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Tema 3 - C20 - 21
Tema 3 - C20 - 21
TEMA 3: Tratamiento de muestras
1. Operaciones preliminares o tratamientos previos de la muestra
2. Tratamiento de las muestras. Consideraciones generales
3. Tratamiento de muestras para determinación de analitos inorgánicos.
3.1. Muestras sólidas
3.2. Muestras líquidas y gaseosas
4. Tratamiento de muestras para determinación de analitos orgánicos
4.1. Muestras sólidas
4.2. Muestras líquidas y extractos: técnicas de preconcentración y limpieza
1. Operaciones preliminares o tratamientos previos de la muestra
Los tratamientos previos son una serie de operaciones físicas que se realizan antes de iniciar
el tratamiento químico propiamente dicho para adecuar la muestra a la medida. Estas
operaciones dependen de las características de la muestra, por lo que resulta imposible una
descripción exhaustiva de los distintos pretratamientos.
MUESTRAS SÓLIDAS
En general, las muestras sólidas son las que demandan mayor pretratamiento. Veamos
algunas de las operaciones previas más usuales.
Lavado: Muchas muestras se lavan con objeto de eliminar la contaminación superficial. El
que se lleve a cabo o no la etapa de lavado depende de las características de la muestra y de
la información buscada. A veces interesa analizar ambos tipos de muestra, lavada y sin lavar
para diferenciar procesos de adsorción superficial de aquellos en los que ha habido una
penetración al interior (por ejemplo, pesticidas en frutas). Para el lavado, la muestra se
sumerge durante un tiempo en una disolución de lavado, que puede ser:
Agua: útil para eliminar partículas y algunas sustancias de la superficie
Disolventes orgánicos (alcoholes, cloroformo, acetona, etc): útiles para eliminar
grasas
Disoluciones acuosas de tensioactivos, ácidos diluidos, agentes complejantes
En todo caso hay que tener cuidado al elegir la disolución de lavado para que no se altere la
composición de la muestra o se extraiga de ella algún componente no previsto.
Cualquier operación de lavado debe llevarse a cabo antes de triturar la muestra, y en ningún
caso pueden someterse a lavado muestras de pequeño tamaño de partícula.
Secado: la presencia de agua en muestras sólidas, puede provocar resultados erróneos. Los
problemas más frecuentes suelen ser:
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• Alteraciones de la matriz, disolución parcial de algunos componentes, reacciones de
hidrólisis de algunos compuestos. Además, el agua puede influir en el comportamiento de la
muestra durante las operaciones de tratamiento.
• El contenido de humedad puede alterarse por condiciones atmosféricas. Por eso, es
conveniente eliminarla antes del análisis y, si es necesario, cuantificarla. Para ello, se elimina
totalmente la humedad (hasta pesada constante) y se calcula la diferencia de peso antes y
después del secado. De este modo siempre podrá decidirse si expresar el resultado del
análisis respecto a peso seco o muestra total.
Los métodos de secado más usuales son:
Secado en estufa: la muestra se coloca en un recipiente de gran superficie y poca
profundidad en el interior de un horno o estufa eléctrica durante cierto tiempo. La
temperatura suele oscilar entre 100‐110°. Estos dos factores (tiempo y ta) deben estar
cuidadosamente seleccionados para evitar errores, ya que temperaturas muy elevadas
pueden dar lugar a pérdidas por volatilización. Las pérdidas dependen del analito (de su
volatilidad) y del tipo de matriz. El tamaño de partícula también suele tener mucha
influencia. En el caso de analitos orgánicos hay que considerar que pueden alterarse más
fácilmente con la temperatura. Los analitos inorgánicos suelen ser más estables y menos
volátiles. Sin embargo, incluso en estos casos pueden darse pérdidas significativas por
volatilización en algunos elementos. Una alternativa posible es realizar un secado más
prolongado a menor temperatura. Así, con temperaturas de secado entre 60‐65º pueden
minimizarse las pérdidas por volatilización. No obstante, debe tenerse en cuenta que
tiempos muy prolongados de secado a baja temperatura podrían dar lugar a
contaminaciones.
