Virusologija

Virusi su najmanji infektivni agensi vidljivi jedino elektronskim mikroskopom

Virusi su obligantni unutarćelijski paraziti- razmnožavaju se isključivo u živoj ćelije

Veličina virusa kreće se od 25 do 300 nm

• Klasifikacija virusa

1.Prema vrsti domaćina:

• bakteriofagi – inficiraju bakterije i druge mikroorganizme

• biljni virusi – virusi koji inficiraju biljke

• animalni virusi – virusi koji inficiraju kičmenjake

2. Prema tipu nukleinske kiseline:

• DNK virusi

• RNK virusi

3. Prema tipu nukleinske kiseline, građi virusne čestice i načinu replikacije virusa:

• Familije (-viridae)

• Podfamilije (-virinae)

• Rodove (-virus)

• Vrste

• Patogeneza virusne infekcije

1. Ulazak virusa u organizam – najčešće preko kože (abrazije, povrede, insekti),

gastrointestinalnog trakta, respiratornog trakta, genitalnog trakta, ređe preko
konjunktive i urinarnog trakta.

2. Širenje (diseminacija) virusa – najčešće preko krvi (viremija) i limfotoka , rjeđe preko
perifernih nervnih vlakana

3. Izlučivanje virusa – najčešće preko površina koje su uključene u ulazak virusa u

organizam (kod lokalizovanih i nekih generalizovanih infekcija); preko kože,
respiratornog i digestivnog trakta, ali i preko urina i majčinog mleka.

4. Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija

5. želimo postaviti etiološku dijagnozu da bi mogli započeti sa liječenjem sa specifičnim

antivirusnim lijekovima (CMV, HSV,HIV, HBV)
 6. želimo osigurati sigurnu zaštitu bolesnika od bolničkih infekcija;

7. virusološkim istraživanjima želimo isključiti virus kao uzrok bolesti;

8. želimo otkriti koliko je neka osoba predisponirana za određenu infekciju (važno npr.
prije zaposlenja, prije transplantacije organa, u trudnoći).

9. želimo epidemiološki pratiti različite virusne infekcije (influenca, HAV, COVIS-19)

10. kada od dijagnoze zavise terapijski postupci i prognoza oboljenja (npr. teratogeni
virusi, diferencijalna dijagnoza virusnih encefalitisa, virusne bolesti sa atipičnom
kliničkom slikom...)

Virusološka (direktna) dijagnostika

izolovanje i identifikacija virusa u sistemima živih ćelija

ispitivanje morfoloških osobina virusne čestice

dokazivanje virusnih antigena

dokazivanje nukleinske kiseline virusa

Serološka (indirektna) dijagnostika

-dokazivanje prisustva specifičnih antivirusnih antitijela

Laboratorijska dijagnoza virusnih infekcija obuhvata:

Uzimanje uzoraka

Transport uzoraka

Obradu uzoraka i njihovu inokulaciju u sistem živih ćelija

Identifikaciju virusa

OSNOVNI PRINCIPI PRAVILNOG UZIMANJA UZORAKA

1. Uzorak treba uzeti u pravo vrijeme – u akutnoj fazi bolesti, 1-3 dana od pojave prvih
simptoma. Uzorke treba uzeti prije primene antivirusne terapije! Za serološku analizu se
uzima parni uzorak seruma: na početku bolesti i 10-14 dana kasnije.

2. Uzorak treba uzeti sa pravog mjesta – što zahteva dobro poznavanje patogeneze bolesti i
tropizma virusa.

3. Uzorak treba uzeti na pravi način – što podrazumjeva pravilan izbor tehnike uzimanja, koja
treba da bude najbolja za postavljanje dijagnoze i najkomfornija za pacijenta.
4. Uzorci se mogu uzeti uz :

• aktivno učešće pacijenta (urin, sputum, stolica...) • pasivno učešće pacijenta (krv, brisevi,
punktati...) Uzimanje treba obaviti pod sterilnim uslovima! Instrumenti moraju biti hemijski
čisti i sterilni, najbolje oni za jednokratnu upotrebu.

5. Potrebno je uzeti dovoljnu količinu materijala - za sve analize koje se žele izvršiti.

6. Posude koje se koriste za uzimanje uzoraka moraju biti: hemijski čiste, sterilne, sa
adekvatnim zapušačem ili zatvaračem na zavrtanje, najbolje one predviđene za jednokratnu
upotrebu.

7. Uzorak je neophodno pravilno i jasno obilježiti što podrazumjeva da na njemu mora pisati:

• ime i prezime pacijenta i/ili identifikacioni broj

• vrsta uzetog uzorka

• vrijeme i datum uzimanja uzorka

Propratna lista treba da sadrži sljedeće podatke:

• spol i godište pacijenta

• naziv ustanove koja šalje materijal i ime ljekara koji ga je uzeo

• dijagnozu (na koju se sumnja)

• virusološke analize koje se traže (precizno naznačene)

• kliničke i epidemiološke napomene: datum početka bolesti, klinički nalazi, primenjena

terapija, podaci o izloženosti virusnim uzročnicima, ujedima životinja ili insekata, skorija
putovanja i skorije vakcinacije.

TRANSPORTNI MEDIJUMI ZA VIRUSE (TMV)

Transportni medijumi za viruse (TMV) imaju za cilj da očuvaju infektivnost virusa, da

spriječe sušenje uzorka i onemoguće razmnožavanje bakterija i gljivica.

Sadrže: - rastvor soli (odgovarajuća jonska koncentracija) - proteine (najčešće albumin ili
želatin) - pufer (održanje pH) -antibiotike i fungicide

* MEM, Hank-ov rastvor, Stjuart-ov...

• BRISEVI

Brisevi u virusološkoj dijagnostici treba da budu:

• Od rejona ili dakrona

• Ne treba da budu od kalcijum alginata ili prirodne vate (pamuka) jer oni smanjuju
infektivnost virusa.
 • Drške briseva treba da budu od metala ili plastike

• Ne treba da budu od drveta jer su smole iz drveta štetne za kulturu ćelija

• UZIMANJE UZORAKA ZA VIRUSOLOŠKA ISPITIVANJA

1. Krv se uzima vene punkcijom ili kroz venski kateter (8-10 ml).

• virusološka dijagnostika - puna krv (Na-citrat, EDTA ili heparin), ili plazma - za PCR
ne sme da bude sa heparinom!

