AnaGabriellaCostaLemosDaSilva DISSERT

0
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
ANA GABRIELLA COSTA LEMOS DA SILVA
ESTADO NUTRICIONAL EM VITAMINA A E VITAMINA E DE MULHERES

NO SEGUIMENTO DA LACTAÇÃO
NATAL/RN
2018
1

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Nutrição,
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre em Nutrição.
Orientador (a): Prof (a). Dr (a). Karla Danielly

da Silva Ribeiro Rodrigues
NATAL/RN
2018
2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Silva, Ana Gabriella Costa Lemos da.

Estado nutricional em vitamina A e vitamina E de mulheres no
seguimento da lactação / Ana Gabriella Costa Lemos da Silva. -
2018.
90f.: il.
Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Nutrição.
Orientadora: Profa. Dra. Karla Danielly da Silva Ribeiro
Rodrigues.
1. Aleitamento materno - Dissertação. 2. Retinol -

Dissertação. 3. Alfa-tocoferol - Dissertação. 4. Lactação -
Dissertação. 5. Consumo alimentar - Dissertação. I. Rodrigues,
Karla Danielly da Silva Ribeiro. II. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 613.287.2

3

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Nutrição

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em ____ de ___________________________ de ________.
Profa Dra Lúcia de Fátima Campos Pedrosa
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________
Profa Dra Karla Danielly da Silva Ribeiro Rodrigues
Orientadora
_________________________________________________
Profa Dra Bruna Leal Lima Maciel
Membro Interno
_________________________________________________
Profa Dra Illana Louise Pereira de Melo
Faculdade Uninassau
Membro externo
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, por tudo que Ele me proporciona, pela vida, saúde e coragem de enfrentar
minhas limitações e dificuldades do dia a dia.
Aos meus pais por todo o amor e carinho, e por terem investido tudo o que tinham
nos meus estudos, além do incentivo e apoio em todas as minhas decisões.
À minha família, avó, irmãos, sobrinhos, padrinhos e ao meu esposo, pelo incentivo
e apoio em todos os momentos que preciso.
Ao professor Roberto Dimenstein pelo acolhimento no laboratório, por ter aceitado

me orientar, mesmo sem me conhecer, e por todos os ensinamentos.
À professora Karla Danielly por ter aceitado me co-orientar, e, posteriormente,

orientar, por todo o aprendizado, companheirismo e dedicação ao nosso trabalho. É
uma honra ser sua primeira orientanda de mestrado.
À Juliana Dametto e Larissa Lira pelo acolhimento e ensinamentos iniciais no

laboratório.
À Amanda Rebouças pela amizade e apoio no desenvolvimento desse trabalho.
Às alunas de iniciação científica do laboratório, sem elas o desenvolvimento desse

trabalho não teria sido possível: Alana Fernandes, Amanda Freitas, Amanda
Gabriela, Andressa Melo, Angélica Sousa, Beatriz Mendonça, Byanca Carneiro,
Danna Calina, Esther Figueredo, Juliana Amorim, Juliane Medeiros, Julia Padovam,
Lorena Thalia, Melissa Moia, Nathalia Lorena, Raissi Laiani e Vanessa Felgueiras.
Às técnicas de enfermagem que ajudaram nas coletas de sangue das mães,

Renicleide, Tatyanna e Diane.
Às mães que se dispuseram a participar dessa pesquisa e por terem permitido

nossa entrada em suas vidas.
À minha turma de mestrado, principalmente, às minhas amigas Beatriz Luz, Karen

Barros e Rebecca Germoglio, pelo apoio, companheirismo, alegrias e tristezas
compartilhadas.
5
Às professoras Clélia Lyra, Danielle Soares, Bruna Leal e Illana Melo pelas
contribuições nas bancas de qualificação e defesa.
À UFRN e o Programa de Pós-graduação em nutrição, professores e funcionários,

pelos conhecimentos compartilhados e apoio financeiro.
Aos profissionais do ambulatório de pediatria do Hospital Universitário Onofre Lopes

que permitiram e viabilizaram a coleta de dados dessa pesquisa.
A todos, muito obrigada!

6
RESUMO
Na lactação as mulheres necessitam de um maior aporte nutricional tanto
para repor os nutrientes secretados no leite, quanto para garantir o estado
nutricional adequado, como nas vitaminas A e E, essenciais para o crescimento,
imunidade e estado antioxidante. Sendo assim, este trabalho objetivou avaliar o
estado nutricional de vitamina A e vitamina E de mulheres no seguimento da
lactação e a relação da ingestão dietética habitual com as concentrações das
vitaminas no soro e leite. O estudo foi do tipo longitudinal com 43 mulheres lactantes
recrutadas em um hospital público localizado em Natal-RN, Brasil. A coleta de leite,
sangue e informações dietéticas ocorreram em três momentos: a primeira entre 25 a
74 dias pós-parto; a segunda por volta de 30 dias após a primeira e a terceira 30
dias após a segunda. O retinol e alfa-tocoferol foram analisados por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência. Valores de retinol < 0,7 μmol/L (20 µg/dL) no soro e < 1,05
μmol/L (30 µg/dL) no leite, e de alfa-tocoferol sérico < 12 μmol/L (517 µg/dL) foram
indicativos de baixas concentrações. A inadequação dietética foi analisada conforme
Estimated Average Requirement (EAR) com variação intrapessoal ajustada pelo
Multiple Source Method, e a ingestão também foi classificada por quartis de
consumo. O retinol sérico variou em torno de 1,65 μmol/L no seguimento da
lactação, com 5% de baixas concentrações apenas na primeira coleta, e no leite
foram identificadas 12%, 14% e 12% de baixas concentrações nas três coletas,
respectivamente. O alfa-tocoferol sérico diminuiu na lactação, de 30,18 μmol/L na
primeira coleta a 25,49 μmol/L na terceira (p=0,008), com aumento no percentual de
deficiência. As concentrações das vitaminas no leite materno apresentaram valores
semelhantes entre as coletas. A inadequação dietética de vitamina A e vitamina E foi
encontrada em 58% e 100% das lactantes, respectivamente. Houve correlação
positiva apenas entre o retinol sérico e a ingestão habitual de vitamina A (r=0,403,
p=0,007), e maiores concentrações de retinol sérico foram encontrados nas
lactantes classificadas no maior quartil de consumo de vitamina A (p=0,031). Os
resultados encontrados revelaram que as mulheres lactantes são de risco nutricional
para a deficiência de vitamina A e vitamina E, reforçando a importância de uma
alimentação adequada e o monitoramento da deficiência durante a lactação.
Palavras-chaves: Aleitamento materno, retinol, alfa-tocoferol, lactação, consumo

alimentar.
7
ABSTRACT
In lactation, women need a greater nutritional intake both to replenish nutrients

secreted in milk and to ensure adequate nutritional status, as in vitamins A and E,
essential for growth, immunity and antioxidant status. Thus, this study aimed to
evaluate the nutritional status of vitamin A and vitamin E in over the course of
lactation and the relation between usual dietary intake and serum and milk vitamin
concentrations. The study was a longitudinal study of 43 lactating women recruited at
a public hospital located in Natal-RN, Brazil. The collection of milk, blood and dietary
information occurred in three moments: the first between 25 and 74 days postpartum;
the second about 30 days after the first and the third 30 days after the second.
Retinol and alpha-tocopherol were analyzed by High Performance Liquid
Chromatography. Serum alpha-tocopherol <12 μmol/L (517 μg/dL) in serum and
<1.05 μmol/L (30 μg/dL) were indicative of low concentrations. Dietary inadequacy
was analyzed according to the Estimated Average Requirement (EAR) with
intrapersonal variation adjusted by the Multiple Source Method, and the intake was
also classified by quartiles of consumption. Serum retinol varied around 1.65 μmol/L
over the course of lactation, with 5% of low concentrations only in the first collection,
and in the milk 12%, 14% and 12% of low concentrations were identified in the three
collections, respectively. Serum alpha-tocopherol decreased in lactation from 30.18
μmol/L in the first collection to 25.49 μmol/L in the third (p=0.008), with an increase in
the percentage of deficiency. The concentrations of vitamins in breast milk presented
similar values among the samples. Dietary inadequacy of vitamin A and vitamin E
was found in 58% and 100% of women, respectively. There was a positive
correlation only between serum retinol and vitamin A intake (r=0.403, p=0.007), and
higher concentrations of serum retinol were found in women classified as the highest
quartile of vitamin A intake (p=0.031). The results found that lactating women are at
nutritional risk for vitamin A deficiency and vitamin E, reinforcing the importance of
adequate nutrition and monitoring of lactation deficiency.
Key-words: Breastfeeding, retinol, alpha-tocopherol, lactation, food consumption.

8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 – Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina A para

indivíduos em diferentes estágios de vida..................................................................20
Quadro 2 - Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina E para
indivíduos em diferentes estágios de vida..................................................................25
Figura 1 - Desenho da coleta de dados da pesquisa…………………………………..30
Figura 2 - Esquema ilustrativo do processo de extração de retinol e alfa-tocoferol do
soro e leite materno……………………………………………………………..………….32
Figura 3 - Esquema das diluições do padrão de retinol para leitura no
espectrofotômetro.......................................................................................................33
Figura 4 - Esquema das diluições do padrão de alfa-tocoferol para leitura no
espectrofotômetro.......................................................................................................34
Figura 5 - Curva de calibração dos padrões de retinol (A) e alfa-tocoferol (B) com
equação da reta (y) e coeficiente de regressão linear (R2).......................................35
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AI Adequate Intake (Ingestão adequada)

Alfa-TTP Alpha-Tocopherol Transfer Protein (Proteína Transportadora de Alfa-
tocoferol)
AIG Adequado para a Idade Gestacional
ANOVA Analysis of Variance (Análise de variância)
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
dL Decilitro
DRI Dietary Reference Intakes (Ingestão Dietética de Referência)
DVA Deficiência de vitamina A
DVE Deficiência de vitamina E
EAR Estimated Average Requirement (Necessidade Média Estimada)
g Grama
GIG Grande para a Idade Gestacional
GPA Alfa-1-glicoproteína ácida
HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IG Idade gestacional
IMC Índice de Massa Corporal
LDL Low Density Lipoproteins (Lipoproteína de Baixa Densidade)
LoD Limit of Detection (Limite de Detecção)
LoQ Limit of Quantitation (Limite de Quantificação)
LPL Lipase Lipoprotéica
Mg Miligrama
mL Mililitro
MS Ministério da Saúde
MSM Multiple Source Method
N Número
nm Nanômetro
OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS Organização Pan-Americana da Saúde
PCR Proteina C-reativa
PIG Pequeno para a Idade Gestacional
PNAN Política Nacional de Alimentação e Nutrição
10
QFA Questionário de frequência alimentar