Liofilización: es un proceso de secado a baja temperatura y alto vacio. Se realiza en dos
etapas:
1)la muestra se congela a unos ‐40° (con N2 líquido, que está a ‐195°C)
2)la muestra congelada se somete a alto vacio para que el hielo sublime
Este procedimiento es más lento y mucho más caro que el secado en estufa, ya que requiere
equipamiento especializado (liofilizador). Es útil cuando existen grandes riesgos de
descomposición de la matriz al calentar y de muchas pérdidas por volatilización. Se utiliza
principalmente para analitos termolábiles en muestras de alimentos, materiales biológicos,
etc. Las muestras una vez liofilizadas deben mantenerse en atmósferas muy secas porque se
absorben agua con mucha facilidad.
Trituración y homogenización: La disminución del tamaño de partícula con la trituración
favorece etapas posteriores de tratamiento, como la disolución o la extracción. Además, si
se va a realizar una división de la muestra en porciones (submuestreo), la trituración y
homogeneización es necesaria para garantizar la representatividad de las submuestras.
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Cuanto más heterogénea es la muestra mayor importancia tiene la etapa de trituración, con
ella se consigue una reducción del tamaño de partícula que junto con una etapa de mezclado
permite la homogeneización garantizando la representatividad.
En general se distinguen dos tipos de equipos para trituración de muestras dependiendo de
las características de estas:
• Trituración de materiales duros: la muestra se somete a fuertes impactos o presiones con
otro material más duro que ella. Para muestras de pequeño tamaño pueden ser simples
morteros de laboratorio (de vidrio, de porcelana, de ágata, etc). La trituración es por
abrasión con movimientos circulares.
Hay que tener en cuenta que durante el proceso de trituración la muestra puede sufrir
contaminación que puede ser de dos tipos:
contaminación por desgaste. Las partes móviles de los equipos de trituración con el
uso pueden desprender partículas metálicas
contaminación cruzada: se produce por restos de la muestra anterior que quedan en
el triturador si no se ha hecho una limpieza adecuada
También pueden producirse alteraciones de la muestra debido al calor generado durante el
proceso de trituración como consecuencia de la fricción. Estas alteraciones pueden ser
pérdidas de humedad y componentes volátiles, descomposición de alguna especie u
oxidación de algún componente.
Trituración de materiales blandos: la muestra se trocea empleando objetos cortantes, ya
sea de forma manual o automática. Se trata de picadoras de cuchillas que giran a gran
velocidad cortando la muestra en trozos. En este caso no hay un calentamiento apreciable y
la posibilidad de contaminación se reduce a la contaminación cruzada. A veces las muestras
incluso se congelan con nitrógeno líquido o CO2 sólido para disminuir aun más el riesgo de
aumento de temperatura.
División y submuestreo: esta operación surge de la necesidad de reducir el tamaño de la
muestra para adecuarla a las necesidades de la técnica de análisis. Debe asegurarse que la
muestra reducida es representativa. La división puede llevarse a cabo de forma manual o
mecánica:
Manual: se emplea el método del cono y el cuarteamiento.
Métodos mecánicos: existen dos tipos
Cuarteadores mecánicos (riffler): es una caja metálica abierta en forma de rejilla por
su parte superior y con salidas laterales. La muestra se añade por la parte superior y
las rejillas la reparten alternativamente entre dos recipientes situados a ambos lados.
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Así se consiguen dos submuestras iguales. Debe trabajarse con cantidad de muestra
suficiente para pasar por igual por todas las rejillas.
Divisores continuos rotatorios: es la forma de división de la muestra más controlada
y reproducible. La muestra se coloca en un embudo acoplado a un sistema de
vibración que permite la salida de la muestra. La bandeja circular en la que se
encuentran los diferentes contenedores va girando de modo que la muestra se
reparte homogéneamente entre ellos.
MUESTRAS LÍQUIDAS Y GASEOSAS
Si las muestras poseen partículas en suspensión es necesario separarlas del resto de la
matriz. Puede ser que una vez separadas se sometan también a análisis o que interese sólo
analizar la fase líquida o gaseosa.
