1. Preparare 500 ml di una soluzione 0,9% (W/V, peso/volume) di NaCl (soluzione “fisiologica”).

Una soluzione allo 0,9% è una soluzione che contiene 0.9 gr di soluto in 100 ml di solvente.
Bisogna pesare 4,5 gr di NaCl e scioglierli in 500 ml di acqua distillata.

2. Preparare 100 ml di una soluzione 95% (V/V, volume/volume) di etanolo.

Bisogna misurare 95 ml di etanolo puro e portarli a 100 ml con acqua distillata.

3. Preparare 50 ml di una soluzione 0,1 M di NaCl (per pesata).

Una soluzione 0,1 M contiene 0,1 moli in 1 litro di solvente; in 50 ml ci saranno 0,005 moli.
Bisogna pesare 0,005 x 58,44 (PM dell’NaCl), cioè 0,29 gr e scioglierli in 50 ml di acqua
distillata.

4. Preparare 150 ml di una soluzione 0,4 M di NaCl (per diluizione da una soluzione 2 M).
Il fattore di diluizione è pari a 2M/0,4 M = 5. Quindi, 150 ml/5 = 30 ml.
Bisogna misurare 30 ml della soluzione 2 M e portarli a 150 ml con acqua distillata.

5. Calcolare i grammi di glucosio presenti in 10 ml di una soluzione 15 mg/ml

15 mg x 10 ml = 150 mg totali
6. Preparare 600 ml di una soluzione 0,2 M HCl.
L’HCl è un gas che in commercio si trova in soluzione acquosa concentrata al 37,27 %. Questo
vuol dire che nella bottiglia di HCl concentrato sono presenti 37,27 g di HCl per ogni 100 g di
soluzione. La densità dell’acido cloridrico al 37,27 % è 1,185 g / ml. Il PM dell’HCl è 36,46.

PM x Conc Finale x Vol Finale = gr di HCl necessari

1000

Dovendo preparare 600 ml di soluzione, occorreranno

36,46 x 0,2 x 600 = 4,37 g HCl

1000
che saranno contenuti in :
100 x 4,37 = g 11,72 di soluzione al 37,27%
37,27

Essendo piuttosto disagevole pesare un liquido, se si divide il valore in grammi ottenuto per la
densità della soluzione si ottiene il volume di soluzione che corrisponde a 11,72 g di essa:

11,72 = 9,89 ml (portare a 600 ml con acqua distillata)

1,185
I cromòfori nell’UV e nel VIS
 E=hn
E, energia (caloria o Joules, 1 cal= 4,17 J)
h, costante di Planck (6.6 x 10-34 Joules x sec)
n, la frequenza (numero di oscillazioni al secondo, Hertz)

La frequenza (n) = velocità della luce (3 x 108 m/sec nel vuoto)

lunghezza d’onda

Lunghezza d’onda (l) è la distanza tra due massimi consecutivi (nm= 1

miliardesimo di metro)

ENERGIA E FREQUENZA SONO

DIRETTAMENTE PROPORZIONALI

ENERGIA E FREQUENZA SONO

INVERSAMENTE PROPORZIONALI
ALLA LUNGHEZZA D'ONDA
Lo spettro delle onde elettromagnetiche
Tutte le radiazioni UV C e quasi tutte quelle UV B sono assorbite
dall‘ozono dell’atmosfera. Raggiungono la terra le radiazioni del VIS (la
luce solare ci appare bianca come risultato della mescolanza dei 7
colori), quelle dell’IR e le UV A. Le radiazioni UV A sono estremamente
dannose a dosi elevate poiché generano radicali liberi; la melanina è il
pigmento che ci protegge trasformando l’energia delle radiazioni in
calore. Tra gli aspetti positivi degli UV A, la sintesi della vitamina D
(reazione di fotolisi di un derivato del colesterolo).
 Le radiazioni interagiscono con la materia e alcune
molecole assorbono la luce (cromofori)
Gli elettroni di legame di tipo p (nei legami doppi o tripli, negli anelli
aromatici) hanno maggiore densità al di fuori dell’asse di unione dei
nuclei. Questi elettroni sono “meno legati” e più facilmente eccitabili
rispetto a quelli di tipo s presenti nei legami semplici; essi possono
raggiungere il livello energetico superiore quando assorbono energia
corrispondente alla differenza tra i 2 livelli e decadere spontaneamente al
livello inferiore in un tempo brevissimo (circa 10-15 sec).
La ruota cromatica del VIS ci fa capire cosa significa “assorbimento
della luce”. Un cromoforo che assorbe dai 400 ai 430 nm ci appare
giallo, il colore complementare (diametralmente opposto) che “resta”
dopo aver sottratto le radiazioni assorbite.
Lo spettrofotometro è lo strumento che consente la misura dell’assorbimento di
cromofori in soluzione.