• serološka dijagnostika - serum

2. Kostna srž punkcija - oko 2 ml (Na-citrat, EDTA ili heparin)

• TEČNI UZORCI

1. Saliva -uzima se pomoću 1 ili 2 brisa sa sluznice prednjeg dijela poda usne duplje i
predjela oko otvora Stensonovog kanala. Bris se stavlja u epruvetu sa TMV i dobro
zatvori.

2. Urin-uzima se10-20 ml, srednji mlaz (sterilna posuda)

3. Likvor lumbalna punkcija (2-5 ml likvora)

4. Perikardna tečnost punkcija perikarda (najmanje 2 ml)

• UZORCI IZ GORNJEG DELA RESPIRATORNOG TRAKTA

1. Nazofaringealni bris- bris se uvlači kroz nozdrvu do nazofarinksa. Uzima se materijal

iz obe nozdrve. Bris se stavlja u epruvetu sa TMV i epruveta se dobro zatvori.

2. Nazofaringelni ispirak-pomoću posebne pumpice ili šprice u nozdrvu se uliva 3-5 mL

fiziološkog rastvora dok je druga nozdrva zatvorena. Izvlači se fiziološki rastvor
zajedno sa nosnim sekretom. Izvučeni sadržaj se zatim istisne u sterilnu posudu i
dodaje se TMV.

3. 3. Nazofaringealni aspirat: Kateter se plasira kroz nozdrvu u nazofarings, a zatim se

primjeni vakuum pumpa ili šprica. Kateter i posuda za prikupljanje aspirata se isperu
pomoću 5-8 mL TMV i dobijena mješavina se prebaci u sterilnu posudu koja se dobro
zatvara.

4. 4. Bris grla: Nije optimalni izvor za izolaciju respiratornih virusa.

UZORCI IZ DONJEG DELA RESPIRATORNOG TRAKTA

5. Bronhijalni ispirak i bronhoalveolarni lavat (BAL): Neophodno je plasiranje

bronhoskopa. Uzima se 8-10 mL u sterilnu posudu. TMV nije neophodan. BAL je
manje toksičan za ćelije u kulturi.
6. Sputum: Ne smatra se pogodnim uzorkom za virusološku dijagnozu.
 7. UZORCI IZ GASTROINTESTINALNOG TRAKTA
1. Feces- uzima se 2-4 g stolice (sterilna posuda). Ako se ne može odmah
transportovati do laboratorije, neophodno je dodati TMV (8-10 ml) da bi se sprečilo
sušenje.
2. Rektalni bris- bris se uvlači 4-6 cm u rektum i stavlja u epruvetu sa TMV i dobro
zatvori.

UZORCI IZ GENITALNOG TRAKTA

1. Endocervikalni bris- odstrani se egzocervikalna sluz. Žičani bris se uvlači najmanje 1

cm u cervikalni kanal i rotira. Zatim se stavlja u epruvetu sa TMV.
2. Uretralni bris- pacijent ne smije da mokri najmanje 1 sat prije uzimanja brisa! Žičani
bris se uvlači 2-4 cm u uretru i rotira. Zatim se stavlja u epruvetu sa TMV.
3. Sperma- uzorak sperme se sakuplja u sterilnu posudu.

UZORCI SA LEZIJA NA KOŽI

1. Bris lezije- bris se natopi fiziološkim rastvorom i rotira preko lezije. Stavlja se u
epruvetu sa TMV.
2. Bris vezikule- vezikula se prebriše sterilnim fiziološkim rastvorom i probuši sterilnim
instrumentom. Jednim brisom se pokupi tečnost iz vezikule, a drugim sadržaj dna
vezikule. Brisevi se stavljaju u epruvete sa TMV.
3. Aspirat vezikule- vezikula se probuši sterilnom iglom i njen sadržaj aspirira špricem.
Špric se ispere sa TMV.

UZORCI SA OKA

1. Bris konjuktive- bris se natopi sterilnim fiziološkim rastvorom, rotira po konjunktivi i

stavi u epruvetu sa TMV.

2. Bris rožnjače/scraping- uzima ga isključivo oftalmolog! Stavlja se u epruvetu sa TMV.

• UTICAJ FIZIČKO-HEMIJSKIH FAKTORA NA VIRUSE

Inaktivacija virusa predstavlja trajni gubitak

infektivnosti.

• Temperatura: - virusi su stabilni na niskim temperaturama (čuvanje) - na toplotu su

osetljiviji virusi sa omotačem

• Sušenje: većina virusa je osetljiva

• Zračenje (UV i jonizujuće): inaktiviše viruse

• Hemijska sredstva: organski rastvarači (hloroform) - inaktivišu viruse sa omotačem

 • oksido-redukciona sredstva (formaldehid, hlor, jod) - inaktivišu viruse

• pH sredine: na nizak pH - otporniji virusi bez omotača

TRANSPORT UZORAKA

U toku transporta uzorcima treba obezbediti:

• Zaštitu od lomljenja

• Zaštitu od svetlosti

• Adekvatnu temperaturu:

do 48 h na +40C (frižider, vlažni led)

preko 48 h na -70ºC (suhi led)

ne smiju se zamrzavati na -20ºC!

Laboratorijska dijagnostika virusnih oboljenja

Virusološka (direktna) dijagnostika - Dokazivanje virusa ili delova virusne čestice:

-izolovanje virusa i identifikacija virusa u sistemima živih ćelija

-dokazivanje virusnih antigena

-dokazivanje virusne nikleinske kiseline

-dokazivanje virusa na osnovu morfoloških osobina

Serološka (indirektna) dijagnostika - dokazivanje specifičnih antivirusnih antitela

Virusološka (direktna) dijagnostika

• Izolovanje virusa je postupak dokazivanja prisustva virusa u bolesničkom materijalu.

• Podrazumeva umnožavanje virusa u laboratorijskim in vitro uslovima u sistemima živih

ćelija kulture ćelija embrionirana jaja - laboratorijske životinje

Kulture ćelija (ćelijske linije)

Pod kulturom ćelija podrazumjeva se rast i razmnožavanje ćelija u in vitro uslovima.

