Guía de Laboratorio Control Microbiológico

GUÍA DE LABORATORIO
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS INDUSTRIALES, BIOLÓGICOS E INSUMOS PARA LA

SALUD.
Profesora
ANA GRACIELA LANCHEROS DÍAZ
Sexto Semestre
ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, Enero de 2019
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
CONTENIDO
PÁGINA
1. INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………. 2
1.1. OBJETIVOS ……………………………………………………………………….. 2
1.2. PRECAUSIONES UNIVERSALES ……………………………………………… 3
1.3.1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD …………………………………………………. 4
1.3.2. Precauciones en el área de Microbiología ……………………………………... 5
1.3.3. Limpieza de materiales …………………………………………………………… 5
2. PRÁCTICAS
2.1. ANÁLISIS DE AIRE, SUPERFICIES, EQUIPO Y PERSONAL ……………… 7
2.2. RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS MESOFÍLICOS …………... 10
2.3. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS …………………………………….. 14
2.4. REDUCTASA ……………………………………………………………………… 18
2.5. FOSFATASA Y PEROXIDASA ………………………………………………….. 20
2.6. NÚMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES ……………………… 22
2.7. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES FECALES ………… 27
2.8. RECUENTO DE ESTAFILOCOCO COAGULASA POSITIVA ……………….. 30
2.9. ESTERILIDAD EN CONSERVAS ……………………………………………….. 35
2.10. ACIDEZ Y DENSIDAD ……………………………………………………………. 41
2.11. ÍNDICE DE REFRACCIÓN ………………………………………………………. 46
2.12. IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes………………………………… 49
2.13. IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA ………………………………………….. 60
2.14. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MEDICAMENTOS ESTÉRILES Y NO
ESTÉRILES……………………………………………………………………… 67
….
2.15. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS ………………………………………... 72
2.16. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE INSUMOS MÉDICOS ………………….. 75
2.17. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE COSMÉTICOS ………………………….. 77
ANEXOS …………………………………………………………………………… 82
ENFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS INDUSTRIALES, BIOLÓGICOS E INSUMOS PARA LA SALUD
MISIÓN INSTITUCIONAL
(Acuerdo No. 39, septiembre 16 de 2013, Consejo Superior Universitario)
La Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, dentro de una perspectiva humanística, le

apuesta a una educación integral en diversos niveles y modalidades de Pregrado y Posgrado, la
cual se fundamenta en los imperativos axiológicos, las demandas sociales y los desarrollos
tecnológicos y científicos. En su proceso impulsa la vivencia de valores humanos y ciudadanos
que incidan en la formación de profesionales responsables y críticos que se comprometan con
los avances del conocimiento, el desarrollo socio-cultural y el cuidado del medio ambiente.
VISIÓN
Soñamos un Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, que cuente con estudiantes de las
más altas capacidades científicas, con pensamiento crítico y trascendente, comprometidos con
su universidad, con capacidad crítica y una visión madura y responsable de la vida. Queremos
un programa, cuyo compromiso con el saber y el conocimiento aporte soluciones a los
problemas de la comunidad y contribuya a dar respuestas a las nuevas exigencias y
necesidades de la sociedad en materia de salud, que incursione en el análisis de problemáticas
ambientales, conservación de la biodiversidad, reforestación, mejoramiento de la producción en
plantas y animales de interés económico, aprovechamiento de productos de origen natural para
su utilización en la agricultura, la industria y la biomedicina. Que sus profesionales se
contextualicen de acuerdo a las corrientes de la biología moderna, en la búsqueda de nuevos
métodos de diagnóstico y tratamiento de las enfermedades y en el avance de la informática, las
comunicaciones y la información biotecnológica.
Queremos un programa que cuente con docentes de las más altas calidades académicas y
humanas que propicien la investigación, la formación integral y valoren profundamente a la
persona, sus necesidades y sus proyectos de vida.
1
INTRODUCCIÓN
El componente temático denominado “Control microbiológico de productos industriales,

biológicos e insumos para la salud”, describe una de las acciones que los industriales deben
realizar en el proceso de manufactura de los productos, con el objeto de garantizar su calidad
sanitaria. Además el Estado colombiano a través de la función de vigilancia y control, realiza
sobre estos productos pruebas de laboratorio tales como físicas, químicas y microbiológicas con
el objeto de verificar el cumplimiento de los requisitos establecidos en las Normas oficiales
reglamentarias.
La calidad sanitaria de un producto de consumo se fundamenta en la prevención, buscando que
el producto final sea apto para el consumo humano y el profesional de la bacteriología tiene los
conocimientos que le permiten identificar y controlar los factores de riesgo en las diferentes
etapas del proceso de producción, conservación y control. Además puede intervenir en proyectos
de investigación sobre control de los residuos originados por la industria, previniendo así la
contaminación del medio ambiente.
Actualmente con el proceso de la internacionalización de las economías, nuestro país tiene
convenios comerciales con varios países tales como CAN, MERCOSUR, Comunidad Económica
Europea, Tratado de Libre Comercio próximo a firmarse, dentro de esta problemática Colombia
debe certificar que los productos que va a exportar cumplen con las Normas de calidad sanitaria
internacionalmente aceptadas. El papel del bacteriólogo es decisivo en la industria ya que puede
intervenir en la ejecución de pruebas que son determinantes en la prevención de la calidad de un
producto de consumo, proporcionando información oportuna de los diferentes procesos,
permitiendo tomar acciones correctivas en mejora de la calidad, dando como resultado el
cumplimiento de las normas del producto y a los consumidores ofreciéndoles la garantía de
calidad, evitando riesgos de posibles enfermedades transmitidas o generadas por los productos
de consumo.
La presente guía de laboratorio describe algunos procedimientos analíticos microbiológicos y
físico-químicos de alimentos, medicamentos e insumos para la salud, pruebas que aplicadas en
planes y programas de aseguramiento de la calidad, contribuyendo a garantizar el producto y
evitar los posibles riesgos de enfermedades transmitidas o generadas por los productos de
consumo.
OBJETIVOS
 Realizar pruebas físicas, químicas, microbiológicas y biológicas que aseguren el
cumplimiento de las Normas Reglamentarias para los alimentos, bebidas,
medicamentos, cosméticos, productos biológicos, productos de aseo, higiene y limpieza,
buscando la solución a problemas sanitarios.
 Identificar la normatización pertinente relacionada con el registro, la vigilancia y control
de alimentos, bebidas, medicamentos, biológicos, cosméticos e insumos para la salud.
 Utilizar las herramientas para tomar acciones correctivas oportunas durante las etapas
de producción y consumo de los productos, asegurando la calidad del producto final para
verificar el cumplimiento de los requisitos legales.
 Tomar muestras de laboratorio al inicio, durante y al final del proceso de producción para
verificar cumplimiento de requisitos legales.
 Controlar los puntos críticos en la producción, venta, distribución y consumo de
alimentos, bebidas, productos industriales e insumos para la salud.
2
PRECAUCIONES UNIVERSALES
Las siguientes son recomendaciones universales y que deben ser puestas en práctica por los
trabajadores de la salud en su desempeño profesional:
 Utilizar siempre ELEMENTOS DE BARRERA apropiados, según necesidades: blusa,

guantes, mecheros, tapabocas, cámaras de seguridad, mascarilla y gafas.
 Bata, preferiblemente larga, de uso diario y exclusivo para el área de trabajo
 Guantes desechables (látex), al realizar venopunciones u otros procedimientos de acceso
vascular y al manipular muestras.
 Los guantes reducen la incidencia de contaminación con sangre u otros líquidos durante los
diferentes procedimientos, pero no pueden prevenir lesiones penetrantes causadas por
agujas o instrumentos cortopunzantes.
 Mecheros para establecer una zona de asepsia entre el operario y el material a procesar.
 Tapabocas, mascarilla y gafas protectoras para evitar contacto de las mucosas con
aerosoles, gotas y salpicaduras producidas por muestras.
 Cámara de seguridad recomendada para el manejo de material altamente infeccioso (virus,
Rickettsias, otros).
 Lavado de Manos. Este debe realizarse vigorosamente antes y después del contacto con un
paciente; inmediatamente si se contamina con sangre u otros líquidos corporales y después
de quitarse los guantes.
 Elementos Cortopunzantes. Agujas, lancetas, bisturís, pinzas, otros, utilizarlos y desecharlos
con precauciones para evitar lesiones.
 Lesiones Exudativas o Dermatitis. Si se padece alguna de ellas se debe evitar todo contacto
directo con pacientes y manejo del equipo correspondiente hasta que hayan sanado
completamente.
 Embarazo. La trabajadora de la salud embarazada debe estar familiarizada con el
cumplimiento estricto de las precauciones, para minimizar el riesgo de infección que incida en
el bebé.
 El equipo reutilizable contaminado debe ser limpiado de material orgánico visible, colocado en
un contenedor impermeable y enviado al área de descontaminación.
 Agujas contaminadas y otros objetos agudos desechables deben ser manejados
cuidadosamente.
 Las agujas usadas nunca deben ser dobladas, quebradas o retapadas. Los objetos agudos
contaminados deben ser descartados inmediatamente después de su uso en contenedores
resistentes llamados "guardianes", diseñados para este propósito, los cuales se sellan y se
desechan sin llenarlos completamente.
 Para minimizar el riesgo de intercambio de líquidos corporales, las máscaras de bolsillo o
dispositivos de ventilación mecánica deben estar disponibles en áreas donde pueden llegar a
necesitarse, en procedimientos de resucitación.
 Salpicaduras de sangre o líquidos que contienen sangre deben ser limpiadas usando guantes
u otras barreras, quitando el exceso de material con toallas desechables, lavando con agua y
jabón y desinfectando con una solución de hipoclorito de sodio al 1:100 para superficies lisas
y 1:10 para superficies rugosas en agua. El hipoclorito diluido debe prepararse cada 24 horas.
3
 Salpicaduras abundantes o que contienen vidrios quebrados u objetos agudos, deben

cubrirse con toallas desechables, agregar hipoclorito 1:10, dejarlo actuar 10 minutos y limpiar
como se describió anteriormente.
 Trabajadores de la salud con lesiones abiertas, dermatitis, etc., deben evitar el contacto
directo con el paciente y la manipulación directa del equipo contaminado.
 El cumplimiento de estas precauciones es responsabilidad de cada trabajador de la salud.
Los (as) docentes deben proveer: orientación, entrenamiento y educación continua para todos
los trabajadores de la salud, a la vez que adecuados suministros. Los (as) docentes deben
monitorear el cumplimiento de las precauciones universales y específicas, y deben desarrollar
mecanismos de asesoría y reentrenamiento a los trabajadores de la salud y/o estudiantes que
no cumplan, así como desarrollar acciones reflexivas apropiadas para evitar el incumplimiento
repetitivo.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD ESPECÌFICAS EN EL LABORATORIO
Además de las normas universales y descritas, aplicables en el laboratorio, se estipulan las

específicas según el área.
1. Cualquier persona que entre al laboratorio debe entender los riesgos biológicos y otros
riesgos con los que se pueden encontrar durante su trabajo normal en el laboratorio y estar
entrenados en las precauciones de seguridad y procedimientos apropiados.
2. Todos los estudiantes de bacteriología deben conocer y apropiarse de las normas de
bioseguridad.
3. Utilizar permanentemente blusa larga abotonada y solo en el área de los laboratorios.
4. Usar guantes desechables de látex para tomar y manipular cualquier tipo de muestra.
5. Usar máscaras y protectores oculares si existe la posibilidad de contacto de las membranas
mucosas con sangre o líquidos corporales.
6. Usar gorro en procedimientos que generen aerosoles y salpicaduras.
7. Emplear cámara de seguridad cuando se realicen procedimientos de alto potencial que
generen salpicaduras.
8. Utilizar mecheros en todos los procedimientos microbiológicos.
9. El sistema ideal para la toma de muestras por venopunción es el de tubos al vacío por su
bajo riesgo de contaminación. Limitar el uso de jeringas a situaciones en que no haya otra
alternativa.
10. Utilizar dispositivos para pipeteo mecánico o pipetas automáticas en el manejo de todos los
líquidos y reactivos en el laboratorio. NUNCA PIPETEAR CON LA BOCA.
11. No consumir ni llevar al laboratorio bebidas o alimentos.
12. Abstenerse de fumar en ellaboratorio.
11. Usar adecuadamente los equipos y proporcionarles mantenimiento permanente.
12. Debe llevarse calzado apropiado, cerrado y de suela antideslizante en todas las áreas del
laboratorio
13. El laboratorio debe estar pulcro, ordenado y limpio, y se debe minimizar el almacenamiento
de materiales innecesarios para el trabajo.
4
PRECAUCIONES EN EL ÁREA DE MICROBIOLOGÍA
1. Aplican las normas específicas y universales de bioseguridad en el laboratorio.

2. Las Bacterias, virus, hongos u otros agentes infecciosos se estudian debido que pueden
causar enfermedades, pueden ayudarnos a entender el mundo natural y por muchas
otras razones, entre las que se incluye la posibilidad de aplicaciones industriales.
3. Ya quemuchos agentes pueden serpatógenos para los seres humanos, animales u
otras formas de vida, su utilización tiene riesgos que varían dependiendo de cada agente
y del modo de empleo.
4. Enladefinición de RiesgoBiológico seincluyenlosagentesinfecciosos oetiológicos
(queproducenenfermedades),los materialespotencialmenteinfecciosos, ciertastoxinas
y otros materiales biológicos peligrosos.
5. Entre los agentes biopeligrosos se encuentran: Ciertas bacterias, hongos, virus,
rickettsias, chlamidias, parásitos, productos recombinantes, alérgenos, cultivos de
células humanas y animales y los agentes infecciosos potenciales que contengan estas
células, viroides, priones yotros agentes infecciosos que se contemplan en leyes,
normativas y normas.
LIMPIEZA DE MATERIALES
1. Todos los materiales usados en el laboratorio deberán ser adecuadamente decontaminados.

Dichos elementos serán posteriormente desechados o lavados, secados y/o esterilizados,
según los requisitos que deban reunir para su reutilización.
2. Al finalizar la clase o después de salpicaduras de sangre u otros líquidos corporales, las
superficies de las mesas del laboratorio deberán ser descontaminadas con solución de
Hipoclorito de sodio 2 %.
3. El material contaminado reutilizable debe esterilizarse en el autoclave (a 15 libras de presión,
21C, 21’).
4. Los escobillones y baja lenguas utilizados deben desecharse en frascos con hipoclorito y
luego sí eliminarlos.
5. Los restos de muestras (orina, líquidos, otros), deben desecharse en hipoclorito durante
media hora antes de eliminarlos.
6. Otros materiales de desecho contaminados deben colocarse en hipoclorito y luego en bolsas
plásticas debidamente rotulados “MATERIAL CONTAMINADO’’ y desecharse en los sitios
destinados para tal fin.
7. Los pisos de los laboratorios no deben barrerse ni encerarse; sólo se trapean con solución de
hipoclorito.
8. Si por accidente hay derramamiento de sangre u otro líquido, se le agrega hipoclorito por 15
minutos y luego se hace limpieza normal con agua y jabón.
9. El material de vidrio o reutilizable debe lavarse previamente en el laboratorio.
10. Los reactivos quedarán debidamente tapados y cerrados.
11. El laboratorio debe quedar en perfectas condiciones:
La puerta debidamente cerrada.
Llaves de agua y gas cerradas.
5
Luces apagadas.
Microscopios limpios, desconectados y con su correspondiente forro protector.
Vertedero libre de mechas de reactivos colorantes y desechos.
Mesones limpios y descontaminados.
Piso libre de basura.
Tablero limpio y asientos organizados debajo de los mesones.
Al finalizar la clase:
El material utilizado, dependiendo de la asignatura deberá quedar identificado, organizado y
clasificado en sus respectivos recipientes según lo establecido, así:
 Material para esterilizar.
 Material para decontaminar.
 Material para incubar.
 Material para guardar en nevera.
Se deben utilizar bolsas de basura según el material a desechar:
 Bolsas rojas para material peligroso, biológico y/o contaminado
 Bolsas verdes para material no peligroso, biodegradable.
 Bolsas grises para material no peligroso, reciclable.
6
PRACTICA No 1.
ANÁLISIS DE AIRE, SUPERFICIES, EQUIPO Y PERSONAL
OBJETIVOS
 Determinar el grado de desinfección de las superficies, equipos y materiales utilizados en el

laboratorio de control microbiológico de productos de consumo.
 Conocer los mecanismos de desinfección más utilizados en un laboratorio de control sanitario de
productos de consumo.
 Saber qué métodos y medios se deben tener en cuenta para aislar los microorganismos
presentes.
PRELABORATORIO
 Defina: desinfección, desinfectante y las condiciones que éste debe tener para que sea
efectivo.
 Qué aspectos son importantes para un correcto manejo del material, reactivos, equipo
de laboratorio.
 Qué sistemas de desinfección y limpieza se pueden emplear.
El objetivo del control microbiológico es determinar el estado higiénico de los equipos y

superficies después del proceso de lavado y desinfección para poder ser utilizados
posteriormente. De igual manera a las manos y guantes de los operarios.
La reducción al mínimo de la contaminación microbiana y la conservación de la calidad de los
productos de consumo exigen la debida observación de los principios de limpieza, higiene y
sanidad del equipo con el que entran en contacto durante todas las etapas de producción hasta
cuando el consumidor los adquiere en los puntos de venta.
Los materiales de los envases o de los empaques son fuente de posible contaminación, el
producto a través de su envase puede contaminarse con compuestos bacteriostáticos o
fungistáticos como también pueden contaminarse con compuestos de origen químico.
El peligro se presenta solo cuando se omiten las normas de correcta fabricación, las cuales se
deben observar durante todo el proceso de producción y mercadeo.
El equipo que esta en contacto con las materias primas o con el producto en proceso, debe estar
convenientemente limpio y en condiciones higiénicas, pues de no ser así, microorganismos
pueden llegar a él, multiplicarse y producir un producto infectante o tóxico para evitar esta
situación es necesario efectuar una limpieza y desinfección en forma periódica.
Para obtener un producto de excelentes condiciones higiénicas se deben observar entre otros
los siguientes aspectos:
Higiene de los manipuladores
Limpieza durante todas las etapas del proceso
Transporte y almacenamiento adecuados.
Para poder determinar los microorganismos en cualquier superficie se utilizan los métodos
cuantitativos con escobillones, esponjas, con paños absorbentes, con cajas Rodac o con
Petrifilm y métodos cualitativos usando aplicadores de algodón o swabs.
7
MATERIALES
- Agar OGY
- Agar EMB
- Cajas Agar nutritivo
- Cajas Agar Sabouroud

- Cajas Agar Sangre
- Escobillones en solución buffer
- Placas “Rodac”
- Muestreador de aire.
- Tiras de agar TC, YM ó SXD,C
PROCEDIMIENTO
- Tomar muestras de las diferentes superficies de sitios del laboratorio, equipos y demás
material utilizado para el análisis microbiológico de productos de consumo.
- Para el análisis del aire ambiental, emplear el equipo “muestreador de aire ambiente”
tomar los volúmenes de muestra de aire acuerdo con la contaminación esperada.
- Sembrar las muestras siguiendo los procedimientos adecuados, en los medios
correspondientes.
- Incubar a 37° C por24 -48horastodoslosmedios, conla excepción del agarSaboraud
y OGY que se incuban a temperatura ambiente por una semana.
- Efectuar el conteo de las colonias.
- Hacer coloración de Gram y de azul de lactofenol.
Método en caja Rodac