Los métodos más utilizados para separar las partículas sólidas son:
Filtración: para líquidos y gases. La muestra se hace pasar a través de un material de
porosidad controlada que retiene las partículas.
Centrifugación: sólo para líquidos. La muestra se somete a una elevada velocidad de giro
que empuja a sedimentar, a distinta velocidad, a las partículas de distinta masa de la mezcla.
Las partículas sólidas se depositan en el fondo. A veces, si las partículas son de tamaño muy
pequeño se adicionan sustancias coagulantes que favorecen la formación de agregados de
mayor tamaño.
2. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS. Consideraciones generales
Consiste en la adecuación de la muestra para el análisis. Actualmente es la etapa del proceso
analítico que más tiempo consume y es la más expuesta a errores. Como principios
generales debe tenerse en cuenta:
debe transformarse el analito en la forma química más adecuada para el método a
aplicar
en algunos casos se eliminan interferencias
la preparación debe hacerse sin pérdidas de analito
no deben agregarse nuevos interferentes procedentes de reactivos o recipientes de
reacción
la preparación de la muestra debe incluir la dilución o concentración de los analitos
para que queden dentro del intervalo de concentración de la técnica a emplear
Las operaciones de tratamiento de la muestra se caracterizan por su especificidad para cada
problema planteado. Hay que tener en cuenta la naturaleza del analito (orgánico o
inórgánico) y el estado de agregación de la matriz de la muestra, así como su naturaleza
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orgánica o inorgánica. Por ello, son muy variadas ya que hay multitud de combinaciones
posibles.
3. Tratamiento de muestras para determinación de analitos inorgánicos
3.1. Muestras sólidas
Aunque algunas técnicas analíticas pueden trabajar directamente sobre muestras sólidas, lo
más frecuente es que los sólidos tengan que someterse a una etapa de disolución, es decir,
una transformación en una fase líquida. La disolución puede ser total o parcial, según que
toda la muestra sólida pase a la fase líquida o sólo los analitos y algunos componentes de
forma selectiva.
Veamos primero las formas de disolución total. Los casos más frecuentes en muestras
ambientales son:
Disolución con reacción química
Disgregación
Mineralización de matrices orgánicas
Disolución con reacción química
La muestra se solubiliza gracias a reacciones químicas de tipo ácido‐base, redox, de
complejación o combinaciones de éstas. Se suelen usar ácidos o mezclas de ácidos. Suele
comenzarse probando el disolvente más suave para ir sucesivamente utilizándolos más
enérgicos. Se comienza con ácidos diluidos (en frio o en caliente), ácidos concentrados (en
frio o en caliente) y mezclas de los mismos entre sí o con otros agentes complejantes u
oxidantes. Los ácidos más frecuentes son clorhídrico (HCl), nítrico Cetc. El uso de mezclas de
ácidos permite combinar distintas propiedades de los mismos.
Estas operaciones de disolución se aceleran normalmente aumentando la temperatura o la
presión. Así pueden usarse frascos abiertos en caliente, digestores cerrados herméticamente
(al calentar además aumenta la presión) o empleo de ultrasonidos y microondas.
Además de mezclas de ácidos entre sí, se pueden mezclar ácidos con otros agentes
oxidantes como el peróxido de hidrógeno (H2O2)
Disgregación:
Cuando las muestras inorgánicas sólidas son insolubles en ácidos se recurre a la disgregación
o descomposición total por fusión. Se trata de un tratamiento muy enérgico que consiste en
la fusión de la muestra mezclada previamente con un reactivo sólido ya sea básico
(carbonato sódico o hidróxido potásico) o ácido (bisulfato potásico) en crisoles de platino o
níquel a elevadísima temperatura (depende del fundente desde 300 para los hidróxidos a
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700‐800 para carbonatos. Una vez fundida, se deja enfriar y el residuo sólido se disuelve en
un disolvente apropiado. Este tipo de tratamiento es muy agresivo y sólo se utiliza en casos
extremos en los que no es posible disolver la muestra con ningún otro tratamiento.