- specijalne sterilne posude (staklene ili plastične)

- hranljivi medijumi za rast i održavanje ćelija (rastvor glukoze, elektrolita, vitamina,

esencijalnih aminokiselina, 10% ili 2% seruma, pufera, pH indikator, antibiotika i fungicida)

- 37°C - 5% CO2

Obrada uzoraka prije inokulacije

Homogenizacija – isečci tkiva, feces, brisevi.. Dodavanje antibiotika i fungicida – za uzorke
bez TMV

Filtriranje kroz bakteriološke filtre – veličina pora 0,22 μm Centrifugiranje – u centrifugama

sa hlađenjem, na manjim brzinama, za inokulaciju se koristi supernatant

Diferencijalno centrifugiranje – prethodno dobijen supernatant se centrifugira na velikim

brzinama, za inokulaciju se koristi sediment

Kulture ćelija (ćelijske linije)

U odnosu na poreklo ćelija:

- Humane ili animalne ćelije

- Embrionalne ili ćelije odraslih jedinki

- Normalne ili tumorski izmenjene ćelije

U odnosu na adherentnu sposobnost ćelija:

- Adherentne - jednoslojne

- višeslojne

-Suspendovane i rotirajuće kulture ćelija

Kulture ćelija (ćelijske linije)

Stanične kulture mogu biti:

1. Primarne kulture ćelija (PMK) - dobijaju se direktno od organa ili tkiva, sadrže više
tipova ćelija - mogu se presađivati 2-3 puta

2. Diploidne (MRC-5, Wi-38) – dobijaju se iz tkiva organa čovjeka (pluća,bubreg).

Sastoje je od jedne vrste stanica sa haploidnim brojem hromozoma- mogu se
presađivati 50-100 puta

3. Trajne ćelijske kulture (VERO, He-La, HEp-2) – obično se dobiju od tumorskog tkiva,
a broj dijeljenja ćelija nije ograničen. Broj hromozoma u ćelijama je različit-
heteroploidan.

3. Za rad u virusološkom laboratoriju najprikladnije su već gotove komercijalno

pripremljene ćelijske kulture, na koje se odmah poprijemu inokulira uzorak. Time se
izbjegava skupi i tehnički zahtjevan postupak održavanja kultura.

Dokazivanje prisustva virusa u kulturi ćelija CITOPATOGENI EFEKAT (CPE)

Direktan metod –CPE – vidljive promene ćelija nastalih usled replikacije virusa u
njima (citocidni virusi).
 Može se vidjeti kao:

1. Promena oblika ćelija (zaokrugljivanje, bubrenje,skupljanje)

2. Fuzija ćelijskih membrana (multinuklearne–džinovske ćelije, sincicijum)

3. Pojava inkluzija u jedru i/ili citoplazmi

4. Smrt (liza) ćelije

Dokazivanje prisustva virusa u kulturi ćelija- Indirektne metode

Indirektne metode - koriste se za viruse koji ne daju CPE (necitocidni ili umereni virusi) ili za
viruse koji sporo daju CPE u kulturama ćelija.

Razlikujemo:

1. Metod hemadsorpcije

2. Metod interferencije

Metod hemadsorpcije

-koristi se za viruse koji poseduju hemaglutinine zasniva se na vezivanju eritrocita za

hemaglutinine eksprimirane na površini virusom inficiranih ćelija - reakcija je specijes
specifična

Metod interferencije

Fenomen interferencije je interakcija između dva virusa pri čemu dolazi do zaustavljanja
replikacije jednog od virusa - znak prisustva necitocidnog virusa je odsustvo CPE
kontrolnog citocidnog virusa

Embrionirana jaja

Prednosti primene embrioniranih jaja za izolovanje virusa: zatvorena i sterilna šupljina

mlado embrionalno tkivo sa visokim potencijalom rasta i razmnožavanja najjeftiniji živi
sistem, najčešće se koristi pileći embrion

Mana: mali broj virusa se može izolovati primjenom embrioniranih jaja

Embrionirana jaja

Za izolovanje virusa se koriste različite strukture pilećeg embriona:

žumančana kesa

alantoisna šupljina

amnionska šupljina

horioalantoisna membrana Nakon inokulacije virusa - inkubacija na 37°C, 24h do 8 dana

Dokazivanje prisustva virusa u pilećem embrionu-direktni metod

POKSOVI

Poksovi – vidljive tačkaste promene na horioalantoisnoj membrani

Dokazivanje prisustva virusa u pilećem embrionu- indirektan metod

Virusna hemaglutinacija - koristi se za viruse koji poseduju hemaglutinine - zasniva se na

vezivanju eritrocita za hemaglutinine na površini virusa - reakcija je specijes specifična -
reakcija može biti kvalitativna i kvantitativna

Fenomen elucije

Fenomen elucije je obrnuta reakcija hemaglutinacije, karakterističan za one viruse pored

hemaglutinina imaju i enzim neuraminidazu koji razara receptore na eritrocitima.

Laboratorijske životinje

Za inokulaciju virusa u laboratorijske životinje

potrebno je odabrati:

-Životinju osetljivu na virus

- Životinju odgovarajuće starosti

- Najbolji put inokulacije u osetljivu životinju

zavisi od tropizma virusa

Dokazivanje prisustva virusa u laboratorijskim životinjama

Direktan metod:

- pojava nespecifičnih i specifičnih znakova infekcije

- nastanak tumora

- smrt životinje

Indirektan metod:

- histopatološki preparat

- dokazivanje virusnih antigena u tkivu

- dokazivanje virusne nukleinske kiseline

DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA

PCR

Zadnjih godina metode umnožavanja nukleinskih kiselina dovele su do značajnih promjena u

virološkoj dijagnostici.

Brz razvoj novih tehnika, metoda i aparatura, brzo nadopunjuje naše znanje o biologiji
uzročnika infekcija.

U iskusnim i dobro opremljenim laboratorijima ne postoje više problemi uspješnog,

vjerodostojnog i brzog umnožavanja DNK ili RNK genoma različitih virusa.

Kvalitativno dokazivanje virusnih nukleinskih kiselina praktički je već potisnulo kvantitativno

ili semikvantitativno dokazivanje virusne nukleinske kiseline u realnom vremenu.

 Direktne hibridizacijske metode

 Direktnim dijagnostičkim molekularnim metodama omogućena je detekcija virusnih

nukleinskih kiselina u samom uzorku bez njihovog prethodnog umnožavanja. Sve
hibridizacijske metode temelje se na interakciji kratkih nukleotidnih lanaca (nazvanih
sonda ili proba) sa komplementarnim određenim dijelom genoma virusa (engl. target).

 Sonda je obično označena enzimom, fluorohromom ili antigenskim supstratom koji

omogućuje detekciju hibridizirane sonde.

 Molekularne metode su dosegnule najveći napredak i upotrebljivost na području

dijagnostike i praćenja liječenja infekcije virusom HIV, hepatitisa C i B, kao i
citomegalovirusnih infekcija i dijagnostiku virusnih meningitisa i encefalitisa.