RAE Equivalente de atividade de retinol
RBP Retinol-binding protein (Proteína ligadora de retinol)
RDA Recommended Dietary Allowance (Ingestão Dietética
Recomendada)
Rpm Rotações por minuto
R24h Recordatório 24 horas
TACO Tabela Brasileira de Composição de Alimentos
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UI Unidades internacionais
UL Tolerable Upper Intake Level (Limite Superior Tolerável de
Ingestão)
USDA United States Department of Agriculture
VLDL Very Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de Densidade Muito
Baixa)
µg Micrograma
µmol Micromol
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13
2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA .................................................................. 15
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 16
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 16
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 16
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 17
4.1 LACTAÇÃO ...................................................................................................... 17
4.2 VITAMINA A ..................................................................................................... 18
4.2.1 Funções e fonte alimentares .................................................................. 18
4.2.2 Vitamina A e lactação .............................................................................. 20
4.2.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina A ........... 20
4.3 VITAMINA E ..................................................................................................... 23
4.3.1 Funções e fontes alimentares................................................................. 23
4.3.2 Vitamina E e lactação .............................................................................. 24
4.3.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina E ........... 25
5 METODOLOGIA .................................................................................................... 27
5.1 ASPECTOS ÉTICOS E UNIVERSO AMOSTRAL............................................ 27
5.2 COLETA DE DADOS ....................................................................................... 28
5.3 EXTRAÇÃO DO RETINOL E ALFA-TOCOFEROL NO LEITE E SORO
MATERNO ............................................................................................................. 30
5.3.1 Extração do retinol do leite materno ...................................................... 30
5.3.2 Extração do retinol do soro materno e alfa-tocoferol do leite e soro
materno.............................................................................................................. 30
5.4 PREPARO DO PADRÃO DE RETINOL ........................................................... 31
5.5 PREPARO DO PADRÃO DE ALFA-TOCOFEROL .......................................... 32
5.6 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ............ 33
5.7 VALORES DE REFERÊNCIA .......................................................................... 35
5.8 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL ANTROPOMÉTRICO .................. 35
5.9 AVALIAÇÃO DO CONSUMO ALIMENTAR ..................................................... 36
5.10 ANÁLISE ESTATÍTICA .................................................................................. 37
6 ARTIGO PRODUZIDO ........................................................................................... 38
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 59
12
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60
APÊNDICES ............................................................................................................. 70
ANEXOS ................................................................................................................... 86
13
1 INTRODUÇÃO
Durante a lactação as necessidades nutricionais são elevadas, maiores
do que no período gravídico, devido à necessidade de repor as quantidades
substanciais secretadas no leite materno, e garantir o aporte nutricional adequado
ao bebê. Desta forma, recomenda-se um aumento no consumo dietético da maior
parte dos nutrientes durante este período, incluindo a vitamina A e vitamina E1–3.
A vitamina A atua na visão, comunicação intercelular, crescimento e
diferenciação celular4. A deficiência de vitamina A (DVA) constitui uma das principais
carências nutricionais do mundo, sendo considerada um problema de saúde pública
no Brasil e em outros países em desenvolvimento, acometendo principalmente
crianças e gestantes5. Esta deficiência também foi observada em mulheres lactantes
durante os diferentes estágios da lactação, atingindo até 33% das mulheres
estudadas6–10.
Já a vitamina E atua na captação de radicais livres, evitando a
peroxidação lipídica em lipoproteínas e membranas celulares11, sendo importante
para a função imune, no controle da inflamação e no desempenho cognitivo12,13. A
deficiência de vitamina E (DVE) durante a lactação é pouco relatada na literatura.
Baixas concentrações de alfa-tocoferol sérico foram observadas em mulheres no
pós-parto imediato e estavam diretamente relacionados ao status de vitamina E dos
neonatos14,15. Outro estudo demonstrou que 70% das mulheres lactantes avaliadas
apresentaram DVE no decorrer da lactação16, o que demonstra a importância de se
estudar esses micronutrientes na fase da lactação e sua relação com o leite
materno.
O leite materno deve conter quantidades adequadas de vitamina A e
vitamina E, uma vez que suas reservas corporais nos neonatos são baixas ao
nascimento17, o que torna o aleitamento uma importante estratégia para o combate
das deficiências nutricionais em crianças18,19.
A composição dessas vitaminas no leite pode variar de acordo com o
estágio da lactação, período da mamada, prematuridade e populações19–23, mas
ainda não há consenso se a concentração sérica e o consumo alimentar materno
podem afetar diretamente as concentrações dessas vitaminas no leite. Alguns
estudos não encontraram essa relação14,15,20,24,25, e outros encontraram associações
positivas ou negativas entre essas variáveis26,27. Vale destacar que todas essas
análises foram realizadas nas primeiras 72 horas após o parto, em que o leite
14
secretado é denominado colostro e contem altas concentrações das vitaminas

independente dos níveis circulantes maternos, sendo importante explorar essa
relação no período de amamentação prolongada.
Como essas vitaminas apresentam ampla importância para o grupo
materno-infantil e por algumas evidências relatarem baixas concentrações no leite
materno6,7,9,16,25,27–29, é importante explorar como se comporta o estado nutricional
materno (soro, leite e consumo alimentar) no decorrer da lactação, principalmente na
fase do leite maduro, por ser o leite predominante no período do aleitamento
materno.
15
2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
A vitamina A apresenta grande relevância para o grupo materno-infantil,
pois atua, principalmente, no sistema visual e na imunidade. Sua deficiência foi
observada em lactantes durante os diferentes estágios da lactação, variando de 7%
a 33% das mulheres estudadas quando determinada pela análise do retinol sérico e
no leite materno6,7,8,9.
A vitamina E é um potente antioxidante que atua, principalmente, na
função imune, no controle da inflamação e no desempenho cognitivo13. No
seguimento da lactação foi observado baixas concentrações de vitamina E em 70%
de mulheres lactantes no sexto mês pós-parto na África do Sul16, e no Brasil foi
observado um aumento nas lactantes com DVE no decorrer da lactação22, sendo
essa temática pouco relatada na literatura e estudada no Brasil apenas pelo nosso
grupo de pesquisa.
Além disso, durante a lactação sabe-se que as necessidades nutricionais
aumentam consideravelmente no intuito de manter a produção láctea, assim como o
balanço energético materno para a produção de leite ideal10. Sendo assim, a
ingestão adequada de nutrientes ajustada a maior necessidade materna é essencial
durante esse período, para que seja evitado um déficit nutricional tanto da lactante,
no leite materno e consequentemente no bebê.
Desta forma, é importante a avaliação da vitamina A e a vitamina E
durante a lactação, para identificar se as concentrações séricas nesses
micronutrientes podem influenciar a composição do leite materno. O
acompanhamento do estado nutricional das vitaminas em lactantes contribui para as
ações de vigilância alimentar e nutricional preconizadas na Política Nacional de
Alimentação e Nutrição (PNAN)30, no tocante a identificação de indivíduos/grupos
que apresentem agravos e riscos para saúde, relacionados ao estado nutricional
bioquímico e ao consumo alimentar, o que fornece subsídios para a promoção de
maiores ações de políticas públicas ao combate da DVA e/ou DVE no grupo
materno-infantil.
Assim, esse estudo tem a seguinte pergunta norteadora: qual o estado
nutricional de vitamina A e vitamina E de mulheres na lactação e a relação da
ingestão dietética com a composição dessas vitaminas no soro e leite materno
maduro?
16
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o estado nutricional de vitamina A e vitamina E de mulheres no
seguimento da lactação e a relação da ingestão dietética habitual com as
concentrações das vitaminas no soro e leite materno.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar e comparar as concentrações de retinol e alfa-tocoferol sérico e
do leite materno de lactantes em diferentes momentos da lactação;
 Correlacionar as concentrações de retinol e alfa-tocoferol no soro e no leite
durante a lactação;
 Avaliar a ingestão dietética de vitamina A e vitamina E e relacionar com as
respectivas concentrações séricas e no leite materno.
17
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 LACTAÇÃO
O leite materno fornece todos os nutrientes, vitaminas e minerais de que o
recém-nascido precisa para o seu crescimento nos seis primeiros meses de vida,
não sendo necessário nenhum outro líquido ou alimento 31. Sendo assim, estudos
demonstraram que os bebês amamentados têm um menor risco de doenças como
gastroenterite, pneumonia, obesidade infantil, leucemia e síndrome da morte súbita
infantil32. Para a mãe, a amamentação traz vantagens como a aceleração da perda
do peso ganho na gravidez e da involução uterina pós-parto, proteção contra anemia
decorrente da amenorreia puerperal mais prolongada, menor incidência de câncer
de mama e de ovário, além de diabetes tipo 233,34.
Embora muitas lactantes apresentem a intenção de amamentar, a
manutenção do aleitamento materno exclusivo até os seis meses ainda é muito
baixa31. No relatório que descreve a situação do aleitamento materno em 227
municípios brasileiros, que realizaram a II Pesquisa de Prevalência do Aleitamento
Materno em 2008, verifica-se que, em relação ao aleitamento materno na primeira
hora de vida, a maioria dos municípios participantes encontra-se em boa situação,
com prevalências entre 50% e 89%. Já em relação ao aleitamento materno exclusivo
em menores de seis meses, a maioria tem situação considerada pela Organização
Mundial de Saúde (OMS) como “razoável”, com prevalências inferiores a 50%35.
Muitos fatores estão associados à interrupção precoce da amamentação,
dentre eles os fatores sociais, psicológicos e comportamentais36. Apesar dessa
elevada prevalência de desmame precoce, o aleitamento materno ainda é o grande
fator de proteção contra a deficiência de nutrientes até os dois anos de idade 38, o
que torna essencial garantir uma melhor qualidade nutricional do leite materno.
O colostro é a primeira secreção láctea, que permanece até o 4º ou 6º dia
pós-parto, contém maiores concentrações de proteína e de minerais, porém menos
gordura e carboidrato do que o leite maduro. Do 7º ao 21º dia pós-parto o leite é
chamado de transição, fase em que ocorre a diminuição da concentração de
imunoglobulinas e proteínas e aumento nos níveis de lactose e gordura, até atingir
as características do leite maduro. Após o 21º dia pós-parto o leite maduro é o que
permanece durante todo o restante do período da lactação, sendo importante sua
avaliação quanto ao teor de nutrientes5,39.
18
A composição do leite materno muda ao longo da lactação 19. Lee e

Kelleher relataram que fatores maternos como a variação genética, composição da
dieta e exposições ambientais são importantes na modulação e no desempenho da
lactação, incluindo a variação no volume e composição do leite36. Como
consequência, destaca-se o aumento das necessidades nutricionais nesse período 1.
Desta forma, as deficiências nutricionais nas lactantes podem resultar na falha na
ativação da atividade secretora de várias perspectivas, como ineficiente capacidade
de resposta hormonal e defeitos nos processos celulares envolvidos na
morfogênese e vias secretoras36.
Acrescenta-se a importância de um adequado estado nutricional em
micronutrientes de relevância significativa para a saúde e crescimento dos lactentes,
como a vitamina A e vitamina E40, sendo essencial a manutenção das concentrações
adequadas destas vitaminas no leite materno, para evitar o desenvolvimento da DVA
e DVE na fase da lactação.
4.2 VITAMINA A
4.2.1 Funções e fonte alimentares
O termo "vitamina A" refere-se a um grupo de compostos que possuem
atividade biológica do retinol todo-trans, incluindo o retinol, o retinal e ácido retinoico,
enquanto que o termo “retinoides” inclui formas de vitamina A e os muitos análogos
sintéticos do retinol, com ou sem atividade biológica3.
A vitamina A está relacionada à expressão gênica e ao adequado
funcionamento do sistema visual, sendo o retinal um componente ativo dos
pigmentos visuais nos cones e bastonetes da retina. Além disso, está envolvida no
crescimento e desenvolvimento celular atuando nas células produtoras de queratina
em vários tecidos epiteliais. Atua também na manutenção da integridade das células
epiteliais a partir da participação na comunicação das células adjacentes, além de
participar da função imunológica, atuando nos processos de manutenção da
imunocompetência, principalmente, em relação aos linfócitos de respostas mediadas
pelas células T e de ativação de macrófagos. Apresenta, ainda, papel fundamental
na gestação e lactação, considerando-se as demandas maternas, fetais e do
lactente4,41.
19
A capacidade de sintetizar compostos com atividade de vitamina A está

limitada a plantas e microrganismos. Assim, os animais devem obter a vitamina A
por meio da dieta, seja pela vitamina A pré-formada ou provitamina A42.
A vitamina A pré-formada é encontrada apenas em alimentos de origem
animal, seja em áreas de armazenamento, como o fígado, ou associada à gordura
em ovos, leite e derivados e leite materno. Quanto aos alimentos de origem vegetal,
estes contêm precursores de vitamina A que são carotenóides, particularmente o β-
caroteno. Dentre as principais fontes de carotenóides estão os vegetais amarelo-
alaranjados, tais como cenoura, abóbora, mamão, e vegetais verde-escuros, como
espinafre e brócolis43. A vitamina A contida nos alimentos é expressa em termos de
equivalentes de retinol (RAE), ou seja, a soma das vitaminas provenientes do retinol
pré-formado e dos carotenoides4.
Sendo assim, para realização das funções da vitamina A e evitar a
deficiência dessa vitamina, as Dietary Reference Intakes, elaboradas pelo Institute of
Medicine, recomendam a ingestão de 1200 µg/dia de vitamina A para lactantes
menores de 18 anos de idade e 1300 µg/dia para lactantes de 19 a 50 anos de
idade, considerando que a Estimated Average Requirement (EAR) e Tolerable
Upper Intake Level (UL) são as categorias de referência mais adequadas para a
avaliação de dietas, enquanto Recommended Dietary Allowances (RDA) ou
Adequate Intake (AI) devem ser utilizadas como metas de ingestão3 (Quadro 1).
Quadro 1. Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina A para

indivíduos em diferentes estágios de vida.
Estágios da vida EAR (µg/dia) RDA/AI* (µg/dia) UL (µg/dia)