Mineralización:
Cuando las matrices son de naturaleza orgánica para la determinación de analitos
inorgánicos (ej: contenido total de un metal en un tejido animal o vegetal) se procede a la
destrucción de la materia orgánica como paso previo a la disolución. Es lo que se denomina
"mineralización", y consiste en una oxidación de la materia orgánica a CO2, H2O, SO2 y óxidos
de nitrógeno (NxOy). Este proceso puede llevarse a cabo de dos modos:
Vía húmeda: es un calentamiento con ácidos concentrados oxidantes (nítrico HNO3, sulfúrico
H2SO4, perclórico HClO4). También pueden usarse mezclas de ácidos con otros agentes
oxidantes. Se denomina también digestión acida. Requiere mucha dedicación del operador y
puede haber contaminaciones por los reactivos.
Vía seca: consiste en un calentamiento de la muestra a 400‐600oC en un recipiente
adecuado (crisol). También se denomina calcinación. El oxígeno atmosférico actúa como
oxidante. Requiere poca atención del operador. Su principal inconveniente son las posibles
pérdidas por volatilización, que pueden ser especialmente relevantes en el caso de algunos
elementos como Hg, desaconsejando su uso.
Finalmente, a veces no se pretende la disolución total de la muestra sino la puesta en
disolución de forma selectiva de algunas especies. Suele hablarse en este caso de lixiviación
o extracción de estos componentes, según que haya o no reacción química. Los métodos
corresponden a lo que hemos visto antes de disolución con y sin reacción química.
Este tipo de tratamiento puede ser útil por ejemplo para evaluar la movilidad y
disponibilidad de metales en suelos. Implica extracciones secuenciales con distintos
reactivos y diferentes condiciones.
3.2. Muestras líquidas y gaseosas
Cuando se trata de analitos inorgánicos, este tipo de muestras requieren, en general, poco
tratamiento. Principalmente habrá que adecuar la concentración mediante dilución o
preconcentración. Además, puede ser necesarios tratamientos para eliminación de
interferentes, que son muy específicos para cada caso o problema planteado.
Para la preconcentración de muestras líquidas se emplean tratamientos similares a los que
se usan para analitos orgánicos (extracción líquido o extracción en fase sólida), si bien son
mucho más frecuentes para éstos últimos y, por eso, se tratarán posteriormente.
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En el caso de muestras gaseosas lo más común es que la preconcentración tenga lugar
durante el muestreo. Esto es aplicable también en caso de la determinación de analitos
orgáncios.
4. Tratamiento de muestras para determinación de analitos orgánicos
La determinación de compuestos orgánicos presenta, en general, una problemática más
compleja que cuando se trata de analitos inorgánicos. Las principales razones son:
• Los compuestos orgánicos están formados por C, H, O, N y, en algunos casos, S y
halógenos. La composición química no es específica de una sustancia. Sólo lo es su
estructura. Hay muchos compuestos orgánicos diferentes, muchos más que inorgánicos, y us
estructuras pueden ser muy complejas.
• El método de tratamiento de la muestra y de análisis no debe alterar el compuesto, o si lo
hace debe ser de forma controlada. Muchos compuestos orgánicos son lábiles, pueden
alterarse con la temperatura o con tratamientos oxidantes muy enérgicos.
• Hay pocos detectores y son poco específicos. Por ello, los métodos de análisis suelen
requerir separaciones previas. Por eso, conviene usar tratamientos de muestra que
simplifiquen la matriz eliminando componentes no deseados.
4.1. Muestras sólidas:
Se persigue la disolución de la muestra ya que la mayor parte de las técnicas analíticas
requieren el analito en disolución. Es más frecuente la disolución parcial buscando la puesta
en disolución selectiva del analito:
Extracción sólido‐líquido.
La muestra se pone en contacto con un disolvente o mezcla de disolventes (extractante)
para debilitar las interacciones analito‐ matriz e incrementar las interacciones analito‐
extractante. Objetivo: obtener la mayor cantidad posible de analito y la mínima de
interferentes.
El disolvente se debe elegir en función de las características del analito y la matriz. Cuanto
más polar sea el disolvente orgánico, más miscible es con el agua. Disolventes polares como
el metanol, el etanol o la acetona son útiles para disolver compuestos orgánicos polares.