I0 It

La sorgente può essere Il monocromatore consente Il rivelatore produce un

una lampada a di ottenere un fascio di luce segnale elettrico che
tungsteno (VIS) o una ad 1 lunghezza d’onda dipende dall’energia
lampada ad idrogeno partendo da una sorgente delle radiazioni che lo
o deuterio (UV) di radiazioni policromatica investono

La cella contenente il campione si chiama cuvetta. Le cuvette possono

differire per natura del materiale (vetro/plastica per lettura nel VIS, quarzo
per lettura nell’UV) e cammino ottico (la distanza tra il raggio entrante e
quello uscente), ma hanno sempre 2 facce opposte che non possono essere
attraversate dalla luce (attenzione al loro posizionamento nello
spettrofotometro !)

I0 (Intensità luce incidente) e It (Intensità luce trasmessa); Trasmittanza (T) = It /I0

It = I0 non c’è assorbimento
It < I0 se c’è assorbimento
 ANALISI QUALITATIVA: LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO
Se si registra in continuo l’assorbanza (Densità Ottiche, OD) in funzione della
variazione della lunghezza d’onda (nm) si ottiene uno spettro di assorbimento
nel quale è possibile identificare una lunghezza d’onda di massimo
assorbimento caratteristica del cromoforo in esame.
Le proteine e i peptidi sono cromofori nell’UV per il contributo del legame
peptidico (intorno ai 200 nm) e degli AA aromatici (tra 260-280 nm). Alcune
proteine assorbono anche nel VIS in virtù della presenza di gruppi non proteici
ad esse associati: le proteine che contengono il gruppo eme assorbono anche a
420-540 nm; le proteine che contengono FAD/FMN assorbono anche a 420 nm.
Per la presenza delle basi azotate, gli acidi nucleici presentano un
massimo di assorbimento intorno a 260 nm. L’assorbimento è
maggiore per le catene singole in cui le basi sono maggiormente
esposte.
 ANALISI QUANTITATIVA: LA LEGGE DI LAMBERT-BEER

A= e C l
L’Assorbanza (A) dipende dalla concentrazione molare del cromoforo (C), dal
cammino ottico in cm (l) e da un parametro e (coefficiente di estinzione molare
tipico del cromoforo; coincide con l’A di una soluzione 1M del cromoforo letta in
una cuvetta con l = 1 cm).

La Trasmittanza diminuisce in modo esponenziale con l’aumentare di A.

T = 10 - e C l cioè log10 1/T = A

La legge di Lambert-Beer è l’equazione di

una retta passante per l’origine degli assi (A
sulle y e C sulle x) in cui il prodotto e l è il
coefficiente angolare.
La proporzionalità tra A e C (entro un certo
intervallo) consente misure quantitative nel
caso di una soluzione che contiene 1 solo
cromoforo alla lunghezza d’onda scelta di
cui sia noto l’e.
Determinazione della
concentrazione di una
soluzione proteica
(omogenea ed
eterogenea)
Se la soluzione contiene 1 sola proteina (soluzione omogenea o pura) di
cui è noto l’e, il calcolo della concentrazione è estremamente semplice
grazie alla legge di Lambert-Beer.
Se si utilizza una cuvetta con cammino ottico = 1 cm, allora C = A/e

E’ evidente che si può calcolare e solo se è disponibile il valore esatto del

peso molecolare. Nel caso di proteine (ed acidi nucleici) spesso si fa uso
del coefficiente di estinzione percentuale che indica l’assorbimento di
una soluzione contenente il cromoforo all’1% (1 gr/100 ml, ovvero 10
mg/ml).
Se la soluzione contiene più di 1 proteina (soluzione eterogenea), non è possibile
utilizzare la legge di Lambert-Beer per il calcolo della concentrazione. In questo
caso utilizzeremo un colorante che reagisce con le molecole proteiche formando un
addotto colorato. Il colorante Coomassie (nel reagente BIORAD) forma complessi
non covalenti con gli AA basici ed aromatici delle proteine (soprattutto arginina)
sviluppando un colore blu. La quantità di reattivo che si lega è proporzionale alla
quantità di proteina; quindi, l’assorbimento alla l di 595nm è proporzionale alla
concentrazione proteica. Una soluzione proteica pura a concentrazione nota (lo
standard, generalmente Albumina di Siero Bovino, BSA) consente di costruire una
retta di taratura (almeno 3 punti allineati su una retta passante per l’origine degli
assi cartesiani) dalla quale per estrapolazione è facile ricavare la concentrazione
incognita conoscendo il suo assorbimento a 595nm.