Bebês
0 a 6 meses ND 400* 600
7 a 12 meses ND 500* 600
Mulheres
14 a 18 anos 485 700 2800
Acima de 19 anos 500 700 3000
Gestantes
≤ 18 anos 530 750 2800
19 a 50 anos 550 770 3000
20
Lactantes
≤ 18 anos 885 1200 2800
19 a 50 anos 900 1300 3000
EAR: Necessidade média estimada; RDA: Ingestão Dietética Recomendada; AI:
Ingestão adequada; UL: Limite superior tolerável de maior ingestão; ND: Não foi
possível estabelecer este valor
3
Fonte: Institute of Medicine, 2001
4.2.2 Vitamina A e lactação

No leite materno a maior parte do retinol encontra-se sob a forma de ésteres de
retinil, principalmente retinol palmitato e estearato, e o restante como retinol livre44.
O mecanismo de transferência da vitamina A materna para o leite tem sido estudado
em ratos, mas ainda não é totalmente compreendido em humanos. A maior parte
desta vitamina, cerca de 70%, pode ser transferida ao leite materno através da
proteína ligadora de retinol (RBP) e o restante pelos quilomícrons45,46. Entretanto,
O’Byrne e colaboradores observaram em seu estudo que a RBP não é essencial na
transferência de retinol ao leite em ratos mutantes em situações pós-prandiais,
sugerindo que nesse estado a vitamina A pode ser adquirida exclusivamente da
dieta e que a lipase lipoproteica (LPL) é uma enzima essencial no processo de
captação do retinol ao leite47.
A composição de vitamina A do leite humano pode ser influenciada por
diversos fatores, como o estágio de lactação48, período da mamada23, tempo de
gestação e estado socioeconômico da mãe49, hábitos alimentares e
suplementação50,51,52.
Durante os primeiros seis meses de vida da criança, sabe-se que as
reservas hepáticas de vitamina A estão muito limitadas, principalmente, se o leite
materno consumido for proveniente de lactantes com dieta pobre na vitamina. Dessa
forma, o monitoramento e a melhora do estado nutricional de vitamina A de
mulheres na lactação podem ajudar a aumentar os estoques hepáticos e fornecer
uma quantidade adequada dessa vitamina às crianças por meio do consumo do leite
materno, evitando assim o desenvolvimento da DVA53.
4.2.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina A

Dolinsky e Ramalho, baseadas em diversos estudos, mostraram que
apesar da oferta de vitamina A ser ampla tanto a crianças quanto a indivíduos
21
adultos, suas reservas no organismo podem ser depletadas por dois fatores. O
primeiro consiste de uma ingestão inadequada de vitamina A necessária para
satisfazer as reações orgânicas, prejudicando assim as funções fisiológicas, ainda
que os sinais clínicos de deficiência não sejam evidentes; e o segundo fator é a
frequência de episódios infecciosos54.
A DVA constitui um dos principais problemas nutricionais do mundo,
afetando cerca de 19 milhões de gestantes e 190 milhões de crianças em idade pré-
escolar5. Em dimensões epidemiológicas, ela pode ser avaliada a partir de sinais e
sintomas clínicos, indicadores histológicos, bioquímicos e dietéticos.
A avaliação da concentração de retinol sérico por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) é um método comum usado para avaliar o estado
nutricional em vitamina A de populações55, considerando valores satisfatórios
aqueles acima de 20 μg/dL (0,70 μmol/L)4. A dosagem do retinol sérico correlaciona-
se com a prevalência e gravidade da xeroftalmia e pode mudar em resposta a
intervenções. Embora atualmente a OMS recomende o seu uso, a concentração
sérica de retinol apresenta baixa sensibilidades nos casos de depleção moderada
das reservas hepáticas de vitamina A e dos processos infecciosos, devendo ser
usado em conjunto com outro indicador biológico, como as proteínas de fase aguda
Proteina C-reativa (PCR) e alfa-1-glicoproteína ácida (GPA), pelo fato da
homeostase do retinol ser afetada pela resposta de fase aguda a qualquer infecção
ou inflamação56.
Em estudos brasileiros foi observada deficiência de vitamina A em
mulheres no pós-parto, com prevalência de até 20,5%7,6. A DVA também foi avaliada
em outros países. Na República do Congo foi observada em 14% das mulheres
lactantes8 e na Turquia nenhuma das lactantes apresentou a DVA nas duas cidades
avaliadas57.
A concentração de vitamina A no leite tem sido proposta como um
indicador do estado nutricional da vitamina para as lactantes e seus bebês, pois
reflete o fornecimento da vitamina A ao lactente, além de ser sensível às mudanças
de ingestão dietética da vitamina, e de mais fácil coleta do que o soro50,58,59. Valores
de retinol no leite maduro inferiores a 30 μg/dL (1,05 μmol/L ou 8 μg/g de gordura)
são indicativos de DVA60.
A DVA avaliada por esse indicador apresenta grande variação no Brasil,
com prevalência de 3% das lactantes em estudo realizado no nordeste25, 20% a
22
40% das lactantes da região sudeste9,24,61, chegando até 87,5% das lactantes
adolescentes no Rio de Janeiro27.
Outro indicador que pode ser avaliado para determinar a DVA é a
ingestão dietética de vitamina A, considerada um indicador precoce da deficiência,
pois um consumo alimentar inadequado é o primeiro estágio da carência
nutricional62,63.
O instrumento mais utilizado para avaliar a ingestão dietética de vitamina
A em lactantes é o questionário de frequência alimentar64,65,24. Porém, outros
estudos mostraram que a utilização de três recordatórios 24 horas, após a correção
da variabilidade do consumo intrapessoal, também permite uma estimativa mais
precisa da ingestão usual, da adequação alimentar e da prevalência de inadequação
de energia e nutrientes de grupos e populações do que o uso de apenas um
recordatório66,67.
Destaca-se que as gestantes e lactantes podem ser as mais afetadas
pela inadequação no consumo, uma vez que o requerimento dietético de vitamina A
aumenta durante este período, quando comparado as mulheres adultas não
gestantes ou não lactantes3. Em estudo realizado no Brasil foi observado que 22%
das mulheres apresentaram baixo consumo de vitamina A no último trimestre
gestacional7. Quando analisado o consumo alimentar de vitamina A no decorrer da
lactação, foi encontrada uma ingestão alimentar abaixo do recomendado em mais da
metade das lactantes estudadas no Brasil e na Indonesia24,65.
No Brasil, país classificado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e
pela Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) como sendo área de carência
subclínica, adota-se como estratégia de intervenção a suplementação com vitamina
A, realizada desde 198337. Em 2005, o Ministério da Saúde (MS) ampliou o
programa de suplementação para puérperas residentes nas áreas de maior risco,
com administração de dose única com 200.000 unidades internacionais (UI) via oral
no pós-parto imediato68, e em junho de 2016 essa medida foi encerrada, apesar das
pesquisas mostrarem concentrações aumentadas do retinol no leite 24 horas após a
suplementação64,69. Sendo assim, a estratégia de prevenção e controle da
deficiência de vitamina A para puérperas será pautada no estímulo ao consumo de
uma alimentação adequada e saudável, com base nas orientações do Guia
Alimentar para a População Brasileira69.
23
Não se sabe ainda as consequências da suspensão da suplementação de

puérperas no Brasil, sendo importante e necessária a realização de estudos que
mostrem se as mulheres lactantes fazem parte do grupo de risco para DVA, uma vez
que as exigências nutricionais da vitamina estão aumentadas nesse período para a
secreção no leite materno, e consequente garantia do suporte adequado ao lactente.
4.3 VITAMINA E
4.3.1 Funções e fontes alimentares
O termo vitamina E é utilizado para designar oito diferentes compostos
lipossolúveis denominados tocoferóis (α-, β-, δ- e γ-tocoferol) e tocotrienóis (α-, β-, δ-
e γ-tocotrienol) encontrados nos alimentos, diferindo entre si pela presença de
insaturações e pelo número de grupamentos metil nos tocotrienóis. O alfa-tocoferol é
a forma biologicamente mais ativa da vitamina E, representando aproximadamente
90% da vitamina encontrada em tecidos animais. As outras formas naturais da
vitamina não são consideradas para a demanda nutricional de vitamina E, pois,
embora possam ser absorvidas, não são convertidas para alfa-tocoferol pelos
humanos, além de serem fracamente reconhecidas pela proteína transportadora de
alfa-tocoferol (alfa-TTP) no fígado, apresentando-se, assim, em quantidades
mínimas na circulação quando comparadas as quantidades de alfa-tocoferol11.
A vitamina E tem como ação principal a proteção dos ácidos graxos
polinsaturados de cadeia longa das membranas celulares e das lipoproteínas contra
a oxidação70. É extremamente importante nos estágios iniciais de vida, desde a
concepção até o desenvolvimento pós-natal da criança, quando o feto passa para
um ambiente hiperóxido. Como a transferência placentária da vitamina E é limitada
durante a gestação, o leite humano é a única fonte de vitamina E para bebês em
aleitamento materno exclusivo, desempenhando importante fator de proteção contra
os possíveis danos causados pelos radicais livres, principalmente para as crianças
nascidas prematuramente (< 37 semanas gestacionais)17.
As principais fontes naturais do alfa-tocoferol são os óleos vegetais
polinsaturados, sementes, óleo de peixe, nozes, ovos, fígado, laticínios e vegetais
verdes4 .
As Dietary Reference Intakes recomendam a ingestão de 19 mg/dia de
vitamina E para lactantes de todas as idades, com intuito de repor a vitamina
secretada no leite e garantir o estado nutricional adequado2 (Quadro 2).
24
Quadro 2. Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina E para

indivíduos em diferentes estágios de vida.
Estágios da vida EAR (mg/dia) RDA/AI* (mg/dia) UL (mg/dia)
Bebês
0 a 6 meses ND 4* ND
7 a 12 meses ND 5* ND
Mulheres
14 a 18 anos 12 15 800
Acima de 19 anos 12 15 1000
Gestantes
≤ 18 anos 12 15 800
19 a 50 anos 12 15 1000
Lactantes
≤ 18 anos 16 19 800
19 a 50 anos 16 19 1000
EAR: Necessidade média estimada; RDA: Ingestão Dietética Recomendada; AI:
Ingestão adequada; UL: Limite superior tolerável de maior ingestão ND: Não foi
possível estabelecer este valor
2
Fonte: Institute of Medicine, 2000
4.3.2 Vitamina E e lactação