Los disolventes orgánicos con moderada o baja polaridad como el diclorometano, el éter
dietílico, el acetato de etilo, el hexano o el tolueno son los que se suelen utilizar para
compuestos hidrófobos.
El procedimiento de la extracción sólido‐líquido puede ser simplemente una extracción con
agitación, poniendo la muestra finamente molida en contacto con un disolvente adecuado
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en un recipiente abierto. El rendimiento de la extracción dependerá del disolvente, la
temperatura, la presión y el tiempo de contacto.
Para aumentar la eficacia de la extracción sólido‐líquido puede optarse por distintas
estrategias:
Extracción Soxhlet: Se utiliza cuando las interacciones analito‐matriz son más intensas.
La mezcla disolvente/muestra se calienta de forma continua, a reflujo. El disolvente se
evapora y sube hasta la cámara de condensación, por donde circula agua fría
(refrigerante); aquí se condensa y cae a la cámara con el sólido, donde interaccionará
con este, se acumula aquí y cuando alcanza el nivel de la válvula vuelve al matraz
inferior. Este continúa calentándose y vuelve a destilarse durante varias horas de forma
cíclica y continua. Como inconvenientes se pueden citar el largo tiempo de extracción
(12‐ 48 h) y el elevado volumen de disolventes orgánicos empleados (300‐500 mL);
además no puede utilizarse para analitos termolábiles. Sin embargo, es un método muy
utilizado y es la referencia de todas las técnicas de extracción actuales.
Extracción con microondas: Alternativa a la extracción Soxhlet con un calentamiento
más rápido y eficaz. La muestra se coloca en un recipiente (abierto o cerrado) junto al
disolvente y se somete a la radiación. Posteriormente el extracto se debe filtrar. La
energía microondas es absorbida por las moléculas produciendo su rotación. Esta
rotación es la responsable del calentamiento de la muestra. Se usan mucho para la
determinación de compuestos orgánicos en distintos tipos de muestras (suelos,
sedimentos, etc.)
Extracción acelerada con disolvente (ASE): es la más reciente de las técnicas de
extracción sólido‐líquido. Usa disolventes orgánicos a alta P y T, en un equipo diseñado
especialmente. La muestra sólida se coloca en un recipiente que se sella, se llena con
disolvente y se calienta provocando un gran aumento de la presión en la celda. El
extracto se expulsa de la celda con nitrógeno gaseoso y se transfiere automáticamente a
un vial. Se consigue una extracción rápida (20‐30 min) y efectiva, con bajo consumo de
disolventes (20‐30 ml). El inconveniente es su elevado coste.
4.2. Muestras líquidas y extractos: técnicas de preconcentración y limpieza
Se emplean técnicas de separación. Esta puede definirse como una operación que permite
dividir una mezcla de componentes en fracciones de distinta composición, de manera que
una de las fracciones esté enriquecida en alguno de los componentes respecto a la mezcla
inicial.
La separación supone la transferencia de uno o más componentes entre dos fases. Además
puede implicar procesos de transformación química.
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La materia transferida pueden ser los analitos u otras especies (por ejemplo interferentes).
Hay muchas técnicas de separación. Aquí veremos las principales técnicas cuya finalidad es
acumular al analito libre de interferencias en una de las fases: técnicas de extracción
Los objetivos perseguidos con el tratamiento con estas técnicas de extracción son:
• Eliminar interferencias
• Preconcentrar el analito
Las más utilizadas son:
Extracción líquido‐líquido
Consiste en la transferencia de analitos (u otras especies) de la muestra a un disolvente
líquido inmiscible con ella. Se basa en un equilibrio de distribución que se rige por la ley de
distribución: a una temperatura dada, la relación de las concentraciones en equilibrio de una
sustancia distribuida entre dos disolventes no miscibles en contacto es constante. Esta
constante de distribución es característica de cada analito para cada par de disolventes.
Procedimiento experimental de la Extracción Líquido‐Líquido:
1. Contacto íntimo entre las fases: se mezclan las fases para facilitar la transferencia de
soluto entre los dos disolventes, hasta alcanzar el equilibrio
2. Separación de las fases: el embudo se deja en reposo hasta separación de las dos capas, y
se recoge el extracto y la fase inicial por separado.
