Imunoglobuline: structura si functie Primele dovezi asupra faptului ea anticorpii se regasese intr-o anumita particulara fractiune a serului au aparut in 1939, cand Tiselius si Kabat au imunizat iepuri cu Ovalbumina. Serul animalelor a fost impartit in doua si a fost supus electroforezei bumine, al-, Electroforeza proteinelor serului permite separarea acestora in 5 fractii major a2-, B- si y-globuline. i Diferenfele de migrare ale proteinelor in cmpul electric sunt datorate sarcinilor electrice istincte, marimii si greutitii moleculare ale moleculelor, dar si unor caracteristici ale mediului de migrare (in principal pH') sau unor condifi fizice (de ex. temperatura). Benzile de migrare de la nivelul gelului vor putea fi ulterior colorate, iar scanarea densitometric’ a acestora va permite transformarea patter-ului benzilor in grafice caracteristice (electroforegrame), ceca ce permite cuantificarea fiecirei fractii proteice. Intensitatea marciiii/grosimea benzii determin dimensiunea varfului reprezentat in grafic, iar aceasta reflecti concentratia fractici respective. Aare By Govt bettas obtinute ey Deieiaed wane arose ke electroforegrami normali; B. gammopatie monoclonali; C. gammopatie policlonald; D. inflamatie cror Tratarea serului cu antigenul a condus la formarea unui precipitat, iar apoi, serul restant a fost supus electroforezei, constatandu-se scaderea exclusiva a fractici 7. Concluzia a fost ca in aceasta particulara fractie se regasesc moleculele specifice pentru antigen, care au fost denumite imunogobutine, pentru a le distinge de alte proteine care s-a incadra in aceeasi fractie electroforetica. Majoritatea isotipurilor de imunoglobuline se regisesc in fractia y a serului. Gammopatiile policlonale sunt caracterizate de benzi largi, difuze si intens colorate la nivelul fractiei y, cea ce reflecti 0 crestere a cantititii de imunoglobuline cu diferite isotipuri gi specificititi (C). Aceste molecule sunt secretate de plasmocite diverse si reprezintd, cel mai adesea, rezultatul stimulitii antigenice cronice de catre diversi patogeni (D). Aparitia unui varf ascutit in regiunea y-globulinelor din electroforegrama este sugestiva pentru prezenja unei gammopatii monoclonale. © astfel de protein’ apare ca o consecin{i a proliferarii necontrolate (in dauna altor clone de limfocite B) a unei singure clone de limfocite, care s-au diferentiat in celule secretante de anticorpi. In majoritatea cazurilor, stimulul nu este unul antigenic, cel mai adesea fiind vorba de o afectiune maligna B (B). " Protcinele sunt substane amfotre, astfel cd in funete de pH-ul medlu, se pot compona ca baze sau aciz, oe ce se reflect 9 asupra sarin lor electrice. Inu tampon de migraealcalin de excmpla, proteinele vor aves carter acid io sarcing electri negtva Scanned with CamScannerStructura Molecula cel mai intens investigata in studiile de structura a fost IgGl, considerata a fi smolecula prototip”, cea mai bine reprezentata din punet de vedere cantitativ si care se gaseste exclusiv sub forma de monomer. Fiecare astfel de monomer este format din doua lanturi usoare (Light ~ L) identice cu 0 GM de aprox. 25 kDa si doua lanturi grele (Heavy ~H) identice, cu GM de aprox. 50 kDa. Fiecare lant usor este legat de un lant grew prin intermediul unei legaturi disulfidice inter-lant, o egatura covalenta foarte putemica, la care se adauga a combinatie de legaturi ne-covalente cum at fi legaturi hidrofobe, legaturi de hidrogen ete. Intre cele doua lanturi grele se gasesc egaturi similare. Studi enzimatice Intelegerea structurii acestei molecule a fost posibila ca urmare a experimentelor de digestie enzimatica. Rodney Porter si Gerard Edelman au fost rasplatiti cu premiul Nobel in 1972. Pentru inceput, fractia y a serului a fost separata intr-o fractie cu greutate moleculara crescuta si una scazuta. Ambii s-au concentrat asupra fractiei cu GM scazuta. Astfel, Porter a clivat molccula pentru o perioada scurta de timp cu papaina si a separat doua fragmente. Desi are, in general, 0 activitate proteolitica nespecifica si ar putea sa cliveze intreaga molecula