 Važno mjesto molekularne metode zauzimaju i u dijagnostici kod

imunokompromitiranih bolesnika, a posebno kod presađivanja organa ili koštane srži.

 Metode amplifikacije (umnožavanja) nukleinskih kiselina

 Metode umnožavanja nukleinskih kiselina najvažnije su tehnike za direktno

dokazivanje genoma virusa u modernom virološkom laboratoriju.

 Izolacija nukleinskih kiselina- svakoj molekularnoj metodi koja se temelji na

umnožavanju, prethodi izolacija nukleinskih kisleina. Tehnike koje se koriste obično
se izvode u više koraka, a izolacija nukleinskih kiselina je od najveće važnosti za
postizanje pravilnih rezultata. Postupak izolacije:

razgradnja proteina, staničnih i virusnih membrana i oslobađanje nukleinske kiseline, što se

postiže raznim deterdžentima i enzimima

nukleinska kiselina se veže za djeliće silicij-oksida koji su fiksirani u posebne membrane i

preko kojih protiče otopina razgrađenog staničnog i virusnog materijala. Druga mogućnost je
da se nukleinska kiselina veže za posebne magnetne djeliće, a ostatak stanica i debris samo se
isperu puferom

nukleinska kiselina rastopi posebnim puferom koji zbog svoga sastava omogući odvajanje od
djelića za koje je bila fiksirana

 Izolacija nukleinske kiseline danas se u dijagnostičkoj virologiji obično izvodi

automatskim procesima, ali još uvijek je potrebna precizna evaluacija metode za svaki
specifički materijal iz kojega želimo izolirati nukleinske kiseline. Unatoč
nepreglednom broju molekularnih metoda i njihovih varijanti koje su razvijene u
zadnjoj deceniji, na prvom mjestu po važnosti i upotrebljivosti u dijagnostičkoj
virologiji ostaje samo jedna metoda, a to je lančana reakcija polimerazom (engl.
polymerase chain reaction, PCR)

 Danas je u dijagnostičkoj virologiji najraširenija metoda PCR u realnom vremenu

(engl. real-time PCR) kod koje se umnožavanje i detekcija odvijaju istovremeno, tako
da se za prikazivanje produkata mogu upotrijebiti nespecifične boje koje se vežu na
novonastalu DNK (npr. SYBR green, anilinska boja koja se koristi u molekularnoj
biologiji za bojenje nukleinskih kiselina).

 U dijagnostičkim procesima je primjerenija upotreba hibridizacijskih sondi koje

priliježu na odsječke DNK (između oba početna nukleotida) i označene su
primjerenim fluorescentnim bojama. Postoji puno varijanti označavanja sondi;
najraširenije su sonde TaqMan i MGB (engl. minor groove binder). Sonde su na
jednom kraju označene sa supstancijom koja apsorbira ekscitacijsku energiju
fluorofora, a na drugoj sa fluoroforom. Kad polimeraza dođe do hibridizirane sonde,
usljed 5'-egzonukleazne aktivnosti dolazi do cijepanja i razdvajanja fluorofora od
supstancije koja apsorbira njegovu ekscitacijsku energiju zbog čega se kod izloženosti
primjerenom izvoru svjetlosti opazi fluorescencija.

 Količina svjetlosti je srazmjerna količini razgrađene sonde, a ova sa količinom ciljnih

odsječaka koje je sonda mogla hibridizirati i zbog toga je bila u dosegu egzonukleazne
aktivnosti polimeraze. Upotrebom sondi protokol umnožavanja je izmijenjen tako da
se umjesto tri koraka upotrijebe samo dva (spojeni su koraci prianjanja
oligonukleotida i produžavanje lanca DNK). Zbog modifikacije protokola i nekih
tehničkih poboljšanja značajno je skraćen proces umnožavanja. Danas nisu rijetkost
PCR reakcije kod kojih umnožavanje DNK ne traje više od 40 minuta. Ako se u
reakciji PCR pod jednakim uslovima umnoži i poznata količina ciljane DNK
(standardi) može se nacrtati mjerna krivulja i odrediti količina ciljane izlazne DNK u
uzorku.

 Veliki uspjeh PCR pokrenuo je i druge istraživačeka razvoju sličnih metoda. U

metode umnožavanja ciljne nukleinske kiseline se, osim PCR-a, ubrajaju i metode
3SR (engl. self-sustained sequence replication) kojom se umnožava RNK,
umnožavanje putem transkripcije (TMA). metode umnožavanja proba lančanom
reakcijom ligaze (engl. ligaše chain reaction, LCR.
 Uz ove, postoje još i metode kod kojih se, nakon hibridizacije, umjesto ciljne DNK ili
RNK, umnožava samo signal koji se nalazi na probi. Za svaki hibrid između ciljne
DNK i probe veže se više detektorskih molekula koje tako pojačavaju signal. Dva
najpoznatija sistema koja se temelje na umnožavanju signala jesu testovi za detekciju
rizičnih tipova papilomavirusa i metoda razgranate DNK (engl. branched-chain
bDNA) za detekciju i kvantifikaciju hepatitisa B i C.

DETAKCIJA ANTIGENA

Koriste se imunološke antigen-antitijelo reakcije:

 Tehnika imunofluorescencije

 Enzimski imuno esej (ELISA)

 Latex (indirektna) aglutinacija

 Radioimunoesej (RIA)

 Reakcija vezivanja komplementa (RVK)

 Virusni antigeni dokazuju se direktno u uzorku

 Za svaku od metoda osnova istraživanja je antitijelo specifično za određen virus. To su

uglavnom monoklonska antitijela koja su komercijalno dostupna.

 Prednosti metode dokazivanja antigena virusa:

-kratko vrijeme izvođenja testa (koje iznosi od 30 minuta),

-virus nije potrebno razmnožavati budući da nije potrebna prisutnost infektivnih čestica,

-virusni antigeni mogu se dokazati i ako je virus u uzorku inaktiviran.

 Dokazivanje virusnog antigena upotrebom specifičnih monoklonskih antitijela kod

jednog određenog testa uvijek je usmjereno na dokazivanje specifičnog virusa.

 Metode za dokazivanje virusnih antigena najčešće se koriste kod virusnih infekcija

dišnih puteva (respiratorni sincicijski virus, adenovirus, virusi parainfluence i
influence), uzoraka dobijenih iz mjehurića na koži ili sluznici (virus varičele, virus
herpes simpleks tip 1 i 2) i kod virusnih gastroenteritisa kod djece (rotavirusi,
adenovirusi, norovirusi).