O mecanismo de transferência da vitamina E do sangue materno para o
leite não é conhecido, mas descarta-se uma transferência passiva com o
triglicerídeo pela diferença entre o perfil lipídico e alfa-tocoferol no leite71. Estima-se
que a secreção quantitativa de alfa-tocoferol para o leite siga uma cinética tipo
Michaelis-Menten para o transporte ativo através das membranas, quando a taxa de
secreção é independente da quantidade de leite produzida e secreção de gordura72.
Em vacas, o aumento da secreção de vitamina E no leite colostro foi associado a
uma maior atividade do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) na
glândula mamária73, e acredita-se que em humanos isso também ocorra, já que em
mulheres na lactação o alfa-tocoferol circulante foi primariamente relacionado às
frações LDL/lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL)74. Mas ainda não se sabe
qual a principal lipoproteína carreadora de alfa-tocoferol para a glândula mamária.
No leite materno as concentrações de vitamina E variam no decorrer da
lactação, sendo o colostro particularmente rico neste micronutriente48,75 e sua
ingestão pelo recém-nascido é essencial para fortalecer suas defesas contra a
25
toxicidade do oxigênio, evitando o aparecimento da DVE76. Além disso, a

composição da vitamina E no leite pode variar de acordo com a prematuridade, tipo
de parto e populações 15,19–22,26.
4.3.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina E

A dosagem do alfa-tocoferol sérico é o indicador mais utilizado para
avaliar o estado nutricional em vitamina E no grupo materno-infantil77. Para adultos,
independente da faixa etária ou gênero, atualmente, adota-se que uma
concentração abaixo de 517 μg/dL (<12 μmol/L) seja representativa da deficiência
de vitamina E2.
Poucos são os estudos que avaliaram a DVE na lactação. Em pesquisas
desenvolvidas em Natal-RN observam-se entre 16% e 19% de mulheres no pós-
parto imediato que estavam em risco e/ou DVE14,15. Um estudo realizado na África
do Sul encontrou uma prevalência de 70% de DVE em mulheres lactantes16.
Rodrigues (2016) também avaliou as concentrações séricas desta vitamina durante
a lactação, observando que a DVE aumentou no decorrer da lactação, sendo
encontrado 8,6% de mulheres no pós-parto imediato e 22,2% aos três meses de
lactação, além de observar também que as concentrações de alfa-tocoferol no leite
materno reduziram no decorrer da lactação22.
Entretanto, estes estudos não exploraram situações de estabelecimento
do aleitamento materno, como o seguimento da lactação no período do leite maduro,
nem associaram as concentrações séricas desta vitamina com o leite.
A avaliação do consumo alimentar e dietético de vitamina E também pode
ser um método importante para identificar o estado nutricional, uma vez que a
inadequação prolongada na ingestão da vitamina também está associada ao
desenvolvimento da DVE2. Entre os instrumentos utilizados para tal avaliação, o
recordatório de 24 horas é o mais empregado em estudos com mulheres na
lactação78,79,80,81. Após a correção da variabilidade do consumo intrapessoal, a
ingestão habitual da vitamina pode ser avaliada conforme o requerimento nutricional
diário (EAR) para determinação da prevalência de inadequação dietética de grupos
ou populações2.
Alguns estudos avaliaram o consumo alimentar em vitamina E de
mulheres na fase da lactação, mostrando uma elevada prevalência de inadequação,
26
chegando até 100% das lactantes com consumo habitual abaixo da recomendação
dietética (16 mg/dia)20,22,78,82,83.
A OMS recomenda a avaliação das concentrações de vitaminas no leite
materno como o único indicador do estado nutricional da mãe e do recém-nascido.
No entanto, apesar do conteúdo de alfa-tocoferol no leite ter sido o foco de alguns
estudos14,84,85, essa avaliação como parâmetro de diagnóstico nutricional ainda é
escassa.
Somado a isso, a maioria dos estudos brasileiros são realizados no leite
dos primeiros dias de lactação, sendo encontrado poucos que avaliaram o leite
maduro27,29,61,86,87, que é o período que caracteriza o estabelecimento do
aleitamento, e pode melhor caracterizar a real relação entre as concentrações
séricas das vitaminas e sua secreção no leite.
Nessa perspectiva, existem relatos teóricos sobre o fornecimento de
vitamina E via leite materno para atingir a recomendação nutricional do bebê. Foi
visto que o leite colostro e o de transição atendem as necessidades nutricionais da
criança, mas o leite maduro provavelmente não consegue fornecer a quantidade
diária de vitamina E recomendada29,83,88, sendo importante avaliar os fatores que
interferem nas concentrações das vitaminas no leite no decorrer da lactação,
principalmente, na fase do leite maduro, para que as lactantes e seus bebês que
estão em aleitamento materno sejam monitorados durante a assistência nutricional,
com consequente prevenção de DVA e DVE nesse grupo.
Além disso, as concentrações séricas materna de vitamina E tem relação
direta com o alfa-tocoferol do recém-nascido e da criança aos três meses de vida,
destacando-se que situações de concentrações limítrofes ou baixos de alfa-tocoferol
materno podem resultar em deficiência de vitamina E para a criança, reforçando a
importância da saúde materna na proteção à criança contra o estresse oxidativo22.
27
5 METODOLOGIA
5.1 ASPECTOS ÉTICOS E UNIVERSO AMOSTRAL
Todas as etapas do estudo foram aprovadas pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (CAAE 61189516.9.0000.5292) e desenvolvidas conforme normas
éticas de pesquisa envolvendo seres humanos (Apêndice 1).
O estudo foi do tipo longitudinal observacional, composto por mulheres
lactantes recrutadas no ambulatório de pediatria do Hospital Universitário Onofre
Lopes (HUOL), Natal-RN, no período de dezembro de 2016 a dezembro de 2017.
Foram convidadas a participar da pesquisa mulheres com 25 a 74 dias
pós-parto, que estavam na sala de espera do atendimento no ambulatório, sendo
incluídas as que estavam amamentando sua criança, seja de forma exclusiva ou
parcial, sem diagnóstico de doenças infectocontagiosas e síndromes de má
absorção de gorduras, não fumantes, sem uso de suplementos de vitamina A ou
vitamina E, e que tiveram partos com concepto único. Foi utilizado o período entre
25 e 74 dias pós-parto como o momento inicial da pesquisa, pelo fato de
compreender o período de 1 a 2 meses de idade do bebê, fase de estabelecimento
do aleitamento materno e para que na terceira coleta a mulher ainda estivesse em
aleitamento, tendo em vista que a média do número de meses de aleitamento
materno exclusivo no Brasil é de 2,2 meses e 9,1 meses para o aleitamento
materno89.
Foram excluídas as lactantes que não tiveram leite ou sangue suficiente
para a análise das vitaminas, que utilizavam diariamente suplementos contendo
vitamina A ou vitamina E durante a lactação e usuárias de drogas ilícitas.
A coleta de dados ocorreu em três momentos: a primeira de 25 a 74 dias
pós-parto; a segunda por volta de 30 dias após a primeira e a última coleta 30 dias
após a segunda.
O tamanho da amostra foi calculado no Software G*Power (versão
3.1.9.2)90 e resultou em número amostral mínimo de 28 participantes por grupo,
considerando a comparação entre três momentos dependentes. Para esse cálculo
adotou-se critérios mais conservadores para um teste bicaudal com alfa 0,05, poder
0,80 e medida de efeito elevado 0,80, tendo em vista as perdas no seguimento das
coletas de dados.
Adotou-se como perdas amostrais os casos de desistência da pesquisa
28
ou número de coletas de leite materno ou sangue inferior a três. Assim, inicialmente

foram recrutadas 116 lactantes e após as perdas e critérios de exclusão
permaneceram 43 mulheres. Desta forma, o número de lactantes arroladas foi
superior ao tamanho amostral calculado, para a previsão do alcance da quantidade
mínima de dados coletados no tempo final do seguimento do estudo.
5.2 COLETA DE DADOS

As coletas foram realizadas no ambulatório de pediatria do HUOL,
durante os retornos médicos para acompanhamento do crescimento e
desenvolvimento da criança. Caso a participante não retornasse ao ambulatório, as
amostras biológicas eram coletadas em visita domiciliar perante consentimento e
agendamento prévio.
Após a explanação dos objetivos e procedimentos da pesquisa, as
mulheres assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido em consonância
com o Comitê de Ética em Pesquisa do HUOL/UFRN (Apêndice 2), e foram
submetidas a coleta de leite e sangue, medidas antropométricas (peso e estatura) e
realização de entrevista com formulário semiestruturado (Apêndice 3), para
obtenção de dados socioeconômicos, parto, história clínica e dados dietéticos.
Informações dietéticas maternas e da criança, além de leite e sangue
materno, foram adquiridos em todas as coletas de seguimento, assim como o peso
da mãe (Figura 1). Não foi possível manter o número de coletas de leite e sangue
para todos os participantes pelos seguintes motivos: contato telefônico inválido
(mudança de número/número inexistente), não identificação/mudança do domicílio,
não comparecimento à consulta ou problemas/recusa na coleta de sangue e/ou leite
materno.
O leite materno foi obtido por expressão manual de única mama não
sugada previamente, sendo coletado no início e final da mamada (representado pelo
tempo final de amamentação da criança). Tal procedimento foi realizado por
evidências demonstrarem diferenças na composição de retinol entre os leites
anterior e posterior à mamada23.
As amostras de sangue das mulheres foram obtidas por enfermeiro ou
técnico de enfermagem do ambulatório de pediatria. Caso as amostras biológicas
fossem coletadas em visita domiciliar, essas foram coletadas por um técnico de
enfermagem participante do projeto. Todas as amostras foram coletadas em tubo de
29
polipropileno embalado em folha de alumínio e transportados em temperatura de

refrigeração. Este material foi transportado ao Laboratório de Bioquímica dos
Alimentos e da Nutrição do Departamento de Bioquímica da UFRN, em que o leite
materno foi armazenado a -20 ºC até o momento das análises. O sangue antes de
ser armazenado foi centrifugado por 10 minutos (4000 rpm), com posterior
separação de alíquotas de soro para determinação das vitaminas.
No seguimento, após a coleta de dados, todas as mulheres receberam
orientações sobre o manejo da lactação, doação de leite, alimentação saudável e
alimentos fontes de vitamina A e vitamina E, desenvolvidas no Projeto de Extensão
vinculado à pesquisa (Apêndice 4).
Figura 1. Desenho da coleta de dados da pesquisa.