de IgG, tratamentul de scurta durata conduce doar la clivarea legaturilor mai susceptibile. In urma acestui tratament au fost obtinute doua fragmente identice cu 0 GM de 45 kDa care isi pastreaza activitatea de legare a antigenului si care au fost denumite Fab (fragment antigen binding) si un fragment de SO kDa denumit Fe (fragment crystallizable) deoarece, in urma pastrarii peste noapte la temperatura scazuta, cristalizeaza. Disulfide Lebain : eV | te poe Papin digestion Mercaptoethanot red Fab Fab 7 e Sy +] |tenain ey HS ‘SH si Fe SH H chain Scanned with CamScannerSecventele de aa ale lanturilor prezinta cateva diferente minore, Ia nivelul catorva aa, pe baza caror sunt impartite in subtipuri: la sorece sunt 3, iar la om sunt 4. Secventierea lanturilor H Pentru studiul lanturilor H, proteinele mielomatoase au fost reduse cu mercaptoctanol si alchilate, iar apoi lanturile H au fost separate prin filtrare pe gel intr-o solutie de denaturare. Cand a fost comparata secventa in aa, a aparut un pattern similar ca cel al lanturilor L: partea ‘N-terminala, formata tot din cca 110 aa prezenta o variatie importanta a secventei si a fost denumita regiune variabila. Restul lantului prezenta 5 tipuri de secventa de baza, corespunzatoare a 5 tipuri de regiuni constante ale lanturilor grele (1, 5, 7, & @). Fiecare din aceste tipuri de lanturi grele defineste un «isotip». Lungimea regiunii constante este de cca 330 aa pentru 6, y sia si de cca 440 aa pentru p sis. Lanturile grele ale unei anumite molecule de anticorp determina clasa acelui anticorp. Fiecare clasa poate folosi oricare tip de lant L. O singura molecula de anticorp prezinta doua lanturi H identice si doua lanturi L identice Diferente minore ale secventei de aa ale lanturilor grele a si 7 a condus la impartirea suplimentara in subclase. La om exista doua subclase de lanturi a si 4 subclase de lanturi . (a) Heavy chain Light chain 1.7.0.6, or € Kork coo- coo- Structura Ig este determinata de organizarea primara, secundara, tertiara si cuatemara a proteinei. Structura primara — secventa liniara de aa, permite impartirea lanturilor in regiuni variabile si constante. Scanned with CamScannerAlfred Nissonof a utiizat pentru digestie pepsina, cu care a separat un fragment de 100 kDa compus din doua fragmente Fab si care a fost denumit F(ab"). Spre deosebire de fragmentele Fab, F(ab’): era capabil sa precipite antigenele. In urma scindarii cu pepsina nu a putut fi separat un fragment de tipul Fc, deoarece acesta a fost digerat in multiple fragmente. Edelman a disociat molecula prin reducerea legaturior disulfidice inter-lant, Porter a redus si el molecula cu mercaptoetanol si a alchilat-o, un tratament chimic care reduce ireversibil legaturile disulfidice. Apoi, proba a fost analizata prin cromatografie pe 0 coloana care separa moleculele in functie de marimea lor si au fost identificate astfel doa Janturi de $0 kDa si doua lanturi de 25 kDa, denumite H si L. Ramanea de facut legatura dintre rezultatele scindarii enzimatice si lanturile obtinute prin distrugerea legaturilor disulfidice. Tot Porter este cel care imunizeaza capre, fie cu fragmente Fab umane, fie cu fragmente Fc. Anticorpii anti-Fab s-au dovedit capabili sa reactioneze atat ccu lanturile H cat si L, in timp ce anticorpii anti Fe nu recunoasteau decat lanturile H. Accasta observatie a condus la concluzia ca fragmentele Fab constau dintr-o portiune de lant greu si lant usor, in timp ce fragmentul Fe contine doar componente ale lantului greu. In urma acestor rezultate, Edelman si Porter au propus modelul care a devenit atat de ‘cunoscut, cel al moleculei alcatuite din doua lanturi H identice si doua lanturi L identice, unite prin legaturi disulfidice. Studii de seeventiere Debutul a fost foarte dificil datorita faptului ca nu existau cantitati suficiente de proteina perfect omogena. Secventierea a devenit posibila doar atunci cand au fost descoperite micloamele, 0 malignitate a plasmocitelor. Daca in mod normal o astfel de celula reprezinta un stadiu final de diferentiere, un plasmocit malign este o celula