 Imunoenzimske metode

 Najčešće se koristi tzv. "metoda duplog sendvića" (engl. double sandwich assay).
 Na dnu mikrotitarske pločice su vezana specifična antitijela za virusni antigen koja
djeluju kao "lovac" za antigene u uzorku. Ako su u uzorku prisutni antigeni, oni se
vežu na antitijela i pritom nastanu imunosni kompleksi. Na njih se nakon ispiranja u
slijedećem koraku dodaje za virus specifično antitijelo, ovaj put označeno pomoću
enzima. Nakon ispiranja dodaje se supstrat specifičan za enzim, koji zbog djelovanja
enzima promijeni boju. Intenzivnost boje izmjeri se pomoću spektrofotometra.

 Enzimsko-imunološkom metode upotrebljavaju se najviše za dokazivanje virusnih

antigena u stolici jer je sve ove virusne uzročnike vrlo teško izolirati u staničnoj
kulturi-adenovirusi , rotavirusi, virus hepatitisa B (u serumu), virus HlV-a, a rjeđe
respiratorni sincicijski virus i virus influence A.

 Metoda direktne imunofluorescencije (DFA)

 Kod imunofluorescentnih testova iskorištena je osobina nekih materijala

(fluorohroma) da, nakon što su obasjane svjetlošću nižih valnih dužina, mogu emitirati
(odašiljati) svjetlost vidljivog spektra. Kod metode direktne imunofluorescencije
koristi se monoklonsko antitijelo označeno sa fluorohromom usmjereno protiv
najizloženijih antigena određenog virusa.

 Uzorak je najčešće bris uronjen u tekući medij. Tekućina skupa sa stanicama se odijeli
u sterilnu epruvetu i centrifugira, nakon čega se odvoji supernatant, a stanice se nanesu
na označena mjesta na posebnom predmetnom teflonskom stakalcu.

 Kad se osuše, fiksiraju se u hladnom acetonu, a potom se nanose monoklonska

antitijela specifična za virus, te nakon inkubacije u trajanju od pola sata, vrši se
ispiranje i mikroskopiranje pod mikroskopom sa ultraljubičastim ekscitacijskim
svjetlom .

 Virusnu infekciju potvrđuje nalaz (za određeni virus) specifičnih nakupina virusnih
antigena koji se vide u obliku zelene fluorescencije u unutrašnjosti inficiranih stanica.
Različiti virusi imaju specifičnu raspodjelu i lokalizaciju unutar inficiranih stanica
(jezgra, citoplazma).

 Metoda ima značajnu prednost pred drugim metodama u brzini izvođenja. Međutim,
ova metoda ima i nekoliko nedostataka - upotrebljivost metode je ograničena samo na
one uzročnike za koje su na komercijalnom tržištu na raspolaganju odgovarajuća
monoklonska antitijela; za mikroskopiranje je potrebna iskusna osoba jer je za
pouzdanu interpretaciju rezultata potrebno višegodišnje iskustvo; rezultati se mogu
očitavati samo individualnim mikroskopiranjem što u razdoblju većih epidemija
predstavlja veliki napor i opterećenje za laboratorijske radnike.

 Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa.

 Imunoflorescencija

 Dokazivanje virusnih antigena brzim testovima

 Brzi testovi za dokazivanje antigena virusa temelje se na reakciji između antigena i
označenog antitijela na principu lateralne imunodifuzije.

 Princip lateralne imunodifuzije omogućuje da se ostatak reaktanta odstrani sa

hromatografskim izdvajanjem (separacijom). Detektorski reagent i uzorak se kreću
preko membrane do ciljne crte gdje detektorski reagent reagira s reagentom-lovcem
koji je imobiliziran na membrani. Rezultat se obično očita usporedbom oblika testne i
kontrolne crte.

 U usporedbi sa ostalim imunološkim testovima njegovo izvođenje je izuzetno

jednostavno (nanošenje uzorka na membranu i očitavanja rezultata nakon određenog
vremena inkubacije). Za izvođenje testa nije potrebno posebno educirano osoblje i
moguće ga je izvesti na mjestu uzimanja. Jednostavnost izvođenja i brz rezultat su
glavne prednosti zbog kojih je interes za prodaju i upotrebu ovih testova vrlo velik.

 Za dijagnostiku virusnih uzročnika infekcije dišnih puteva na raspolaganju su brzi

testovi za dokazivanje infekcije virusom gripe i respiratornim sincicijskim virusom,
sad i Corona virusa.

 Imunohistohemijske metode

 U inficiranim stanicama i histološkim rezovima tkiva virusni antigeni mogu se

prikazati pomoću specifičnih antitijela koja su označena sa enzimom. Prilikom
dodavanja odgovarajućeg supstrata nastanu netopljivi obojeni precipitati koji se u
mikroskopskom preparatu (svjetlosni mikroskop) vide kao obojene mrlje. Ova se
tehnika najčešće upotrebljava za dokazivanje virusnih antigena u biopsijskim
uzorcima i uzorcima uzetim prilikom autopsije.

 Lateks aglutinacija

 Kod metode aglutinacije, odgovarajući dijelovi virusa aglutiniraju polistirenske

dijelove (latex) koji su prekriveni sa specifičnim antitijelima. Metoda nije tehnički
zahtjevna, a rezultat se očitava golim okom. Osjetljivost metode je niska. Najviše se
upotrebljava za dokazivanje antigena rotavirusa u stolici gdje osjetljivost doseže 69%
do 96%.

 Elektronska mikroskopija (EM)

 Kod elektronskog mikroskopa (EM) za stvaranje slike umjesto svjetla upotrebljava se

snop elektrona. Na ovaj način se postiže prekoračenje ograničenja razlučivanja
svjetlosnog mikroskopa koje je ograničeno na valnu dužinu vidljive svjetlosti. U
virologiji se najviše upotrebljava transmisijska elektronska mikroskopija kod koje
se umjesto svjetlosti kroz uzorak usmjeri snop elektrona. Neki elektroni se na površini
uzorka zaustave, a drugi prolaze kroz njega (transmisija) i projiciraju sliku na
fluorescentnom zaslonu. Informacije koje EM može pružiti kod gledanja uzorka jesu
morfologija, veličina i površinske strukture virusa. Građa nekih virusa je toliko
 značajna da ih po morfološkim svojstvima možemo uvrstiti u određenu virusnu
porodicu.