30
5.3 EXTRAÇÃO DO RETINOL E ALFA-TOCOFEROL NO LEITE E SORO

MATERNO
5.3.1 Extração do retinol do leite materno
A extração de retinol nas amostras de leite foi realizada de acordo com o
método adaptado de Giuliano e colaboradores 91, em que para 1,0 mL de leite foram
adicionadas iguais quantidades de Etanol 95% (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), para
precipitação proteica, e Hidróxido de Potássio a 50% (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil),
para hidrolisar os ésteres de retinol. A mistura foi agitada por 1 minuto e levada a
banho-maria a 60ºC por 1 hora, sendo novamente agitada a cada 10 minutos.
Como reagente extrativo, adicionou-se 2 mL de Hexano PA (Vetec, Rio de
Janeiro, Brasil) por três etapas de extração. Cada uma das etapas foi agitada em
vortex e centrifugada (10 minutos, 4000 rpm), sendo o extrato hexânico separado e
colocado em outro tubo, totalizando 6 mL. Destes, foram separados 4 mL para
serem evaporados em banho-maria à 37°C. Os resíduos foram dissolvidos em 250
µL de etanol absoluto (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) e agitados por um minuto para
serem analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
5.3.2 Extração do retinol do soro materno e alfa-tocoferol do leite e soro

materno
O soro e leite materno foram analisados de acordo com o método
adaptado de Ortega e colaboradores92. Para 1,0 mL de soro/leite foi utilizada a
mesma quantidade de Etanol 95% (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) e 2 mL de Hexano
PA (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil). As amostras foram homogeneizadas durante 1
minuto em vortex e centrifugadas durante 10 minutos a 4000 rpm para separação da
camada de sobrenadante, que foi removida posteriormente para outro tubo.
Essas etapas da adição do hexano e retirada do sobrenadante ocorreram
por três vezes para extração do alfa-tocoferol no leite ou soro e do retinol no soro.
Por fim, 4 mL da camada reunida de sobrenadante foram evaporadas em banho-
maria à 37ºC e o extrato seco foi dissolvido em 250 µL de etanol absoluto (Vetec,
Rio de Janeiro, Brasil) para análise do retinol e alfa-tocoferol no soro, ou dissolvido
em 250 µL de diclorometano (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil): metanol (Sigma-Aldrich,
Estados Unidos) 2:1 (v:v) para análise do alfa-tocoferol no leite, para serem
analisados em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O método foi
adaptado para os casos de amostras com volume inferior a 1,0 mL, sendo
31
adicionado menor volume de etanol. A apresentação esquemática da metodologia

empregada na separação e determinação do retinol e alfa-tocoferol no soro e leite
encontra-se na figura 2.
Figura 2. Esquema ilustrativo do processo de extração de retinol e alfa-tocoferol do

soro e leite materno.
5.4 PREPARO DO PADRÃO DE RETINOL

O padrão estoque de retinol foi preparado com 1 mg de retinol sintético
(Sigma-Aldrich, Brasil) diluído em 1,0 mL de etanol 99% e agitado por 1 minuto. Em
seguida foram realizadas três diluições, sendo a última submetida à leitura em
espectrofotômetro a 325 nm, em cubeta de quartzo com capacidade para 1,0 mL.
Utilizou-se o coeficiente de extinção específico (ε 1%, 1 cm = 1780) em etanol
absoluto (Vetec) (Figura 3)93.
32
Padrão estoque 1 mg de retinol + 1 mL de etanol absoluto

(1 mg/mL)
Padrão de trabalho 1 0,1 mL de padrão estoque + 0,9 mL de etanol absoluto
Padrão de trabalho 2 0,1 mL de padrão trabalho 1 + 0,9 mL de etanol absoluto
Padrão de leitura
0,3 mL de padrão trabalho 2 + 0,7 mL de etanol absoluto
Leitura no espectrofotômetro
1,0 mL do etanol absoluto (branco)
1,0 mL do padrão leitura
Figura 3. Esquema das diluições do padrão de retinol para leitura no

espectrofotômetro
Fórmula usada para a determinação da concentração real do padrão: [ ] do Padrão = Aº / ε%
Onde: [ ] do padrão = concentração do padrão em gramas de retinol por 100 mL da solução de leitura
(g/%); Aº = leitura da absorbância realizada no espectrofotômetro; ε% = coeficiente de extinção
específico do retinol (ε% = 1780).
5.5 PREPARO DO PADRÃO DE ALFA-TOCOFEROL

O padrão estoque de alfa-tocoferol foi preparado com 18 mg de alfa-
tocoferol (Sigma-Aldrich, Brasil) diluído em 1,0 mL de etanol 99% e agitado por 1
minuto. Posteriormente foram realizadas duas diluições, sendo a última submetida à
leitura em espectrofotômetro a 292 nm, em cubeta de quartzo com capacidade para
1,0 mL. Utilizou-se o coeficiente de extinção específico (ε 1%, 1 cm = 75,8 a 292 nm)
em etanol 99% (Vetec) para quantificação da leitura (Figura 4)94.
33
Padrão estoque 18 mg de alfa-tocoferol + 1 mL de etanol absoluto

(18 mg/mL)
0,1 mL padrão estoque + 0,9 mL etanol absoluto

Padrão de trabalho
absoluto
0,05 mL padrão trabalho + 0,95 mL etanol absoluto

Padrão de leitura
absoluto
1,0 mL do etanol absoluto (branco)
1,0 mL do padrão leitura
18 mg
Leitura no espectrofotômetro alfa-tocoferol + 1 mL de etanol absoluto
Figura 4. Esquema das diluições do padrão de alfa-tocoferol para leitura no

espectrofotômetro
Fórmula usada para a determinação da concentração real do padrão: [ ] do Padrão = Aº / ε%
Onde: [ ] do padrão = concentração do padrão em gramas de alfa-tocoferol por 100 mL da solução de
leitura (g/%); Aº = leitura da absorbância realizada no espectrofotômetro; ε% = coeficiente de extinção
específico do alfa-tocoferol (ε% = 75,8).
5.6 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

As concentrações de retinol e alfa-tocoferol nas amostras foram
determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE (HPLC) em
cromatógrafo Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Japão), constituído de loop injetor de 20
µL, comunicador CBM 20A, bomba LC-20 AT, detector SPD-20A UV-VIS, coluna
C18 LIChrospher® 100 RP-18 (5 µm) (Merck, Darmstadt, Alemanha) e computador
com programa LC Solution (Shimadzu, Kyoto, Japão) para o processamento dos
dados.
O cromatograma evoluiu em eluição isocrática com fase móvel metanol
em grau de pureza para CLAE e fluxo de 1,0 mL por minuto em comprimento de
onda de 325 nm para o retinol e 292 nm para o alfa-tocoferol.
As concentrações de retinol e alfa-tocoferol foram identificadas e
determinadas por comparação com a área dos seus respectivos padrões (Sigma-
Aldrich, São Paulo, Brasil), em tempo de retenção de 3,9 minutos para o retinol e
10,3 minutos para o alfa-tocoferol. Os valores das vitaminas nas amostras foram
expressos em µmol/L.
34
5.6.1 Linearidade, exatidão e precisão do método

A fim de testar a linearidade do método utilizado para dosagem das
vitaminas A e E, duas curvas de calibração foram construídas por meio de regressão
linear (concentração versus área do pico). As curvas de calibração foram obtidas por
meio de análises de soluções padrão de retinol e alfa-tocoferol com diferentes
concentrações. As curvas de calibração foram consideradas lineares, uma vez que
os valores dos coeficientes de linearidade (R2) foram 0,9999 e 0,9971 para o retinol
e o alfa-tocoferol, respectivamente (Figura 5).
Figura 5. Curva de calibração dos padrões de retinol (A) e alfa-tocoferol (B) com
equação da reta (y) e coeficiente de regressão linear (R2).
A exatidão do método foi avaliada por meio do teste de recuperação. Para

realização desse teste, foi adicionado padrão interno em alíquotas da amostra teste
(soro ou leite), que foram submetidas à extração e analisadas em CLAE para
determinação da porcentagem de recuperação do padrão interno. Para o teste de
recuperação de retinol no leite, foram utilizadas 5 alíquotas, contendo 1 mL cada, do
pool de leite maduro e retinol sintético como padrão interno, obtendo-se uma
35
porcentagem de recuperação de 93,3%. O mesmo procedimento foi realizado para o

soro e a taxa de recuperação obtida foi de 107,0%. Para o teste de recuperação do
alfa-tocoferol no leite, foram utilizadas 5 alíquotas, contendo 1 mL cada, do pool de
leite maduro e o padrão interno foi o acetato de alfa-tocoferol, obtendo-se uma
recuperação de 97,6%. Esse teste de recuperação também foi feito para o alfa-
tocoferol no soro materno e a taxa de recuperação foi de 95,7%.
A precisão do método foi verificada por meio do teste de repetitividade,
com utilização de 3 alíquotas de uma mesma amostra (leite ou soro). Esse teste
consistiu na extração do retinol e do alfa-tocoferol dessas alíquotas e determinação
em CLAE em 3 dias alternados. O coeficiente de variação foi inferior a 4% para as
amostras de soro e leite materno.
A sensibilidade do método foi determinada quando soluções padrões
foram diluídas até se chegar a concentração mínima a ser detectada (Limite de
detecção - LoD) e quantificada (limite de quantificação – LoQ) no aparelho de CLAE.
O LoQ e LoD foram atingidos em concentração de 0,04 μg/mL de retinol e 0,05
μg/mL de alfa-tocoferol.
5.7 VALORES DE REFERÊNCIA

Concentrações de retinol no soro materno inferiores a 0,7 µmol/L (20
µg/dL) e inferiores a 1,05 µmol/L (30 µg/dL) foram indicativas de deficiência de
vitamina A no soro e leite, respectivamente95,60.
A deficiência de vitamina E foi confirmada quando encontrado valores de
alfa-tocoferol séricos inferiores a 12 µmol/L (< 517 μg/dL) na lactação96.
5.8 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL ANTROPOMÉTRICO

As medidas antropométricas atuais da mulher lactante (peso e altura)
foram coletadas de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde –
Sistema de Vigilância Alimentar e Nutricional97. As mulheres foram pesadas
descalças e usando roupas leves. Foram orientadas a retirar objetos pesados, tais
como chaves, cintos, óculos, telefones celulares e quaisquer outros objetos que
interferiam no peso total. A leitura foi realizada após o valor do peso estar fixado no
visor. A estatura foi verificada na posição de pé, posicionada no centro do
equipamento, descalça, com a cabeça livre de adereços e encostada em um
antropômetro vertical.
36
A avaliação do estado nutricional antropométrico da mulher lactante

também foi realizada pelo Índice de Massa Corporal (IMC), com informações de
peso e estatura referentes à coleta dos dados. O IMC foi classificado em baixo peso,
eutrofia, sobrepeso ou obesidade grau I, II ou III98.
Na avaliação do crescimento intrauterino do bebê utilizaram-se as curvas
de crescimento específicas para os recém-nascidos a termo (≥ 37 semanas)99 e
outra para os recém-nascidos pré-termo (< 37 semanas)100, que relacionam o peso
ao nascer referido com a idade gestacional (Anexo 1). Desta forma, os neonatos
foram classificados em Pequeno para a Idade Gestacional (PIG) quando a relação
peso/IG foi abaixo do percentil 10º, Adequado para a Idade Gestacional (AIG) os que
ficaram entre os percentis 10º e 90º, e Grande para a Idade Gestacional (GIG)
quando o índice encontrava-se acima do percentil 90º.
5.9 AVALIAÇÃO DO CONSUMO ALIMENTAR

O tipo de alimentação oferecida à criança foi obtido por questionamento
às mães sobre todos os alimentos/líquidos ofertados ao bebê na última semana. Tal
abordagem foi utilizada para verificar se a lactante estava oferecendo o aleitamento
materno exclusivo. O aleitamento foi classificado em exclusivo quando oferecido
apenas leite humano, seja via oral ou via enteral ou acrescido de suplementos
nutricionais específicos para o leite (leite humano fortificado). O aleitamento materno
foi determinado nos casos de ingestão de leite humano e outros leites, fórmulas
lácteas ou alimentos.
A ingestão de vitamina A e vitamina E das lactantes foi obtida por três
Recordatórios de 24 horas (R24h) aplicados nas coletas de dados, que consistiu no
relato de todos os alimentos, preparações, suplementos e bebidas consumidos nas
últimas 24 horas que antecederam a entrevista. As medidas caseiras descritas pelas
mulheres foram convertidas a gramatura ou mililitros com base nas padronizações
de livros e textos101,102,103.
Os inquéritos alimentares foram analisados no ambiente do software
Virtual Nutri Plus (http://www.virtualnutriplus.com.br/), considerando o banco de
alimentos construído por Rodrigues22. Nesse banco as informações nutricionais dos
alimentos e preparações foram retiradas da Tabela Brasileira de Composição de
Alimentos (TACO)104 e United States Department of Agriculture (USDA)105, da qual foi
retirada a informação da vitamina E.
37
Para avaliação do consumo habitual foi utilizado o Multiple Source

