ISOLASI M.

O DAN
MENGHITUNG KOLONI

Winny Muliyadini, ST., MT

JURUSAN TEKNIK KIMIA

U N T I R TA - 2 0 1 8
Teknik Isolasi Kultur Murni :

1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-

plate)
2. Penuangan (Pour-plate)
3. Kultur Yang Diperkaya (Enrichment Culture)
4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
5. Isolasi Sel Tunggal
1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)

• Umumnya digunakan untuk memperoleh kultur murni mikroba yang tidak

berhasil ditumbuhkan pada media padat dan hanya dapat tumbuh pada
media cair
Untuk bakteri paling sesuai  menggunakan agar cawan
Sampel

Pengenceran berseri dg larutan

garam fisiologis (0,85 %)

Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran

(batang gelas) pada media agar  koloni tumbuh
menyebar

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga

Diperoleh kultur murni

1 sel  1 koloni
 Cara Penggoresan Kultur pada Agar Cawan ;
1. Goresan Langsung
2. Goresan Kuadran
3. Goresan Radian

Goresan Kuadran

http://www.personal.psu.edu/faculty/k/h/khb4/enve301/301labs/301labgraphics
/streak.gif
Metode Penggoresan

 Dengan penggoresan terjadi pengenceran sel secara gradien

Goresan langsung Goresan radian (unt
u/ mengkultur mikroba) mengkultur mikroba)

Goresan Kuadran (isolasi koloni tunggal untuk

mempelajari mikroba)
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
Teknik Penyebaran (Spread-plate)

http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
culture.html
• Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri
& menggunakan peralatan yang sederhana
• Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat
digunakan/disebarkan pada media
• Dua sel dapat bergabung menjadi membentuk satu
koloni
Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak
 pencegahan dengan menambahkan deterjen

2. Teknik Penuangan (Pour-plate)

• Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cair

(+/- 450C) dalam tabung reaksi, sehingga distribusi
sampel merata  dituang ke petri dish & dibiarkan
mengeras pada suhu ruang, lalu diinokulasi
• Tidak cocok untuk isolasi mikroba psikrofilik
Teknik Penuangan (Pour-plate)

Sampel +/- 1 g)
....
1 ml
. ...
. ... A
A Agar cair …..
. Diperiksa

....
. .. .. . B
B
Koloni terisolasi
Suspensi Pengenceran
Penuangan
Bakteri Dibiarkan mengeras
. .
.. C
C
Inkubasi

Tahap I Tahap II Tahap III

Media agar miring

http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap06/lecture5.htm
• Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) &
kuantitatif (jumlah sel mikroba)

• Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan

menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum
penanaman pada agar cawan
Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  contoh terlebih dulu
diberi perlakuan pemanasan s.d 850C selama 5 menit

• Media Selektif :
- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari
faeces
- Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae

• Media Diferensial :
- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk
koloni berbeda & mudah dikenali
E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik
 3. KulturYang Diperkaya

• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat

fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi

inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri
tertentu

1 2 3 4

Media cair dgn substrat khusus

Contoh : bakteri tanah :
α-conidendrin

(+) (-)

Verifikasi
4.Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

• Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam

jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam susu asam

• Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya

mengandung 1 galur mikroba

• Perlu dicek kemurnian kultur

Serial-dilution Method

http://dc338.4shared.com/doc/9lEZll1X/preview.html
5.Teknik Isolasi Sel Tunggal

a. Metode Mikromanipulator

• Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop

untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari sampel

• Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet

(tabung kapiler) di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal
& dipindahkan ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media
yang sesuai

• Lebih cepat, namun kelemahannya :

- alat mahal
- operator harus trampil
Micromanipulator

http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html
Micromanipulator
b. Metode Kapiler untuk mendapatkan sel tunggal mikroba
Pembuktian Kemurnian Kultur

Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni  perlu dilakukan

pengujian dengan kriteria sbb. :

(Kultur murni : sel-sel mikroba yang ada  sejenis)

1. Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil

pewarnaan yang sama
2. Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan
kesamaan
3. Hasil penggoresan dll seragam
4. Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan /karakteristik identik,
contoh memfermentasi gula yang sama dll
IDENTIFIKASI
• Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi

• Metode untuk identifikasi mikroba adalah :

1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul
atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun
tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas)
yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik
cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna
dll)
Contoh 1. Karakteristik Morfologis

(Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan
mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak)

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium
Contoh 1. Bentuk & Susunan Sel

Sel
Bakteri

http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg
Contoh 3. Karakteristik Kultural
 Tampilan pertumbuhan pada media padat (bentuk koloni, tepi koloni,
permukaan koloni dll)
Kultur pada Agar Miring
4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba ( contoh
kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula
menjadi asam dan gas dll)
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat

5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran
dll)

6. Susunan Antigen (Serologi)

Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas
* Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat
diinjeksikan ke hewan

7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit

8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe
SELANJUTNYA..

• Bagaimana menghitung jumlah koloni suatu

mikroba??
PENGHITUNGAN KOLONI
• Setelah inkubasi,hitung koloni pada cewan yang memiliki jumlah 25-250 koloni (CFU)
SYARAT-SYARAT PERHITUNGAN
• Hitung jumlah koloni, kalikan jumlah koloni (atau rerata jumlah jika digunakan
ulangan dalam pengenceran yang sama) dengan kebalikan pengencerannya.