Tener previamente preparadas las cajas con los medios de acuerdo a cada una de las
determinaciones.
- Remueva la tapa de la caja Rodac.
- Presione suave pero firme con la caja de Agar directamente sobre la superficie a
determinar.
- Levántela sin deslizarla y tápela de nuevo, márquela ubicando cada uno de los sitios
muestreados para identificar cada una de las cajas.
- Incubar invertidas, bacterias mesófilas de 24 – 48 horas a 32-35ºC, mohos y levaduras
de 5-7 días a 22-25ºC±1.
- Contar las colonias. Reportar como ufc/caja Rodac
Método con muestreador de aire RCS PLUS

El muestreador de ambiente de alto flujo RCS de Boitest es usado para investigar la calidad
microbiológica del aire ambiente, la funcionalidad del equipo de tratamiento de aire, y la
efectividad de las medidas de purificación. Es usado rutinariamente en áreas en donde es
importante que las partículas transportadas por aire, descritas por la ley o a través de
estándares individuales, no deban excederse.
8
ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Control microbiológico de productos industriales, biológicos e insumos para la salud
El muestreador de aire RCS plus valora cuantitativamente el contenido de microorganismos del

aire. La corriente entra por el rotor, es alimentado por las aspas y sale por la parte posterior de la
cabeza. Contiene una tira de agar según la determinación deseada y almacena volúmenes
programables.
LUGAR UFC/Placa Rodac

BUENO REGULAR MALO
Mesones y equipos 0-5 6 - 15 > 16
Pisos 0 – 25 26 – 50 > 51
Paredes y equipos 0–5 6 - 15 > 16
Áreas blancas - paredes <5 -
Cabina flujo laminar <3 -
Fuente: ACCYTEC.2002
CONTROL DE MANOS Y GUANTES DE OPERARIOS
Cada empresa debe determinar sus propios límites, de acuerdo a los históricos. Ej.:
Manos < 60 UFC/caja Con base a históricos
Guantes < 30 UFC/caja
ANALISIS Y RESULTADOS
- Observar el crecimiento en cada uno de los medios y correlacionarlos con las muestras
inoculadas.
- De acuerdo a los resultados obtenidos, determinar el grado de higiene y limpieza del
laboratorio.
AUTOEVALUACION.
Describir las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica.
Que aportó usted para el desarrollo de la práctica.
De acuerdo a su interés, conocimientos y responsabilidad califíquese en escala de 1 a 5.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
Fraizer, W. C. Microbiología de los alimentos. Acribia 2004
Publicación Científica N° 538 OPS Décimo quinta edición. 1992 ISBN 92 75 31538
Ortega Yolanda y Quevedo Fernando. Garantía de Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Alimentaria. OPS / OMS 1991
Vélez Mª Teresa y Cuadrado Cano Bernarda. Control Microbiológico a medicamentos,
Cosméticos y desinfectantes. Universidad de Cartagena. Editorial Universitaria. Cartagena 2005.
Montville, Thomas. 2009. Introducción a la microbiología de los alimentos.
Análisis microbiológico de la gestión de la seguridad alimentaria. ICMSF Edición 2004.
INFORME
POST – LABORATORIO
9

PRÁCTICA No. 2.
RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS MESOFÍLICOS
OBJETIVOS
 Conocer y realizar lastécnicas delaboratorio para efectuar el recuento de
microorganismos mesófilicos aeróbicos viables en los productos de consumo.
Resaltar la importancia de este recuento para el control sanitario de un producto
 Conocer las normales del recuento total mesofílico de algunos productos de consumo.
MARCO TERÓRICO
Los recuentos de bacterias viables se basan generalmente en el número de colonias que se
desarrollan en placas de Agar nutritivo que ha sido previamente inoculado con cantidades
conocidas de una solución del producto a analizar e incubadas en condiciones ambientales
predeterminadas.
Tales recuentos se denominan en algunos casos erróneamente como recuentos totales en placa,
cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias que pueden crecer en las
condiciones ambientales indicadas. En efecto se obtiene una amplia variedad de condiciones,
cambiando la posición del medio sólido, los gases del ambiente, el tiempo y temperatura de
incubación.
En el caso de las bacterias mesofílicas, estas se desarrollan a temperaturas entre 20° a 45°.
Este recuento es el más usado para indicar la calidad sanitaria de los productos.
En el comercio internacional, el importador de los productos de consumo, carece a menudo de
información sobre las condiciones sanitarias o del tiempo y temperatura relativas a la producción
y transporte, en este caso es conveniente efectuar el recuento de la flora aerobia mesofílica y
dependiendo de los resultados obtenidos, se podría saber si el producto fue manejado en forma
correcta. Este recuento puede ser tenido en cuenta por el industrial para evaluar la eficacia de la
sanitización durante todo el proceso de producción.
PRE – LABORATORIO
 Mencione las limitantes que tenga el recuento total de microorganismos en los
productos de consumo.
 Qué finalidad tiene un recuento de bacterias mesofílicas aerobias?.
 A todos los productos de consumo se les debe practicar esta prueba?
 A qué productos de consumo no se practica este recuento?
MATERIALES
- Cajas de petri estériles. Incubadora a 37° C. Cuenta colonias. Pipetas bacteriológicas de 1 mL
estériles
- Agar peptona de caseína - glucosa extracto de levadura (Agar Plate Count)
- Agua Peptonada al 0.1%
- Placas de Petrifilm.
10

PROCEDIMIENTO
- Antes de iniciar el análisis se deben hacer todas las anotaciones que identifiquen al
producto, anotar todo indicado en el marbete o etiqueta. Verificar si el etiquetado cumple
con las normas conforme al tipo del producto que se esta analizando.
- Preparar la muestra y sus diluciones de acuerdo con el recuento de microorganismos
esperado, siguiendo el procedimiento indicado (Figura 1).
Figura 1. Procedimiento para las diluciones.
- Una vez preparadas las diluciones del homogenizado de la muestra, proceder a

transferir por duplicado las alícuotas de 1 mL de cada una de las respectivas diluciones
consecutivas en cajas de Petri estériles. - - Proceder a colocar en las cajas de Petri,
±15 mL de Agar Plate Count fundido y mantenido a una temperatura de 45° C. Una vez
adicionado el medio se procede a mezclar el inóculo con el medio de cultivo adicionado.
- No debe pasarmás de 20 minutos entre la preparación de las diluciones y el vertido del
medio nutritivo.
11

- La forma más adecuada de mezclar el inóculo con el medio nutritivo es por movimiento
de la caja de arriba hacia abajo unas cinco veces, luego rotar la caja unas cinco veces
en el sentido del movimiento de las agujas del reloj.
- Repetir el movimiento de la caja unas cinco veces haciendo un ángulo recto sobre el
movimiento inicial de arriba a abajo y finalmente rotar la caja unas cinco veces en el
sentido contrario al movimiento de las agujas del reloj.
- Incubar a 35 ± 2° C por 48 horas.
- Se deben hacer controles de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que
tenga el medio, como también controlando la esterilidad del agua peptonada al 0,1%
incubando una caja que contenga 1 mL del agua peptonada en Agar Plate Count.
Método con Petrifilm

- Colocar la placa Petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.
- Con una pipeta perpendicular a la placa Petrifilm colocar 1 ml de muestra en el centro
del film inferior.
- Dejar caer el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire.
- Sujetando el aplicador difusor para recuento total, colocarlo sobre el Petrifilm.
- Ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inóculo sobre el área circular. No
girar ni deslizar el aplicador.
- Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel.
- Incubar las placas cara arriba en pilas de hasta 20 placas, a 35-37 ºC por 24±2 horas y
realizar el recuento en un contador de colonias. Consultar la guía de interpretación.
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten recuentos entre
30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja, empleando el contador de colonias.
Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por su factor de dilución.
Si las cajas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y mayores de
300 colonias, contar las colonias de las cuatro cajas, calcular el recuento para cada una de las
diluciones y sacar el promedio entre ellas.
Ejemplo:
Dilución 10-1 a) 330 b) 350
330 + 350 x 10 / 2 = 6.800 / 2 = 3400
Dilución 10-2 a) 26 b) 28 26 + 28 x 100 / 2 = 5.400 / 2 = 2.700
Promedio 3.400 + 2.700 / 2 = 3.050
Recuento total: 3.050 UFC / g o mL de la muestra analizada
Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilución de mayor concentración, informar
el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de dilución más concentrada.
Ejemplo: Dilución 10-1: Ausencia de colonias.
Informar el recuento como menor de 10 ufc/g
Si se ha sembrado 0,1 mL informar como menor de 100 UFC /g o mL
En caso que dos diluciones consecutivas estén dentro del rango de 30 - 300 colonias, se hace el
recuento para cada una de las diluciones y se reporta la media aritmética de los dos valores
12

obtenidos, a menos que el recuento mayor contenga dos veces al menor, en este caso se
reporta el recuento menor. Ejemplo
290 colonias en la dilución 10-1 = 2.900
4.000/2.900 = Menor de 2. Se registra la media aritmética = 3.500 UFC / g o mL
170 colonias en la dilución 10-1 =1.700
3.500 / 1.700 = Mayor de 2. Informar el menor o sea 1.700 UFC / g o mL
Realizar los cálculos y anotar los resultados. Comparar sus resultados con los obtenidos por los
otros grupos.
El número de microorganismos mesofílicos obtenidos en su muestra cumple con la norma de
calidad sanitaria para ese producto?
Cuales podrían ser las causas que ocasionan un recuento alto de mesofílicos?
AUTOEVALUACION
Describa cuales fueron las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica.
De acuerdo a su interés y a sus conocimientos califíquese en una escala de 1 a 5.
BIBLIOGRAFIA
Manual de Técnicas de Laboratorio Control Microbiológico de Alimentos. Guía Institucional.
Eduardo López Ávila. Graciela Lancheros 2004
INVIMA. Manual de Técnicas de Análisis para Control de Calidad Microbiológico de Alimentos
para consumo 1998.
ANDI. Normas y Procedimientos reglamentarios de la Industria de los Alimentos 2002
Fundamentos de Microbiología de los Alimentos. Ray Bibek. 2010
INFORME
POST – LABORATORIO
13

CONTROLMICROBIOLÓGICODEPRODUCTOSINDUSTRIALES,BIOLÓGICOSEINSUMOSPARALASALUD
PRÁCTICA No. 3.
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
OBJETIVOS
 Destacar la importancia de los mohos como elemento de un proceso industrial.
 Conocer los riesgos que trae para la salud el contenido de mohos y las micotoxinas que
estos pueden generar en un producto.
 Valorar el recuento de mohos y levaduras como control de calidad en un producto
biológico.
MARCO TEÓRICO
Los hongos son células eucarióticas y heterótrofas, se presentan en forma de levaduras
(unicelulares) y mohos (pluricelulares), poseen pared que contiene quitina, glucano y otros
polisacáridos.
La membrana celular es rica en esteroides y en el citoplasma se observan mitocondrias y retículo
endoplasmático. El núcleo posee membranas y cromosomas. Su reproducción puede ser sexual
y asexual.
Para su desarrollo requieren un medio rico en carbono, nitrógeno, magnesio, manganeso,
temperaturas entre 20 y 40ºC. Su hábitat es cualquier material en donde actúa como saprófito,
simbiótico, parásito y con distribución universal en agua suelo y aire. Los hongos son benéficos
en el ciclo natural del carbono, en la nutrición de las plantas o en la producción industrial de
bebidas, alimentos y los más variados productos químicos. Algunos pueden alterar los alimentos
e insumos, pero muy pocos son patógenos.
Los mohos y las levaduras tienen algunas características similares a las bacterias cuando
contaminan los alimentos, tales como la capacidad de alteración y la producción de metabolitos
tóxicos.
Los mohos y levaduras se ponen en evidencia en condiciones desfavorables para el crecimiento
bacteriano como pH bajo, alto contenido de sales y azúcares, bajo contenido de humedad y baja
temperatura de almacenamiento.
PRE-LABORATORIO
 ¿Cuáles son los hongos y levaduras que más se utilizan en la producción de alimentos?
 ¿Cuáles son los géneros y especies que contaminan con más frecuencia los alimentos?
 ¿Cómo está compuesto el medio OGY?
 ¿Cuáles son las diferencias entre hongo y levadura?
 ¿Qué requisitos deben tener en cuenta los manipuladores de alimentos para reducir los
riesgos de contaminación por los mohos en los alimentos?
 ¿Cuáles son los alimentos más susceptibles a la contaminación por mohos?
 Diga la importancia de algunos hongos en la industria.
 ¿Qué son las micotoxinas?
MATERIALES
Cajas de petri y placas Petrifilm (recuento de mohos y levaduras)
Pipetas estériles de 1 ml
Agar Oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) fundido y a 44-48ºC.
14

PROCEDIMIENTO
- Homogenización de la muestra y preparación de las diluciones. Ver figuras.
Recuento de Mohos y Levaduras
1. Homogenización
leche en 10 g 90 ml
polvo Agua Peptonada
Muestra
9 ml
9 ml 9 ml
2. Dilución
1 ml
1 ml 1 ml
1:100 1:1000 1:1000

1:10
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
3. Siembra
Medio OGY
4. Incubación 22 C  2 por 5 a 7 días
5. Lectura y Cálculos
Figura.
15

Fuente: Métodos de análisis microbiológicos de alimentos. Allert y Escolá, 2002.
16

-Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones a una caja de petri. Realizar la simbra por
duplicado.
- Verter en cada caja de petri 15 ml de medio OGY y mezclar.
- Verter en cajas de petri medio y diluyentes sin inocular como control de esterilidad.
- Dejar solidificar el agar.
- Incubar a 22 ± 2ºC de 5 a 7 días.
- Efectuar la lectura del cultivo, leyendo las cajas donde hubo crecimiento entre 20-100
colonias y se multiplica por el inverso de la dilución. Si en dos cajas hay crecimiento
entre 20-100 colonias se realizan los cálculos y se saca la media aritmética. Se informa
ufc de mohos y levaduras por ml o g de alimento. Si cajas de diluciones consecutivas,
presentan recuentos inferiores a 20 y mayores a 100 colonias, efectuar los recuentos en
las 4 cajas, luego se calcula el recuento para cada una de las diluciones y se obtiene el
promedio de las dos diluciones.
Método con Petrifilm
- Colocar la placa Petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.
- Con una pipeta perpendicular a la placa Petrifilm colocar 1 ml de muestra en el centro
del film inferior.
- Dejar caer el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire.
- Sujetando el aplicador difusor para mohos y levaduras, colocarlo sobre el Petrifilm.
- Ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inóculo sobre el área circular. No
girar ni deslizar el aplicador.
- Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel.
- Incubar las placas cara arriba en pilas de hasta 20 placas, a 25ºC±2 por 3-5 días y
realizar el recuento en un contador de colonias. Consultar la guía de interpretación.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
Realizar un cuadro con los resultados de los diferentes grupos.
AUTOEVALUACIÓN
De acuerdo a su interés, conocimientos y responsabilidad califíquese en escala de 1 a 5.
BIBLIOGRAFÍA
Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos. Corrie Allert Vandevenne y Martha Escolá
Ribes. Díaz de Santos. 2002.
Fraizer, W. C. Microbiología de los alimentos. Acribia 2004
Normas y Procedimientos reglamentarios de la Industria de los Alimentos ANDI 2002
Manual de Técnicas de Análisis para Control de Calidad Microbiológico de Alimentos de
Consumo Humano Invima. 1998
INFORME
17

PRACTICA No. 4
REDUCTASA
OBJETIVOS
- Discutir la importancia de la presencia de la enzima reductasa en la leche
- Interpretar la presencia de la enzima en la leche
- Estimar la enzima reductasa en los diferentes tipos de leche
PRELABORATORIO
- ¿Puede haber crecimiento microbiano en una leche recién ordeñada? ¿Por qué?
- ¿Qué prácticas se deben tener en cuenta para obtener una leche de buena calidad
bacteriológica?
- Hable sobre la mastitis
- Fundamento de la prueba de reductasa
- ¿De acuerdo al resultado de la prueba de reductasa, cómo puede clasificarse una
leche?
- Tiempo de reducción del azul de metileno en una leche cruda y en una leche higienizada
MATERIALES Y REACTIVOS
- Tubos de ensayo tapa rosca estériles
- Pipetas de 10ml
- Gradillas
- Baño de María
- Termómetro
- Reloj con alarma
- Solución de Azul de metileno para reductasa:
Azul de metileno grado reactivo (C16H18CIN3S.2H2O) C.I Nr 52015
Solución Colorante madre:
Colocar en frasco estéril de color ámbar 2000 ml de agua destilada recientemente
hervida por 10 minutos. Agregar 1.1 g. de cloruro de azul de metileno, agitar hasta
completa disolución, enfriar y conservar la solución del colorante en un sitio oscuro y en
refrigeración. Preparar la solución semanalmente.
Solución de trabajo:
En un frasco ámbar que contenga 90 ml de agua destilada estéril, agregar 10 ml de la
solución madre preparar esta solución diariamente. Anotar la fecha de preparación en
los recipientes.
PROCEDIMIENTO:
 Con una pipeta transferir a cada tubo 1 ml de la solución de azul de metileno
inmediatamente antes de haber colocado 10ml de leche. Evitar la exposición prolongada
a la luz, especialmente a la luz directa del sol.
 Tan pronto como se agregue la muestra, tapar los tubos sin apretar y colocarlos en el
baño.
 Para controlar la temperatura colocar un tubo que contenga 10 ml de leche y un
termómetro en la gradilla con los otros tubos.
18

 Cuando esté completa la gradilla o lote de muestra se puede comenzar la incubación o

se puede pasar la gradilla a un lugar adecuado de 0 a 4C, mientras llega el momento
conveniente para la incubación.
Aflojar ligeramente los tapones
 Para distribuir la crema cuando la temperatura alcance los 36C apretar los tapones,
invertir lentamente cada gradilla de tubos tres veces y anotar esta hora como la del
comienzo de la incubación.
Interpretación:
Si cualquiera de las muestras se decolora después de una incubación de 30 minutos se informa

como TRAM: 30 minutos
Después de la lectura inicial a los 30 minutos, efectuar las lecturas siguientes cada hora.
Anotar las lecturas como tiempo de reducción en horas completas entre la inversión inicial de los
tubos y las lecturas de 0,5 a 1,5 horas anotar TRAM:1 hora. Si ocurre entre 1,5 y 2,5 horas se
informará TRAM: 2 horas.
Debido a la pérdida irregular del color azul que se puede observar al final del tiempo de lectura
anotar la decoloración de la muestra cuando las 4/5 partes de la porción visible esté blanca.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Analice y explique los resultados obtenidos en las diferentes pruebas, y con base en estos datos
identifique y califique la calidad de la leche analizada.
AUTOEVALUACIÓN
- Describa las debilidades y fortalezas que encontró en la práctica
- Qué aportó para Ud. el desarrollo de la práctica?
- De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y a su responsabilidad, califíquese en una escala
de uno a cinco
BIBLIOGRAFIA
Lactología Industrial. E. Spreer. 2000
http://www.puntofocal.gov.ar/notific_otros_miembros/col67_t.pdf
http://www.invima.gov.co/version1/normatividad/alimentos/decreto%20616%20de%202006.doc
http://www.invima.gov.co/version1/normatividad/alimentos.htm
INFORME
19

