Qué son las pruebas AFST

Primeramente hablaremos que son las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos, estas

son influenciadas por un número de variables técnicas, que incluyen, el tamaño del
inóculo, es decir, la concentración de microorganismos utilizada para realizar un cultivo
microbiano y la preparación del mismo, la formulación y el pH del medio, la duración y la
temperatura de incubación, y el criterio usado para la determinación del punto final.
Además, las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos son complicadas por problemas de
los mismos hongos, tales como una tasa de crecimiento lenta (comparada con las
bacterias) y la habilidad de ciertos hongos dimórficos para crecer como una levadura
unicelular que produce blastoconidias, hifas o formas de hongos filamentosos que pueden
producir esporas asexuales dependiendo del pH, la temperatura y la composición del
medio.

Objetivo

El objetivo de realizar prueba de sensibilidad a los antifúngicos y sus siglas AFST bueno
que es producir datos procesables para el médico tratante sobre la susceptibilidad,
entonces tenemos que  la susceptibilidad intermedia o dependiente de la dosis es el
fenotipo de resistencia para una combinación de organismo-agente antifúngico. La AFST
puede predecir el resultado del tratamiento, a lo largo de esto han dicho que AFST ha
alcanzado la mayoría de edad como un herramienta clínica útil.

Entonces hablaremos de la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima

fungicida,

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)

La CMI es la concentración mínima inhibitoria, la cual es una concentración más baja en

microgramo por mililitro de un antibiótico que inhibe el crecimiento de una determinada
cepa bacteriana.

bueno y la concentración mínima de un antimicótico expresada en g/mL, puede inhibir o

reducir el crecimiento de un moho o levadura in vitro de las principales especies de
levaduras oportunistas [Candida spp, Cryptococcus neoformans] y hongos filamentosos
microscópicos.

Y la manera en que se informa la CMI que es la concentración mínima inhibitoria, como

les mencione anteriormente es...

Bueno al lado de cada antibiótico se indica la interpretación de la sensibilidad: S

(sensible), I (intermedia) o R (resistente), seguido de la CMI en μg/ml. “Sensible” significa
que el crecimiento del microorganismo está inhibido a la concentración sérica del fármaco
que se alcanza utilizando la dosis habitual; "intermedia" que esto significa que el
crecimiento del microorganismo está inhibido, bueno solamente a la dosis máxima
recomendada y "resistente" es que el microorganismo es resistente a los niveles séricos
del fármaco que se alcanzan normalmente. bueno y estas normas de interpretación las ha
establecido el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI).
LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA FUNGICIDA (CMF)

La Concentración mínima fungicida, bueno se refiere al agente o solución que disminuye

en 99.9% el crecimiento del hongo a partir de un inóculo de subcultivo puro.

Ensayos fenotípicos convencionales para probar la susceptibilidad fúngica

Métodos AFST de referencia

Bueno Actualmente, los ensayos fenotípicos para realizar AFST in vitro para levaduras u
hongos filamentosos (también denominados mohos) incluyen dos métodos estándar
universalmente reconocidos, CLSI y EUCAST que aplican el método de microdilución en
caldo (DMO). Esta mide la actividad fúngica expresada como la concentración inhibitoria
mínima (MIC) de un fármaco antifúngico, que indica la concentración mínima de fármaco
que inhibe el crecimiento de los hongos.

Bueno, se ha demostrado que estos métodos al finalizar las pruebas producen datos de
CMI comparables para todas las clases de agentes antifúngicos. El método EUCAST
utiliza un porcentaje alto de glucosa de (2%) para el medio de la prueba que facilita un
mayor crecimiento de hongos, para estos métodos tiene un tiempo de incubación
recomendado de 24 h. Basándose en diferentes valores absolutos de MIC generados,
EUCAST y CLSI han establecido puntos de corte clinicos divergentes para las especies
de Candida. A diferencia de CLSI, que no ha establecido CBP (puntos de corte clínicos)
contra Aspergillus.

