Separando moléculas María O.

Requesens

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Introducción

La cromatografía es un método muy

utilizado en todas las ramas de la ciencia
que permite la separación, identificación
y determinación de los componentes
químicos en mezclas complejas. Ningún
otro método de separación es tan potente
y de aplicación tan general. Las
cromatografías son procesos que abarcan
varias técnicas separativas, basadas en
propiedades físicas de ciertos materiales,
que en interacción con sustancias o
mezclas de sustancias,
la/s cual/es guarda/n relación con las
propiedades químicas de éstas, permite
descomponer una mezcla y analizar sus
constituyentes. Con el desarrollo de la
tecnología, las técnicas cromatográficas
se diversificaron y mejoraron
sensiblemente su capacidad para
resolver mezclas de distinta naturaleza.
En este artículo se presentan conceptos
introductorios, un breve panorama de las
diversas técnicas cromatográficas
disponibles y sus aplicaciones

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1. Cromatografía
Las cromatografías son técnicas de
separación de mezclas para su
determinación que se basan en las
diferentes interacciones de las
moléculas que la forman con una
sustancia. Con ella se determina la
identidad y concentración de los
componentes de una mezcla.
1.1. La fase estacionaria.
Definimos fase estacionaria como el
material que permanece dentro de la
columna cromatográfica durante la
cromatografía y que retiene algún
componente de la muestra, posee una
gran área superficial y puede ser un
sólido o un líquido dispuesto sobre un
sólido que actúa como soporte.
Figura 1. Representación gráfica de los
componentes de la crompatografía. En este
caso por capa fina ascendente. Recuperado de
https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/75465
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Tubo: Columna cromatográfica.
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1.2. Fase móvil
Definimos fase móvil como un fluido
que puede ser líquido, gas o fluido
supercrítico que se usa como portador de
la mezcla y que se hace pasar a través de
la columna cromatográfica y la fase
estacionaria.
2. Clasificación de
cromatografías.
2.1. Según el tipo de
contacto entre la fase móvil y
estacionaria.
Cuando la fase estacionaria está
confinada dentro de un tubo1 a través del
cual se alimenta la fase móvil
denominamos estos métodos como
cromatografías en columna. (Figura 2).
Figura 2. Separación de una mezcla mediante
Cromatografía en columna. Recuperado de
https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/75465
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Además, la fase estacionaria puede 2.2. Según el estado de las

distribuirse como una capa fina y fases.
homogénea sobre un soporte plano de
material inerte, los métodos que utilizan
esta forma se denominan El estado físico de la fase móvil
cromatografías en capa fina (CCF). determina la primera gran división de los
La CCF es el representante de un grupo métodos cromatográficos. En esencia,
más amplio en el cual la fase estacionaria algún tipo de fluido puede ser usado
tiene forma plana, llamado como fase móvil. Históricamente, los
cromatografías planares. Otro líquidos fueron los primeros en ser
representante de este grupo es la usados dando lugar a un amplio rango
cromatografía en papel, donde el soporte de métodos clasificados como
material es el papel, el cual constituye la cromatografía líquida (CL). Los gases
fase estacionaria (Figura 3). también pueden ser usados como fase
móvil, los métodos basados en este
principio se clasifican como
cromatografía gaseosa (CG).

Figura 3. Método de cromatografía en capa

fina(CCF) ascendente. Recuperado de
https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/75465

Tabla 1. Clasificaación de las cromatografías

en función de el estado de las fases,
desplazamiento de la fase móvil y según la
interacción de las moléculas con la fase
estacionaria. Recuperado de
https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/75465.

Figura 4. Cromatografía en capa fina (CCF). Por último, tenemos la cromatografía

Detección de componentes revelados con un de líquidos supercríticos, también
reactivo químico. Recuperado de conocida como SFC, es un método que
https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/75465 combina las técnicas de la cromatografía

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HPLC o líquida y la cromatografía de

2.3.2. Partición o reparto.
gases. Sirve para separar los compuestos
no volátiles o inestables que no pueden
En este caso, la fase estacionaria es un
separarse con el gas o no se pueden
líquido, poco miscible con la fase móvil.
detectar mediante el HPLC.
Los solutos se distribuyen entre las dos
Este método de separación de mezclas se
fases dependiendo de su solubilidad en
usa para analizar concentraciones de
cada una de ellas, es decir, según su
compuestos y moléculas de pesos
coeficiente de reparto. Aunque el
elevados. Utiliza el dióxido de carbono
mecanismo fundamental de la
para que la ruta de flujo pueda adquirir
separación es la extracción o reparto, es
una presión bien alta.
prácticamente imposible evitar
Asimismo, la SFC puede detectar la
adsorciones por parte del sólido soporte,
ionización de una llama, la captura de
por lo que muchas de las separaciones
electrones y el espectrómetro de las
son empíricas. Los sólidos soportes más
masas. En este sentido, es necesario
utilizados son el silicagel, el polvo de
contar con el cromatógrafo necesario
celulosa y la tierra de diatomeas; menos
para obtener una mejor precisión en los
aplicación tienen el almidón y el relleno
resultados.
de bolas de vidrio.