care scapa mecanismelor de control si, ca atare, se poate divide in continuare fara sa fie nevoie de o stimulare antigenica. Anticorpii produsi de aceste celule maligne sunt, din punct de vedere structural, identici cu cei normali; sunt denumiti insa proteine miclomatoase pentru a se preciza sursa lor. La un pacient ‘cu mielom, cca. 95% dintre anticorpii serici pot fi reprezentati de proteina mielomatoasa. La multi pacienti, celulele mielomatoase secreta, de asemenea, lanturi usoare in exces — descoperite initial in urina acestor pacienti si denumite proteine Bence-Jones (dupa medicul american care le-a evidentiat)?, Mielomul poate apare nu doar la om ci si la animale, de ex. la soareci, atat in mod spontan cat si indus prin injectarea de ulei mineral (mineral oil) in cavitatea peritoneala. Clonele de plasmocite maligne care se dezvolta sunt denumite plasmocitoame si sunt denumite MOPC (mineral oil plasma cells). ‘Secventierea lanturilor usoare data ce compararea secventelor de aa ale diferitelor proteine Bence-Jones, provenite de la diversi indivizi a fost posibila, s-a constatat ca existau diferente importante intre ele la nivelul jumatatii situate catre capatul N-terminal. Aceasta regiune a fost denumita ca atare ,regiune variabila”, In schimb, portiunea situata catre capatul C-terminal, a fost denumita regiune constanta, avand doar doua tipuri de secvente de baza, ceea ce a condus la identificarea a doua tipuri de lantuiri usoare: k si A. La om, cca 60% dintre lanturile L sunt de tip k, in timp ce la soarece cca 95% dintre lanturile L sunt k. O anumita molecula de Ac nu le poate contine pe amandoua, fie ambele sunt de tip k, fie de tip 2. * Proteinele Bence Jones sunt paraproteine cu o greutate de cca. 40kDa, prezente in citea $0-60% din cazurile de ‘mielom, precum si in macroglobulinemia Waldenstrom. Prezenta Jor in urina atesta totodata o diminuare a capacitatt de fitrare a rinichiulu, determinata fie chiar de catre lanturile usoare in sine, fie ca urmare a hipercalcemici care epare ca 0 consecinta a distructiei osoase. Identificarea proteinelor Bence-Jones se bazeaza pe comportamentul lor particular, incalzirea urinii la 45-60°C conducand la precipitarea acestor proteine, iar {ncalzirea ine ontinuare la 90-95"C conducand la redizolvatea precipitatulu, Scanned with CamScannerStructura secundara este formata prin plierea (folding) lantului polipeptidi in stratui (foi) B pliate. Lanturile sunt plite intr-o structura tertiara, care conduce a formarea de domenii globulare, care sunt conectate la domeniile invecinate prin continuarea lanturilor polipeptidice in afara foilor B pliate. In final, domeniile globulare ale domeniilor grele si usoare adjacente interactioneaza si creaza structura cuatemara, formand domenii functionale care permit, printre altele, Ig-nei sa lege specific un anumit Ag. Domenii Analizele de structura au demonstrat ca atat lanturile L cat si H contin o serie de unitati homologe de cca 70-110 aa. In cadrul fiecarei astfel de unitati, denumita domeniu, exista 0 Iegatura disulfidica intralant, care creaza o bucla de cca 60 aa, o) Antigen) binding Biological activity 446 Seeventele de aa ale domeniilor nu sunt identice dar sunt similare si genereaza o forma particulara in spatiu. Lanturile L contin un domeniu V si unul C; lanturile H contin un domeniu V si 3 sau 4 domenii C, in functie de clasa Ig-nei. Analiza cristalografica a aratat ca domeniile Ig-nelor se pliaza de o maniera caracteristica, conducand Ia o structura compacta, Aceasta consta din doua straturi opuse, alcatuite din foi B Pliate, unite intre cle prin ,bucle de conexiune”, avand diferite lungimi, Foile B pliate din cadrul unui strat sunt stabilizate prin legaturi de hidrogen care leaga gruparile NH dintr-o foaie cu gruparile carbonil din foia adjacenta, Foile B pliate sunt caracterizate prin aa hiidrofobi si hidrofilialtemativi, ale earor catene laterale sunt dispuse perpendicular pe planul stratului, Aminoacizii hidrofobi sunt orientati catre interior, iar cei cei hidrofilicatre exterior. Cele doua straturi opuse sunt stabilizate prin interactiuni hidrofobe si prin intermediul legaturii conservate disulfidice intralant. Scanned with CamScanneri strand arrangement interactiunile necovalente dintre domenii, prin intermediul fetelor aleatuite din foi pliate. Astfel de interactiuni se formeaza intre straturi identice dintre domenii non-identice: V.