BSA (mg) A (OD) A (OD)

0,6
1 0,1
2 0,23 •
0,3

• •
•
3 0,31
4 0,42
1 2 3 4
BSA (mg)
Molti dosaggi enzimatici
sono eseguiti con lo
spettrofotometro
La concentrazione di un enzima è direttamente proporzionale alla velocità con
cui il S scompare o il P si forma durante la reazione. Se il S o il P sono
cromofori (nell’UV o nel VIS), possiamo utilizzare lo spettrofotometro. Si
prepara la miscela di reazione contenente il S (a concentrazione saturante) ed
eventuali cofattori; si imposta la lunghezza d’onda di assorbimento del
cromoforo e, dopo aver aggiunto l’Enzima, si registra la variazione di A nel
tempo (DA/min). A questo punto, dividendo DA/min per l’e del cromoforo,
avremo le mmoli di cromoforo/min (in base alla legge di Lambert-Beer), cioè le
Unità enzimatiche.

1 Unità Enzimatica è la quantità di enzima

[S]
che catalizza la trasformazione di 1 mmole
0,3
di Substrato in Prodotto, in 1 min, a 25°C,
in condizioni di pH e forza ionica ottimali.
[P]
0
1 2
Tempo (min)
Una procedura di
purificazione
Una procedura di purificazione consiste in una serie di tecniche che consentono
di ottenere 1 sola proteina in soluzione a partire da un materiale di partenza (un
tessuto animale, un vegetale, un batterio) che contiene moltissime proteine. La
purificazione è d’obbligo per la caratterizzazione chimico-fisica della proteina.
Inoltre, molti enzimi sono attualmente utilizzati in biotecnologia (formulazione
di farmaci, trattamento di bevande, detergenza, trattamento di pellami,
preparazione di prodotti da forno).
 La procedura di purificazione di una proteina

i) richiede idoneo materiale di partenza. Se è

possibile, è bene partire da un materiale ricco della
proteina di interesse, semplice da reperire ed economico

ii) è sempre un compromesso tra

il grado di Purezza desiderato. Per usi industriali, il grado di purezza

non dovrà essere necessariamente elevato; per studi di tipo cinetico, la
purezza dovrà essere maggiore; per ottenere cristalli, la purezza della
preparazione dovrà essere del 100%.
il costo della purificazione. Alcune tecniche garantiscono ottimi
risultati ma sono costose.
ed è importante ricordare …..

T
 La preparazione dell’omogenato
Si comincia, di solito, con l’estrazione delle proteine dalle cellule per ottenere
un omogenato. Se un frullatore basta per rompere cellule animali, le tecniche
saranno più drastiche nel caso di cellule vegetali e batteriche che presentano
una parete cellulare (pressione elevata, ultrasuoni, enzimi).
Nel caso di cellule eucariotiche, la centrifugazione differenziale dell’omogenato
consente di separare gli organelli subcellulari.

Le CENTRIFUGHE sviluppano una

forza di sedimentazione indicata con un
numero che rappresenta un multiplo
della forza di gravità terrestre. Particelle
diverse sedimentano con velocità
diversa a seconda di densità,
dimensione e forma. La velocità a cui si
effettua la centrifugazione dipende da
caso a caso. Per raggiungere elevate g
(ultracentrifugazione) sono necessari
sistemi per refrigerare e creare il vuoto.
La separazione in alcuni casi richiede la
formazione di un gradiente di densità
(Ficoll per separare cellule, bromuro di
sodio per separare lipoproteine).
Le proteine presenti in un omogenato (cellule animali, vegetali o
batteriche) possono essere separate in base alla diversa idrofobicità
mediante precipitazione in ammonio solfato