PRACTICA No. 5
FOSFATASA Y PEROXIDASA
OBJETIVOS
Comprobar la presencia de Fosfatasa y peroxidasa en diferentes tipos de leche
 Comprobar el grado de calor utilizado durante la pasteurización de la leche
PRELABORATORIO:
- Nombre las principales enzimas que se encuentran presentes en la leche y su
fundamento
- ¿Por qué es importante la determinación de Fosfatasa alcalina en la leche?
- Haga un cuadro comparativo de los resultados que espera obtener de Fosfatasa alcalina
y Peroxidasa en los diferentes tipos de leche
- Baño de María
- Tubos de ensayo de 16 x 150
- Pinzas para tubos
- Pipetas de 1 y 5 ml
- Papel absorbente
- Vasos desechables
- Solución de Guayacol
- Solución de agua oxigenada al 3% recién preparada
- Kitt de Fosfatasa alcalina
- Termómetro
Solución de Guayacol:
Guayacol de una pureza mínima del 99% 2 g.
Alcohol etílico de 75º G.L. 80 ml
Solución acuosa defenol al3% 20 ml
La solución debe ser incolora, conservar en frasco ámbar en nevera.
Solución deagua oxigenada al 0.3 % recientemente preparada
Agua oxigenada estabilizada y de 30% de concentración 1 ml
Agua destilada C.S.P. 100 ml
PROCEDIMIENTO
Determinación de Peroxidasa:
Antes de iniciar el procedimiento la leche se debe mezclar bien, estar a una temperatura entre 20
y 30ºC y no estar acidificada.
- Medir en un tubo de ensayo 3 ml de leche. Agregar 10 gotas de solución de Guayacol.
- Agitar Esperar un minuto. Observar el color.
- Agregar 5 gotas de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada).
20

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS INDUSTRIALES, BIOLÓGICOS E INSUM OS PARA LA SALUD
- Observar el color.
Interpretación:
Si en el lapso comprendido entre la adición del primer reactivo y el segundo aparece coloración
curaba (salmón), indica la presencia de agua oxigenada y de peroxidasa.
Si después de la adición del segundo reactivo, aparece por debajo de la superficie de la leche un anillo de
color curaba (salmón), indica la presencia de peroxidada. Esperar 5 minutos después de la adición
del agua oxigenada.
Determinación dela Fosfatasa:
Disolver una pastilla en 10 cc del sustrato
Tomar 2 cc de esta solución y adicionar 0,02 cc de leche

Mezclar suavemente. Se recomienda incubar 10 minutos a 37 C.
Interpretación:
Positivo: color amarillo. Leche cruda fresca
Negativo: color blanco lechoso. Leche hervida 2 minutos
Elabore un cuadro comparativo con los resultados de los grupos de trabajo.
AUTOEVALUACIÓN
de uno a cinco
BIBLIOGRAFIA
FRAZIER, W. C. Microbiología moderna delos alimentos. Acribia. 2002

JAY, James. Microbiología moderna de los alimentos. Acribia. España. 2000
KEATING, Patrick F. Recepción de la leche y control de calidad. FAO TR-la/75/35
LOPEZ, E., NINO, P., ACOSTA. y otros. Análisis físico-químico y microbiológico de leches
Manual de técnicas. Bogotá. Instituto Nacional de Salud. 1998
INFORME
21

PRÁCTICA No. 6.
NÚMERO MAS PROBLABLE (NMP) DE COLIFORMES

OBJETIVOS
 Analizar la importancia del hallazgo de microorganismos coliformes en alimentos como
indicativo de mala calidad higiénica de los mismos.
 Reconocer las características propias del crecimiento de los microorganismos
coliformes.
PRELABORATORIO
 ¿Qué indica un número elevado de coliformes en los alimentos que han recibido
tratamiento térmico para garantizar su calidad sanitaria?
 A parte de E. coli ¿quê otras bacterias se encuentran con más frecuencia contaminando
los alimentos?
 ¿En qué parte del organismo del hombre y de los animales habita normalmente la E.
coli?
 ¿Cómo es la patogenia de la E. coli en el hombre?
 ¿Cuál es el valor admisible de los coliformes en las diferentes clases de leches?
 ¿Cuál es el valor permitido de este recuento en el producto analizado?
MARCO TEÓRICO
Las bacterias coliformes comprenden varios géneros de la familia Enterobacteriaceae
ampliamente distribuida en la naturaleza, suelo, y agua. También es habitante normal del tracto
intestinal del hombre y animales de sangre caliente.
E. coli y Enterobacter aerogenes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan lactosa
con producción de gas. E. coli es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos
entéricos en agua, moluscos, productos lácteos y otros alimentos.
Una presencia alta de Coliformes en los diferentes productos nos indica, materias primas de
mala calidad, un proceso defectuoso, poca higiene de los manipuladores y posible
contaminación y mal manejo del producto terminado.
Los coliformes crecen bien sobre muchos medios de cultivo y en general sobre todos los
alimentos. Estos microorganismos crecen a menos 2ºC y también a temperaturas próximas a
50ºC. El crecimiento en los alimentos es pobre o muy lento a temperaturas de 5ºC
Con relación al pH, se ha señalado que estos microorganismos crecen dentro de un amplio
margen con valores comprendidos dentro de 4.4 a 9.0.
MATERIALES
- Fiolas o frascos tapa rosca c/u, con 90 mL de agua peptonada estéril al 0,1%
- Tubos con 9 mL de agua peptonada estéril
- Tubos con 10 mL de caldo lactosado bilis verde brillante y campana de Durham
- Balanzas
- Pipetas de 1 mL estéril
- Baja lenguas estériles
- Etanol y algodón
22

PROCEDIMIENTO
PRUEBA PRESUNTIVA
- Seguir lo indicado en la figura anexa.
- Homogenización de la muestra y preparación de las diluciones
- Pipetear 1 ml de las diluciones en tubos con caldo lactosado bilis verde brillante al 2% en
series de tres tubos por cada dilución.
- Incubar los tubos a 35ºC por 24 horas.
- Pasadas las 24 horas anotar y retirar los tubos con producción de gas y dejar incubando
otras 24 horas los tubos negativos o que no presenten gas.
- Pasadas las 48 horas anotar todos los tubos que muestren producción de gas.
PRUEBA CONFIRMATIVA
- Comprobar que los tubos con producción de gas son positivos para coliformes.
- Sembrar por estría en las placas de agar Eosina Azul de metileno (EMB) o agar Violeta
rojo bilis a partir de los tubos con producción de gas.
- Incubar a 35ºC por 24 horas.
- Lectura: Anotar el número de tubos confirmados como positivos y buscar en la tabla de
NMP. Ver tabla anexa.
- Aplicar la siguiente fórmula:
NMP de coliformes/g o ml= NMP de la tabla x factor de dilución intermedia / 100
- Analizar el recuento obtenido y las posibles causas de este resultado.
- Comparar su resultado con los resultados obtenidos en los otros grupos.
- ¿Cómo prevenir la contaminación por coliformes en los alimentos elaborados?
AUTOEVALUACIÓN
de uno a cinco
BIBLIOGRAFÍA
Microorganismos de los Alimentos ICMSF II Edición, 2.002
Normas y Procedimientos reglamentarios de la Industria de los Alimentos ANDI . 2002
Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos. Corrie Allert Vandevenne y marta Escolá
Ribes. Díaz de Santos. 2002.
INFORME
23


Figura. NMP DE COLIFORMES. Presuntiva
24

TABLA . NMP por gramo de muestra cuando se usan series de 3 tubos que
contienen 0.1, 0.01, y 0.001 gramos de muestra en las tres
diluciones.
Número de tubos positivos Número de tubos positivos

NMP NMP
Tres tubos Tres tubos Tres tubos por g. Tres tubos Tres tubos Tres tubos por g.
de 10-1 de 10-2 de 10-3 de 10-1 de 10-2 de 10-3
0 0 0 <3 2 0 0 9.1
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9
0 1 0 3 2 0 3 26
2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6.2
0 2 1 9.3 2 2 0 21
2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13
0 3 2 16 2 3 1 36
2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3.6 3 0 0 23
1 0 1 7.2 3 0 1 39
1 0 2 11
1 0 3 15 3 0 2 64
3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19
1 2 0 11 3 1 3 160
3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16
1 3 1 20 3 3 0 240
3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1.100
1 3 3 29 3 3 3 > 1.100
Fuente: Guía Control microbiológico de alimentos VI semestre. UCMC.
25

26

PRÁCTICA No. 7.
NÚMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES FECALES
OBJETIVOS
Determinar la calidad sanitaria que presenta un producto procesado.
 Conocer y aplicar las pruebas microbiológicas utilizadas para el recuento de Coliformes
fecales.
 Analizar la importancia de la presencia de coliformes fecales en alimentos como
indicativo de contaminación fecal.
PRELABORATORIO
 ¿Cuáles son las características que deben tener los microorganismos para que se
consideren como indicadores?
 Mencione los géneros más implicados en la contaminación fecal de los alimentos.
 ¿Cuáles son las características generales de los enterococos?
Valores de las normales permitidas de coliformes fecales en las diferentes clases de
leches.
Identificar la norma sanitaria de coliformes fecales en el producto analizado.
 ¿Cómo prevenir la contaminación por coliformes en los diferentes productos?
MARCO TEÓRICO
El término coliformes fecales ha surgido como un intento de encontrar métodos rápidos y fiables
para establecer la presencia de E. coli y variantes estrechamente relacionadas, sin necesidad de
purificar los cultivos obtenidos en las pruebas para coliformes. Es necesario diferenciar los
coliformes de origen fecal (procedentes del intestino del hombre y de los animales de sangre
caliente) de los coliformes de otros orígenes.
Los coliformes son buenos indicadores de la contaminación fecal del agua.
El hallazgo de gran número de estos microorganismos en los alimentos, así como en el agua,
indican la polución o contaminación fecal ya que las enfermedades transmitidas por el agua,
generalmente son de carácter intestinal.
MATERIALES
- Tubos con caldo lactosado bilis verde brillante al 2% y campana de Durham (10 mL).
- Tubos con 5 mL de caldo triptófano
- Pipetas de 1 mL estéril (estudiantes)
- Asas bacteriológicas
- ReactivodeKovac´s
- Tubos positivos confirmados correspondientes a la prueba del NMP de coliformes.
- Baño serológico a 45ºC.
PROCEDIMIENTO
Test de Mac-Kenzie
- A partir de los tubos positivos con producción de gas del NMP de coliformes, transferir
de cada tubo una asada de cultivo en (Ver figura):
27

NMP de Coliforme fecal
Test de Mac-Kenzie
1 De los tubos positivos confirmados de

coliformes (gas positivo) transferir a
cada tubo una asada de cul tivo en:
2 Caldo lactosa bilis verde brillante al 2%

con tubos de fermentación de Durham
3 Caldo Indol o caldo Triptófano
4 Incubar los tubos por 48 hor as a 45° C

± 0,5°C en baño de agua termostatado. Al
término de la incubación, observar la pr
oducción de gas.
5 Revelar el caldo Indol o caldo Triptófano

adicionando 0,2 mL de Reactivo Kovacs
Observar la presenci a de un anil lo de
color cer eza.
Positivo (+) para coli for me fecal en
ambas pruebas.
6 Lectura ycálculo
Preparo: ELAL
7 Informe
Figura: NMP Coliformes fecales
28

- Tubos con caldo lactosado bilis verde brillante al 2% y campana de Durham (10 mL)
- y una asada en Tubos con 5 mL de caldo triptófano.
- Incubar los tubos a 45±0.5 ºC por 48 horas en el baño serológico.
- Observar la producción de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2%.
- Revelar el caldo triptófano, adicionando 0.2 ml de reactivo de Kovac´s, agitar
suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa
de alcohol amílico, cuando la prueba es positiva o el color original del medio, cuando la
prueba es negativa.
- Considerar como coliformes de origen fecal los que demuestren positividad en ambas
pruebas.
- Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales por g. o ml.
Nota: El N.M.P. se puede hacer utilizando lastablas delas series detres tubos por dilución, ola
tabla de cinco tubos por dilución, ola de 10 tubos por dilución, la lectura va de acuerdo a latabla
que esté utilizando, ya sea la de 3 la de 5 o la de 10.
- Realizar el recuento de NMP de coliformes fecales mediante el empleo de la tabla y
expresar los resultados.
- Analizar los datos obtenidos y las causas de dichos resultados.
- Comparar su resultado con los resultados obtenidos en los otros grupos.
- ¿Cómo prevenir la contaminación por coliformes en los alimentos elaborados?
AUTOEVALUACIÓN
- Qué aportó para Ud. para el desarrollo de la práctica?
de uno a cinco
BIBLIOGRAFÍA
Microorganismos de los Alimentos ICMSF II Edición, 2.002
Normas y Procedimientos reglamentarios de la Industria de los Alimentos ANDI . 2002 Métodos
de análisis microbiológicos de los alimentos. Corrie Allert Vandevenne y marta Escolá Ribes.
Díaz de Santos. 2002.
INFORME
29

PRÁCTICA 8.
RECUENTO DE ESTAFILOCOCO COAGULASA POSITIVA
OBJETIVOS
Determinar la presencia de S. aureus en un alimento.
 Interpretar la intoxicación producida por este microorganismo y su foco de
contaminación.
PRE-LABORATORIO
 ¿Qué es una enterotoxina?. Cuales son las más prevalentes en la problemática de los
alimentos?
 ¿Qué alimentos están más frecuentemente implicados en esta intoxicación?.
 ¿Pueden ser destruidos los estafilococos?
 ¿Cómo prevenir la contaminación de estafilococos en los alimentos elaborados?
MARCO TEORICO
La intoxicación estafilococcica se produce por la ingestión de alimentos en los que se ha
multiplicado el Staphylococcus aureus, coco Gram positivo, catalasa positivo y productor de
toxinas activas por vía oral. Algunos Staphylococcus incluyendo S. aureus producen la enzima
desoxirribonucleasa, termoestable, característica exclusiva de esta bacteria. El hallazgo de esta
enzima en un alimento es indicador de un abundante desarrollo de Staphylococcus y de la
posible presencia de enterotoxina estafilococcica.
Se trata pues de una intoxicación propiamente dicha, en el sentido de que las enterotoxinas
responsables se encuentran preformadas en los alimentos. Después de un corto período de
incubación, el proceso se manifiesta muchas veces de forma fulminante, siendo el vómito, la
diarrea, abatimiento y espasmo abdominal sus síntomas más frecuentes los cuales pueden
aparecer luego de transcurrir de 3 a 8 horas de haber ingerido el alimento contaminado y tener
una duración inferior a 30 horas.
Los estafilococos enterotoxigénicos pueden encontrarse ya en los alimentos en el momento de
su obtención, en especial en los de origen animal o llegar posteriormente a ellos a partir de los
manipuladores. Un porcentaje elevado de personas sanas son portadoras de S. aureus en las
fosas nasales y garganta. Este germen se encuentra también en piel, en abscesos cutáneos tal
como el acné, heridas infectadas, etc. Los manipuladores de alimentos son, consiguientemente
el origen más frecuente de estafilococos que llegan a los alimentos.
MATERIALES
- Tres tubos con 9 mL de agua peptonada
- Fiola o frascos tapa rosca con 90 mL de agua peptonada
- Cajas de petri con agar Baird Parker
30

- Pipetas de 1 mL estériles.
- Rastrillos
- Caldo BHI 5 mL
- Plasma para coagulasa
- Muestras de producto para analizar
- Balanzas
PRINCIPIO:
El medio Baird Parker, presenta agentes selectivos como glicina, litio y telurito que favorecen el
crecimiento de Staphylococcus e inhiben el crecimiento de la flora acompañante.
La yema de huevo hace el medio amarillo opaco, los Staphylococcus reducen el telurito
formando colonias gris - negras y presentan halos claros de proteólisis alrededor de las mismas.
Pueden presentarse también halos opacos de lipólisis.
APLICACIÓN:
Productos lácteos, productos cárnicos, postres, comidas rápidas, productos avícolas, cereales,
alimentos concentrados, pescado y productos marinos, salsas, alimentos listos para el consumo.
PROCEDIMIENTO
- Homogenizar la muestra y preparar las diluciones las respectivas.
- Pipetear 0.1 mL de las diluciones sobre la superficie del agar.
- Extender con los rastrillos el inóculo sobre toda la superficie del agar (Ver figuras).
- Incubar las placas a 35 ± 2° C durante 48 horas
- Pasadas las 48 horas de incubación, seleccionar las placas que presenten entre 20-200
colonias negras brillantes, con bordes reducidos blancos y que aparezcan rodeadas de
zonas claras que contrastan con el medio opaco.
- Asuma como un ejemplo que el total de colonias típicas durante las 48 horas fue de 60
en la dilución 10-2 Cálculo 60 x 100 = 6.000 UFC
- Tomar un mínimo de tres colonias típicas y realizar la prueba de la coagulasa conforme
al procedimiento establecido. Transferir el número de colonias a confirmar a un número
igual de tubos que contienen 5 mL de caldo BHI.
- Incubar a 35 ± 2° C durante 18 a 24 horas.
- Transferir, atubodeensayo0,3mLdecaldoBHI+ 0,3mL deplasma, incubar 4a24
horas a 35 ± 2° C. Se debe efectuar un control positivo y un control negativo.
- Sobre el número total de colonias típicas después de las 48 horas de incubación y la
proporción de colonias confirmadas por la prueba de la coagulasa, hacer el cálculo de
estafilococo coagulasa positivo, utilizando como factor de correcciónla relación:
31

- Factor de corrección = colonias positivas para coagulasa /colonias examinadas

- Si se tomaron 4 colonias para la coagulasa y tres dieron la prueba positiva el factor sería
de: Factor de corrección = ¾
- Cálculo de estafilococo coagulasa positiva = 6.000 X ¾ = 18.000/4 = 4.500
Determinación de Estafilococo aureus en alimentos
25 gramos
Muestra de queso
Muestra
homogenizada
Diluciones 1 mL 1 mL
9 mL deagua
peptonada
Siembra e Sobre medio de

incubación agar Baird-Parker
Recuento de colonias
(Negras redondeadas
por zonas claras) Sembrar con asa cada una de las colonias
sospechosas (3 o 4) en 5 mL de caldo BHI
Prueba de la coagulasa
Examinar aglutinación luego de
incubar 4-6-24 horas Transferir
0,3 mL de plasma 0,3 mL BHI
5 mL
De acuerdo al número total de colonias positivas

Cálculo. para S. aureus y al número de colonias
examinadas, coagulasa positivas
Preparo: ELAL
Informe
32

33

Describa la técnica de la coagulasa
Haga el recuento y calcule el número de estafilococo por gramo de muestra
AUTOEVALUACION
- Describir las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica
- Que aportó usted para el desarrollo de la práctica
- De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y a su responsabilidad califíquese en una
escala de uno a cinco.
BIBLIOGRAFIA
Eduardo López Ávila. Graciela Lancheros 2004.
INVIMA Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. Manual de Técnicas de
Análisis para Control de Calidad Microbiológico de Alimentos para consumo humano 1998
Universidad de los ANDES. Gestión de calidad e inocuidad en la industria y auditor interno en
HACCP. Programa Profesionales. Bogotá. 2007.
Salgado C. María Teresa. Microbiología de alimentos. 2006. Manizales. Universidad de Caldas.
34

PRÁCTICA No. 9
ESTERILIDAD EN CONSERVAS
OBJETIVOS
 Esta prueba esta dirigida específicamente a un producto alimenticio enlatado.