 Pomoću metode negativnog kontrasta virusima u suspenzijama povećavamo kontrast,

odnosno okolišu u kojem se oni nalaze smanjujemo propusnost za elektrone pomoću
teških metala ili njihovih soli (npr. 1% uranil-acetat). Virusi zato postaju vizuelno
svjetliji od svoje okolice i dobro je vidljiva njihova površinska struktura. Metoda se
može prilagoditi za bilo koji uzorak koji sadrži više od IO6 virusa/mL.

 Glavna prednost ove metode jeste da se u uzorku može prikazati bilo koji virus
ukoliko je prisutan u dovoljnom broju. Uspješnost ove metode dokazuje njena
upotreba kod otkrića velikog broja za čovjeka važnih virusa, kao što su npr. virus
hepatitisa B, rotavirusi, norovirusi i virus SARS. Danas je upotreba ove metode
ograničena na dokazivanje enteričnih virusa kod gastroenteritisa i dokazivanje
herpesvirusa i poksvirusa iz kožnih promjena. Elektronskim mikroskopiranjem virus
često ne možemo opredijeliti dalje od nivoa virusne porodice jer se pojedini virusi
unutar porodice ne razlikuju dovoljno po morfološkim osobinama.

DETAKCIJA ANTIGENA

Koriste se imunološke antigen-antitijelo reakcije:

 Tehnika imunofluorescencije

 Enzimski imuno esej (ELISA)

 Latex (indirektna) aglutinacija

 Radioimunoesej (RIA)

 Reakcija vezivanja komplementa (RVK)

Virusni antigeni dokazuju se direktno u uzorku

Za svaku od metoda osnova istraživanja je antitijelo specifično za određen virus. To su

uglavnom monoklonska antitijela koja su komercijalno dostupna.

Prednosti metode dokazivanja antigena virusa:

-kratko vrijeme izvođenja testa (koje iznosi od 30 minuta),

-virus nije potrebno razmnožavati budući da nije potrebna prisutnost infektivnih čestica,

-virusni antigeni mogu se dokazati i ako je virus u uzorku inaktiviran.

Dokazivanje virusnog antigena upotrebom specifičnih monoklonskih antitijela kod jednog

određenog testa uvijek je usmjereno na dokazivanje specifičnog virusa.

Metode za dokazivanje virusnih antigena najčešće se koriste kod virusnih infekcija dišnih
puteva (respiratorni sincicijski virus, adenovirus, virusi parainfluence i influence), uzoraka
dobijenih iz mjehurića na koži ili sluznici (virus varičele, virus herpes simpleks tip 1 i 2) i kod
virusnih gastroenteritisa kod djece (rotavirusi, adenovirusi, norovirusi).

 Imunoenzimske metode

Najčešće se koristi tzv. "metoda duplog sendvića" (engl. double sandwich assay).

Na dnu mikrotitarske pločice su vezana specifična antitijela za virusni antigen koja djeluju
kao "lovac" za antigene u uzorku. Ako su u uzorku prisutni antigeni, oni se vežu na antitijela i
pritom nastanu imunosni kompleksi. Na njih se nakon ispiranja u slijedećem koraku dodaje za
virus specifično antitijelo, ovaj put označeno pomoću enzima. Nakon ispiranja dodaje se
supstrat specifičan za enzim, koji zbog djelovanja enzima promijeni boju. Intenzivnost boje
izmjeri se pomoću spektrofotometra.

Enzimsko-imunološkom metode upotrebljavaju se najviše za dokazivanje virusnih antigena u

stolici jer je sve ove virusne uzročnike vrlo teško izolirati u staničnoj kulturi-adenovirusi ,
rotavirusi, virus hepatitisa B (u serumu), virus HlV-a, a rjeđe respiratorni sincicijski virus i
virus influence A.

 Elisa reader

 Metoda direktne imunofluorescencije (DFA)

Kod imunofluorescentnih testova iskorištena je osobina nekih materijala (fluorohroma) da,

nakon što su obasjane svjetlošću nižih valnih dužina, mogu emitirati (odašiljati) svjetlost
vidljivog spektra. Kod metode direktne imunofluorescencije koristi se monoklonsko
antitijelo označeno sa fluorohromom usmjereno protiv najizloženijih antigena određenog
virusa.

Uzorak je najčešće bris uronjen u tekući medij. Tekućina skupa sa stanicama se odijeli u
sterilnu epruvetu i centrifugira, nakon čega se odvoji supernatant, a stanice se nanesu na
označena mjesta na posebnom predmetnom teflonskom stakalcu.

Kad se osuše, fiksiraju se u hladnom acetonu, a potom se nanose monoklonska antitijela

specifična za virus, te nakon inkubacije u trajanju od pola sata, vrši se ispiranje i
mikroskopiranje pod mikroskopom sa ultraljubičastim ekscitacijskim svjetlom .

virusnu infekciju potvrđuje nalaz (za određeni virus) specifičnih nakupina virusnih antigena
koji se vide u obliku zelene fluorescencije u unutrašnjosti inficiranih stanica. Različiti virusi
imaju specifičnu raspodjelu i lokalizaciju unutar inficiranih stanica (jezgra, citoplazma).

Metoda ima značajnu prednost pred drugim metodama u brzini izvođenja. Međutim, ova
metoda ima i nekoliko nedostataka - upotrebljivost metode je ograničena samo na one
uzročnike za koje su na komercijalnom tržištu na raspolaganju odgovarajuća monoklonska
antitijela; za mikroskopiranje je potrebna iskusna osoba jer je za pouzdanu interpretaciju
rezultata potrebno višegodišnje iskustvo; rezultati se mogu očitavati samo individualnim
mikroskopiranjem što u razdoblju većih epidemija predstavlja veliki napor i opterećenje za
laboratorijske radnike.
  Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa.

 Imunoflorescencija

 Dokazivanje virusnih antigena brzim testovima

Brzi testovi za dokazivanje antigena virusa temelje se na reakciji između antigena i označenog
antitijela na principu lateralne imunodifuzije.

Princip lateralne imunodifuzije omogućuje da se ostatak reaktanta odstrani sa

hromatografskim izdvajanjem (separacijom). Detektorski reagent i uzorak se kreću preko
membrane do ciljne crte gdje detektorski reagent reagira s reagentom-lovcem koji je
imobiliziran na membrani. Rezultat se obično očita usporedbom oblika testne i kontrolne crte.