2.3. Según la interacción de

2.3.3. Intercambio iónico.
las moléculas con la fase
estacionaria.
La cromatografía de intercambio iónico
es un método que permite la separación
de moléculas basada en sus propiedades
2.3.1. Adsorción
de carga eléctrica. Se compone de dos
fases: la fase estacionaria o
Se llama adsorción, cuando el soluto
intercambiador iónico, y la fase móvil.
está confinado en la superficie de la fase
La fase estacionaria insoluble lleva en la
estacionaria. Son muchos los sólidos
superficie cargas electrostáticas fijas,
adsorbentes qque se utiliza como fase
que retienen contraiones móviles que
estacionaria en cromatografía, los más
pueden intercambiarse por iones de la
importantes son: alúmina, silicato de
fase móvil, la cual suele ser una
aluminio, silicagel, óxido, carbonato y
disolución acuosa con cantidades
carbón, almidón y azúcares como
moderadas de metanol u otro disolvente
orgánicos. Como eluyentes (solventes
orgánico miscible con agua que contiene
que se emplean para preparar la fase
especies iónicas generalmente en forma
móvil) se utilizan agua, alcoholes,
de buffer. Los iones de ésta compiten con
cetonas, ésteres, cloroformo, tetracloruro
los analitos por los sitios activos de la
de carbono, etc. Su capacidad de elución
fase estacionaria.
depende de su polaridad, del adsorbente
y de los componentes a eluir.
El principio básico de la cromatografía
de intercambio iónico es que las
moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de
Figura. 5. Cromatografía de adsorción. Recuperado de modo que dichas moléculas pueden ser
http://www.divulgacion.ccg.unam.mx/files/pdfs/como/Purifi
cacion_extraccion_DNA-RNA.pdf asociadas o disociadas cambiando el

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ambiente iónico. La separación mediante
intercambiadores iónicos se realiza por
lo general, en dos fases: en la primera las
sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones
que originan una unión fuerte y estable;
a continuación, se eluye de la columna
con buffers de diferentes pH o diferente
fuerza iónica, compitiendo los
componentes del buffer con el material
por los sitios de unión.
Figura 6. Cromatografía de
intercambio iónico. Recuperado de
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-
Virtual/BQblog/Cromatografia%20de%20inte
rcambio%20ionico.pdf.
2.3.4. Penetrabilidad
En este método, el componente básico es
una columna empaquetada con una
matriz en gel especial, que son partículas
de un polímero orgánico de estructura
tridimensional, que originan una red de
poros hidrofílicos equilibrados con un
tampón acuoso. La técnica consiste en
que las moléculas de gran tamaño no
penetran por los poros del polímero, por
lo que migran mucho más rápidamente
que las de menor tamaño que sí son
capaces de penetrar por los poros de la
matriz. Al principio del desarrollo de la
técnica, se realizaba a bajas presiones
por lo que el rango de aplicaciones
estaba restringido debido a los elevados
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tiempos de separación y su poca
resolución. En la actualidad se han
desarrollado matrices de sílica estables a
elevadas presiones que se utilizan
columnas de alta presión, para la
separación de biomoléculas en función
de su forma y tamaño.
Figura 7. Cromatografía de penetrabilidad.
Recuperado de
http://www.divulgacion.ccg.unam.mx/files/pd
fs/como/Purificacion_extraccion_DNA-
RNA.pdf.
2.3.5. Afinidad.
La cromatografía por afinidad es un tipo
de cromatografía de líquidos que se basa
en la unión reversible entre el
analito de interés y un ligando
específico, inmovilizado en un soporte
sólido inerte. Cuando la muestra pasa por
la columna, sólo son retenidas las
moléculas que se unen de manera
selectiva al ligando por afinidad y las
que no se unen avanzan con la fase
móvil. Después, los analitos retenidos
pueden ser arrastrados cambiando las
condiciones de la fase móvil.
Las matrices o soportes deben ser rígidos
y resistentes, insolubles, permeables y
reactivos. Pueden ser matrices de
polisacáridos o sintéticas. Los ligandos
por afinidad característicos son
anticuerpos, inhibidores de enzimas,
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compuestos más generales, como
lectinas. Se fijan mediante enlaces
covalentes a la fase estacionaria
químicamente activada. Según la
naturaleza de los ligandos y los analitos
distinguimos dos procedimientos
generales de elución:
• Elución bioespecífica: la fase
móvil contiene un inhibidor por
el que el analito tiene preferencia
(compite con el ligando). El
analito se retira entonces del
ligando y es eluido.
• Elución no específica: la fase
móvil provoca un cambio en el
sitio activo del ligando, mediante
variaciones del pH, de la
constante dieléctrica o de la
fuerza iónica del medio. También
se puede desnaturalizar el
ligando mediante reacciones
químicas con urea o tiocianato
potásico.
Figura 8. Cromatografía de afinidad.
Recuperado de
https://cienciadelux.com/2015/08/16/cromato
grafia-por-afinidad/.
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3. Centrífuga.
La centrífuga es un equipo capaz de
sedimentar los componentes de una
solución homogénea según sus
diferentes densidades. Esto es posible
gracias a la separación que proporciona
la rotación y aceleración centrifuga a
alta velocidad durante cortos periodos
de tiempo. De esta manera, dicha
solución queda finalmente separada en
dos fracciones, la fracción sobrenadante
y la fracción sedimentada que queda
depositada en el fondo del tubo.
Basandonos en un procedimiento
normalizado de trabajo de una
centrífuga podemos dictar el
funcionamiento de la misma:
Ubicación del equipo
• El equipo deberá ubicarse sobre una
superficie plana, impermeable, lavable y
antideslizante.
• El equipo NO podrá ser ubicado en un
lugar que interfiera con la circulación:
pasillos u otros lugares de tránsito o que
obstaculice las salidas de emergencia.
Elementos de Protección Personal y
Ropa de Trabajo
• Ropa de trabajo: El Guardapolvo
deberá estar puesto en forma correcta,
evitando mangas sueltas o partes
deshilachadas que puedan desprenderse
o quedar atrapadas en parte del equipo.
Deberá ser de algodón y con broches,
sin botones.
Protección ocular: Deberemos utilizar
protector ocular durante la colocación
de las muestras y el retiro de las
mismas.
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a utilizar para centrifugar