Métodos AFST comerciales

Estos métodos fenotípicos están limitados al requerir un cultivo puro del organismo
infectante antes de la prueba. Sin embargo, SYO, Etest son métodos comerciales
ampliamente utilizados para AFST in vitro de especies de Candida y Aspergillus , y
tambien se cree que son superiores a los métodos de referencia en uso, conveniencia y
flexibilidad.

El panel antifúngico de microdilución SYO, permite que la prueba simultánea de

anfotericina B, equinocandinas y triazoles, sea evaluado ampliamente para las levaduras,
convirtiéndose en el foco de grandes estudios hospitalarios.  Para que los CBP(puntos de
corte clínico / ECV ( valores de cortes epidemiológicos) de CLSI asignen susceptibilidad a
agentes antifúngicos sistémicamente activos. Para esto se realizaron dos estudios
recientes donde se informaron sobre los resultados de SYO MIC para especies
de Candida . En el estudio las tasas de susceptibilidad / peso corporal a la anfotericina B y
la flucitosina fueron superiores al 97% en todos los aislados de levadura.

Cabe recalcar que SYO es una adaptación colorimétrica del método CLSI BMD, que se
basa en el estándar para levaduras y para moho, puntos finales de color SYO se
determinan visualmente a medida que el color de AlamarBlue cambia de azul (0% de
crecimiento) a rojo (100% de crecimiento), y solo un color púrpura intermedio puede
indicar un 50% de crecimiento.

En comparación con SYO, este… los ensayos de difusión en gradiente como las tiras
reactivas Etest / MIC son fáciles de realizar y es un método de difusión en agar, que
consta de una tira con una gradiente de concentración de antifúngico y que permite
cuantificar, mediante la lectura de un elipse de inhibición, las concentraciones inhibitorias
mínimas (CIMs). Esta es la única prueba de susceptibilidad al isavuconazol disponible
comercialmente, contra EUCAST.

Ensayos fenotípicos no convencionales para probar la susceptibilidad fúngica

Métodos AFST basados ​en espectrometría de masas MALDI-TOF

MALDI-TOF MS ofrece la oportunidad de identificar casi todos los géneros y especies

microbianos con una fiabilidad, rapidez y rentabilidad sin precedentes aunque para
hongos no ha sido tan rápido ya que la complejidad de la célula fúngica obstaculizaron la
optimización temprana de los procedimientos analíticos de muestras.

para probar el método se realizó una investigación basados ​en MALDI-TOF MS para

probar la susceptibilidad a equinocandina de especies de hongos. mediante esta prueba
obtuvo espectros de masas de células fúngicas expuestas a diferentes concentraciones
de caspofungina durante 15 h, y luego se compararon los espectros de masas
"intermedios" con cada uno de los espectros de masas "extremos" utilizando un análisis
de índice de correlación compuesto (CCI), el segundo ensayo que se realizo, fue
parecido al primero solo que simplificado proporcionando discriminación entre aislados
susceptibles y resistentes de C. albicans, después de 3 h de exposición de células
fúngicas a tres niveles de fármaco antifúngico: sin fármaco (concentración nula),
intermedio ("punto de corte") y máximo (concentración máxima). Este ensayo de “tres
puntos”, los aislamientos fueron susceptibles o resistentes cuando los valores de CCI
obtenidos al coincidir su espectro de punto de ruptura con su espectro máximo fueron,
superiores o inferiores a los valores de CCI obtenidos.

Pruebas de susceptibilidad a antifúngicos

Los métodos que se utilizan para realizar las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos
incluyen los caldos de dilución (macro y micro dilución), el método de dilución en agar y la
prueba de difusión en disco. se dice que en la actualidad se han evaluado dos pruebas de
susceptibilidad a antifúngicos comerciales; el Test de microdilución colorimétrica
desarrollado por Alamar Biosciences, Inc (Sacramento, California) y la tira antifúngica de
difusión en agar conocida como E test desarrollada por AB Biodisk (Soina, Suecia).