Fino ad una certa concentrazione di

ammonio solfato, le molecole di sale
formano ponti idrogeno con residui
polari delle proteine, stabilizzano la
proteina e si oppongono alla
formazione di aggregati (salting in).
A concentrazioni saline più elevate,
il sale sottrae alla proteine molecole
di solvente e le proteine aggregano
per l'interazione di aree idrofobiche
(salting out).
Le proteine molto idrofobiche
precipitano a bassa concentrazione
Una centrifugazione
di sale, quelle meno idrofobiche
consente di separare le
precipitano ad alta concentrazione
proteine precipitate (il pellet)
di sale.
da quelle solubili (il
sovranatante).
Dopo una precipitazione in ammonio solfato è necessario eliminare il
sale dalla soluzione. La dialisi consente di separare macromolecole da
piccole molecole (ioni, sali) grazie ad una membrana semipermeabile
(pori di dimensioni controllate) che permette il passaggio solo delle
piccole molecole. Il moto delle sostanze è dovuto alla differenza di
concentrazione della sostanza tra i soluti nei due comparti e termina
una volta raggiunto l'equilibrio.
Le tecniche più efficienti di separazione delle molecole proteiche sono quelle
cromatografiche. Nella CROMATOGRAFIA, il campione (la soluzione
contenente le proteine) viene fatto passare su una fase stazionaria per mezzo del
flusso di una fase mobile (o eluente). Nella Cromatografia su colonna, la fase
stazionaria è una resina contenuta in un tubo di vetro e l’eluente è una soluzione
tampone. Le caratteristiche della resina fanno si che le diverse proteine si
ripartiscano in maniera diversa tra la fase stazionaria e quella mobile e, quindi,
che si separino.

R
E
Pompa peristaltica immette il S
tampone sulla resina ad un I
N
flusso costante (ml/min) A

L’eluato della colonna viene raccolto in

provette mediante un collettore automatico
Su un’aliquota di ciascuna frazione cromatografica viene letto l’assorbimento a
280 nm. I valori ottenuti consentono di disegnare un cromatogramma (in nero).
Le frazioni che contengono la proteina di nostro interesse (in rosso) sono
riunite e sottoposte a tecniche di purificazione fino all’ottenimento di una
soluzione pura: le altre frazioni sono eliminate.
A (OD)

0,8

0,6

0,4

0,2

1 2 3 4 5 6 7

frazioni

Quali sono le caratteristiche delle proteine che sono sfruttate per ottenere
la loro separazione mediante cromatografia ?
La cromatografia a scambio ionico separa le proteine in base alle differenze
di pI (punto isoelettrico è il valore di pH a cui la proteina ha carica netta zero
perché il numero delle cariche negative uguaglia quello delle cariche positive).
Esistono resine con carica negativa (CM, carbossi metil, legano cationi) e
resine con carica positiva (DEAE, DiEtilAminoEtil, legano anioni). Le
proteine assumono carica netta negativa a valori di pH > pI e carica netta
positiva a valori di pH < pI.
Se creiamo le condizioni giuste (scelta della resina e del pH della soluzione
tampone) possiamo ottenere il legame della proteina di interesse alla resina.

• STEP. 1. Scelta della resina e del pH (per ottenere il legame)

• STEP 2. Carica del campione contenente la proteina che vogliamo
separare dalle altre
• STEP. 3. Lavaggio della resina con tampone per allontanare le proteine
non legate
• STEP 4. Distacco delle proteine legate mediante aggiunta di NaCl nel
tampone (aumento della forza ionica ).
Cromatografia a scambio anionico
A (OD)
Proteine che non hanno
1,0 interagito con la resina

0,5 0-1 M NaCl

frazioni

Ancoretta
Tampone +
Tampone magnetica
NaCl 1 M
colonna

rubinetto
Agitatore
magnetico Formatore di gradiente di
forza ionica
La cromatografia per affinità separa le proteine in base all’affinità per una
molecola (ligando) legata covalentemente ad una resina (agarosio, cellulosa,
destrano, sefarosio) per mezzo di un braccio spaziatore che favorisce
l’interazione. L’efficienza di questa cromatografia è molto alta, con la
possibilità di separare in one-step una specifica molecola da molte altre.

Resina HO
O OH

O O
HO OH
Ligando
OH
OH

OH
Braccio
spaziatore
STEP. 1. Scelta della resina con il ligando “giusto”
STEP 2. Carica del campione contenente la proteina che vogliamo separare
dalle altre
STEP 3. Lavaggio della resina con tampone per allontanare le proteine non
legate
STEP 4. Distacco della proteina dal ligando indebolendo il legame (aggiunta
nel tampone di NaCl o di una molecola per la quale la proteina ha
affinità maggiore).
Purificazione di un antigene mediante cromatografia x affinità
che ha l’anticorpo come ligando.
La cromatografia per gel filtrazione (esclusione molecolare) separa le
proteine in base alle diverse dimensioni molecolari. La resina è costituita di
granuli di gel con pori di dimensione controllata. La reazione tra destrano e
epicloridrina determina la formazione di un polimero chiamato Sephadex
ampiamente utilizzato come resina per gel filtrazione. Il rapporto tra i reagenti
determina la porosità del gel e, quindi, i suoi limiti di esclusione. Ad esempio, il
Sephadex G-100 ha limiti di esclusione 1000-100,000 Da; il Sephadex G-75 ha
limiti di esclusione 1000-50,000 Da.
Le molecole che non possono entrare
nei pori del gel utilizzano il volume
vuoto (Vo) della resina e sono eluite
per prime; quelle che riescono ad
entrare completamente nei pori
utilizzano il volume totale (Vt) della
resina e sono eluite per ultime.
Quindi, il volume di eluizione ed il
Vo Vi Vt peso molecolare sono inversamente
correlati.
Il volume di tampone necessario per l’eluizione delle molecole da una
gel filtrazione (ml, Ve) è regolato dalla formula
Ve = Vo + Kd Vi
Kd è il coefficiente di distribuzione (può assumere tutti i valori
compresi tra 0 e 1) della molecola in questione.