• Protección de pies: El calzado deberá los tubos.
ser cerrado y con el talón cubierto. No 4. Colocar los tubos de
se podremos utilizar calzado tipo forma equilibrada y
sandalias o similar. simétrica.
5. Cerrar la tapa de la
• Protección de manos: Deberemos centrifuga.
utilizar guantes para la manipulación de 6. Girar la rueda de las
muestras para evitar daños causados por revoluciones hasta
agentes derramados dentro del equipo. alcanzar la velocidad
deseada (rpm).
7. Girar la rueda del
tiempo, hasta alcanzar el
Instrucciones de equilibrio y balanceo tiempo necesario (min).
8. Pulsar el botón START
Utilizar siempre los porta-tubos comprobar que el LED
estándares para los cabezales se enciende (color
correspondientes a la marca y modelo verde).
de su equipo.
9. Cuando termine la
Los tubos con la muestra deben centrifugación,
ajustarse al alto y diámetro del porta- comprobar que el LED
tubos de la centrífuga para evitar del botón STOP esté
rozamiento con el cabezal de la encendido para poder
centrífuga durante la operación abrir la tapa.

Colocar los tubos de idéntica forma y 10. Abrir la tapa, pulsando

peso, cargados con igual cantidad de el botón del lateral
material en lugares opuestos. derecho y recoger los
tubos.
Si tenemos un N° impar de muestras,
colocamos un tubo extra conteniendo un 11. Apagar la centrifuga
líquido balanceador (agua destilada pulsando el interruptor,
aireada, vaselina líquida o glicerina) cuando ya no se vaya a
para colocar del lado opuesto de la usar.
muestra impar.

Puesta en marcha

1. Encender presionando el
interruptor (posición ON
en interruptor ON/OFF).
2. Si la centrífuga está
cerrada, pulsar el botón
de apertura situado en el
lateral derecho.
3. Colocar los adaptadores
adecuados que vayamos

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Instrucciones para el Mantenimiento

preventivo

Hay que verificar que el equipo esté

desconectado de la corriente eléctrica.
Retirar los portatubos y limpiar la parte
interna del equipo utilizando un paño
húmedo de forma diaria.
No utilizar cepillo u otro accesorio
metálico o abrasivo. No usar líquidos
corrosivos.
Lavar los portatubos. Verificar el
estado de la ficha de conexión eléctrica
en forma mensual.
Mensualmente chequear el buen
funcionamiento de la lámpara
indicadora de marcha del equipo.

Si la centrífuga está colocada sobre un

pie, hay que verificar que los apoyos
antideslizantes del mismo se encuentren
en buen estado y que la centrífuga esté
insertada de manera segura dentro del
pie.

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4. Referencias bilbiográficas.

[1] Cromatografía: conceptos y [6] Técnicas Generales de Laboratorio.

aplicaciones. (2021). Repositorio (2020). [Libro electrónico]. Altamar.

Institucional CONICET Digital.

https://dx.doi.org/

[2] Procedimiento para el uso de la

centrífuga. (2021). Instituto de

Investigación y Desarrollo en

Ingeniería.https://probien.conicet.gov.a/

[3] Funcionamiento de la centrífuga.

(2021). Divulgación UNAM.

http://www.divulgacion.ccg.unam.mx/

[4] R. (2019, 24octubre).Cromatografía

de fluidos supercríticos: ¿en qué

consiste esta técnica? Net Interlab.

https://net-interlab.es/cromatografia-de-

fluidos-supercriticos/

[5] Entradas, V. M. (2015, 16 agosto).

Cromatografía por afinidad.

Cienciadelux.https://cienciadelux.com/2

015/08/16/cromatografia-por-afinidad/

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