 Determinar las condiciones en que se encuentran los productos enlatados de mayor
consumo ysi eltratamiento térmico al que han sido sometidos sonlos correctos.
 Conocer y realizar el procedimiento a que se somete el producto enlatado para la
determinación de posibles alteraciones que pueden presentar.
 Identificar los daños causados en la lata producidos por golpes en el envase.
PRE- LABORATORIO
 En qué consiste el proceso de escaldado en el tratamiento que se le hace a un alimento
que va a ser enlatado
 Métodos que se utilizan en la destrucción de microorganismos (esporulados o no)
 Cuál es el aspecto que debe tener un enlatado para ser considerado en buen estado
 Qué alteraciones se pueden presentar en un bote o recipiente
 Qué microorganismos pueden encontrarse implicados en las alteraciones de los
enlatados
 Qué factores causan deterioro en los alimentos enlatados
 Cual es la duración sanitaria promedio de un alimento enlatado
 Leer artículos relacionados sobre el tema y exponerlos antes de la práctica.
MARCO TEÓRICO
Se define enlatado como la conservación de los alimentos en recipientes cerrados, generalmente
implica un tratamiento térmico como factor principal en la conservación. El proceso de enlatado
se realiza en latas, botes o recipientes generalmente de hojalata conformados de acero,
recubiertos de estaño con una capa de esmalte o resina, de acuerdo con el tipo de alimento,
para prevenir o retardar la acción del producto sobre el material de la lata. Igualmente pueden
ser empleados otros materiales, tales como el vidrio, aluminio, plástico o combinación de estos.
Antes de iniciar el proceso de enlatado, el producto alimenticio debe ser recolectado en buenas
condiciones, clasificado y ser sometido a un proceso de lavado. El área de trabajo para su
análisis debeser estéril, cuarto estéril o cubículo de siembra estéril o cabina deflujo laminar.
La temperatura y tiempo de tratamiento de un alimento dependerá del efecto que el calor ejerza
sobre dicho producto y de otros métodos de conservación que vayan a emplearse
35
conjuntamente. UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

36

La esterilidad comercial determina si los alimentos envasados en recipientes herméticamente

cerrados cumplen con los requisitos de esterilización comercial al que fueron sometidos. Se
aplica a todos aquellos alimentos catalogados como comercialmente estériles.
MATERIALES
- Productos enlatados que correspondan al mismo número de lote de producción
- Malla de asbesto y trípode
- Vasos de precipitado
- Láminas
- Abrelatas estéril
- Papel de filtro
- Incubadoras
- Jabón
- Tubos con caldo infusión cerebro corazón
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
- Identificar completamente la muestra, anotando toda la información del rotulado en el
respectivo libro del protocolo de análisis
- Retirar las etiquetas de la lata, guardarlas en lugar seguro
- Anotar cualquier anormalidad que presente el recipiente (golpes, oxidación)
- Lavar el recipiente con agua tibia y jabonosa
- Enjuagar con agua tibia
- Secar con toallas limpias desechables
- Envolver con papel de filtro la lata, con el objeto de descubrir cualquier escape, debido a
orificios que pueda presentar el recipiente
- Marcar las latas con la fecha, número de muestra y temperatura de pre-incubación
PREINCUBACION
- Incubartreslatasdel mismo númerolote a35±2° C durante 10días
- Incubartreslatasdel mismo númerolote a55±1° C durante 10días
37

- Observar las latas cada dos días, volteándolas.

- Anotar cualquier anormalidad que se presente
- Si cualquier lata presenta abombamiento, durante el tiempo de incubación se debe
detener dicha incubación y anotar el tiempo transcurrido.
- Efectuar su análisis microbiológico inmediatamente.
PREPARACION DE LAS LATAS PARA SU EXAMEN

- Lavarse bien las manos y antebrazos y desinfectarlos correctamente
- Desinfectar con alcohol antiséptico (70%) todas las latas por examinar
- Flamear rápidamente la parte que se va a abrir
- Una vez abierta la lata se debe cubrir con la base de una caja de Petri estéril
- Anotar las características del producto
- Observar el aspecto interno que presente la lata
- Anotar cualquier anormalidad que se observe
EXAMEN DEL CONTENIDO DE LA LATA

- Transferir dos gramos del producto a cada uno de los 6 tubos que contienen 10 mL de
caldo infusión cerebro corazón, adicionados de 0.1% de almidón
- Incubar 3 tubos en anaerobiosis y 3 en aerobiosis, a la misma temperatura de pre-
incubación por 72 horas
- Realizar un frotis directo del producto y colorearlo con Gram. Contar las células
bacterianas por campo. Un número elevado es indicativo de las condiciones insanitarias
con los que se manejó el producto durante todo su proceso, además indica posiblemente
una materia prima contaminada.
LECTURA
- Hacer frotis de cada uno de los tubos sembrados y colorearlos con Gram para
determinar el tipo de gérmenes presentes.
- Considerar que el producto es estéril cuando no más de un tubo incubado en aerobiosis
muestra desarrollo.
38

Prueba de esterilidad
1 Preparación de las latas

Identificaciónde Anotar defectos Lavar con agua tibia
y jabón
la muestra observados de lalata

Retiraretiquetas y
guardarlas
Enjuagar Identificación de la lata, fecha Envolver la lata en

y secar número de muestra y papel de filtro
temperatura de incubación
2 Pre-incubación
Incubar 3 latas del mismo lote a 35 Incubar 3 latas del mismo lote a 55 ±
± 2°C durante 10 días 1°C durante 10 días
Observar las latas cada 2 días y voltearlas

Si la lata presenta abombamiento detener la
incubación. Efectuar
Lata en buen estado al final del tiempo de el análisis microbiológico
incubación se encuentranormal
Figura: Prueba de esterilidad en enlatados
39

3 Preparación de la muestra para su examen
Alcohol antiséptico
Lavadoy desinfección Lavadoydesinfección Flamear Abrir con abrelatas estéril

las manos
de la lata (apertura)
Anotar cualquier
Ver aspecto anormalidad
Cubrir la caja abierta Anotar lascaracterísticas
interno
con la base de caja de Petri del producto
4 Examen del contenido de la alta

Hacer frotis
2 gramos de muestra/ tubo
Cada tubo con 10 mL

de caldo infusión cerebro
corazón, adicionados de 0,1%
de almidón
Incubar en anaerobiosis a la Incubar en aerobiosis a la misma

misma temperatura de pre- temperatura de pre- incubación por
incubación por 72 horas 72 horas
Hacer frotis de cada tubo sembrado y colorear con Gram
5 Informe de resultados
40
Figura: Prueba de esterilidad
UNIVERSIDAD COLEGIOen enlatados
MAYOR DE CUNDINAMARCA

41

- Confirmar que el hallazgo de microorganismos en el enlatado analizado
demuestra que no es apto para el consumo
- En qué tubos se observa crecimiento y qué significa dicho crecimiento
- Qué anormalidades encontró en el enlatado durante todo el procedimiento
- Compare sus resultados con los resultados obtenidos por los demás grupos
- Qué factores pueden permitir el abombamiento de un enlatado
- Informar sobre el aspecto interno y externo de la lata
AUTOEVALUACION
- Describir las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica
- Que aportó usted para el desarrollo de la práctica
escala de uno a cinco.
BIBLIOGRAFIA
Jay, James. Microbiología Moderna de los alimentos. Acribia. ISBN 84- 200-0482-0
Hart, F, L Fisher Análisis moderno de alimentos. Acribia pp 33 - 135
INVIMA. Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. Manual de Técnicas de
Análisis para el Control de Calidad Microbiológico de Alimentos para consumo humano 1998
Salgado C. María Teresa. Microbiología de alimentos. 2006. Manizales. Universidad de Caldas.
INFORME
42

PRÁCTICA No. 10.
ACIDEZ Y DENSIDAD
OBJETIVOS
 Conocer las técnicas empleadas para la determinación de la densidad en la leche

 Identificar los diferentes factores que pueden modificar el valor de la densidad en una
leche
 Destacar la importancia de la determinación de la densidad en la leche
 Conocer los valores normales de densidad en los diferentes tipos de leche
PRELABORATORIO
- Qué factores modifican el valor de la densidad en una leche?
- Qué importancia tiene la determinación de la densidad en una leche?
- Qué métodos se utilizan para determinar la densidad en una leche?
- Describa las características físico-químicas para los diferentes tipos de leche.
- Termolactodensímetro a 15/15C con graduaciones en la escala de un grado
lactodensimétrico debidamente calibrado conpicnómetro provisto determómetro.
Calibración del termolactodensímetro15/15C:
- A una leche normal se le determina la densidad con picnómetro
- Calcular los grados lactodensimétricos L15/15 con la siguiente fórmula:
- l15/15= 1000 (d 15/15 -1)

- Efectuar cinco determinaciones completas con el Termolactodensímetro que se va a
calibrar efectuando la corrección por temperatura. Sacar el promedio, denominar l 15/15
este promedio.
- Corrección del aparato es igual L 15/15 - l 15/15
- Probeta de vidrio sin pico que permita el movimiento libre del Termolactodensímetro y la
total inmersión del vástago graduado.
- Balanza analítica con aproximación a 0,1 mg
- Picnómetro con capacidad de 100ml con tapón esmerilado, provisto de termómetro de 0
a 4C y tabuladora lateral capilar con caperuza.
- Baño de María con control termostático a 15C
- Preparación de la muestra:
- Si la leche es fresca y no hay separación de la crema, mezclar trasvasándola de un
recipiente a otro tres veces. Evitar la formación de espuma. Si la muestra contiene
grumos de grasa calentar a no más de 38C antes de homogenizar.
PROCEDIMIENTO
Determinación de la Densidad 15/15 con Termolactodensímetro:
Fundamento: se determina por aerometría
- Llevar la muestra a una temperatura cercana a los 15C +-5C
43

- Mezclar trasvasándola tres veces de un recipiente a otro tres veces

- Agregar la leche a la probeta con esta inclinada para evitar formación de espuma
- Introducir suavemente el termolactodensímetro manteniéndola vertical y sosteniéndolo
en su descenso hasta un punto cercano a su posición de equilibrio.
- Imprimir un ligero movimiento derotación
- Evitar contacto del termolactodensímetro con las paredes de la probeta.
- Efectuar la lectura después de un minuto de sumergido el termolactodensímetro
- Efectuar la lectura en la parte alta del menisco
- Hacer la observación en forma perpendicular a este
Cálculos:
La lectura observada en el vástago corresponde a los grados lactodensimétricos aparentes.
Para obtener los grados lactodensimétricos reales, hacer dos correcciones:
corrección del error sistemático del termolactodensímetro (en grados lactodensimétricos CA),
determinado por calibración con picnómetro.
Corrección por no estar la leche a T de 15C
Para obtener los grados lactodensimétricos reales y la D 15/15 se aplica:
L15/15= L + 0,24 (T - 15) + CA
D15/15 = 1 + L15/15
1000
L15/15C= Grados lactodensimétricos 15/15 corregidos

T = Temperatura de la muestra en grados centígrados
CA = Corrección sistemática de los grados lactodensimétricos determinados con picnómetro
l = Lectura en la escala de los grados lactodensimétricos
D 15/15C = Densidad de la leche 15/15C
Informar la densidad con 4 cifras decimales
Determinación de la densidad 15/15 con picnómetro:
Fundamento: La densidad de la leche 15/15 se expresa mediante la relación de la masa de un
volumen de leche a 15C respecto al agua a 15C
Calibración del picnómetro:
- Lavar el picnómetro con detergente
- Enjuagar con agua destilada
- Dejar secar el picnómetro y la caperuza al ambiente
- Llevar a 15C y pesar todo el aparato con aproximación a 0,1 mg. Denominar este P1
- Llenarel picnómetro con agua destilada
- Colocar el picnómetro en baño de hielo a 15C
- Colocar la caperuza, secar el picnómetro y pesar. Este será P2
- Llenar el picnómetro con la leche a analizar. Pesar denominar este P3
Cálculos de la densidad 15/15C:
D 15/15= P3 - P1
P2 - P1
44

ACIDEZ Y PRUEBA DE ALCOHOL EN LECHES
OBJETIVOS
 Explicar cómo se realiza la prueba de acidez y prueba de alcohol en leches

 Aplicar las técnicas de determinación de acidez
 Analizar la importancia de la determinación de estas pruebas con relación a la calidad
PRELABORATORIO
- Cuál es el fundamento de la técnica de acidez empleada en el laboratorio?

- Si la acidez sobrepasa el valor normal a qué se debe?
- Qué es acidez normal o aparente ?
- Qué es acidez desarrollada?
- Formas de expresar la acidez de la leche
- Explique el fundamento de la prueba de alcohol
MATERIALES
- Vasos de precipitado de 250ml

- Pipetas volumétricas de 9 ml
- Tubos de ensayo
- Pipetas de 1 y 10 ml
- Buretas
- Potensiómetro
- Hidróxido de Sodio 0,1 N
- Solución de Fenoftaleína al 1 %
- Soluciones Buffer pH 7 y pH 4
- Alcohol etílico al 70%
- Agua destilada
- Frasco lavador
PROCEDIMIENTO
45

- Cuando la muestra contenga grumos de grasa calentar a 38C en baño de María

- Enfriar a 20C
- Colocar en un vaso de precipitado o vaso plástico 9 ml de leche
- Agregar 5 gotas de fenoftaleína
- Titular con Hidróxido de Sodio hasta viraje a rosado (12"a 15" color)
Cálculos:
Acidez expresada como ácido láctico % m/v = 0,1 x V x F
10 ml de leche 0,09 x V x F
9 ml de leche 0,1 x V x F
pH:
- Calibrar el potenciómetro con soluciones buffer pH 4 y pH 7
- Medir el pH de la leche, teniendo extremo cuidad con el electrodo

- Dejar el potenciómetro apagado y el electrodo en la solución acuosa
Prueba de Alcohol
- Mezclar volúmenes iguales de la leche y alcohol en el tubo de ensayo
- Agitar por inversión observar la mezcla
- Se considera positiva la prueba cuando se observan partículas coaguladas de caseína
(cuajada) en la pareddel tubo
- ¿Qué factores modifican el valor de la densidad en una leche?
- ¿De qué es indicativo la variación del valor normal de la densidad en la leche?
- Realice un cuadro comparativo de sus resultados con los obtenidos por los otros grupos
de trabajo
- Describa los diferentes componentes de la leche
AUTOEVALUACIÓN

- De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y a su responsabilidad, califíquese en una
escala de uno a cinco
46

POSTLABORATORIO
- Cuál es la acidez de los diferentes tipos de leche según el decreto 2437?

- Cuál fue la acidez de su leche? Compárela con la de los otros grupos
BIBLIOGRAFIA

Ecología Microbiana de los Alimentos. ICMSF 1.995
Lactología Industrial. E. Spreer. 2000
47

PRÁCTICA 11.
ÎNDICE DE
REFRACCIÓN
OBJETIVOS
 Establecer el índice de refracción del producto elaborado.
 Usar el refractómetro como método analítico para deducir la calidad de un producto
 Formular los conceptos necesarios para procesar un vino de calidad.
MARCO TEÓRICO
Los refractómetros son instrumentos que emplean las propiedades ondulatorias de la luz para
estudiar las propiedades de muestras atravesadas por rayos luminosos. Han sido aplicados en el
análisis de productos como aceites, grasas, chocolates, mantecas esencias y otras sustancias
de interés industrial, ofreciendo en ocasiones, datos fiables sobre la composición cuantitativa de
mezclas de dos cuerpos.
PRE-LABORATORIO
¿Enquésebasa elfuncionamiento del refractómetro de Abbe?
Seleccione cinco productos con su respectivo índice de refracción.
¿Cómo se mide el índice de refracción en muestras sólidas?
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Refractómetro
Agua destilada
Pipetas de 5 ml.
Papel absorbente o papel de filtro.
48

PROCEDIMIENTO
USO DEL REFRACTÓMETRO DE ABBE
A. Lista de partes principales. Figuras 1 y 2.