U usporedbi sa ostalim imunološkim testovima njegovo izvođenje je izuzetno jednostavno

(nanošenje uzorka na membranu i očitavanja rezultata nakon određenog vremena inkubacije).
Za izvođenje testa nije potrebno posebno educirano osoblje i moguće ga je izvesti na mjestu
uzimanja. Jednostavnost izvođenja i brz rezultat su glavne prednosti zbog kojih je interes za
prodaju i upotrebu ovih testova vrlo velik.

Za dijagnostiku virusnih uzročnika infekcije dišnih puteva na raspolaganju su brzi testovi za

dokazivanje infekcije virusom gripe i respiratornim sincicijskim virusom, sad i Corona virusa.

 Imunohistohemijske metode

U inficiranim stanicama i histološkim rezovima tkiva virusni antigeni mogu se prikazati

pomoću specifičnih antitijela koja su označena sa enzimom. Prilikom dodavanja
odgovarajućeg supstrata nastanu netopljivi obojeni precipitati koji se u mikroskopskom
preparatu (svjetlosni mikroskop) vide kao obojene mrlje. Ova se tehnika najčešće
upotrebljava za dokazivanje virusnih antigena u biopsijskim uzorcima i uzorcima uzetim
prilikom autopsije.

 Lateks aglutinacija

Kod metode aglutinacije, odgovarajući dijelovi virusa aglutiniraju polistirenske dijelove

(latex) koji su prekriveni sa specifičnim antitijelima. Metoda nije tehnički zahtjevna, a rezultat
se očitava golim okom. Osjetljivost metode je niska. Najviše se upotrebljava za dokazivanje
antigena rotavirusa u stolici gdje osjetljivost doseže 69% do 96%.

 Elektronska mikroskopija (EM)

Kod elektronskog mikroskopa (EM) za stvaranje slike umjesto svjetla upotrebljava se snop
elektrona. Na ovaj način se postiže prekoračenje ograničenja razlučivanja svjetlosnog
mikroskopa koje je ograničeno na valnu dužinu vidljive svjetlosti. U virologiji se najviše
upotrebljava transmisijska elektronska mikroskopija kod koje se umjesto svjetlosti kroz
uzorak usmjeri snop elektrona. Neki elektroni se na površini uzorka zaustave, a drugi prolaze
kroz njega (transmisija) i projiciraju sliku na fluorescentnom zaslonu. Informacije koje EM
može pružiti kod gledanja uzorka jesu morfologija, veličina i površinske strukture virusa.
Građa nekih virusa je toliko značajna da ih po morfološkim svojstvima možemo uvrstiti u
određenu virusnu porodicu.

Pomoću metode negativnog kontrasta virusima u suspenzijama povećavamo kontrast,

odnosno okolišu u kojem se oni nalaze smanjujemo propusnost za elektrone pomoću teških
metala ili njihovih soli (npr. 1% uranil-acetat). Virusi zato postaju vizuelno svjetliji od svoje
okolice i dobro je vidljiva njihova površinska struktura. Metoda se može prilagoditi za bilo
koji uzorak koji sadrži više od IO6 virusa/mL.

Glavna prednost ove metode jeste da se u uzorku može prikazati bilo koji virus ukoliko je
prisutan u dovoljnom broju. Uspješnost ove metode dokazuje njena upotreba kod otkrića
velikog broja za čovjeka važnih virusa, kao što su npr. virus hepatitisa B, rotavirusi,
norovirusi i virus SARS. Danas je upotreba ove metode ograničena na dokazivanje enteričnih
virusa kod gastroenteritisa i dokazivanje herpesvirusa i poksvirusa iz kožnih promjena.
Elektronskim mikroskopiranjem virus često ne možemo opredijeliti dalje od nivoa virusne
porodice jer se pojedini virusi unutar porodice ne razlikuju dovoljno po morfološkim
osobinama.

DETEKCIJA ANTITIJELA

Mjerenje specifičnih antitijela usmjerenih protiv virusa, danas je jedna od najvažnijih metoda
dijagnostičke virologije. Ova je tehnologija omogućila automatizaciju i tako je postalo
moguće sa malo napora pregledati veliki broj seruma u kratkom vremenu.

Jedino je serološkim metodama moguće opredijeliti postojeću imunost na neke virusne

infekcije.

Serološka dijagnostika ovisi od dinamike stvaranja antitijela. U akutnoj fazi bolesti moguće je
dokazivati IgM-antitijela, a u rekonvalescenciji IgG- i IgM-antitijela. Uzorak koji se
pretražuje može biti serum, plazma ili likvor.

Za detekciju specifičnih IgM-antitijela virusa kojega dokazujemo, može se uraditi testiranje sa

dva seruma od kojih prvoga moramo uzeti što ranije u početku bolesti, a drugog za 2 - 3
sedmice nakon početka simptoma (parni serum). Četverostruki porast titra antitijela se smatra
potvrdom skorašnje infekcije.

IgG-antitijela se mogu određivati kvantitativno i semikvantitativno. Rezultat se može izraziti

u titrom antitijela (najveće razrjeđenje seruma koje još pokazuje pozitivni rezultat) ili
internacionalnim jedinicama.

Zbog automatizacije često se koristi u dijagnostici HlV-a, hepatitisa, krpeljnog encefalitisa i

drugih infekcija.

Metoda indirektne imunofluorescencije (IFA)

Metodom indirektne imunofluorescencije (IFA) u serumu bolesnika se dokazuju specifična

antivirusna antitijela.
Ako su u serumu bolesnika prisutna specifična antitijela protiv virusnih antigena (na stakalcu
je to pozitivna reakcija), pod mikroskopom će se vidjeti žutozelena fluorescencija. U vidnim
poljima mikroskopa, sa rastućom koncentracijom seruma, vidi se sve slabija fluorescencija, a
posljednje vidno polje u kojem se vidi reakcija, predstavlja titar antitijela. Metoda indirektne
imunofluorescencije je vrlo brza, specifična i ima dobru osjetljivost. Ocjena rezultata je
subjektivna, te je za njezino izvođenje i prije svega validaciju, potrebno dugogodišnje
iskustvo onoga tko izvodi mikroskopiranje. Primjerena je prije svega za upotrebu u
istraživanjima i u manjim serijama uzoraka.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA)

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) je danas među najboljim i najviše upotrebljavanim

imunološkim testovima u virologiji. Postoje brojne varijante ove metode, a kod svih je
iskorištena činjenica da je na antitijela moguće vezati enzim koji time ne gubi svoju aktivnost,
a isto tako ni antitijelo neće izgubiti sposobnost da se veže sa svojim specifičnim antigenom.
Najčešće su antitijela označena sa alkalnom fosfatazom ili sa peroksidazom. Metoda je vrlo
osjetljiva i specifična, te je izuzetno primjerena za automatizaciju i izvođenje velikog broja
testiranja u većim ili manjim serijama.