-Vi, Ci-Cyy sau identice: C2-Crr2, Crs-Cs. © Antigen-bisting aS -Anugeh-binding sve carbotyunte Scanned with CamScannerStructura domeniului globular permite, de asemenea, reatizarea unor bucle de conexiune cu lungimi si secvente variabile, aspect extrem de important pentru ca tocmai aceste segmente sunt cele care participa la realizarea paratopului. Domeniile regiunii variabile Analiza comparativa a unei multitudini de lanturi a condus la realizarea asa numitelor diagrame Wu-Kabat. Acestea au evidentiat ca, in cadrul regiunilor variabile, diferentele dintre lanturi se regasese in fapt la nivelul unor secvente reduse ca intindere, care au fost denumite CDR (complementarity determining region) sau regiuni hipetV si care reprezinta maximum 20% din totalul de cca 110 aa al domeniului V. Au fost identificate 3 astfel de regiuni hiperV, atat la nivelul lantului L cat si la cel H. Restul domeniului V prezinta o variatie mult mai redusa ~ aceste portiuni sunt denumite ,regiuni cadru”. Regiunile CDR sunt de fapt cele care contribuie efectiv 1a realizarca situsului de interactiune cu Ag-nul si se regasesc Ia nivelul buclelor de conexiune dintre foile pliate. Regiunile cadru se regasesc Ia nivelul foilor f pliate si actioneaza ca un suport pentru cele 6 bucle. Daca dispunerea spatiala a foilor B pliate este aceeasi pentru toate domeniile, in schimb orientarea spatiala a buclelor difera de la Ig la Ig. Vir domain CDRI CDR2 CDR3 150, b 100} Z = : $0 0 0 20 40 60 80 100 120 Residue position number Studiile de cristalografie au reusit de asemenea sa documenteze interactiunea dintre anticorpi si antigene dintre cele mai diverse, de la haptene si carbohidrati pana la acizi nucleici, peptide mici sau proteine mari globulare. In sistemul lizozim-anti-lizozim (proteina mare, globulara), s-a evidentiat ca suprafata de interactiune este relativ mare (intre 650-900 A), plata, cu cateva ondulatii, La nivelul unei astfel de suprafete pot lua contact intre 15 si 20 a, In cazul anticorpilor care leaga antigene mai mici, situsul de legare este mai mic si seamana chiar cu ‘un buzunar. Desi situsul de legare al Ig-nei (paratopul) este format atat din domeniul variabil al lantului H cat si L, in cazul interactiunii cu anumite Ag pot fi utilizate preponderent CDR-urile lantului H sau din contra, ale lantului L. Scanned with CamScannerStudiile de cristalografie au reusit sa mai evidentieze un aspect foarte interesant. De ex., formarea unui complex intre neuraminidaza si anti-neuraminidaza conduce la 0 modificare orientarii lanturilor laterale, atat ale epitopului cat si ale paratopului. Aceasta modificare conformationala (care nu reprezinta un exemplu izolat) conduce in ultima instanta la o mai buna pottivire intre cele doua structuri. Chiar daca aceasta miscare nu este spectaculoasa, find in general de aproximativ 1 A, ea se dovedeste valoroasa din punct de vedere functional. Dupa cum precizam insa, modificarea conformationala nu priveste insa doar anticorpul ci si epitopul antigenului poate suferi acest gen de modificare, Regiunea balama Lanturile y, 5 si a prezinta 0 secventa peptidica extinsa intre domeniile Cy si Cin, care nu prezinta homologie de structura cu celelalte domenii si care a fost denumita regiune ,balama”. Este bogata in prolina si, ca atare, foarte flexibila, conferind mobilitate celor doua brate. Ca rezultat, Fab poate avea prezenta diferite unghiuri ale bratelor atunci cand trebuie sa se ataseze la un Ag. @ NO, NO; DNP ligande—° 0,N cet