Pruebas de microdilución en caldo

Las primeras determinaciones de estas pruebas se realizaron empleando una cantidad

considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaron unas diluciones
crecientes de antibióticos, con el mismo fundamento que el descrito para el método de
dilución en agar. y este procedimiento se denominó microdilución en caldo.

Método macrodilución

Este método es el más ampliamente usado y es el método de referencia para células

levaduriformes.

Este método es adecuado para probar todos los agentes antifúngicos de cualquier
aislamiento fúngico. Este método se utiliza en laboratorios en los cuales el volumen de
estas pruebas sea bajo.

El medio de cultivo que se utiliza, se define como un medio sintético y actualmente, se

está utilizando el caldo medio Roswell Park Memorial Institute, más conocido por su
siglas, RPMI 1640 con L-glutamina y un indicador de pH sin bicarbonato de sodio.

Este medio , es bufferizado a pH 7,0 a 25 grados centígrados . Un buffer que da

resultados satisfactorios para pruebas antifúngicas es el MOPS el cual tiene una
molaridad final de 0, 165 para un pH de 7,0.

Este medio es apropiado para Anfotericina B, 5-FC, y azoles y es el recomendado a

emplear cuando se realiza una prueba de susceptibilidad contra especies de Candida y
varios hongos filamentosos.

No obstante, el RPMI no es adecuado para soportar el crecimiento de algunas cepas de

Cryptococcus neoformans y no permite distinguir aislamientos susceptible, de algunas
cepas potencialmente resistentes a anfotericina B

Pruebas de difusión en disco

Es un método que brinda resultados cualitativos de la susceptibilidad antifúngica, consiste

en depositar discos de papel de filtro impregnados con antifúngicos sobre la superficie de
una placa de agar Mueller-Hinton (MH) previamente inoculada con el microorganismo, al
ponerse en contacto el disco impregnado de antifúngico con la superficie húmeda con el
agar, el filtro absorbe el agua y el antifúngico se difunde por el agar, formando un
gradiente de concentración que produce una zona de inhibición de crecimiento.

Algunas ventajas de esta prueba es que es una técnica simple, flexible y de bajo costo La
desventaja es que sólo existen puntos de corte para fluconazol y voriconazol. bueno la
utilización de azul de metileno disperso en la superficie de la placa parece mejorar los
límites de la zona de inhibición y pues facilita la lectura.

Métodos de dilución en caldo

estos Constituyen el estándar de oro para poder determinar la susceptibilidad in vitro,

tanto de levaduras como de hongos filamentosos y miden CIM, que como les mencione
anteriormente significa concentración inhibitoria mínima a distintos fármacos antifúngicos,
como anfotericina B, fluocitosina, fluconazol, ketoconazol, itraconazol y los nuevos
triazoles como voriconazol, posaconazol y ravuconazol.
bueno y en la actualidad se dispone de dos estándares que utilizan el método de
microdilución en caldo con este propósito. Se han determinado puntos de corte de CIM
para fluconazol, itraconazol, voriconazol y fluocitosina. Los puntos de corte para las
equinocandinas (caspofungina, micafungina, anidulafungina) contra Candida, aún no han
sido validados; sin embargo, es importante señalar que Candida parapsilosis, Candida
guilliermondii y Candida famata... tienden a presentar CIMs más altas a estos fármacos.

bueno y como las Recomendaciones para el estudio de susceptibilidad antifúngica,

la realización de estas pruebas tiene indicaciones precisas:

como son:

-- Efectuar estudios de vigilancia epidemiológica que permitan conocer los perfiles de

susceptibilidad y resistencia de cepas clínicas, claro estas aisladas principalmente de
infecciones invasoras en un país, lugar… pues o en zona geográfica y así.

-- Determinar el nivel de resistencia frente a nuevos compuestos con actividad antifúngica.

-- Predecir, adivinar la respuesta clínica y optimizar la terapia de pacientes hospitalizados

que no responden al tratamiento, que tambien presentan infecciones fúngicas invasoras o
en los que se aíslan cepas con alta tasa de resistencia a fármacos antifúngicos (Ej. C.
glabrata y fluconazol).