Le molecole di dimensioni maggiori dei pori del gel non penetrano nei
pori (Kd = 0) e sono eluite per prime; il Ve di tali molecole viene
definito Vo (volume vuoto o escluso).
Ve = Vo

Le molecole di dimensioni tali da penetrare completamente nei pori

del gel (Kd =1) sono eluite per ultime; il Ve di tali molecole
corrisponde a
Ve = Vo + Vi cioè Ve = Vt

Le molecole il cui peso molecolare è compreso tra i due casi descritti

(0 < Kd <1) sono eluite con un Ve compreso tra Vo e Vt.
 Cromatografia per gel filtrazione (dimensioni 1,5 x 20 cm, Vt = 35,3 ml)

A (OD)

0,6

0,4

0,2

Frazioni
Ve =Vo
Ve = Vt
 I CRITERI DI PUREZZA
Ad ogni passaggio di purificazione possiamo calcolare
l’attività specifica = [proteina da purificare]
[proteine totali]

Poiché nel corso di una procedura di purificazione le

proteine contaminanti diminuiscono, l’attività specifica
deve aumentare nel corso di una procedura di purificazione
fino a raggiungere un valore massimo e costante quando la
proteina è pura. La diminuzione dell’attività specifica è
indice di errori nell’esecuzione delle tecniche.

Di solito non ci si affida al solo calcolo dell’attività specifica,

ma si utilizza una tecnica elettroforetica per verificare il
grado di purezza della soluzione.
L’ELETTROFORESI separa molecole dotate di carica in base alla loro
mobilità in un campo elettrico che è influenzata dalla carica netta della
proteina, dal supporto usato, dal campo elettrico applicato (Tiselius, Nobèl per
la Chimica nel 1948). L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE,
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) consente di separare proteine (DNA fino
a 800 bp) con la possibilità di variare le dimensioni dei pori del gel variando la
% di acrilammide (pori più stretti all’aumentare della % di acrilammide).

TEtraMEtiletilenDiammina

In assenza di O2 e a
bassa temperatura
1. Scegliere il pH del tampone;
2. Caricare nei pozzetti un’aliquota della soluzione
proteica e un tracciante che migra più velocemente
delle proteine;
3. Applicare un voltaggio costante fino a quando il
tracciante esce dal gel;
4. Recuperare il gel dalle lastrine di vetro e colorarlo con
Coomassie;
5. Eliminare l’eccesso di colorante (lavaggi con acido
acetico/metanolo fino a che il fondo del gel è
trasparente).
La determinazione del
peso molecolare
La cromatografia per gel filtrazione consente di determinare il peso
molecolare nativo di una proteina (quello derivante dall’associazione di
tutte le eventuali subunità).
Si effettua una cromatografia di calibrazione con proteine a peso
molecolare noto, si calcola il Ve di ciascuna di esse, e si riporta in
grafico il Log PM di ciascuna proteina in funzione del suo Ve. Si
sottopone la proteina in esame alla stessa cromatografia e si ottiene il suo
Ve da cui, per estrapolazione sulla retta di taratura, si ricava il peso
molecolare.

••
• ••

LogPM
• •• •
Ve
L’SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
consente di determinare il peso molecolare minimo di una proteina (quello della/e
subunità). L’SDS-PAGE è una elettroforesi denaturante che permette la separazione
delle proteine SOLO in base al peso molecolare.

100 °C x 5 min
Si effettua una corsa di calibrazione con proteine a peso molecolare noto
e si calcola la mobilità di ciascuna banda; si riporta in grafico Log PM
in funzione della mobilità. Conoscendo la mobilità della proteina in
esame, si ricava il peso molecolare della subunità per estrapolazione
sulla retta di taratura.

mobilità, cm