Formation of secretory IgA Clase de Ig si activitatea biologica Atunci cand anticorpii sc leaga la antigen, aceasta legare nu va conduce Ia distrugerea antigenului. Pentru a fi eficienti impotriva patogenilor, anticorpii trebuie sa antreneze mai departe alte raspunsuri, care vor ucide patogenii si vor inlatura antigenete. In timp ce partea variabila este singura care se poate lega la antigen, partea constanta a lanturilor grele este cea care este responsabila pentru interactiunile-colaborarea cu alte proteine, celule si tesuturi, Tocmai pentru ca aceste efecte sunt mediate de partea constanta a lanturilor grele, nu toate clasele au aceleasi proprietat. Opsonizarea Procesul care promoveaza fagocitarea Ag-nelor de catre macrofage sau neutrofile se realizeaza prin intermediul receptorilor Fe. In timp ce interactiunea dintre un singur receptor si un singur fragment Fe este slaba, cand sunt implicate mai multe molecule semnalul este Scanned with CamScannerputenic, semnal care va conduce Ia intemalizarea antigenului. Inauntrul fagocitului, patogenul devine tinta nor variate procese de digestie enzimatica sau a produsilor activi ai oxigenului. Combinatia acestor procese este letala pentru organismul fagocitat. Activarea sistemului complement IgM si trei din cele patru subclase de IgG pot declansa activarea unei cascade de evenimente la care participa o serie de glicoproteine serice si membranare cunoscute sub numele de sistem complement. Un produs care rezulta din activarea SC este, de exemplu, C3b. Acesta se poate lega la suprafata tintei si va fi recunoscut de catre receptori pentru complement, care se gasese pe suprafata a diverse celule cum ar fi eritrocitele de ex, care se vor ocupa cu transportul antigenelor catre splina si ficat. DCC Daca receptorul Fe care este implicat in legarea la un fragment Fe al unui Ac atasat la un Ag se gaseste pe suprafata unei celule care ucide extracelular, asa cum este celula NK, procesul va conduce nu la fagocitoza, ci la maniera de distrugere mentionata anterior, in afara celulei Transcitoza Procesul prin care IgA este transportata catre suprafata mucoasei (respiratorie, digestiva, tract uro-genital), ca si transportul in lapte necesita trecerea prin celulele epiteliale, Acest fenomen este posibil deoarece moleculele de anticorp sunt transportate de catre molecule specializate care se leaga la capatul C-terminal al lanturilor H si se numeste transcitoza. Unele animale transfera anticorpi din clasa G (prin acelasi mecanism de transcitoza) prin bariera feto-placentara. Aceasta este o forma de imunizare pasiva. TABLE 4-2 PROPERTIES AND BIOLOGICAL ACTIVITIES* OF CLASSES AND SUBCLASSES OF HUMAN SERUM IMMUNOGLOBULINS PropertyAcivey IgG GEG GUGM aED ‘Molecular weigh” 15000 150.000 150,000 150,000 150,00-150/000- 900.000 190,000 150,00 00,000 00,000 Heavy-chain Ma pe We St a2 » . 8 component ‘Normal serum ° 3 1 053008800030 level (g/t) 1m vivo serum B op 8 2B ‘ ‘ sas od half fe ays) Acivnesdanid = + Ht = 7 ene = union eG gad ID abs ext 2 ones Ip en ex a nome dee nck of ene Mba bast eM monemez tr te le in rom enue {Hpi np ror yt eed a ome epee Receptori Fe Legarea anticorpilor la antigen reprezinta doar primul pas in eliminarea acestuia din urma, ‘Sunt necesare mecanisme suplimentare pentru inlaturarea complexelor antigen-anticorp, iat Scanned with CamScanneracestea depind de recunoasterea regiui beneficiaza de receptori Fc cu exceptia IgD. Moleculele din familia FeR pot fi clasificate in 2 categorii. Majoritatea FeR transmit celulei un semnal activator sau inhibitor, iar efectele includ endocitoza, fagocitoza sau ADCC. Feneceptor Fey (coe) ea (co) ea (C032) Fete (e052 ena (C63) yaa (cont) Fart ean (C25 Feat (Coe) Plyler ram pression MaMa New cr Ma Mo New Me PB erstopi cs (mid and eho) Ma Moe Beg Mo Ma, At Ms 83 10, ia Maa, Ma M,N fo ‘hl als ef atobtesialrepatory and opens cet, fel osc, pei bps Superfamilia Ig-nelor ] a i Rooks oan cS Ter oe cos cot ctw cae Fe de catre receptorii Fe. Toate isotipurile an tector Focon -ebeaton ndocps phagoya ADCC ‘Aebaon ndocis pages nibs cel acaon endoespagpyi ‘Aebation endo pagers ‘aan endo agra, ADEE Contato signing by ascaon it eter Fs Achaonendoyss phagcts tggen mast Celtasph dean aances Ab espns eon ot tes, esa endo phagcras, ADEE ‘arepet gaan IeGrangr rm meter newborn Pee amie z : ervm2 _ yeas UrAS \ Scanned with CamScanner