Može se evaluirati i kvalitativno i kvantitativno, moguće je određivati antitijela klase IgG i

IgM, a i antitijela klase IgA kod infekcija sluznica (često kod infekcija dišnih puteva).

Količina antitijela se može izraziti titrom, arbitrarnim jedinicama, indeksom ili

internacionalnim jedinicama (IU).

Reakcija vezanja komplementa (RVK)

Reakcija vezanja komplementa (RVK) jedna je od najstarijih metoda za dokazivanje

specifičnih antitijela. U reakciji je iskorištena sposobnost komplementa da hemolizira
eritrocite i da se veže na imunološke.

Metodom RVK dokazuje se prisutnost antitijela protiv različitih virusa (mumps, ospice,
krpeljni menin-goencefalitis, poliovirus, enterovirusi itd.).

Ova metoda ne omogućava dokazivanje pojedinih različitih razreda antitijela nego se uvijek
određuju samo zajednička antitijela (zajedno IgG i IgM). Dokaz akutne infekcije izvodi se
testiranjem dva uzorka u vremenskom razmaku od 14 dana kada se određuje moguća
promjena u titru antitijela (četverostruki porast za potvrdu akutne infekcije).

Sistem komplementa

Sistem komplementa je glavni efektorni mehanizam humoralnog imuniteta i takođe važan

efektorni mehanizam prirodnog imuniteta.

Sastoji se od serumskih proteina i proteina u ćelijskoj membrani koji reaguju međusobno kao
i sa drugim molekulima imunog sistema na način koji je visoko kontrolisan.
Aktivacija komplementa obuhvata sekvencijalnu proteolizu proteina komplementa pri čemu
se stvaraju proteolitički enzimi. Proteini koji čine sistem komplementa su proteini plazme koji
su normalno inaktivni; aktiviraju se u određenim uslovima da bi stvorili produkte koji
ostvaruju brojne efektorne funkcije komplementa.

Produkti aktivacije komplementa se kovalentno vezuju za površinu bakterija ili za antitijela

vezana za bakterije ili druge antigene.

Aktivaciju komplementa inhibiraju regulatorni proteini koji su prisutni u ćelijskoj membrani

domaćina a nema ih na membrani bakterija.

Povoljni efekti delovanja komplementa:

- Opsonizacija i olakšavanje fagocitoze

- Hemotaksa i aktivacija fagocita

- Liza bakterija i inficiranih ćelija

- Regulacija humoralnog imunog odgovora

- Uklanjanje imunih kompleksa

- Uklanjanje apoptotičnih ćelija

Nepovoljni efekti delovanja komplementa:

- Inflamacija

- Anafilaksa

Prvi dio reakacije

poznati antigen+standarizirana količina komplementa +inaktivirani serum bolesnika

Drugi dio reakcije

hemolitički sistem(ovčiji eritrociti i serum u kome se nalazi hemolizin protiv ovčijih

eritrocita

hemoliza eritrocita – negativna reakcija

nema hemolize eritrocita – pozitivna reakcija

Inhibicija hemaglutinacije (IH)

Metoda se temelji na intrinzičnoj sposobnosti nekih virusa da aglutiniraju (sljepljuju)

eritrocite, za što su odgovorni posebni glikoproteini smješteni na površini virusa -
hemaglutinini.

Virusi koji na svojoj površini izražavaju hemaglutinine su virus rubele, virus influence, virusi
parainfluence, virus mumpsa i brojni arbovirusi (npr. virus krpeljnog meningoencefalitisa).
Prisutnost specifičnih antitijela u serumu bolesnika sprječava aglutinaciju eritrocita, te dolazi
do inhibicije hemaglutinacije. Kod ove metode je važno serum bolesnika prije testiranja
obraditi kaolinom ili mješavinom heparina i magnezijevog klorida da bi se odstranili
nespecifični inhibitori hemaglutinacije.

Ovom metodom nije moguće razlikovati IgG- i IgM-antitijela. Metoda je

semikvantitativna jer se može odrediti titar (najveće razrijeđenje seruma).

Neutralizacijski test (NT)

Test se temelji na neutralizacijskom djelovanju antitijela na moguću infekciju virusa. Vezanje

specifičnih antitijela na površinu virusa dovodi do prekrivanja veznih mjesta na virusu kojima
se on inače veže na receptore stanice domaćina i time se onemogućava infekcija, odnosno
dolazi do neutralizacije virusa.

Neutralizacijska antitijela u serumu bolesnika se određuju tako da se unaprijed pripremi

serum s odgovarajućim razrjeđenjima koji se nanesu na stanične kulture kojima je dodana
poznata količina infektivnog virusa protiv kojeg tražimo antitijela. Ako dođe do uspješne
neutralizacije (na staničnim kulturama ne dolazi do citopatskog efekta) pripremi se veće
razrjeđenje (titar) seruma od onoga u kojemu je došlo do neutralizacije. Ako u serumu
bolesnika nisu prisutna neutralizacijska antitijela, u svim sistemima kojima smo dodali
infektivni virus doći će do pojave citopatskog efekta.

Ovom metodom se ne mogu određivati pojedine klase antitijela (npr. IgM ili IgG) nego samo
skupni titar neutralizacijskih antitijela.

Metoda western blot/ imunoblot (WB)

Pomoću metode western blot (WB) dokazuju se antitijela protiv tačno određenih virusnih .
Rezultat se pokaže u obliku obojenih prugastih područja na filter-papiru, a ukazuju na
reakciju sa tačno određenim antigenom. Sto je veći broj obojenih prugastih područja, veća je
mogućnost da je potvrđena infekcija s određenim virusom.

Varijanta ove metode je metoda imunoblot. Kod ove metode se umjesto prirodnih virusnih
proteina (obično iz izolata virusa) na membranu, u tačno određenim razmacima, nanesu
rekombinantni virusni proteini (dobiveni kloniranjem i ekspresijom virusnih proteina u
ekspresijskim sistemima). Prugasta područja su kod imunoblot metode nanesena na
membranu u jednakim razmacima i zato ih je lakše interpretirati .

Western blot se koristi u serološkim tehnikama kao metoda za potvrdu rezultata kod kritičnih
infekcija koje za bolesnika mogu imati teške posljedice, kao što su npr. infekcija virusom
HIV, infekcija virusom hepatitisa C i ponekad infekcija virusom Epstein-Barrovim.