1. Ocular
2. Ensamble de iluminación de la muestra
3. Perillas de abertura del prisma
4. Prisma secundario
5. Prisma principal
6. Termistor
7. Ensamble de la iluminación de la escala
8. Caja desecadora
9. Conexiones de entrada y salida de agua para el control de temperatura
l0. Tornillo de ajuste
11. Perilla de compensación de color
12. Perilla de medición
13. Termómetro
A. Ajuste de la escala
1. Colocar de 2 a 3 gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal con una
jeringa o pipeta. (Figura 3)
2. Cerrar el prisma secundario y observar a través del ocular.
3. Ajustar la escala, a 1.333 ( Brix 0%). Figura 4.
49

B.- Medición del índice de refracción de las soluciones

1.- Abriendo el prisma secundario colocar de 2 a 3 gotas de solución en el centro de la superficie
del prisma
2.- Cerrar cuidadosamente el prisma secundario
3.- Observar por el ocular, girar la perilla de compensación de color hasta que aparezca una
línea clara y definida en el campo de visión
4.- Girar la perilla de medición alineando la línea delimitadora con las líneas de intersección
5.- Leer en la escala superior el índice de refracción y el % de sólidos disueltos.
Evaluar el producto según los datos obtenidos.
POST-LABORATORIO
- ¿En qué se diferencia un vino de un licor?
- En un cuadro establezca las bebidas destiladas, la materia prima para su producción y
los º alcoholimétricos correspondientes.
- Qué es el Aceite de Fussel?
BIBLIOGRAFÍA
Control e Higiene de los alimentos. Larrañaga, I. et al... ,Mac Graw Hill 1999
Microbiología Industrial. Prescott y Dunn 1995
Fermentation Biotechnology. Owen P. Ward. 1995
Decreto 3192 (Nov. 1983)
Métodos Físicos para análisis orgánicos. Vol. 1, Parte 2. Capítulo 18. A. Wessberger.
AUTOEVALUACIÓN
¿Qué sugerencia o sugerencias plantea, para la ó las debilidades encontradas?
50

PRÁCTICA No. 12.
IDENTIFICACIÓN DE Listeria
OBJETIVO monocytogenes
 Conocer las etapas que se deben aplicar para el reconocimiento de Listeria

monocytogenes en un alimento.
 Determinar la presencia de Listeria monocytogenes en un producto lácteo
 Conocer las diferentes técnicas para el aislamiento y tipificación de la Listeria
moncytogenes en un alimento.
 Conocer los principales métodos de control para evitar su presencia en otros productos
PRE - LABORATORIO
 Cuales son las principales especies de Listeria descritas y cuales pueden ser patógenas
para en hombre y los animales.
 Cuales son las condiciones de crecimiento. Métodos de búsqueda. Lugar de origen
 Incidencia de la Listeria monocytogenes en los alimentos crudos y procesados
 Control de la Listeria monocytogenes en la industria alimenticia.
 Desinfección. Resistencia a desinfectantes.
 Cuales son las normales de la presencia de Listeria en los alimentos en nuestro país.
 Que se debe hacer para protegerse contra los alimentos contaminados con Listeria
 Porqué las la mujer embarazada no deben comer quesos campesinos frescos?
MARCO TEORICO
Enfermedad bacteriana causada por la Listeria monocytogenes, que por lo común se manifiesta
en las formas de meningo encefalitis, septicemia o ambos cuadros. Se hace destacar, el carácter
oportunista de esta bacteria, pues su carácter patógeno, depende no tanto de su virulencia sino
de la debilidad de la víctima.
La población de mayor riesgo son los recién nacidos, ancianos y personal de salud débil, en
especial personas que presentan alguna inmunodeficiencia.
Su principal reservorio lo constituyen los forrajes, el agua, el lodo y los granos ensilados.
Los alimentos que presentan mayor riesgo de contaminación son:
Vegetales crudos que pueden presentar un recuento de 1 a 5 gérmenes por gramo.
Carne roja en especial de animales alimentados con forrajes procedentes de establos lo que
indica la larga vida de esta bacteria en los forrajes.
Carne de aves, esta carne es la más frecuentemente contaminada por Listeria. La razón, gran
posibilidad de contaminación con materia fecal durante el proceso del sacrificio. Todo lo anterior
conlleva un alto riesgo de contaminación cruzada con otros productos alimenticios.
Pescado, el obtenido en altamar no se encuentra contaminado con Listeria, pero el
correspondiente a las capturas en aguas continentales presentan Listeria monocytogenes debido
al impacto de los efluentes y de las aguas residuales.
Leche, como es sabido, por lo general, todas las bacterias patógenas presentes en las heces de
51

la vaca, se encuentran en la leche cruda, aunque sea en pequeña proporción. El proceso de

pasteurización elimina este riesgo. En los productos lácteos elaborados con leche cruda se
presenta la mayor incidencia de presencia de Listeria por lo tanto la ingestión directa de estos
productos son la causal de esta enfermedad.
MATERIALES
- Muestra de queso fresco de venta popular
- Fiolas con 90 mL de caldo de enriquecimiento para Listeria
- Balanza analítica
- Tubos con 9 mL con caldo enriquecimiento Listeria
- Espátula estéril
- Mortero de porcelana o de vidrio con su pistilo, tamaño mediano, estéril
- Vaso de precipitados, de 100 mL, estéril
- Agar sangre
- Caldo triptosa soya con extracto de levadura
- Ácido nalidíxico-cicloheximida-acriflavina
- Agar LPM
- Agar Oxford
- Tinción Gram
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO PARA PRODUCTOS LÁCTEOS

Latécnica utilizada para el aislamiento eidentificación de L. monocytógenes eslarecomendada
por la FDA, en el Bacteriological Analytical Manual (BAM) con algunas modificaciones.
El aislamiento de Listeria incluye 3 etapas fundamentales:

I. Enriquecimiento selectivo.
II. Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial.
III. Identificación.
I. Enriquecimiento selectivo.
- Pesar en la Bolsa para el equipo de homogenización de “Stomacher”,
previamente tarada, 25 gramos de muestra que sea representativa (tomando de
la parte central como de la superficie).
- Añadir 225 mL de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB).
- Colocar la bolsa en el equipo “Stomacher” y hacer funcionar el equipo durante 2
minutos, el tiempo máximo de homogenización dependerá del tipo de alimento.
No sobrepasar los 3 minutos.
- Incubar a 30 ± 2° C por 24 a 48 horas.
- II Siembra en placa con medios selectivos a las 24 horas y 48 horas
- Transferir una asada del cultivo obtenido en el caldo de enriquecimiento (EB) a
placas con Agar Oxford y Palcam, aislar por agotamiento.
- Incubar a 35 ± 2° C por 24 – 48 horas
52
- Las colonias típicas de L. monocytógenes en las placas de Agar Oxford son de

colorverde negro conunhalo negro, debido ala hidrólisis delaesculina.
- Las colonias típicas de L. monocytogenes en las placas de Agar Palcam son de

color verde grisáceo con un halo marrón negro sobre un fondo rojo cereza,
debido a la hidrólisis de la esculina y no fermentación del manitol.
- Otras bacterias pueden formar halos negros, pero el desarrollo del color toma
más de 2 días.
- Seleccionar 3 – 5 colonias típicas de Listeria en cada placa de agar utilizado
Primera Purificación
- Con asa recta tocar suavemente cada colonia seleccionada, sembrarla por
agotamiento en una placa con agar triptosa ácido nalidíxico (ATN).
- Incubar a 35 ± 2° C
- Observar a las 24 horas las colonias crecidas en el agar (ATN) por el método de
iluminación de Hery con la ayuda de un estereoscopio.
- Realizar control positivo: cepa de L. monocytógenes
- Realizar control negativo: cepa Streptococcus faecalis
- Las colonias de L. monocytógenes son pequeñas, de borde nítido, ligeramente
- abombadas con superficie lisa y con la luz incidente oblicua, exhiben superficie
azulada.
- Las colonias de S. faecalis son amarillas hasta amarillas rojizas tornasoladas.
Segunda Purificación
- Tomar una colonia típica de Listeria de cada placa de agar (ATN), repicarla por
agotamiento en una placa con agar tripticasa soya extracto de levadura
(TSAYE)
- Incubar a 35 ±2° C por 18 a 24 horas.
- Adicionalmente, realizar cultivos en fase estacionaria de cepas de estándar de
Staphylococcus aureus (CAMP +) y Rhodococcus equi.
- Transferir una asada de cada una de las cepas estándar a tubos con 5 mL de
caldo de Infusión cerebro corazón.
- Incubar a 35 ± 2° C por 18 a 24 horas
Identificación de Listeria
La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Listeria incluye 2 etapas

seguidas:
Comprobacióndelas coloniassospechosasmediantepruebasbioquímicasdeterminativas.
Identificación serológicas de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros
Identificación de Listeria mediante pruebas bioquímicas

A partir de los cultivos puros obtenidos en el agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE)
realizar las siguientes pruebas:
53

IDENTIFICACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES

25 g
MUESTRA HOMOGENIZAREN: 225 mL caldo de
enriquecimiento
paraListeria
Homogenización de la muestra Enriquecimiento
selectivo
Sembrar en medios selectivos

Incubara 30 ±2°Cpor48horas
Muestra Control + Control - Agar

Oxford
Observar colonias típicas
de L.monocytogenes
Seleccionar 3 colonias
Muestra Control + Control-
Purificación. Incubar a 35 ± 2°C por 24 a 48 h

VercoloniastípicaspormétododeiluminacióndeHenry Agar
Palcam
Segunda purificación Control-

Muestra Control +
Incubara35±2°Cpor18a24h Agar Tsaye
Muestra Control + Control-
Carbohidratos Identificación Iluminación de

xilosa, manitol serológica y Henry
ramnosa tipificación
Preparo: Eduardo Lopez Avila

Catalasa Gram Motilidad Hemólisis Camp Anton
54
Figura. Identificación
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR de Listeria
DE CUNDINAMARCA
55

Método de iluminación de Henry

Observar las colonias con la ayuda de un estereoscopio. Es un procedimiento sencillo, es
disponer de una fuente deluz blanca, un espejo plano y untrípode. La luzdebe incidir sobre el
espejo formando un ángulo de 45° y reflejarse hacia arriba atravesando la placa del agar en un
ángulo de 45°, observar la placa mirándola desde arriba. Las colonias de L. monocytogenes son
pequeñas, de borde nítido, ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz incidente
oblicua, exhiben superficie azulada.
Catalasa
Colocar en un portaobjeto una gota de peróxido de hidrógeno al 3%, suspender la colonia.
Observar si se produce o no burbujas de gas. La L. monocytógenes es catalasa (+) produce
burbuja de gas.
Coloración de Gram
Listeria monocytógenes: Bacilos o cocobacilos Grampositivos.
Encultivos viejos: Bacilos ococos Gramnegativos.
Descartar los cultivos que no cumplan con las siguientes características:
– Catalasa (+)
– Bacilos o cocobacilos Gramnegativos
Movilidad y reducción de nitrato

Inocular con asa recta por punción central tubos con agar movilidad – nitrato modificado Hatano
Schuch.
Incubar a temperatura ambiente 2 – 5 días.
L. monocytogenes: crecimiento típico en forma de sombrilla
Descartar los tubos que no presenten esta apariencia.
Revelar la prueba de nitrato después de la lectura de la inmovilidad, comprobar la presencia de
nitritos en el medio de movilidad – nitrato, añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess, la
aparición de un color rojo, indica presencia de nitritos (posibilidad) en el caso de que no ocurra
cambio de color añadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato
residual. La aparición de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo
tanto una reacción negativa.
Color rojo: no reducción de nitrato.
Color del reactivo: reducción del nitrato.
L. monocytógenes: nitrato negativo (-).

Crecimiento típico de sombrilla
Nota: actualmente la prueba de reducción de nitratos es opcional.
Voges ProsKauer: (+)

Hemólisis
Dibujar una rejilla con 20 a 25 cuadrículas por placa en el fondo de una caja de Petri con agar
tripticasa soya adicionado con 5% de sangre de cordero.
Tomar una colonia típica y sembrarla por picadura en una de las cuadrículas.
56

Incubar a 35 ±2° C por 24 horas.

Realizar controles positivo y negativo.
L. monocytógenes: presenta ligera beta hemólisis.
L. ivanovii: presenta zonas bien delimitadas y amplias de hemólisis.
L. innocua: no muestra hemólisis.
Este procedimiento también se puede realizar sembrando una colonia del cultivo puro en placas
con agar Columbia doble capa adicionado con 5% de sangra de cobayo.
Incubar a 35 ± 2° C por 24 horas.
Prueba de CAMP (The Christie-Atkins-Munch-Peterson)

Listeria monocytogenes posee el factor CAMP que hace que la zona de hemólisis se intensifique
con la B-hemolisina de S. aureus, estableciendo una cabeza de una flecha formada en el punto
en que el factor y la hemolisina se topan.
Sembrar líneas verticales paralelas, de cultivo fresco de Staphylococcus aureus CAMP (+) y
Rhodococcus equi, sobre placas delgadas y frescas con agar tripticasa soya adicionado con 5%
de sangre de cordero.
Inocular horizontalmente (ángulo de 90°) las muestras en estudio y los controles positivos y
negativos, a 1 ó 2 mm de los cultivos anteriores sin tocarlos.
Incubar a 35 ± 2° C por 24 horas. Se observa mejor a las 24 horas.
Considerar una reacción positiva para CAMP cuando se presenta una zona clara de beta
hemólisisenlaintersección delamuestraenestudio conlacepade S. aureus o Rhodococcus
equi.
La hemólisis de L. monocytógenes se intensifica cerca al cultivo de S. aureus. La hemólisis de
L. ivanovii se realza cerca al cultivo del R. equi. La hemólisis de L. seeligeri se intensifica cerca al
S. aureus. Las otras especies de Listeria al no ser hemolíticas presentan una reacción de CAMP
negativa.
Prueba de CAMP. Reacciones de las diferentes especies de Listeria
Interacción Hemolítica
Especies Staphylococcus aureus Rhodococcus equi

L. monocytógenes + ª
L. ivanovii - +
L. innocua - -
L. welshimeri - -
L. seeligeri + -
a RarascepassonS+yR+,perolareacción
R+esmuchomenospronunciadaqueladelaL.ivanovii. Tomado del
Bacteriological Analytical Manual (BAM) del FDA L. monocytógenes 2002
Fermentación de carbohidratos
Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos xilosa, ramnosa y
manitol.
Incubar a 35 ± 2° C por 24 – 48 horas.
57

Descartar a los 7 días de incubación.

Observar el viraje del indicador, generalmente ocurre a las 48 horas.
L. monocytógenes Xilosa (-)

Manitol (-)
Ramnosa(+)
Prueba serológica
Esta prueba sirve como evidencia corroborativa en la determinación del organismo como agente
etiológico de la enfermedad.
La identificación final no se puede hacer sin la caracterización morfológica, serológica y
bioquímica. Más del 90% de L. monocytógenes pueden ser serotipificadas con sueros tipo 1, tipo
4.
Prueba rápida en lámina

- Realizar dos transferencias sucesivas del cultivo en estudio en un tubo con la superficie
inclinada de agar triptosa o infusión cerebro corazón.
- Incubar a 35 ± 2° C por 18 – 24 horas.
- Adicionar al cultivo obtenido, 3 mL de buffer (FA), mezclar para desprender el cultivo.
- Transferir esta suspensión a un tubo estéril.
- Calentar la suspensión con el organismo a 80° C por una hora
- Centrifugar por 30 minutos a 1600 rpm.
- Retirar 2,2 a 2,3 mL del fluido y resuspender los organismos con la porción restante del
líquido y continuar con las instrucciones de la casa fabricante correspondiente
empleada.
- Los laboratorios que realicen la detección rutinaria de Listeria en alimentos deben utilizar
pruebas bioquímicas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serológicas para
determinar si son Listeria.
- La identificación definitiva de Listeria, como pertenecientes a un determinado serotipo
requiere el envío de cepas a un centro especializado en tipificación.
Tipificación mediante Bacteriófagos.
Desde el punto de vista epidemiológico es una prueba muy útil y es realizada por laboratorios
especializados.
El resultado final se debe expresar como L. monocytógenes / 25 g positivo o negativo
PROCEDIMIENTO PARA PRODUCTOS CÁRNICOS

La técnica utilizada para productos cárnicos es la recomendada por el Ministerio de Agricultura
de Brasil.
I. Enriquecimiento selectivo primario
- Homogenizar 25 gramos de la muestra con 225 mL de caldo de enriquecimiento para

Listeria LEB (1) adicionado con 0.225 mL de solución de acriflavina al 1% en hidróxido
de sodio 0,1 N.
- Incubar a 30 ± 2° C por 18 – 24 horas
58

II. Enriquecimiento selectivo secundario.
- Transferir 0.2 mL del cultivo obtenido en el caldo LEB (1) a un tubo con 10 mL de caldo
de enriquecimiento para Listeria LEB (2) adicionado con 0.1 mL de solución de
acriflavina al 0.2% en hidróxido de sodio 0.1 N.
- Incubar a 30 ± 2° C por 18 a 24 horas.
- Transferir una asada del cultivo LEB (2) a placas con agar Oxford y Palcam.
- Seguir la misma pauta utilizada en la técnica BAM de la FDA a partir del numeral
Purificación.
En nuestro caso tomaremos 10 gramos de muestra (queso fresco) debidamente preparada y la

llevamos a fiola que contenga 90 mL de agua peptonada, luego sacamos 10 mL y sembramos en
cada uno de dos tubos, marcamos y llevamos a incubación
Efectuar unsubcultivo enlas cajas de agar LPM incubar a 37° C por 24 y48 horas.
Igualmente efectuar un subcultivo en agar Oxford, incubar a 37° C por 24 - 48 horas
En todo momento se debe efectuar pruebas positivas con Listeria monocytogenes.
Observar la morfología de las colonias.
Hacer tinción de Gram, se debe observar cocobacilos grampositivos, rectos, con disposición en
empalizada semejantes a difteroides.
Identificación bioquímica. Se fundamenta en la utilización de carbohidratos, nitratos, catalasa

conforme a la siguiente tabla. Características de las especies de Listeria
Listeria Listeria Listeria Listeria Listeria Listeria Listeria

Prueba monocytogenes ivanovii seeligeri innocua welshimeri murrayi grayi
B hemólisis + ++ + - - - -
CAMP
S. aureus + - + - - - -
R. equi - + - - - - -
Producción de
ácido desde:
Ramnosa + - - (+) v (+) v v -
Xilosa - + + - + - -
Manitol - - - - - + +
Patogenicidad + + - - - - -
para el ratón
Balow,S. Et all. Manual de Microbiología Clínica. 5ª Edición. American Society for Microbiology. Washington DC
59

60

APLICACIÓN
L. monocytogenes se ha asociado a alimentos tales como la leche cruda, supuestamente
pasteurizada, los queso (variedades suave-maduras), el helado, alimentos crudos, las salchichas
fermentadas de carne cruda, pollo crudo y cocinado, las carnes crudas (de todos los tipos), y los
pescados crudos y ahumados. Su capacidad de crecer a temperaturas bajas como 3ºC permiten
su multiplicación en alimentos refrigerados.
PCR.
A. EXTRACCION DE ADN POR LISIS
- De las colonias aisladas en el medio selectivo transferir de una a cinco colonias a un
tubo estéril con 5ml de BHI e incubar durante 18 horas.
- Tomar un mililitro del caldo inoculado y transferirlo a un tubo estéril
- Centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos
- Descartar el sobrenadante
- Para resuspender el pellet agregar un mililitro de agua desionizada estéril.
- Agitar en Vortex y pasar a un tubo eppendorf estéril de 1.5 ml
- Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos
- Descartar el sobrenadante
- Resuspender el pellet en 100ul de Agua desionizada estéril.
- Calentar por 10 min en baño de agua a 85°C.
- Centrifugar a 13,000 rpm/5 min.
- Tomar 7.5 ml del sobrenadante para usar como templado en una reacción de 25 ml de
PCR.
B. PCR Listeria monocytogenes

- Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC en caldo de BHI a 35°C por 24h.
- Control negativo: montar la reacción del Master Mix sin contenido de ADN y llegando al
volumen final con agua desionizadaestéril.
- Precalentar el termociclador, para esto se debe encender con el botón adecuado.
- Seleccionar la opción RUN. El programa iniciará, pero se debe colocar pausa hasta que
se alcance 94°C de temperatura.
- El ciclo utilizado es el siguiente:
Ciclo inicial de 95°C 5 minutos 35 ciclos de:
- 95°C 90 segundos
- 62°C 60 segundos
- 72°C90segundos
Ciclo final de 72°C 7 minutos
C. ELECTROFORESIS
- Preparar un gel de azarosa al 2%
- Para un gel de 70ml (cubeta grande), teñido con la concentración adecuada de bromuro
de etídio (10ug/ml)
MONTAJE, CORRIDA Y VISUALIZACION DEL GEL

- En el primer pozo, colocar la cantidad recomendada del marcador de Peso Molecular
61

- Con una punta amarilla, tomar 5 μl del amplicón. Colocar el amplicón en el pozo,
teniendo cuidado de no punzar el gel con la punta.
- Colocar el gel montado sobre la fuente de poder a 80 w con 250 mA por 75 minutos.
- Pasado el tiempo de corrido desmontar el gel y observar las bandas en el Chemi Doc
XRS.
Nota:
* Los pasos que se describieron a continuación fueron procedimientos estandarizados en el
laboratorio de biología molecular del LEMA (Laboratorio J209).
Referencia:
VanegasLópez M.C., Reyes V., L., Martinez A.J., Rugeles L.C. 2007.Identificación de microorganismos importantes en
inocuidad y deterioro en la industria. Bogotá. Universidad de los Andes. LEMA.
ANALISIS DE RESULTADOS
- Registrar el resultado obtenido, compararlo y discutirlo con los obtenidos por los demás
grupos.
- Evalúe su resultado con la presentación del producto analizado
- Compare su resultado con las normas sanitarias existentes de su producto con relación
a otros productos.
AUTOEVALUACION
Describir las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica

Que aportó usted para el desarrollo de la práctica
De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y responsabilidad califíquese de 1 a 5
BIBLIOGRAFÍA
Abram S. Benenson. El control de las enfermedades transmisibles en el hombre. Publicación

Científica N ° 538 XV edición Organización Panamericana de la Salud.
Ferran Arnau Calduc. La Listeria en la Industria alimentaria. ALIMENTACION, Equipos y
Tecnología sept.1994
Listeriosis Monografía. Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos INVIMA
Ana Isabel Muñoz Cajiao Graciela Díaz Figueroa Bogotá Noviembre de 1998.
INFORME
62

PRÁCTICA No. 13.
IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA
OBJETIVOS
 Conocer y aplicar las técnicas para la identificación de Salmonella a partir de un
alimento. 
 Valorar la importancia de la determinación de Salmonella en alimentos como parte de su
control sanitario. 
Aprender a procesar productos alimenticios, para identificar presencia de Salmonella.
MARCO TEORICO
La Salmonella es un bacilo Gram negativo, no esporulado que fermenta la glucosa, casi siempre
con formación de gas, pero no fermenta la lactosa ni la sacarosa.
Las temperaturas mínimas para su crecimiento son de 6.7 a 7.8° C en alimentos como carne de
pollo y de unos 10° C en la crema de pastelería o en ensalada de jamón. Crece bien a
temperatura ambiente pero la óptima es de 37° C. Se desarrolla a un pH comprendido entre 4.1
y 9.0 aunque crece mejor en alimentos poco ácidos.
Los alimentos en que frecuentemente se puede aislar Salmonella corresponden a los productos
cárnicos, ya que constituyen el aspecto post-morten de los músculos del cuerpo del animal junto
con el tejido conectivo que los une y rodea, los huesos y la grasa intra e intermuscular.
Bajo el término de carne se incluyen los órganos y las glándulas tales como el hígado, corazón,
riñones, lengua, sesos.
La carne de animal bovino adulto debe tener apariencia marmórea, con superficie brillante y de
color rojo fuerte, firme al tacto, elástica y ligeramente húmeda, debe de carecer de color verdoso
o anormal y de olor extraño o rancio. Recién muerto el animal, la carne es elástica pero muy
pronto se vuelve dura.
La Salmonella es importante en el control sanitario de los alimentos debido a que pueden causar
una severa enfermedad (salmonelosis) en los seres humanos, la cual puede ser mortal. Los
desórdenes gastrointestinales son los más comunes (Ver Anexos).
Los animales también pueden contaminarse con facilidad.
Los animales para consumo humano que estén infectados pueden transmitir la enfermedad a
través de la carne contaminada (cerdo, res, pollo) pescado y otros productos tales como los
huevos, leche.
El agua no tratada también puede ser fuente de contaminación.
PRE- LABORATORIO
 Cómo se produce la salmonelosis?
 Cuales son los síntomas que se presentan en una infección causada por salmonelosis?
 Cuáles son las condiciones necesarias para que se produzca una infección
gastroentérica? 
 Cuales son los métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella a partir de
alimentos?
 Como prevenir la contaminación de Salmonella en alimentos elaborados?
63

MATERIALES
- Fiolas, balanzas, pipetas estériles, asas de inoculación, tijeras, baja lenguas
- Caldo lactosado
- Caldo selenito.
- Caldo tetrationato.
- Agar verde brillante lactosa-sacarosa.
- XLD; Agar Sulfito Bismuto.
- Pruebas bioquímicas (TSI, LIA, Citrato, Urea, SIM, Fenil alanina, Indol, MR-VP)
PROCEDIMIENTO
Enriquecimiento no selectivo.
- Prepare una dilución 10-1 (fig) tomando 25 gramos de la muestra en 225 mL de caldo
lactosado, incube a 35 ±2° C durante 18 a 24 horas. También puede preparar la dilución
10-1 tomando 10 gramos de la muestra en 90 mL de caldo lactosado.
- Realice un frotis y coloración con Gram.
Enriquecimiento selectivo.
- Deladilución anterior coloque 1mLen10 mLdecaldo selenito ycoloque 1mLdela
misma en 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 43 ± 0,5°C durante 18 horas.
Siembra en placa con medios selectivos y diferenciales
- Siembre en agar selectivo con asa, puede usar agar XLD, Agar SB, Agar VBLS.
- Incube a 37° C por 24 horas.
- XDL.carbohidratosfermentable: xilosa,lactosa,sacarosa. Coloniasamarillas,
fermentador. Colonias rosadas o rojas no fermentador.
- Agar SB: colonias de Salmonella productoras de H2S producen colonias negras
- De los cultivos resultantes siembre:
Pruebas bioquímicas
- Caldo de nitratos, Agar motilidad, Agar TSI, LIA, Agar citrato de Simona, Agar urea,
Prueba oxidasa
- Interprete los resultados de las pruebas bioquímicas y determine el germen aislado
Interpretación:
Salmonella bacilo Gram negativo no esporulado
 Fermentador de carbohidratos: Si se produce un cambio de color, según el indicador de
pH utilizado, la reacción es positiva.
64

DETERMINACIÓNDESALMONELLA
Preparo:EduardoLopezA
Stomac
25 gramos her
Bolsa
250 mL
Preparación muestra
Pre-enriquecimiento
Incubar a 37 ± 2°C por 18 - 24 horas
1 mL
Enriquecimiento selectivo en caldo
Incubar a 43 ± 0,2°C por 18 - 24 horas Caldo Caldo tetrationato

selenito
Sembrar en medioselectivo en superficie con
asa poragotamiento
Incubar a 37° C por 24 - 48 horas
Seleccionar 3 colonias típicas sospechosas

deSalmonella(lactosanegativa),aislarlasenagar
selectivo paragarantizar su pureza y proceder
a su identificación
Pruebas a: Bioquímica
b: Serológica
Informe
65
Figura: Identificación
UNIVERSIDAD de Salmonella
COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

66

 Movilidad: Inocular con asa recta por punción central, a una profundidad de ¼ a ½ de
pulgada, tubos con agar movilidad. Incubar. El crecimiento es positivo si el
microorganismo migra de la línea de siembra y se difunde a través del medio. Cuando es
inmóvil sólo crece en la línea de siembra. 
 Reducción de nitrato: Inocular con asa, tubos de caldo nitrato. Incubar. Revelar la prueba
añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess, observar el color.
Rojo: Indica presencia de nitritos (positividad); en caso de que no ocurra cambio de color
añadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar presencia de nitrato residual.
La aparición de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo
tanto una reacción negativa
 Reacción de Agar TSI: Inocular por estría la parte inclinada y por picadura la columna
del medio. Incubar. Cultivos positivos de Salmonella producirán una reacción K/A con
producción de gas y H2 S.
 Reacción en agar citrato de Simmons: Inocular sembrando por picadura la columna del
medio. Incubar. Una reacción positiva estará dada por un viraje del color verde a azul
intenso.
 Reacción de agar LIA: Inocular, sembrando por doble picadura la columna del medio, y
por estría la superficie. Incubar. Los cultivos de Salmonella producirán una reacción K/K
 Reacción en agar Urea: Inocular sembrando por estría la parte inclinada. Incubar. Se
observa una reacción positiva cuandoelcolor delmedioviraarosadovioleta
 Desaminación de la fenil alanina: inocular sembrando por estría la parte inclinada.
Incubar. Revelar añadiendo 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10% sobre la estría de
crecimiento. Un color verde indica positividad de la reacción.
 Producción de Indol. Inocular el tubo con caldo triptófano. Revelar añadiendo 3 a 5 gotas
de Reactivo de Kovac´s. Un anillo color cereza en la superficie del medio indica una
reacción positiva
 Rojo de metilo – Voges Proskaver: inocular 2 tubos con caldo MR-VP. Incubar. Revelar
el rojo de metilo (MR) adicionando a uno de los tubos 4 a 6 gotas de solución del
reactivo de rojo de metilo. Un color rojo indica positividad de la reacción.
67

 Revelar el Voges Proskaver, añadiendo al otro tubo 0,6 mL de alfa naftol al 5% y 0.2 mL
de solución acuosa de hidróxido de potasio al 40%. Agitar el tubo suavemente y dejar en
reposo por 10 minutos. Un color rojo indica positividad de la reacción. 
 Prueba de Lisina decarboxidasa: inocular el tubo con el aminoácido L – lisina colocar
una capa de aceite mineral. Incubar.
 El cambio de color a púrpura indica una prueba positiva.
** Ver tabla de identificación en Anexos.
CONFIRMACION SEROLÓGICA DE LAS COLONIAS SOSPECHOSAS

Con la confirmación serológica se puede identificar a nivel de especie.
TECNICA
 Sobre un porta objetos de vidrio bien limpio, señalar tres áreas. Depositar en una de
ellas una gota de la suspensión del cultivo en estudio y mezclarla con el suero
polivalente O.
 En otra de las áreas indicadas, hacer lo mismo pero utilizando suero polivalente H.
 En la tercera, colocar solo una gota de la suspensión del cultivo, que servirá como
testigo.
 Mover cuidadosamente el porta objetos y observar si se produce o no aglutinación en el
transcurso de un minuto:
 Si hay aglutinación en las secciones del porta objetos donde se han mezclado cultivos y
antisueros , el resultado es positivo
 Si se aglutina el cultivo testigo, es señal que la cepa en estudio es autoaglutinable. En
este caso la prueba, en conjunto no es válida.
 Sihayaglutinación solamente enel suero polivalente H,se añadealaterceragota
(testigo ) un asa de antisuero Vi y se observa si se produce aglutinación. También se
puede repetir la prueba con antisuero polivalente O, habiendo hervido previamente la
suspensión bacteriana durante un minuto.
INTERPRETACION
Los cultivos bioquímicamente típicos de Salmonella y serológicamente negativos a este género
no se consideran Salmonella y requieren más pruebas.
Los cultivos bioquímica y serológicamente típicos de Salmonella se consideran Salmonella.
En el caso de ser necesaria una identificación completa de la cepa, se recurre a Laboratorios de

referencia autorizados.
BIBLIOGRAFIA: PASCUAL ANDERSON, María del R. “Microbiología Alimentaria”. Díaz de
Santos, S.A. Madrid (España). 1992
68

69

APLICACIÓN
Alimentos de origen animal, carne (ternera, cerdo, aves, etc.), los huevos y los productos
industrializados que contienen estas materias primas básicas, productos marinos y leche en
polvo.
POST- LABORATORIO
- ¿Que importancia tiene la determinación de Salmonella a partir de un producto cárnico?
- ¿Cómo se clasifican los derivados cárnicos?
- ¿Cuales son los valores normales de Salmonella que las normas establecen para un
producto alimenticio?
AUTOEVALUACION
- Describir las debilidades y fortalezas que encontró en el desarrollo de la práctica.
- Que aportó usted para el desarrollo de la práctica.
BIBLIOGRAFIA
Eduardo López Ávila. Graciela Lancheros 2004.
FDA. Bacteriological Analytical Manual B.A.M AOAC 2004
INVIMA Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. Manual de Técnicas de
Análisis para Control de Calidad Microbiológico de Alimentos para el consumo humano. 1998.
Ingeniería de los alimentos: operaciones unitarias y prácticas de laboratorio. Sharma y Mulvaney
2009.
INFORME
70

PRÁCTICA 14.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MEDICAMENTOS ESTÉRILES Y NO ESTÉRILES
OBJETIVOS
 Detectar contaminaciones microbianas en los diferentes medicamentos, para asegurar
que su uso en el humano no va a ocasionar ningún proceso infeccioso.
 Determinar las características sanitarias de los medicamentos durante la fabricación,
empaque, almacenamiento y distribución.
 Conocer los diferentes medicamentos y su clasificación.
MARCO TEÓRICO
La prueba de esterilidad busca en los diferentes, medicamentos, cosméticos e insumos para la

salud, detectar bacterias y hongos que puedan desencadenar algún proceso infeccioso en el
humano y/o en animales.
Las pruebas se deben realizar en cuarto estéril con cabina de flujo laminar. Se analizan
soluciones parenterales, inyectables y medicamentos tópicos para productos envasados en
volúmenes mayores de 30 ml se requiere un número de muestras nunca inferior a tres unidades.
Para los inyectables se requiere un número mayor, que no sea inferior a 10 unidades.
Cuando el Control de esterilidad se va a efectuar a un lote completo, se siguen las siguientes

normas:
- En lotes de 100 unidades ó menos se tomará un 10% para análisis.
- En lotes de 100 a 500 unidades se tomarán 10 muestras como mínimo.
- En lotes por encima de 500 unidades se tomarán mínimo 20 muestras.
- En lotes mayores de 2500 unidades se regirá por la siguiente fórmula: 0.4√ n.
Al tomar las muestras de cada lote, debe tenerse en cuenta que estas provengan tanto de la
parte inicial, como de la parte media y de la parte final del lote.
71

Las pruebas recomendadas para los productos farmacéuticos dependen del tipo de forma
farmacéutica, de sus características físicas y condición de esterilidad.
Para los productos estériles existen dos pruebas de importancia, la de esterilidad y la

determinación de endotoxinas. Para el caso de los antibióticos existen otras pruebas adicionales
como la inocuidad y la actividad antimicrobiana.
Cuadro. Clasificación de los medicamentos de acuerdo al tipo de forma farmacéutica
ESTERILES NO ESTÉRILES
LIQUIDOS SÓLIDOS SEMI LÍQUIDOS SÓLIDOS SEMI VARIOS

SÓLIDOS SÓLIDOS
Inyectables Polvos para Unguentos Soluciones Tabletas Óvulos y Aerosoles

reconstitución oftálmicos supositorios
de inyectables
Soluciones Implantes y Emulsiones Cápsulas Cremas Soluciones

oftálmicas sistemas duras y Geles de uso
intaruterinos e blandas Unguentos externo
intaroculares y pastas
Suspensiones Suspensiones Polvos y Sistemas de

granulados liberación
transdérmi-
cos
Fuente: minsalud, Instituto Nacional de Salud: Normas técnicas de calidad. 1994
PRE-LABORATORIO
- Defina límite microbiano y valoración biológica.
- Grafique el proceso de elaboración de por lo menos dos formas farmacéuticas
- Según la categoría de los medicamentos ¿Qué requerimientos a nivel microbiano exigen?
- Qué sugerencias daría Ud. a la industria productora de medicamentos para evitar la
contaminación de los productos?
MATERIALES
Medicamentos estériles:
- Tubos de 150 x 18 mm, tapa rosca, con 10 ml de Caldo Tioglicolato
- Tubos de 150 x 18 mm, tapa rosca con 10 ml de Caldo Tripticasa soya.
72

Medicamentos no estériles:
- Tubos de 150 x 18 mm, tapa rosca, con 10 ml de Caldo Tioglicolato estéril.
- Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptonada al 0.1% estéril.
- Tubos con 9 ml de caldo lactosado estéril
- Cajas con Agar Tripticasa soya
- Cajas con Agar sabouroud
- Agar Sulfito-Hierro-Polimixina, fundido, listo para servir en clase, una fiola (con 100 ml)
- Cajas con Agar EMB
- Cajas con Agar Baird Parker
- Cajas con Agar Cetrimide
- Cajas con Agar sangre
- Tubos cada uno con 10 ml de caldo Selenito.
- Tubos cada uno con 10 ml de caldo Tetrationato
- Jarra de anaerobiosis y reactivos para anaerobiosis
- Micropipeta de 1 mL
- Micropiopeta de 100 µL
- Caja de Puntas de plástico de 1 mL, estéril
- Caja de puntas de plástico para 100 µL, estéril
- Coloración de Gram
- Azul de Lactofenol
- Tijeras estériles
- Baja lenguas estériles
- Pinzas estériles.
PROCEDIMIENTO
Medicamentos estériles:
La prueba se realiza en un cuarto estéril con cabina de flujo laminar.
Se analizan mediante este método:
- Soluciones parenterales (dextrosas, sueros fisiológicos, electrolitos, etc.).
- Inyectables: medicamentos para aplicación intravenosa, subcutánea, intramuscular o
intradérmica.
- Medicamentos tópicos : ungüentos oftálmicos y otros.
- En caso de materia prima o productos sin envasar se debe sembrar por lo menos 5 ml en
cada medio de cultivo.
- En los productos envasados, si el volumen del recipiente es de 20 a 100 ml se deben
sembrar 5 ml. Si el recipiente es menor de 20 ml se siembran cantidades que oscilen entre 1
a 5 ml.
- Si el recipiente es de 1 ml o menos, se debe inocular todo el volumen del recipiente en el
medio de cultivo.
- Siembra: con pipeta estéril de 1, 5 ó 10 ml y según el volumen del inóculo, sembrar los dos
tubos de caldo Tioglicolato y los dos tuobos de caldo Tripticasa soya.
- Un tubo de Tioglicolato y uno de caldo Tripticasa soya se incuban a temperatura de 35± 1ºC.
- Los otros dos tubos se incuban a temperatura ambiente o a 22ºC.
- Los tubos se dejan en incubación por 8 días con observaciones diarias para detectar posible
crecimiento bacteriano.
73

- En ocasiones el producto al ser inoculado en los medios líquidos, produce un ligero
enturbiamiento que impide ver el crecimiento bacteriano, en estos casos se hacen
subcultivos en caldo Tioglicolato y caldo Tripticasa soya al tercer día con inóculos no
mayores de 1 ml.
- Tanto el cultivo original como el subcultivo se observan por 8 días.
Medicamentos no estériles:
Muchos medicamentos o drogas no son estériles, pero la cantidad y clase de microorganismos
que se aíslan, determinan tanto la calidad de la materia prima como las condiciones sanitarias en
que se procesó el producto. Por ello se hace necesario la investigación de los microorganismos
contaminantes.
Las siguientes presentaciones se analizan así:
Tabletas y grageas: Se pulverizan en mortero estéril y se toma un gramo de polvo, que se
inocula en el medio líquido. Si el resultado de este primer paso muestra contaminación se hace
recuento.
Recuento Total:
- Hacer dilución 10-1 (1 g. más 9 ml de agua peptonada al 0.1% estéril).
- A partir de esta primera dilución preparar diluciones 10-2 y 10-3.
- Sembrar por duplicado en Agar Tripticasa soya, 0.1 ml de las diluciones correspondientes o
por método en profundidad 1 ml de cada dilución, en las cajas de pertri vacías y el medio
previamente fundido.
- Incubar a 35±1ºC por 48 horas.
Recuento de Mohos y Levaduras:

- Sembrar por duplicado cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3), método en superficie 0.1
ml o método en profundidad 1 ml en Agar Saboureaud.
- Incubar 20-28ºC por 8 días.
Anaerobios Sulfito-reductores:
- 3 ml del medio Agar Sulfito-hierro-polimixina (S-Fe-px), licuado (45-50ºC) se agregan al
tubo que contiene 1 ml de la dilución más concentrada.
- Se enfría en agua para que solidifique, luego se agrega más medio de tal manera que se
llegue a una altura de 100 mm en tubos tapa rosca de 150 mm de largo.
- Incubar en anaerobiosis a 35ºC por 7 días.
Anaerobios Totales:
- Sembrar a partir del caldo Tioglicolato 0.1ml en Agar sangre.
- Incubar en anaerobiosis a 35ºC por 24 a 48 horas.
Identificación de Salmonella:
- Adicionar 1 g. o 1ml de muestra a un tubo con 9 ml de Caldo lactosado.
- Incubar a 35ºC por 24 horas.
- Tomar de este tubo 1 ml y sembrar en caldo Selenito y caldo Tetrationato.
- Incubar 35ºC por 24 horas.
- Sembrar de los tubos anteriores en Agar SS Y EN Agar XLD.
74

Investigación de Enterobacterias:
- Del caldo lactosado previamente sembrado para identificación de Salmonella, tomar 0.1 ml y
sembrar en Agar EMB.
- Si es necesario, realizar la identificación respectiva.
Identificación de Pseudomona y Staphylococcus aureus.