Method (MSM) (Departamento de Epidemiologia, Instituto Alemão de Nutrição
Humana, Potsdam-Rehbrücke, versão 1.0.1, https://msm.dife.de/), para correção da
variabilidade intrapessoal da ingestão de vitamina A e vitamina E, e, em seguida,
corrigida pelo teor de energia da dieta. Esse foi obtido pelo método de resíduos106,
empregando o software SPSS versão 21.0.
A prevalência de inadequação no consumo habitual de vitamina A e
vitamina E foi avaliado conforme o método da EAR (Estimated Average
Requirement), calculada a partir da área da curva que corresponde à proporção de
indivíduos com inadequação dietética, e avaliada na tabela de distribuição normal (Z
escore), adotando-se 900 μg de vitamina A e 16 mg/dia de vitamina E para mulheres
lactantes96,3.
Para avaliar a relação da ingestão dietética com os indicadores
bioquímicos, as mulheres lactantes foram divididas por quartis de consumo,
separando-as em dois grupos: de menor (até o percentil 25º) e de maior (acima do
percentil 25º) quartil de consumo das vitaminas. Desta forma, foram considerados
como percentil 25º os valores de 721,61 µg/dia e 6,55 mg/dia para a vitamina A e
vitamina E, respectivamente.
5.10 ANÁLISE ESTATÍTICA

As análises estatísticas foram realizadas pelo software IBM SPSS versão
estatística 21.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O teste de
normalidade Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para verificar a distribuição das
variáveis. Os resultados numéricos foram expressos em média (desvio padrão) e os
categóricos em frequências absolutas e percentuais.
A análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Tukey foi utilizada para
verificar as diferenças médias nos valores nos três momentos de coleta. Para avaliar
a relação entre o soro, leite materno e ingestão dietética habitual das vitaminas,
realizou-se o teste de correlação de Pearson. Além disso, foi realizado o teste t de
amostras independentes para comparar as concentrações médias de retinol e alfa-
tocoferol no soro e leite materno de acordo com os grupos de ingestão alimentar das
respectivas vitaminas. As diferenças foram consideradas significativas quando p ˂
0,05.
38
6 ARTIGO PRODUZIDO
6.1 O artigo intitulado “Relationship between dietary intake, vitamin A and vitamin E
concentrations in the serum and breast milk of cohort lactating women over the
course of lactation” foi submetido para publicação no periódico “Maternal & Child
Nutrition”, que possui fator de impacto 2.528 e Qualis A1 da CAPES para área de
Nutrição.
Relationship between dietary intake, vitamin A and vitamin E concentrations in

the serum and breast milk of cohort lactating women over the course of
lactation
Relationship between dietary intake and vitamin A and vitamin E
39
ABSTRACT
This study evaluated nutritional status of lactating women with regard to vitamin A
and vitamin E and the relationship between dietary intake and concentrations in
serum and milk. A longitudinal study was conducted with 43 women recruited at a
hospital in Brazil. The collection of blood samples, milk, and food intake occurred at
three moments in time, at 30-day intervals. Retinol and alpha-tocopherol were
analyzed by High Performance Liquid Chromatography. Dietary inadequacy was
analyzed according to the Estimated Average Requirement, with intrapersonal
variation adjusted by the Multiple Source Method. Food intake was also classified by
quartiles of consumption. Serum retinol was 1.65 μmol/L, with 5% of low
concentrations (< 0.7 μmol/L) at the first collection time. Serum alpha-tocopherol
decreased to 25.49 μmol/L at the third collection time (p=0.008), with an increase in
the percentage of deficiency (< 12 μmol/L). The vitamins in the milk had similar
values at the different collection times and the overall dietary inadequacy of vitamin A
and E was 58% and 100%, respectively. There was a correlation only between
vitamin A intake and serum retinol (r=0.403, p=0.007), and higher retinol
concentrations were found in women classified in the highest consumption quartile
(p=0.031). Over the course of lactation, there was a high degree of inadequacy in
vitamin intake and a reduction in serum alpha-tocopherol, while concentrations in
milk remained unchanged. Dietary intake of vitamin A has been shown to influence
serum retinol, which underscores the importance of adequate nutrition and
monitoring of vitamin deficiency during lactation.
Key-words: Breastfeeding, retinol, alpha-tocopherol, lactation, food consumption.
INTRODUCTION
During lactation, nutritional requirements are even higher than in the
period of pregnancy, due to the need to replenish the substantial quantities of
nutrients secreted in breast milk. Thus, an increase in dietary intake of most nutrients
during this period, including vitamin A and vitamin E, is recommended (Guiné &
Gomes, 2015, Institute of Medicine, 2000, 2001).
Vitamin A plays a role in vision, intercellular communication, cell growth,
and cell differentiation (Erdman Jr., Macdonald & Zeisel, 2012). Vitamin E acts as a
free-radical scavenger, combatting lipid peroxidation in lipoproteins and cell
40
membranes (Traber & Atkinson, 2007). Vitamin E is important for immune function,
inflammation control, and cognitive performance (Dror & Allen, 2011; Traber, 2014).
Vitamin A deficiency (VAD) is one of the major nutritional problems in the
world and is considered a public health problem in Brazil and other developing
countries (World Health Organization, 2013). VAD was observed in lactating women
during various stages of lactation, affecting up to 33% of the women studied (Lira,
Lima, Medeiros, Silva & Dimenstein, 2013; Ribeiro et al., 2010; Samba, Tchibindat,
Gourmel, Houzé & Malvy, 2013; Souza et al., 2012).
Vitamin E deficiency (VED) during lactation is not frequently reported in
the literature. Low concentrations of serum alpha-tocopherol were observed in
women in the immediate postpartum time period, which is directly related to the
vitamin E status of the newborns (Ribeiro et al., 2016; Lira, Ribeiro, Grilo, Lima &
Dimenstein, 2012). Over the course of lactation, in South Africa, 70% of lactating
women presented VED (Papathakis, Rollins, Chantry, Bennish & Brown, 2007),
which demonstrates the importance of studying these micronutrients during the
lactation phase as well as their relationship with breast milk. Breast milk should
contain adequate amounts of vitamin A and vitamin E, since newborns have low
reserves of these vitamins in their bodies at birth (Debier, 2007). This makes
breastfeeding an important strategy for combating nutritional deficiencies in children
(Grilo et al., 2015; Lima, Dimenstein & Ribeiro, 2014).
The composition of these vitamins in milk may vary according to the stage
of lactation, the period of breastfeeding (Ribeiro & Dimenstein, 2004), prematurity
(Rodrigues, 2016), and different populations (Gurgel et al., 2014; Jiang et al., 2016;
Lima, Dimenstein & Ribeiro, 2014). But there is no consensus as to whether maternal
nutritional status and dietary intake can directly affect the concentrations of these
vitamins in milk. Some studies have not found such a relationship (Ribeiro et al.,
2016; Deminice et al., 2018; Jiang et al., 2016; Lima et al., 2017; Lira et al., 2012),
and others have found positive or negative associations between these variables
(Fares et al., 2016; Azeredo & Trugo, 2008). Most of these analyses were performed
during the first 72 hours after delivery, in which secreted milk is termed colostrum and
contains high concentrations of vitamins independent of the concentrations
circulating in the mother’s body. It is important to explore this relationship during the
entire period of breastfeeding.
41
As these vitamins are of great importance during the stage of infancy and
because there is some reported evidence of low concentrations in breast milk
(Azeredo & Trugo, 2008; Lima et al., 2017; Lira et al., 2013; Medeiros et al., 2016;
Ribeiro et al., 2010; Silva et al., 2017; Souza et al., 2012), it is important to explore
the relationship between maternal nutritional status and milk composition over the
course of lactation, and mainly in the mature milk phase. Thus, the objective of this
study was to evaluate the nutritional status of vitamin A and vitamin E in women over
the course of their lactation, as well as the relationship between serum, breast milk
concentration and habitual dietary intake.
KEY MESSAGES
 Concentrations of maternal serum alpha-tocopherol were reduced over the
course of lactation, demonstrating that greater nutritional care at this period is
necessary.
 The alpha-tocopherol and retinol of mature milk remains unchanged during
lactation, even in situations of low vitamin intake and low nutritional status.
This suggests that maternal stocks are used to maintain adequate
concentrations in milk, thus guaranteeing the infant's intake.
 Dietary intake during lactation influences circulating retinol, and it is important
to maintain adequate nutrition during this period.
METHODS
Ethical aspects and sample universe
All stages of the study were approved by the Research Ethics Committee
of the Onofre Lopes University Hospital at the Federal University of Rio Grande do
Norte (CAAE 61189516.9.0000.5292). The study was developed according to ethical
norms of research involving human beings.
Study participants were lactating women recruited from the pediatric
outpatient clinic at the Onofre Lopes University Hospital (HUOL), in Natal, Rio
Grande do Norte, Brazil, from December 2016 to December 2017. Breastfeeding
mothers were eligible to be included regardless of whether they were breastfeeding
exclusively or partially. To be eligible, they must not have been diagnosed with an
infectious disease or a fat malabsorption syndrome, and they had to be non-smokers
who did not use vitamin A or vitamin E supplements during lactation, with single-
42
infant deliveries and without birth defects. Mothers were excluded if they did not have
enough milk or serum to analyze vitamin levels, if they took daily supplements
containing vitamin A or vitamin E, or if they used illicit drugs.
The sample size was calculated using G*Power Software (version 3.1.9.2)
(Faul, Erdfelder, Lang & Buchner, 2007) and resulted in a minimum sample size of
28 participants per group, considering the comparison between three dependent
moments. For this calculation, we adopted more conservative criteria for a two-tailed
test with alpha 0.05, power 0.80, and effect size 0.80, in order to foresee losses over
the course of data collection.
We considered a case to be a sample loss if a lactating mother withdrew
from the research study or if she participated in fewer than three collections of breast
milk and blood. Thus, 116 lactating women were initially recruited and 43 (Figure 1)
remained after exclusion criteria.
Data collection
The collections were performed at HUOL’s pediatric clinic or at a home
visit if there was prior consent and a scheduled visit. Data collection occurred at three
different moments in time: the first collection occurred between 25 to 74 days after
birth, the second data collection was about 30 days after the first period, and the last
data collection occurred 30 days after the second. This initial period was chosen
because it is the stage of establishment of breastfeeding and for the third collection
the woman was still breastfeeding, considering that the average number of months of
exclusive breastfeeding in Brazil is 2 months and 9 month for breastfeeding (Brazil,
2006).
Milk and blood samples were taken from lactating women, and
anthropometric measures (weight and height) as well as an interview with a semi-
structured form were also completed to obtain data on socioeconomic status,
childbirth, clinical history, and diet. Maternal and infant dietary information, as well as
maternal milk and blood, were acquired at all follow-up collections, as well as the
mother’s weight (Figure 1).
Two mL of breast milk were collected under fasting by manual
expression from a single breast that had not been recently nursed. The milk was
collected at the beginning and end of the feeding (represented by the final time of the
infant’s breastfeeding). A 5 ml blood sample was drawn, under fasting, via the
43
brachial vein, through venipuncture. All the biological samples were collected in
polypropylene tubes packed in aluminum foil, after which they were transported in
refrigeration units. Breast milk was stored at -20°C until the time of analysis. Before
being stored, blood samples were centrifuged for 10 minutes (at 4000 rpm), with
subsequent separation of serum aliquots for vitamin analysis.
After the data collection, all the women received guidance on the
management of lactation, milk donation, healthy food and food sources of vitamin A
and vitamin E, developed in the Extension Project linked to the research.
Chemical analysis
The extractions of alpha-tocopherol and retinol in the serum, as well as
the extraction of alpha-tocopherol in milk, were performed according to the method
adapted from Ortega et al. (Ortega, López-Sobaler, Quintas, Martínez, & Andrés,
1998), in which 95% Ethanol (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) was used for protein
precipitation. Hexano PA (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) was used as an extractive
reagent. The retinol extraction in the milk samples was performed according to the
method adapted from Giuliano et al. (Giuliano, Neilson, Kelly, & Canfield, 1992), in
which 95% Ethanol was used (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) as well as Hexano PA
(Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) and Potassium Hydroxide at 50% (Vetec, Rio de
Janeiro, Brazil) to hydrolyze the retinol esters.
After evaporation in an atmosphere of nitrogen, the residues were
dissolved in 250 μL of absolute ethanol (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) for analysis of
retinol and alpha-tocopherol in the serum and retinol in the milk. Alternately, residues
were dissolved in 250 μL of dichloromethane (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil):
methanol (Sigma-Aldrich, USA) 2:1 (v:v) for analysis of alpha-tocopherol in the milk,
to be analyzed through High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
The HPLC used a Shimadzu chromatograph (Shimadzu, Kyoto, Japan)
and a C18 LIChrospher® 100 RP-18 (5 μm) column (Merck, Darmstadt, Germany).
The chromatogram was developed in isocratic elution with a mobile methanol phase
and flow of 1.0 mL per minute, at a wavelength of 325 nm for retinol and 292 nm for
alpha-tocopherol. The vitamins in the samples were identified and quantified by
comparing their areas under the chromatographic curve with the standard area
(Sigma-Aldrich, Brazil). The concentration of the standard was confirmed by the
specific extinction coefficient of retinol (ε 1%, 1 cm = 1780 to 325 nm) and alpha-
44
tocopherol (1%, 1 cm = 75.8 to 292 nm) in absolute ethanol (Vetec, Rio de Janeiro,
Brazil).
Concentrations of maternal serum retinol below 0.7 μmol/L and below
1.05 μmol/L in milk were indicative of low vitamin A concentrations (West, Eilander &
Lieshout, 2002; WHO, 1996). Vitamin E concentration was classified as low when
serum alpha-tocopherol values < 12 μmol/L were found (Institute of Medicine, 2000).
Food intake assessment