• Catat pengenceran yang digunakan dan jumlah koloni dihitung atau diduga pada
tiap petri.

• Untuk mencegah kesalahan ketelitian dan akurasi, catat hanya dua digit pertama
saja. Digit kedua dapat ditingkatkan jika digit ketiga di atas 5; gunakan nol untuk
digit setelah digit kedua.

• Laporkan jumlah (atau dugaan jumlah) sebagai cfu per g atau ml.
SYARAT-SYARAT PERHITUNGAN
• Hitung jumlah koloni. Hanya yang memenuhi syarat yang dihitung.
• Spreader tidak dihitung
• Hitung semua koloni termasuk yang kecil, catat pengenceran yang digunakan
dan hitung jumlah koloni
• Contoh 1:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 243
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 23
Maka jumlah bakteri: 24.300 ditulis 2,4 X 104 cfu/ml
PERHITUNGAN BAKTERI
• Contoh 2
Pengenceran 1:100 jumlah koloni spreader
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 31
Maka jumlah bakteri: 31.000 ditulis 3,1 X 104 cfu/ml

• Contoh 3
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 305
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 42
Maka jumlah bakteri: 42.000 ditulis 4,2 X 104 cfu/ml
JIKA DUA PENGENCERAN MEMENUHI
SYARAT
• Contoh 4
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 200*
Pengenceran 1: 1000 jumlah koloni 42*
1. Bandingkan dua pengenceran tersebut, :
2. jika > 2 maka dirata-rata
3. jika < 2 gunakan pengenceran yg lebih kecil
Maka jumlah bakteri: 42.000/20.000 > 2 maka
jumlah bakteri = ditulis 2,0 X 103 cfu/ml
PERHITUNGAN DENGAN 2 ULANGAN
• Contoh 5
Pengenceran ` Petri 1 Petri 2
10-2 175 208
10-3 16 17
Maka:
• Rata-rata terlebih dahulu pada pengenceran yg memenuhi syarat
• Yang memenuhi syarat hanya pengenceran 1:100 sehingga (175 + 208)/2 = 191,5
• Karena digit ketiga kurang dari 5 maka jumlah bakteri adalah 19.000 cfu/g atau
1,9 X 104 cfu/ml
TIDAK ADA PETRI DENGAN JUMLAH KOLONI ANTARA 25 -
250

• Jika tidak ditemui petri dengan jumlah koloni antara 25 dan 250 dan salah satu
petri memiliki jumlah koloni lebih dari 250 maka pilih yang paling mendekati 250
dan hitung sebagai hasil pendugaan (dugaan) cfu/g
• Contoh 7:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 325
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 20
maka jumlah mikroba adalah 33.000 (dug) cfu/g atau 3,3 X104 cfu/ml (est/dug)
TIDAK ADA PETRI DENGAN JUMLAH KOLONI ANTARA 25
- 250

• Contoh 8:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 287 dan 263
Pengenceran 1;1000 jumlah koloni 23 dan 19
Yang dipakai adalah yang mendekati 250
(287+263)/2 = (550/2) = 27,5 karena desimal terakhir 5 maka
menjadi 28
jadi jumlah mikroba = 2.800 cfu/g atau 2,8 X 103 cfu/ml (est)
SEMUA PETRI DENGAN JUMLAH KOLONI KURANG DARI 25
• Jika petri dari semua pengenceran menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25,
catat jumlah aktual koloni pada pengenceran yang paling rendah dan laporkan
sebagai dugaan cfu/g
Contoh 9:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 0
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 0
maka jumlah mikroba adalah <100 (dug) cfu/g
Contoh 10:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 18 dan 16
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 2 dan 0
maka jumlah mikroba <1700 (dug) cfu/g.
TIDAK ADA KOLONI YANG TUMBUH.

• Jika pada semua pengenceran tidak dijumpai adanya koloni dan tidak terdapat
senyawa penghambat, laporkan jumlah pendugaan dengan kurang dari (<) pada
pengenceran yang paling rendah.
Contoh 11:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 0
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 0.
Maka jumlah mikroba <100 (dug) cfu/g
JUMLAH KOLONI LEBIH DARI 250.
• Jika jumlah koloni tiap petri di atas 250, hitung koloni dalam bagian petri
berdasar distribusi yang mewakili
• Jika dalam hitungan <10 koloni/cm2, pilih dalam 12 cm2 dengan cara 6 luasan
horizontal berurutan dan 6 luasan sudut kanan berurutan.
• Ingat jangan ada koloni yang dihitung dua kali.
• Jika dalam hitungan ada >10 koloni/cm2 hitung koloni dalam 4 luasan yang
mewakili seperti cara di atas, kalikan rerata jumlah koloni per cm2 dengan luas
petri.
• Pada umumnya luas petri sekitar 56 cm2 gunakan ini sebagai faktor pengali.
PENGGUNAAN HAEMACYTOMETER
PERHITUNGAN SECARA LANGSUNG DENGAN
MIKROSKOP
• Menggunakan haemacytometer atau Petroff Houser Counter.

Misal Diket Luas Kotak pada haemacytometer = 4 X 10-2 mm2

Tinggi = 2 X 10-2 mm
Maka volume daerah kotak = 8 X 10-4 mm3 = 8 X 10-7 ml
Jumlah sel dihitung 14 Maka jumlah mikrobia
TERIMAKASIH