Extracción simple: consiste en una única extracción. Se emplea cuando la constante de
distribución es lo suficientemente alta
Extracción múltiple: cuando la eficacia de extracción es baja, se hacen vanas extracciones
con pequeñas porciones de disolvente
Las especies de interés suelen estar en medio acuoso, (la muestra original, o el resultado de
una operación de disolución). La fase extractante suele ser un disolvente orgánico inmiscible
con el agua. En general, las moléculas no cargadas, no polares y de gran tamaño son más
solubles en los disolventes orgánicos. Existen gran variedad de disolventes disponibles y es
posible emplear mezclas y modificaciones del pH de la fase inicial, etc, para conseguir una
buena extracción.
Inconvenientes:
Formación de emulsiones: provoca incompleta separación de las fases
Bajos porcentajes de recuperación en muchos casos
Riesgos de pérdidas o contaminaciones en las distintas etapas,
Empleo de grandes volúmenes de muestra y de disolventes tóxicos e inflamables
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Extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE):
Consiste en poner en contacto la muestra líquida con una fase sólida, que retiene al analito o
a otros componentes de la muestra.
Generalmente la fase sólida (partículas de pequeño tamaño) suele estar alojada dentro de
un cartucho de extracción. La muestra líquida se hace pasar de forma continua a través del
cartucho. Entre ambas fases se producen múltiples equilibrios de distribución de los solutos
y algunos de los componentes de la muestra, quedan retenidos por su mayor afinidad por la
fase sólida que por el disolvente, mientras que otros pasan inalterados. El uso de extractores
a vacío facilita el procesamiento simultáneo de varias muestras con control reproducible del
flujo de extracción.
Etapas en la SPE:
1. Acondicionamiento del soporte
Se hace pasar una disolución a través del sorbente para solvatarlo y equilibrarlo,
favoreciendo el contacto entre la fase sólida y la muestra. Los volúmenes utilizados suelen
ser 2‐4 veces el volumen de sorbente.
2. Adición de muestra
La muestra se hace pasar a través del sorbente mediante, gravedad, presión, vacío o
centrifugación. La velocidad de flujo debe ser relativamente lenta para favorecer las
interacciones entre ambas fases.
3. Lavado o elución de interferentes
Debe emplearse una solución de lavado que no afecte a la retención y posterior
recuperación del analito.
4. Elución
Mediante una disolución en la que el analito debe ser soluble el analito retenido en la fase
sólida, es eluido selectivamente rompiéndose las interacciones existentes entre el soporte y
el analito. La elución se puede hacer con un único disolvente o con mezclas. También se
puede realizar una elución selectiva, mediante la adición secuencial de varios eluyentes para
eluir diferentes clases de solutos. El volumen de eluyente debe ser el mínimo posible para
que se produzca una mayor preconcentración del analito.
Estas cuatro etapas se realizan cuando se quiere preconcentrar y purificar el analito. En el
caso de que se pretenda sólo eliminar interferentes, las etapas se reducen al
acondicionamiento y adición de muestra.
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El empleo de una u otra fase sólida en SPE depende principalmente de la naturaleza del
analito(s). Las fases sólidas más utilizadas son:
Sorbentes apolares
Suelen ser sílices modificadas con grupos alquilo. Ej: octadecil, C18; octil, C8; etil, C2; fenil
y ciclohexil. Preconcentración y limpieza de compuestos orgánicos presentes en muestras
líquidas polares (aguas, bebidas, fluidos biológicos...). Elución con disolvente orgánico
(metanol, acetonitrilo, acetato de etilo, etc)
Sorbentes polares
Formados por compuestos polares o con capacidad de formar enlaces de hidrógeno. Muy
usados: gel de sílice, alúmina (Al2O3) y mezcla de sílice y óxido de magnesio (Florisil).
Utilizados para purificación de extractos orgánicos. Los analitos (y compuestos
interferentes) se cargan sobre el sorbente en un disolvente apolar. La etapa de lavado se
realiza con el mismo disolvente para arrastrar a los compuestos más hidrofóbicos. Los
analitos se eluyen con un disolvente más polar.
Cambiadores de iones
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