The intake of vitamin A and vitamin E of lactating women was evaluated
by three 24-hour recalls (R24h) obtained from data collection, which consisted of
reporting all foods, supplements, and beverages consumed in the last 24 hours prior
to the interview. The home measures described were converted to grams or milliliters
based on the standards used in other books and texts (Araújo, Guerra, 2007; Brazil,
2011; Tomita, Cardoso, 2002).
The food surveys were analyzed using Virtualnutri Plus software
(http://www.virtualnutriplus.com.br/). Intrapersonal variation was corrected through
the Multiple Source Method (MSM) (Department of Epidemiology, German Institute of
Human Nutrition, Potsdam-Rehbrücke, version 1.0.1, https://msm.dife.de/). The
habitual consumption of vitamin A and vitamin E was determined from the three
R24h, with intake adjusted for the energy content of the diet. This was obtained by
the residuals method, using SPSS software version 21.0.
The prevalence of inadequacy of habitual nutrient intake was evaluated
according to the Estimated Average Requirement (EAR) method, calculated from the
area of the curve that corresponds to the proportion of individuals with dietary
inadequacy. It was evaluated in the normal distribution table (Z score), adopting 900
μg/day of vitamin A and 16 mg/day of vitamin E for lactating women (Institute of
Medicine, 2000; Institute of Medicine, 2001).
To evaluate the relationship between diet and biochemical indicators,
lactating women were divided by quartiles of consumption, separating them into two
groups: lower (up to the 25th percentile) and higher (above the 25th percentile)
quartile of vitamin intake. The 25th percentile was considered to refer to values of
721.6 μg/day and 6.6 mg/day for vitamin A and vitamin E, respectively.
45
Statistical analysis
Statistical analysis were performed using the IBM SPSS statistical
software version 21.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The Kolmogorov-
Smirnov normality test was applied to verify the distribution of the variables. The
numerical results were expressed as mean (standard deviation) and the categorical
results were expressed in absolute and percentage frequencies.
The variance analysis (ANOVA) with Tukey post-hoc test was used to
verify the mean differences in the values at the three collection times. To evaluate
the relationship between serum, breast milk, and habitual dietary intake of vitamins,
the Pearson correlation test was performed. In addition, the t-test on independent
samples was performed to compare the mean concentrations of retinol and alpha-
tocopherol in serum and breast milk according to the food intake groups of the
respective vitamins. The differences were considered significant when p ˂ 0.05.
RESULTS
General characteristics
The mean age was 27.8 (7.4) years old. The majority of the women were
of low socioeconomic status, 63% were overweight or obese at the at the first
collection, the mean gestational period at delivery was 36 (3.0) weeks, and 60% of
the women had a cesarean delivery. 86% of the women practiced exclusive
breastfeeding during the first data collection period (Table 1), and the percentages
went down to 74% and 73% at the second and third data collection times,
respectively. The majority of the newborns (85%) had adequate weight for their
gestational age, according to the birth weight / gestational age index (Villar et al.,
2015, WHO, 2006).
Vitamin A and Vitamin E Status

The mean serum retinol and maternal breast milk retinol values were 1.66
μmol/L and 1.57 μmol/L in all collections (p>0,05), respectively. No difference was
observed in the means over the course of lactation (Figure 2a). Low serum
concentrations of retinol were found only in the first collection, equivalent to 5%.
Concentrations of retinol below 1.05 μmol/L were identified in 12%, 14%, and 12% of
the milk at the three collection times, respectively. The habitual vitamin A intake
46
during lactation was 852.7 (274.6) μg/day, and dietary inadequacy was observed in
58% of the lactating mothers.
Serum alpha-tocopherol values were 30.18 (8.8) μmol/L at the first
collection time. The values decreased to 25.49 (9.3) μmol/L at the end of the study
period (p=0.008) (Figure 2b), with a consequent increase in the percentage of low
concentrations of vitamin E over the course of lactation, going from no cases at the
first collection time to 7% of the lactating mothers at the second and third collection
times. The concentration of alpha-tocopherol in breast milk was around 8 μmol/L in
all collection samples, and there was no difference in the means over the course of
lactation (p=0.737) (Figure 2b).
The habitual vitamin E intake was 7.0 (1.0) mg/day and dietary
inadequacy in the population studied was 100%, demonstrating that all lactating
women had vitamin E intake below nutritional recommendations (16 mg/day).
The relationships between biochemical indicators and habitual intake with

regard to retinol and alpha-tocopherol
When we correlated the serum vitamin concentrations with the respective
breast milk and dietary intake at the final collection time of the study, we found a
positive association between serum retinol and habitual vitamin A intake (r=0.403,
p=0.007) (Figure 3b).
When the women in the study were divided according to the vitamin A
quartile classification, a significant difference was observed in the mean
concentrations of serum retinol at the third collection time. Thus, lactating mothers
who had higher concentrations of serum retinol at the third collection time were in the
higher vitamin A intake group. When dividing women according to the vitamin E
intake rating (up to the 25th percentile versus above the percentile), no significant
differences were found in the concentrations of alpha-tocopherol at the third
collection time (Table 2).
DISCUSSION
Lactating women are considered to be a biologically vulnerable group, at
risk of presenting marginal or deficient nutritional status with regard to several
micronutrients and related compounds (Allen, 2005). Therefore, monitoring of
nutritional deficiencies and excesses is necessary to reduce the risks of
47
complications for mothers and, consequently, for babies who are exclusively
breastfed.
The present study reports on the concentrations of retinol and alpha-
tocopherol in serum and breast milk, in addition to the habitual dietary intake of these
vitamins, at three different moments of time during the mature milk phase of lactation.
The study also explores the relationships between these variables.
The concentrations of retinol in serum and breast milk observed in the
study were adequate, with a mean of 1.66 μmol/L in serum and 1.57 μmol/L in milk;
these are similar values to those found in the literature (Azeredo & Trugo, 2008; Kim
et al., 2018; Matamoros, Visentin, Ferrari, Falivene, & Fasano, 2018; Meneses &
Trugo, 2005; Souza et al., 2012). The percentage of low concentrations of retinol was
around 5%, according to the serum indicator, which corroborated data from other
studies of lactating women in Brazil (Azeredo & Trugo, 2008; Meneses & Trugo,
2005). In Brazil, VAD is considered a public health problem that has been monitored
by the World Health Organization, affecting a percentage of 10 to 20% of the
population (Brazil, 2013).
Deficient values were found in the breast milk of a maximum of 14% of the
lactating mothers, which is a result much lower than the results reported in other
states of Brazil, where proportions vary between 20% and 87% of the lactating
mothers who were studied 3,4,10,15.
Of the lactating women who were studied, the percentage who had dietary
inadequacy was 58%. These women may have a higher risk for low concentrations of
vitamin A in their serum and breast milk, because low dietary intake means that
hepatic retinol tends to be used, which impairs vitamin A status (Tanumihardjo et al.,
2016). Therefore, it is imperative that lactating women maintain adequate vitamin A
intake in order to avoid a loss of vitamin A in their breast milk in situations of
prolonged dietary inadequacy. Adequate vitamin A intake can prevent vitamin A
deficiency in the maternal-infant population.
Additionally, the present study found a relationship between habitual
vitamin A dietary intake and the concentration of retinol in maternal serum (Figure 3b
and Table 2), demonstrating that lactating mothers with higher intake of vitamin A
had a higher concentration of vitamin A in their serum at the third collection time (the
final period evaluated). This was the first study that showed this relationship by
analyzing women after 60 days of lactation. For lactating mothers in China, for the
48
same time period of study and categorizing dietary intake by food groups from three
24-hour recalls, this association was not found (Jiang et al., 2016).
The positive relationship between dietary intake and serum retinol
demonstrates the importance of a healthy and balanced diet, with adequate intake of
food sources of vitamin A. Therefore, to reduce the incidence of VAD in lactating
women, actions should be promoted that increase the availability and consumption of
food sources of vitamin A, with consideration of economic, social, and cultural
factors.
During lactation, a reduction in concentrations of alpha-tocopherol in
maternal serum was observed, with a consequent increase in cases of low vitamin
concentrations (Figure 2b). This finding is likely related to a decrease in circulating
lipids at this stage, or to a greater use of maternal vitamin E for milk secretion
(Institute of Medicine, 2000; Schweigert, Bathe, Chen, Büscher & Dudenhausen,
2004). This leads to a decrease in nutritional reserves if there is not adequate
consumption of vitamin E. This inadequacy was found amongst the study
participants, who had vitamin E consumption of 7.0 mg/day, which was less than
50% of the daily recommendation (16 mg/day).
Despite this reduction in serum alpha-tocopherol concentrations during
lactation, vitamin E in breast milk remained stable. There was no correlation between
these variables and diet, even in situations of dietary inadequacy of vitamin E (<16
mg/day). This finding reinforces the proposition that maternal vitamin E stocks are
used to maintain adequate concentrations of the vitamin in milk, thus guaranteeing
the supply of vitamin E to the baby (Traber, 2014).
The largest stock of alpha-tocopherol in the body is in adipose tissue
(about 90%), but the mechanisms involved in the transport of alpha-tocopherol to the
mammary gland and in the secretion in milk are not fully understood. It is believed
that part of the alpha-tocopherol reaches milk via low-density lipoprotein (LDL)
receptors, and another part may be transported through cell surface receptors (SR-
B1) that bind to LDL and to high-intensity lipoprotein (HDL). There is also a
suggestion that this occurs through lipoprotein lipase (LPL) and that it follows
Michaelis-Menten kinetics by active transport (Debier, 2007; Mardones & Rigotti,
2004; Dimenstein et al., 2010; Jensen, Johannsen, & Hermansen, 1999).
In this study, no association was found between serum alpha-tocopherol,
milk, and dietary intake of vitamin E (Figure 3d, 3e, 3f). This result may indicate that,
49
even in situations of low intake, alpha-tocopherol can be efficiently controlled,