- A partir del caldo Tioglicolato previamente incubado, sembrar 0.1 ml en Agar Cetrimide.
- Si hay crecimiento hacer las bioquímicas respectivas para la confirmación de
Pseudomaonas.
- A partir del caldo Tioglicolato previamente incubado, sembrar 0.1 ml en Agar Baird-Parker.
- Incubar 35ºC por 24 a 48 horas.
- Si hay crecimiento hacer las pruebas correspondientes para la identificación de
Staphylococcus aureus.
POST-LABORATORIO
- Según los resultados obtenidos, diga si el producto analizado es rechazado o aceptado.
- Según la categoría de los medicamentos ¿Qué requerimientos a nivel microbiano exigen?
- Qué sugerencias daría Ud. a la industria productora de medicamentos para evitar la
contaminación de los productos?
- En un cuadro mencione los diferentes conservantes utilizados para los medicamentos no
estériles.
AUTOEVALUACION
- De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y a su responsabilidad
califíquese en una escala de uno a cinco
BIBLIOGRAFÍA
Normas técnicas de calidad. Guía de análisis. INVIMA 2002.
The United States Pharmacopea XXXIV Edition 2000
Pyrogens, Prueba LAL. Frederick C. Pearson. 1990.
Parenteral Quality Control. Michael J. Ackers. 1985.
Pharmaceutical Microbiology. W. B. Hugo, D. Russel. 1985.
Vélez M.T., Cuadrado Cano B. 2005. Control microbiológico a medicamentos, cosméticos y
desinfectantes. Editorial Universitaria. Universidad de Cartagena. Cartagena. Colombia.
Evaluación de la calidad de los productos farmacéuticos. Bedoya A., Flórez O. Holguín G.
2011
Análisis químicos farmacéuticos de medicamentos / prefacio de Ives Cohen ; coordinador
Dominique Pradeau ; colaboraron en la traduccin lisy Gºmez de Segura y María del Carmen Elia
Zepeda Alcántara. México : Uteha, Noriega Editores, 2001.
75

PRÁCTICA. 15.
DETERMINACIÓN DE
ENDOTOXINAS
OBJETIVOS:
- Definir la endotoxinas y su importancia en medicamentos.

- Explicar los métodos para la determinación de las endotoxinas bacterianas en
medicamentos.
- Aplicar la prueba invitro, Método Limulus Amebocyte Lysate ó L.A.L.
MARCO TEÓRICO
Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS) o lipoproteínas complejas del tipo endotoxinas
bacterianas, su tamaño varía entre 1 y 50 micras, son solubles en agua, no volátiles y muchas
resisten sin destruirse las temperaturas de autoclave. Son destruídas por oxidación a
temperaturas de 170ºC a calor seco durante 3 horas. La reacción que producen puede tener
consecuencias fatales, sobre todo en pacientes delicados ya que la fiebre puede llegar a 40ºc ó
más.
El objetivo de la prueba es detectar endotoxinas de origen bacteriano que puedan encontrarse
en medicamentos de uso parenteral.
PRELABORATORIO
- Mencione los métodos para realizar el ensayo in Vitro con L.A.L. y su fundamento.
- ¿Qué recomendaciones se deben tener en cuenta para el desarrollo de estas pruebas?
- ¿Cuáles son las posibles fuentes de contaminación con endotoxinas?
MATERIALES
- Baño termostatado a 37°C +-1ºC.
- Agitador Vortex
- Pipetas graduadas de 10, 5 y 1 Ml (puntas de 1ml)
- Tubos apirógenos
- Micropipeta
- Puntas (0,25ul)
- Papel Parafilm
- Reactivo de LAL
- Control estándar de Endotoxina
- Agua apirogénica
PROCEDIMIENTO
- Preparar el agua control positivo con la endotoxinas, siguiendo las indicaciones
del fabricante, hasta alcanzar una concentración final de 0.05 microgramos /ml. La
pérdida de actividad se detecta en la falta de reacción en el agua control positivo.
- Preparar la muestra control positivo de tal manera que también contenga 0.05
µg/ml de endotoxinas. La pérdida de actividad de la endotoxinas se determina por
la ausencia de reacción con el lisado en la MUESTRA CONTROL POSITIVO.
76

- Preparar el reactivo L.A.L. y dispensar el lisado reconstituído en cantidades de 0.1

ml en tubos estériles y libres de pirógenos, taparlos y refrigerarlos a 10ºC hasta su
uso. Si adquiere una apariencia granulosa o pulverulenta, descartarlos. La pérdida
de actividad se detecta en la falta de reacción en el agua control positivo.
- Colocar al baño María a 37 ºC o estufa, tres tubos para realizar la prueba marcados:
agua control positivo, agua control negativo y muestra control positivo, cada una con
0.1 ml de L.A.L.
- Dispensar 0.1 ml de agua control positivo, 0.1 ml de muestra control positivo y 0.1 ml
de agua estéril U.S.P. a los tubos correspondientes.
- Incubar a 37ºC por 15 minutos y observar la gelificación de cada tubo, invirtiéndolo
suavemente unos pocos grados. Si el gel está firme, invertir hasta 180ºC o hasta
que el gel comience a perder su forma. El gel que mantenga su forma es
considerado gel firme. La lectura es inmediata por que el gel no perdura (Ver figura).
Figura. Lectura del gel
- Comparar los resultados obtenidos en cada tubo; si son los esperados, puede
iniciarse la prueba con la solución problema. Si los controles positivos no han
gelificado a los 15 minutos deben observarse 5 y 10 minutos después y realizar las
correcciones del caso.
- El ensayo es válido solamente si el control negativo es negativo, si se ha confirmado
el título de L.A.L. con la serie de estándares y si el control positivo es positivo.
- Análisis de la muestra: Dispensar 0.1 ml de muestra preparada en un tubo con
L.A.L. y mezclar suavemente.
- Asépticamente dispensar 0.1 ml de agua control positivo y 0.1 ml de agua U.S.P. en
sendos tubos con L.A.L.., son los controles de agua positivo y negativo.
- Incubar por 60 minutos a 37ºC y observar gelificación.
- El resultado es positivo cuando se forma un gel firme demostrable con la inversión
del tubo a 180 ºC (ver Figura). Es negativo aquel que no forma gelificación o que
está tan débil que no se mantiene cuando el tubo se invierte cuidadosamente a
180ºC.
77

AUTOEVALUACION
BIBLIOGRAFÍA

Vélez M.T., Cuadrado Cano B. 2005. Control microbiológico a medicamentos, cosméticos y
desinfectantes. Editorial Universitaria. Universidad de Cartagena. Cartagena. Colombia.
Análisis químicos farmacéuticos de medicamentos / prefacio de Ives Cohen ; coordinador
Dominique Pradeau ; colaboraron en la traduccin lisy Gºmez de Segura y María del Carmen Elia
Zepeda Alcántara.México : Uteha, Noriega Editores, 2001.
78

PRÁCTICA 16.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE INSUMOS MÉDICOS
OBJETIVOS
 Detectar contaminaciones microbianas en los diferentes insumos médicos.

 Determinar las características sanitarias de insumos médicos durante la fabricación,
empaque, almacenamiento y distribución.
 Conocer los diferentes tipos de insumos médicos.
MARCO TEÓRICO
Consideramos una gran variedad de elementos usados en medicina ya sea, para aplicar en los
tejidos de un paciente, o para introducir sustancias dentro de los tejidos. Al primer grupo
pertenecen sedas quirúrgicas, sondas y algunas prótesis. El segundo grupo lo componen:
jeringas, agujas hipodérmicas, catéteres, equipos de venoclisis, etc. Todos ellos necesariamente
deben ser estériles, y estar empacados en forma tal, que las maniobras propias para extraerlos
de su envase puedan efectuarse sin contaminarlos.
La presencia de microorganismos en estos productos, indica anormalidades en la elaboración y
procesos de esterilización o alteraciones en el empaque que permiten la entrada de aire.
MATERIAL MÉDICO QUIRÚRGICO

MATERIALES DE CURACIÓN Algodón, gasa, bandas adhesivas y de yeso,
suturas absorbibles y no absorbibles,
esparadrapo y microporos.
VARIOS Agujas hipodérmicas, jeringas, equipo de
venoclisis, sondas, equipos pericraneales,
condones, tampones y toallas higiénicas.
DISPOSITIVOS MÉDICOS Prótesis, lentes de contacto, dispositivos
intrauterinos, equipos ortopédicos,
marcapasos.
Fuente:Normas tácnicas de calidad. Ministerio de Salud. Instituto Nacional de Salud. 1994.
PRELABORATORIO
- En un cuadro establezca la clasificación del material médico-quirúrgico.
- ¿Qué se entiende por producto farmacéutico fraudulento?
- Un producto farmacéutico alterado es aquel que….
MATERIALES
Frascostaparoscacadaunocon90mldeCaldoNutritivo(DAB7MERCK): Composición g/l Peptona
de carne: 10. g.
Extracto de carne 5 g.
Hidrógeno fosfato disódico 2.0 g.
Cloruro sódico 3.0 g.
Disolver 20 g. por litro.
79

Tubos de 150 x 18 mm, tapa rosca, con 10 ml de Caldo Tioglicolato estéril.

Tubos de 150 x 18 mm, tapa rosca con 10 ml de Caldo Tripticasa soya.
Micropipeta de 1 mL
Micropiopeta de 100 µL
Caja de Puntas de plástico de 1 mL, estéril
Caja de puntas de plástico para 100 µL, estéril
PROCEDIMIENTO
- Se toman los recipientes (generalmente plásticos) y con tijeras estériles se hace una
abertura suficiente para dejar salir el producto.
- Se toma el producto con pinzas estériles y se introduce al recipiente con medio de
cultivo.
- El cultivo se incuba a 35± 1 ºC por tres días.
- Después de agitar el medio para que impregne bien el producto, se toman muestras de 1
ml y se inoculan en caldo Tioglicolato, 2 tubos.
- Se inoculan 2 tubos con caldo Tripticasa soya.
- Un tubo de cada medio se deja en incubación a 35 ºC durante 8 días y los otros a
temperatura ambiente o estufa a 22ºC por 8 días.
- El recipiente inicial también se reincuba por el mismo tiempo a 35 ºC.
- Guardar las más estrictas medidas de asepsia al tomar las muestras del recipiente
inicial.
- Cualquier contaminación sobreagregada durante las diferentes maniobras, falsean los
resultados y desconciertan al operador.
- Vencido el tiempo de incubación, tanto la muestra inicial como los subcultivos deben
demostrar una total esterilidad.
POSLABORATORIO
- Hable sobre la prueba de pirógenos.
- Hable sobre la prueba de pirógenos por el método del L.A.L.
AUTOEVALUACION
- De acuerdo a su interés, a sus conocimientos y a su responsabilidad
califíquese en una escala de uno a cinco
BIBLIOGRAFÍA

80

PRÁCTICA 15.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE COSMÉTICOS
OBJETIVOS
 Analizar los productos cosméticos, que por su gran difusión, han creado problemas de
diferente índole dentro de la población.
 Identificar problemas de contaminación microbiana en cosméticos, que pueden
desencadenar procesos infecciosos en piel y mucosas.
 Realizar los análisis microbiológicos necesarios para detectar la presencia de bacterias y
hongos en los cosméticos, microorganismos que frecuentemente colonizan estos productos.
MARCO TEÓRICO
Los productos cosméticos deben cumplir con los estándares de calidad de empaque,
composición microbiológica y características físico-químicas. Se hace necesario el análisis de
estos productos por su gran difusión, que han creado problemas dentro de la población.
Los productos de higiene personal, cosméticos y perfumes deben ser seguros bajo las
condiciones normales o previsibles de uso.
Es de fundamental importancia fijar los parámetros de control microbiológico a fin de asegurar la
calidad higiénica de los productos de higiene personal, cosméticos y perfumes.
Cosmético: Se entenderá por producto cosmético toda sustancia o formulación de aplicación

local a ser usada en las diversas partes superficiales del cuerpo humano: epidermis, sistema
piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos o en los dientes y las mucosas
bucales, con el fin de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto y protegerlos o mantenerlos
en buen estado y prevenir o corregir los olores corporales.
Calidad: Es el conjunto de propiedades de una materia prima, de un material o de un producto

que determinan la identidad, concentración, pureza y seguridad de uso del producto cosmético.
CLASIFICACIÓN DE LOS COSMÉTICOS
1. Cosméticos para niños

2. Para el área de los ojos
3. Para la piel
4. Para los labios
5. Para el aseo e higiene personal
6. Desodorantes y antitranspirantes
7. Cosméticos capilares
8. Cosméticos para las uñas.Cosméticos de perfumería.
9. Productos para higiene bucal y dental.
10. Productos para y después del afeitado.
11. Productos para bronceado, protección solar y autobronceadores.
12. Depilatorios.
13. Productos para el blanqueo de la piel.
81

PRELABORATORIO
- Mencione la alteración o alteraciones de los productos cosméticos por la acción microbiana.

- ¿Qué factores afectan el recuento en los productos cosméticos?
- ¿Cuál es el destino de los microorganismos en un cosmético?
- Qué es el Caldo Modificado de Letheen, para qué se usa y cómo está constituido?
- Mediante un cuadro, determine las diferentes clases de productos cosméticos.
- Qué tipo de sustancias conservantes pueden ser añadidas a los cosméticos?.
MATERIALES
Fiolas o frascos tapa rosca con 90 ml de agua peptonada 0.1% estéril

Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptonada al 0.1% estéril
Mortero con pistilo
Agar Plate-Count fundido listo para servir en clase
2,3,5, Trifenil tetrazolio al 1% (estéril)
Agar Sabouraud glucosa al 4%, fundido listo para servir en clase

Tubos con 9 ml de Caldo Letheen, estériles
Tubos con 9 ml de Caldo lactosado estériles
Cajas con Agar EMB
Cajas con Agar Baird Parker
Cajas con Agar Cetrimide
Cajas de petri vacías y estériles
Alcohol al 70%
Miristato de isopropilo al 1 % estéril o aceite mineral estéril
Tween 80
Micropipeta de 1 mL
Micropiopeta de 100 µL
Caja de Puntas de plástico de 1 mL, estéril
Caja de puntas de plástico para 100 µL, estéril
Solución salina
Xilol
Coloración de Gram
Aceite de inmersión
Microscopios
PROCEDIMIENTO
Manejo de la muestra
- Analizar las muestras tan pronto lleguen al laboratorio, si no es posible, mantenerlas a
temperatura ambiente. (No las coloque enincubación, ni refrigeración ni congelación).
- Inspeccionar los envases antes de abrirlos para anotar las irregularidades.
- Desinfectar la superficie externa del envase con alcohol al 70% y secarlo con gasa estéril
antes de abrirlo.
82

Preparación de la muestra
a) Líquidos: No se requiere una preparación especial, se toman 10 ml o 10 g. del producto

y se agregan a un frasco que contiene 90 ml de solución diluyente (agua peptonada al
0.1% estéril) para quedar así una dilución 10-1
b) Sólidos y polvos: Asépticamente pesar 10 g. del producto en morteros estériles,
agregar lentamente el producto a 90 ml de solución diluyente estéril hasta obtener una
buena homogenización.
c) Cremas y productos con base aceitosa: Asépticamente tomar 10 g. del producto en
mortero estéril, agrgar 10 ml de aceite mineral estéril, mezclar y adicionar 1 ml de tween
80, mezclar hasta obtener una pasta.
Para 10 ml del producto agregar 40 ó 50ml. del solvente (miristato deisopropilo al1% y
obtener una buena homogenización.
A partir del homogenizado hacer diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 etc., usando la solución
diluyente.
Soluciones diluyentes
1. Agua peptonada al 0.1%.

2. Caldo Letheen modificado
3. Solución diluyente (SD)
- Preparación de la solución diluyente:
- En un frasco Schott de 100 ml adicionar:
- Peptona .................................................... 0.1 g.
- Tween 80 (polisorbato) ............................ 1.0 g.
- Agua destilada........................................... 90 ml
- Solución Stock de tampón de fosfatos ....... 0.15 ml
- Perlas de vidrio (para homogenizar) ………. 6-8 unidades
Preparación de la Solución Stock ó Tampón de Fosfatos

- Disolver 34 g. de Fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada (en un
volumétrico de 1000 ml).
- Ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1N.
- Completar a volumen con agua destilada.
- Esterilizar la solución en autoclave a 121º durante 15 minutos y conservar en el
refrigerador hasta su uso.
- El pH final después de la esterilización debe ser de 7.0 ± 0.1 (USP 24 p. 1814)
d) Aerosoles (polvos, líquidos etc.)

