturi provenite de la om, animal sau plante.
Dupa provenienta lor tesuturile ce urmeaza a fi cultivate se împart în:

- tesuturi normale: - embrionare (se cultiva usor, crestere rapida);

- adulte (medii complexe, crestere lenta, precedate de un timp de latenta de

câteva zile);

-tesuturi tumorale.

b. Dispersarea mecanică (maruntirea embrionului) se realizeaza într-un mediu steril, cu ajutorul

unui foarfece special. Daca nu se obtin rezultate satisfacatoare, fragmentele rezultate sunt
supuse dispersarii chimice cu tripsina la 37°C, pe suprafata unui agitator magnetic.

Actiunea tripsinei se opreste prin racirea solutiei si apoi celulele se separa de solutia de tripsina
prin centrifugare si se înlatura supenatantul reprezentat de tripsina.

Se resuspenda sedimentul celular într-un mediu nutritiv, apoi se prepara o dilutie 1:10 a
suspensiei celulare în mediu nutritiv pentru efectuarea numararii.

c. Numărarea cu camera de numarare (hemocitometru).

6
Din dilutia preparata (9 ml de mediu nutritiv, 1 ml din suspensia de celule) se pune o picatura
pe suprafata unei camere de numarare, pentru a stabili densitatea celulelor din suspensie.

Dupa determinarea densitatii suspensiei celulare, se adauga un anumit volum de mediu nutritiv
astfel încât sa se ajunga la numarul optim de celule pe mililitru, si anume 106 celule /ml.

d. Determinarea viabilităţii celulelor din suspensie cu ajutorul solutiei de albastru de triptan

0.5%;

-se adauga 0.1 mI solutie în 0.9 ml de suspensie celulara.

-o picatura din acest amestec se examineaza la micro scopul fotonic

- celulele vii ramân necolorate, cele moarte aparând albastru-violet.

Mortalitatea nu trebuie sa depaseasca 10%.

e. O cantitate din suspensia de celule pentru care s-a determinat viabilitatea si densitatea
optima se repartizeaza pe suprafata recipientului de cultura, cât mai uniform, cu ajutorul unei
pipete Pasteur; se tine la termostat la 37°C, timp de 30 - 60 min. apoi se introduce mediul de
cultura, astfel ca el sa nu antreneze fragmentele fixate pe peretii recipientului. Vasul se închide
si se incubeaza la 37°C, fara a se agita timp de 3-4 zile.

Metoda este analoga si în cazul utilizarii testurilor solide umane, embrionare sau adulte.

f. Controlul culturilor

Controlul mediului de cultura se efectueaza la 12-24 de ore pentru:

- contaminare (bacterii, fungi, virusi);

- constantele fizico-chimice (pH, proteine totale);

-aprecierea eficientei culturii (densitatea celulara pe suport, eficienta de formare a coloniilor).

Controlul morfologic al celulelor din culturi se face prin:

- microscopie fotonica pe preparate proaspete se examineaza celulele vii la microscopul cu

contrast de faza sau pe preparate permanente fixate si colorate;

- histoautoradiografie;

- microscopie electronica.

7
Activitate practică

Cultura de limfociti din sângele periferic

Reeditarea – Se ia 3ml sânge, prin punctie venoasa la plica cotu1ui, cu ajutorul unei seringi
sterile, heparinata anterior recoltarii. Se poate recolta sânge si din punctie în pulpa degetului,
însa aceasta metoda comporta risc de infectie a culturii mai frecvent, motiv pentru care are
aplicatie limitata.

Însamântarea mediului - consta în repartizarea mediului de cultura special în flacoane de sticla

sterile de 20 - 30 ml, în care se va pune 10 ml de mediu de cultura în conditii sterile. Se lasa sa
ajunga la temperatura camerei, dupa care se plaseaza în fiecare flacon 12 - 20 picaturi din
sângele recoltat (numarul picaturilor fiind în functie de leucograma persoanei investigate).

Se închide flaconul cu un dop steril si se agita usor pentru omogenizare.

Cultura este tinuta la termostat la 37C° timp de 72 - 96 ore, interval în care la fiecare 24 ore se
verifica ph-ul si aspectul.

Acidifierea mediului este tamponata cu fosfat - tampon.

Culturile care îsi schimba culoarea sau devin tulburi, vor fi întrerupte, deoarece cultura este
compromisa.