Desinfectar el orificio de salida, expeler una cantidad apropiada en el frasco de dilución,
generalmente lleno hasta la mitad con agua peptonada.
En algunos compuestos es necesario utilizar miristato de isopropilo al 1% como diluyente
para obtener una buena homogenización de las grasas.
83

Recuento Total de bacterias mesófilas
- Una vez preparada la muestra, realizar diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 ; luego tomar 1
ml de cada dilución y sembrar en profundidad con pipeta estéril por duplicado,
en cajas de petri de 100x15 mm.
- Agregar de 15 a 20 ml de medio Tripticasa soya o agar Plate-count con previa
adición de 1.0 ml por cada 100 ml de medio de: 2.3.5, Trifenil tetrazolio al 1%,
cuando este se encuentra entre 45 y 50º, mezclar muy bien hasta homogenizar.
- Mezclar muy bien la muestra con el medio de cultivo, mediante rotación de las
cajas de petri; dejar solidificar y llevar a incubar de 35 a 37ºC, con las cajas
invertidas por 24-48 horas.
Recuento de Mohos y Levaduras
Utilizar diluciones 10-1 y 10-2 y adicionar medio Agar Sabouraud Glucosa al 4% e incubar
a temperatura de 22-25ºC por 5-7 días.
Recuento de anaerobios
Se realizan de las diluciones 10-1 y 10-2 en Agar Tripticasa soya o Agar Plate-count y se
incuban a 35-37ºC en campana de anaerobiosis. También se puede realizar en caldo
Tioglicolato y se incuba de 35-37ºC por 7días.
Determinación de Escherichia coli
Se realiza dilución 10-1 en caldo lactosado, se incuba a 35-37ºC por 24-48 horas y se
repica en medio EMB, Endo, Mac Conkey, etc.
Determinación de Staphylococcus aureus y Pseudomona aeruginosa
Realizar enriquecimiento en caldo Casoy o caldo Letheen con dilución 10 -1, incubando
por 24 horas a 35-37ºC.
Realizar repique con asa en medios de Vogel Johnsons o baird Parker para
Staphylococcus y Cetrimide para Pseudomonas, incubar a 35-37ºC por 24 horas
RESULTADOS
Una vez terminada la incubación, se observa el crecimiento que existe y se cuentan las 2 cajas
de petri, de cada dilución que se encuentre entre 30-300 colonias, se hace identificación de los
microorganismos.
Se observa el crecimiento en los caldos, se hacen las resiembras respectivas y se determinan

los microorganismos identificando si son patógenos o saprófitos.
84

Interpretación de resultados
La presencia de microorganismos patógenos o la presencia de Enterobacterias RECHAZAN el

producto.
La presencia de saprófitos con un conteo superior a 10-3 colonias por gramo o mlilitro del
producto puro, RECHAZA el producto.
POSLABORATORIO
¿Cómo se clasifican las materias primas según el riesgo microbiológico?
AUTOEVALUACION
BIBLIOGRAFIA
Normas técnicas de calidad. Guía de análisis INVIMA 2002.
The united States Pharmacopea XXXIV Edition 2000
Pharmaceutical microbiology. W.B. Hugo. Russel. 1990.
Control de Calidad de Cosméticos. Memorias. López M. Teresa de Jesús. 2002.
Ciencia ytecnología decosméticos. Gershon, Eduard, Sagarin S. Strianse.
Control microbiológico a medicamentos, cosméticos y desinfectantes / autores, María Teresa
Vélez de López, Bernarda Cuadrado Cano. Cartagena de Indias : Universidad de Cartagena,
2005 .
Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. US Food Drug Administration
Second Edition. 2012.
The United States Pharmacopea XXVI Edition.2007.
Buenas Prácticas de Manufactura Cosmética (BPMC). 2002.
Decisión 516 Armonización de Legislaciones de Cosméticos del Pacto A. 2002
OMS. Buenas Prácticas de Manufactura. Informe 32
85

ANEXOS
86

Campylobacter
INTRODUCCION
Campylobacter es la bacteria más frecuente como causa de enfermedad diarreica transmitida
por alimentos en los Estados Unidos. Los casos ocurren como acontecimientos aislados,
esporádicos, no como brotes. Los síntomas son diarrea, dolor abdominal, y fiebre en el plazo de
2 a 5 días después de la exposición al organismo. La diarrea puede ser sangrienta y ser
acompañada náusea y vomito. La enfermedad dura típicamente 1 semana; ocurre mucho más
con frecuencia en los meses del verano que en el invierno. El organismo se aísla de infantes y
adultos jóvenes más con frecuencia que de otras categorías de edad y en los hombres con
frecuencia que en las mujeres.
Aunque Campylobacter no causa comúnmente muerte, se ha estimado que aproximadamente
100 personas con infecciones del Campylobacter pueden morir cada año. Campylobacter es una
bacteria Gram (-), microaerofila, tiene flagelo polar lo que la hace motíl, bacilo delgado y corto
curveado. La especie más comúnmente aislada es C. jejuni, el cual causa gastroenteritis. Los
seres humanos adquieren los organismos comiendo pollo mal cocido o consumiendo leche o
agua contaminadas con la bacteria. Las especies Campylobacter son altamente contagiosas. La
dosis contagiosa de C. jejuni se extiende a partir del 500 a 10.000 células. Se encuentran
principalmente en el intestino de una amplia variedad de animales salvajes y domésticos,
especialmente pájaros. Pueden establecer un estado asintomático temporal del portador, así
como enfermedad, en seres humanos.
PRINCIPIO
El método de detección y aislamiento de Campylobacter sp a partir de alimentos incluye
preenriquecimiento y enriquecimiento. El montaje requiere incubación en CO2 o microaerobiosis
para obtener resultados óptimos.
Campylobacter sp es bacilo pequeño curvado, movilidad característica, Gram (-), Oxidasa (+),
Catalasa (+), Glucosa (-), Sacarosa (-), producción de gas (-).
APLICACIÓN
Campylobacter se puede encontrar en leche, carnes, aves de corral, crustáceos, frutas, y
Alimentos no pasteurizados.
PROCEDIMIENTO
- Tomar 25 g (ml) de muestra y adicionar 100 ml de Caldo Bolton * con suplemento.
- Mezclar 5 minutos en Shaker a 50 rpm.
- Introducir las fiolas de muestras + caldo Bolton con suplemento, a una cámara de
anaerobiosis junto con un generador de microaerofilia.
PREENRIQUECIMIENTO:
- 4 horas de preenriquecimiento, si se conoce el tiempo de producción de la muestra o el
tiempo de contaminación, ósilamuestra se produce diariamenteincubar a37°C en
condiciones de microaerofilia en cámara de anaerobiosis.
- 5 horas de preenriquecimiento, si la muestra ha sido refrigerada por un periodo no mayor
a 10 días. Incubar a 30°C por 3 horas y luego pasar a 37°C por 2 horas bajos
condiciones de microaerofilia en cámara de anaerobiosis.
87

ENRIQUECIMIENTO:
- Desplazar el preenriquecimiento a la incubadora de 42°C e incube durante 24 – 48
horas
- Después del periodo de incubación sembrar por aislamiento en Agar Karmali con
suplemento** e incubar las cajas a 42°C por 24 – 48 horas en condiciones de
microaerofilia en cámara de anaerobiosis.
LECTURAS
Las colonias típicas son irregulares, blanco-rosa pálidas, pegajosas, planas y húmedas, con
tendencia a extenderse.
Confirmar colonias con reacciones bioquímicas. Se debe realizar tinción de gram de las colonias
sospechosas, y en caso de observar bacilos curvos gram negativos muy delgados, se debe
realizar un pase para obtener un cultivo puro.
Una vez se obtenga el cultivo puro, es recomendable sembrar la colonia en agar sangre o
Mueller Hinton en condiciones de microaerofilia, debido a que colonias crecidas en agares con
Carbón (Ej, Karmali) pueden presentar una reacción de oxidasa negativa falsa.
- Oxidasa positivo
- Catalasa positivo
- Sensible al Acido Nalixidico
- Resistente a Cefalotina
* Caldo Bolton
Fórmula g/litro
Peptona de Carne 10
Lactalbumina hidrolisato 5.0
Extracto de Levadura 5.0
Cloruro de Sodio 5.0
Acido Alfa cetoglutárico 1.0
Piruvato de Sodio 0.5
Metabisulfito de Sodio 0.5
Carbonato de Sodio 0.6
Hemina 0.01
pH 7.4 ± 0.2
* Bolton Caldo Suplemento Selectivo

Cefoperazona 10.0mg
Vancomicina 10.0mg
Trimetropin. 10.0mg
Cicloheximida 25.0mg
Cada vial contiene para un volumen de 500 mL
**Karmali - Campylobacter Agar Base

Formula g/litro
Base Agar 39.0
88

Carbón Activado 4.0

Hemina 0.032
Final pH 7.4 ± 0.2
**Karmali - Campylobacter Suplemento Selectivo

Sodium pyruvate 50 mg por vial 100 mg por litro
Cefoperazone 16 mg por vial 32 mg por litro
Vancomycin 10 mg por vial 20 mg por litro
Cycloheximide 50 mg por vial 100 mg por litro
Cada vial contiene para un volumen de 500 mL
Fuente: Identificación de Microorganismos. 2007. Universidad de los Andes. LEMA.
89

ANTIBIÓTICOS
Son medicamentos de gran consumo, con características propias de inestabilidad, pérdida de
actividad entre otras, requieren controles que aseguren su eficacia al ser usados. Dentro de las
pruebas biológicas y microbiológicas están la prueba de inocuidad y la de actividad
antimicrobiana o potencia.
1. Prueba de inocuidad: Tiene como objetivo alguna acción nociva o tóxica del antibiótico.
Se hace en ratones que inoculados con el producto muestren la presencia de síntomas o
signos durante el período de observación, lo que indicará falta de inocuidad del
producto.
Prueba: ratones blancos saludables con peso entre 18 a 25 g., que no hayan sido
utilizados en otro estudio. Durante la prueba los ratones serán controlados diariamente y
dar la alimentación y agua con la que venían siendo alimentados.
Cada antibiótico debe diluirse con la solución y concentración establecida.
Con jeringa estéril y aguja estéril inocular grupos de ratones en número no menor a
cinco por cada antibiótico de prueba, usando la vía correspondiente (oral ó intravenosa).
Observar los animales durante 48 horas, si no hay muertes en este tiempo, la prueba es
satisfactoria. Si ocurre alguna muerte debe repetirse la prueba en otros 5 ratones y la
prueba es satisfactoria si las muertes no sobrepasan el 10% de todos los animales
inoculados, contando la primera prueba.
2. Actividad antimicrobiana:
Los antibióticos tienden a perder su actividad antimicrobiana, tienen fecha de
vencimiento y un mal almacenamiento o mala elaboración hacen que la actividad se
pierda muy pronto y por eso es indispensable detectar su actividad o potencia.
La potencia es expresada en microgramos o unidades de antibiótico que causan la
muerte a un microorganismo de prueba.
Se determina por las técnicas :
1. Dilución en tubos.
2. Difusión en agar
3. Técnica de discos
1. Técnica de dilución en tubos: Se determina la menor cantidad de antibiótico
requerido para inhibir el crecimiento de un microorganismo in vitro o
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Se basa en enfrentar concentraciones
crecientes de un antibiótico a un medio de cultivo inoculado con el organismo de
prueba. Después de la incubación se determina la concentración de la droga que
inhibió el crecimiento observando los tubos. Es recomendable determinar el
porcentaje de T o absorbancia en un espectrofotómetro en cuyo caso debe
realizarse una curva estándar, representando gráficamente los valores de
absorbancia frente a las concentraciones de los distintos niveles de estándar. La
inhibición del crecimiento producida en la muestra es comparada por la producida
por el estándar, así la cantidad de antibiótico en una muestra puede ser
determinada.
2. Técnica de cilindro y difusión en placa:
La inhibición del crecimiento se mide por el tamaño de la zona de inhibición.
90

Se prepara la suspensión del microorganismo a partir de una cepa mantenida en un

tubo inclinado en refrigeración y reactivada por resiembra e incubación a 32-35°C
por 24 horas.
Estandarizar la suspensión: factor de dilución de la suspensión con T de 25% , A
una longitud de onda de 580 nm, tubo de 13 mm de diámetro y S.S. como blanco.
Inoculación dela placa: seleccionar el medio, 21 ml y el medio semilla de 4 ml. Para

preparar el medio semilla tomar cantidades según corresponda , mezclar con el agar
licuado y verter sobre la caja de petri. Una vez solidificado colocar cilindros de
porcelana o acero inoxidable en número de 6 por caja.
Para cada producto existen los solventes, concentración y tiempo de
almacenamiento de la solución stock.
Preparación de las diluciones del patrón:

SOLUCIÓN GENTAMICINA SULFATO
• Pesar 10 mg del estándar y llevar a un volumen

de 100 mL en fiola aforada, con el buffer de pH 8.0
• 1 mL de esta solución contiene: 0.1 mg de estándar
Preparación de la solución de referencia:

• De la solución anterior tomar 1 mL (100 µg) y llevar
a fiola de 100 mL con buffer de pH 8.0
• 1 mL de esta solución contiene 1 µg de estándar
SOLUCIÓN ESTANDAR PARA CURVA PATRÓN
• Marcar 5 fiolas de 100 mL con las letras: L1, L2, L3, L4 y L5

• A la fiola L1 adicionarle 1 mL de la Solución de Referencia
• A la fiola L2 adicionarle 5 mL de la solución de Referencia
• Llevar a volumen de 100 mL con la solución buffer y mezclar.
91

VALORACIÓN DE ANTIBIÓTICOS POR MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Definición
Las valoraciones microbiológicas son un caso particular de valoración biológica. Como tal,
consisten en cuantificar la potencia o actividad de una sustancia activa determinada comparando
las concentraciones de una muestra y de una preparación patrón o de referencia que producen
el mismo efecto, obteniéndose así una potencia relativa cuantitativa.
En el caso de las valoraciones microbiológicas de los antibióticos (antimicrobianos de uso
clínico), la determinación de su potencia (actividad) se basa en la comparación cuantitativa de la
inhibición del crecimiento de un microorganismo de ensayo en un medio adecuado, producida
por al menos dos preparaciones, una de las cuales es el patrón. El microorganismo de ensayo
debe ser susceptible al antibiótico a valorar y el medio de cultivo permitir un crecimiento rápido y
abundante en ausencia del antibiótico.
Cuándo usar un método microbiológico para cuantificar un antibiótico:

Las valoraciones por métodos microbiológicos están indicadas cuando así lo especifican las
Farmacopeas o cuando es el único método aplicable, debido a la naturaleza química del
antibiótico o a que la misma es desconocida. Dado que el método microbiológico determina la
potencia (actividad) a través de la medición de la inhibición del crecimiento y no de propiedades
físicas o estructuras químicas, no resulta indispensable conocer su composición. Si nos
remontamos al descubrimiento de la penicilina por Fleming en el 1928, veremos que la actividad
de la penicilina fue descubierta antes que se conociera su estructura química.
Por otra parte, muchos antibióticos pueden cuantificarse por otros métodos, físicos o químicos,
pero aún en estos casos el método microbiológico puede constituir una alternativa de elección
por su elevada sensibilidad y especificidad y/o por las características del laboratorio analítico.
Las muestras que pueden ser analizadas por métodos microbiológicos incluyen sustancias
activas puras y productos compuestos, ya sea medicamentos, muestras clínicas, extractos
naturales, etc., constituidos por mezclas de sustancias relacionadas químicamente pero que
difieren cuali y cuantitativamente en sus efectos biológicos o por mezclas de sustancias no
relacionadas químicamente pero que tienen actividad biológica.
Propósito:
Las valoraciones microbiológicas se pueden utilizar para distintos propósitos: investigación y
desarrollo de nuevas sustancias activas, seguimiento de procesos fermentativos de producción
de antibióticos, ensayos de biodisponibilidad en fluidos corporales y control de calidad de
materias primas y productos finales. Las características de los ensayos microbiológicos
dependerán de estos propósitos. Así, en estudios de biodisponibilidad es necesario emplear
ensayos microbiológicos muy sensibles, ya que la concentración de la sustancia activa en los
fluidos corporales es muy baja, mientras que, cuando hay que determinar el tiempo de cosecha
en un proceso fermentativo el método deberá producir resultados rápidos, y no necesariamente
ser muy sensible ya que las concentraciones de antibióticos son relativamente altas. Los
ensayos microbiológicos usados en el control de calidad de antibióticos deberán ser
fundamentalmente precisos y, eventualmente, rápidos y/o sensibles.
92
Técnica en placas:
Brevemente, diremos que un volumen medido de una suspensión estandarizada del
microorganismo de ensayo se inocula en el medio de cultivo adecuado, previamente fundido y
enfriado a una temperatura compatible con la viabilidad microbiana (42º-45ºC). Luego de
homogeneizar el medio inoculado, por agitación, se vuelcan volúmenes medidos en placas de
Petri que pueden contener o no una base de medio sin inocular ya gelificado.
Una vez gelificado el medio inoculado, se insertan los reservorios para las soluciones de patrón y
muestra. Estos reservorios pueden ser de diferente tipo: cilindros de acero inoxidable de 8 mm
de diámetro externo y 6mm de diámetro interno, aisladores de porcelana, papeles de filtro, o
simplemente perforaciones circulares realizadas en el medio con un sacabocados. Luego, se
colocan las soluciones de trabajo del patrón y las soluciones de la muestra en los reservorios, a
razón de una en cada reservorio. La cantidad de reservorios por placa, de soluciones del patrón
y de la muestra y la distribución de cada uno dependerán del diseño del ensayo microbiológico.
Más adelante aclararemos este punto. Finalmente, las placas se llevan a incubar en las
condiciones establecidas y, al finalizar el período de incubación se registra el tamaño de los
halos de inhibición que se observan alrededor de cada reservorio.
BIBLIOGRAFÍA
Cerra H, Fernández M, Horak C, Lagomarsino M, Torno G, Zarankin E. Manual de Microbiología
aplicada a las Industrias Farmacéutica, Cosmética y de Productos Médicos. Buenos Aires,
Argentina, 2013
Vélez M, Cuadrado B. Control microbiológico a medicamentos, cosméticos y desinfectantes.
Universidad de Cartagena. 2005.
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46341958000100001#cuadro1
93
94
91

Guía de Laboratorio Control Microbiológico

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Guía de Laboratorio Control Microbiológico

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

GUÍA DE LABORATORIO

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS INDUSTRIALES, BIOLÓGICOS E INSUMOS PARA LA

Bogotá, Enero de 2019

UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

La Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, dentro de una perspectiva humanística, le

El componente temático denominado “Control microbiológico de productos industriales,

 Utilizar siempre ELEMENTOS DE BARRERA apropiados, según necesidades: blusa,

 Salpicaduras abundantes o que contienen vidrios quebrados u objetos agudos, deben

NORMAS DE BIOSEGURIDAD ESPECÌFICAS EN EL LABORATORIO

Además de las normas universales y descritas, aplicables en el laboratorio, se estipulan las

PRECAUCIONES EN EL ÁREA DE MICROBIOLOGÍA

1. Aplican las normas específicas y universales de bioseguridad en el laboratorio.

1. Todos los materiales usados en el laboratorio deberán ser adecuadamente decontaminados.

ANÁLISIS DE AIRE, SUPERFICIES, EQUIPO Y PERSONAL

 Determinar el grado de desinfección de las superficies, equipos y materiales utilizados en el

El objetivo del control microbiológico es determinar el estado higiénico de los equipos y

- Cajas Agar Sabouroud

Método en caja Rodac

Método con muestreador de aire RCS PLUS

ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

El muestreador de aire RCS plus valora cuantitativamente el contenido de microorganismos del

LUGAR UFC/Placa Rodac

ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS MESOFÍLICOS

ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Figura 1. Procedimiento para las diluciones.

- Una vez preparadas las diluciones del homogenizado de la muestra, proceder a

ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Método con Petrifilm

ENFASIS EN MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Recuento de Mohos y Levaduras

1:100 1:1000 1:1000

4. Incubación 22 C  2 por 5 a 7 días

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Fuente: Métodos de análisis microbiológicos de alimentos. Allert y Escolá, 2002.

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

 Cuando esté completa la gradilla o lote de muestra se puede comenzar la incubación o

Si cualquiera de las muestras se decolora después de una incubación de 30 minutos se informa

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Determinación dela Fosfatasa:

Disolver una pastilla en 10 cc del sustrato

Tomar 2 cc de esta solución y adicionar 0,02 cc de leche

FRAZIER, W. C. Microbiología moderna delos alimentos. Acribia. 2002

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

NÚMERO MAS PROBLABLE (NMP) DE COLIFORMES

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

NMP de coliformes/g o ml= NMP de la tabla x factor de dilución intermedia / 100

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Fuente: Métodos de análisis microbiológicos de alimentos. Allert y Escolá, 2002.

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Número de tubos positivos Número de tubos positivos

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Fuente: Métodos de análisis microbiológicos de alimentos. Allert y Escolá, 2002.

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

ÉNFASIS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

NMP de Coliforme fecal

1 De los tubos positivos confirmados de

2 Caldo lactosa bilis verde brillante al 2%