particularly during lactation, in order to participate in oxidative processes and to
protect circulating lipids. This likely occurs through the use of body reserves and/or
uptake from other tissues, such as uptake from tissues of the mammary gland
(Traber, 2014).
Another factor that may affect the absence of an association between diet
and vitamin E concentrations is that all the women in the study had a low intake of
vitamin E. It is interesting to evaluate these relationships between biochemical
indicators and diet in situations of different levels of dietary intake. In addition, a
limitation of the study methods with regard to evaluating food consumption was that
the data depended on the interviewee's memory and under-reporting of nutrients in
the information tables on the chemical composition of food. This limitations are
minimized for correction intrapersonal variability in nutrient intake (Fisberg et al.,
2005).
During lactation, the mammary glands have a degree of metabolic
autonomy that ensures adequate composition of milk (Segura et al., 2016). However,
if there is dietary inadequacy, it is important to verify whether a woman's milk can
deliver adequate amounts of vitamin E up until the end of lactation.
It is interesting to note that there are few studies evaluating maternal
vitamin E levels during lactation and their relation to diet (Antonuchou, Chiou,
Andrikopoulos, Bakoula & Matalas, 2011; Aubuchon-Endsley, Kennedy, Gilchrist,
Thomas & Grant, 2015; Jiang et al., 2016; Martysiak-Żurowska et al., 2013). This
dearth of studies exists despite the extreme importance of wide-ranging nutritional
adequacy during the period of lactation to ensure the mother’s health as well as the
transfer of nutrients to breast milk for the infant’s benefit.
The results showed that lactating women are at nutritional risk for vitamin
A and vitamin E deficiency, and it was the first study to observe a reduction in serum
alpha-tocopherol concentrations over the course of lactation, with a consequent
increase in the percentage of low concentrations, while the composition of alpha-
tocopherol in mature milk remained unchanged.
These results demonstrate the need to better understand the mobilization
and use of retinol and serum alpha-tocopherol in breast milk, as well as to evaluate
the status of these vitamins over the course of lactation in different populations, so
50
that intervention measures can be implemented to offer nutritional assistance to

lactating women and to place them in a nutritional risk group.
Measures that may be effective include food and nutritional education
strategies as well as the promotion of better accessibility of foods that are sources of
vitamins. Other measures include strategies to fortify food, the use of supplements
when necessary, and a healthy and balanced diet. Changes in dietary intake may
improve concentrations of vitamin A and vitamin E and may provide adequate levels
of vitamins in human milk to protect the infant from deficiency in these vitamins.
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54
Table 1 Characteristics of socioeconomic status, demographics, health, prevalence

of inadequate intake of vitamins for lactating women. Natal, Rio Grande do Norte,
Brazil, 2016-2017.
Characteristics n % CI 95%
Level of education of the mother
Primary education incomplete 7 16.3 7.0 – 27.9
Primary education completed 5 11.6 2.3 – 20.9
Secondary education incomplete 7 16.3 7.0 – 27.9
Secondary education complete 18 41.9 25.6 – 55.8
Higher education completed 6 14.0 4.7 – 25.6
Family income levela
<1 Minimum wage 23 53.5 37.2 – 69.8
>1 Minimum wage 20 46.5 30.2 – 62.8
Number of children birthed by the mother
First child (1 child) 20 46.5 32.6 – 62.8
Multiple children (>1 child) 23 53.5 37.2 – 67.4
Type of birth
Normal 17 39.5 25.6 – 55.8
Cesarean 26 60.5 44.2 – 74.4
Classification of maternal BMI at the first
collectionb
Low weight 2 4.7 0.0 – 11.6
Normal 14 32.6 18.6 – 48.8
Overweight 10 23.3 11.6 – 37.2
Obese 17 39.5 25.6 – 53.5
Type of maternal breastfeeding at the first
collection
Exclusive maternal breastfeeding 37 86.0 74.4 – 95.3
Maternal breast milk and other milks c 5 14.0 4.7 – 25.6
Prevalence of inadequate habitual - 58 -
consumption of vitamin A
Prevalence of inadequate habitual - 100 -
consumption of vitamin E
a b
n, number. BMI, Body Mass Index. A Brazilian minimum wage per month = $US 291.5. WHO
c
Classification, 2000. Including cow’s milk, goat’s milk, and formula.
55
Table 2 Mean values (standard deviation) of serum retinol and serum alpha-
tocopherol and maternal breast milk according to categories of habitual intake of
these micronutrients in the maternal diet. Natal, Rio Grande do Norte, Brazil, 2016-
2017.
Biochemical Indicators of Lower intake of Higher intake of p value
Retinol vitamin A (≤ p25) vitamin A (> p25)
Serum Retinol (μmol/L) 1.48 (0.31) 1.75 (0.31) 0.031 *

n = 10 n = 33
Retinol in breast 1.40 (0.48) 1.67 (0.37) 0.126

milk (μmol/L)
n = 10 n = 32
Biochemical indicators of Lower intake of Higher intake of p value

alpha-tocopherol vitamin E (≤ p25) vitamin E (> p25)
Serum alpha-tocopherol 21.18 (8.69) 26.98 (9.11) 0.076

(μmol / L)
n = 11 n = 32
Alpha-tocopherol in human 8.57 (5.19) 9.05 (4.83) 0.794

milk (μ mol / L)
n = 11 n = 31
T-test of independent samples * Significant difference between means, considering p <0.05.

56
Figure 1 Research design regarding data collection

57
Figure 2 Concentrations of retinol and alpha-tocopherol in serum and breast milk of

lactating women over the course of lactation. Natal, Rio Grande do Norte, 2016-2017.
A: Retinol concentrations in serum and maternal milk at collection time 1 (25 to 74 days postpartum),
collection time 2 (30 days after collection 1) and collection time 3 (30 days after collection 2). ANOVA
Test with Tukey post-hoc test. B: Concentrations of alpha-tocopherol in serum and maternal milk at
collection time 1 (25 to 74 days postpartum), collection time 2 (30 days after collection 1) and
collection time 3 (30 days after collection 2). ANOVA Test with Tukey post-hoc test. * Significant
difference between means, considering p <0.05.
58
Figure 3 Correlations between biochemical indicators and the habitual intake of

vitamin A and vitamin E for lactating women at the time of the third collection. Natal,
Rio Grande do Norte, Brazil, 2016-2017.
r = Pearson's correlation coefficient. p value = level of significance.
59
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo encontrou um maior percentual de baixas concentrações de
retinol no leite materno (12% a 14%) do que na avaliação do retinol sérico, além de
observar que as concentrações séricas e do leite materno dessa vitamina se
mantiveram inalteradas no período investigado. Em contrapartida, foi o primeiro
estudo a observar uma redução nas concentrações de alfa-tocoferol sérico no
seguimento da lactação, com consequente aumento do percentual de baixas
concentrações, enquanto que a composição do alfa-tocoferol no leite maduro
permaneceu inalterada.
A inadequação dietética foi de 58% e 100% das vitaminas A e E,
respectivamente, demonstrando que esse grupo pode ser de risco nutricional. Além
disso, encontrou uma relação entre a ingestão dietética de vitamina A e as
concentrações séricas de retinol, demonstrando que quanto maior o consumo da
vitamina A, maior a concentração de retinol no soro materno.
Tais resultados mostram a necessidade de melhor compreender a
mobilização e utilização do retinol e alfa-tocoferol sérico para o leite materno, assim
como avaliar o status dessas vitaminas no seguimento da lactação em diferentes
populações, para que possam ser implementadas medidas de intervenção na
assistência nutricional de mulheres lactantes e as coloquem em grupo de risco
nutricional.
Entre as medidas que podem ser eficazes estão as estratégias de
educação alimentar e nutricional, assim como a promoção da acessibilidade ao
consumo de alimentos fontes das vitaminas, estratégias de fortificação de alimentos,
uso de suplementação quando necessário, bem como uma alimentação saúdavel e
equilibrada como um todo. Uma vez que mudanças no consumo alimentar podem
melhorar as concentrações de vitamina A e vitamina E, e possivelmente garantir
suporte adequado das vitaminas no leite humano para proteger o lactente da
deficiência dessas vitaminas.
60
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70
APÊNDICES
71
APÊNDICE 1 - Parecer técnico

72
73
74
APÊNDICE 2 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
EMPRESA BRASILEIRA DE SERVIÇOS HOSPITALARES

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ONOFRE LOPES
GERÊNCIA DE ENSINO E PESQUISA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – TCLE

Esclarecimentos
Este é um convite para você participar da pesquisa: Estado nutricional em
vitamina A e vitamina E de mulheres no seguimento da lactação, que tem como
pesquisador responsável Prof. Dra. Karla Danielly da Silva Ribeiro Rodrigues.
Esta pesquisa pretende avaliar o estado nutricional materno em vitamina A e
vitamina E, a partir da análise de retinol e alfa-tocoferol no sangue e leite.
O motivo que nos leva a fazer este estudo é que há necessidade de pesquisas que
avaliem o estado nutricional em vitamina A e vitamina E de mães que amamentam, com o
intuito de avaliar a presença da deficiência destas vitaminas neste grupo, e que determine
se o estado nutricional da mãe vai influenciar na composição do leite materno e na saúde da
criança no período da lactação.
Caso você decida participar, você deverá responder três questionários da pesquisa:
um no primeiro dia, o segundo no máximo no dia 90 após o parto e o último no máximo no
dia 180 após o parto, com informações sobre sua alimentação e a do bebê. Cada
questionário será preenchido em média durante 30 minutos. Durante estes três encontros
serão coletados 2 mL de leite de peito e 5 mL de seu sangue, além de ser aferido seu peso
e sua altura. Esse material coletado servirá para analisar a quantidade de vitamina A e
vitamina E, e será armazenado no Laboratório de Bioquímica da Nutrição e dos Alimentos
da UFRN.
Durante a realização da coleta de dados, sangue e leite de peito a previsão de riscos
é mínima, ou seja, o risco que você corre é semelhante àquele sentido num exame físico ou
psicológico de rotina, podendo haver riscos referente à contaminação.
Pode acontecer um desconforto na região afetada que será minimizado, já que a
coleta desse material será realizada por profissionais treinados, com uso de equipamentos
de proteção individual, como máscara, luvas, agulhas e seringas descartáveis e você terá
como benefício a informação da quantidade de vitamina A e vitamina E presente em seu
leite e sangue, podendo receber orientações alimentares para o período da amamentação.
1/3
Rubrica do Participante/Responsável legal: Rubrica do Pesquisador:
75

Em caso de algum problema que você possa ter, relacionado com a pesquisa, você
terá direito a assistência gratuita que será prestada pela Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
Durante todo o período da pesquisa você poderá tirar suas dúvidas ligando para
Karla Danielly da Silva Ribeiro Rodrigues, telefone (84) 3342-2291, e-mail:
karladaniellysr@yahoo.com.br.
Você tem o direito de se recusar a participar ou retirar seu consentimento, em
qualquer fase da pesquisa, sem nenhum prejuízo para você.
Os dados que você irá nos fornecer serão confidenciais e serão divulgados apenas
em congressos ou publicações científicas, não havendo divulgação de nenhum dado que
possa lhe identificar.
Esses dados serão guardados pelo pesquisador responsável por essa pesquisa em
local seguro e por um período de 5 anos.
Se você tiver algum gasto pela sua participação nessa pesquisa, ele será assumido
pelo pesquisador e reembolsado para você.
Se você sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta pesquisa, você será
indenizado.
Qualquer dúvida sobre a ética dessa pesquisa você deverá entrar em contato com o
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes, telefone: 3342-5003,
endereço: Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis – Espaço João Machado – 1° Andar – Prédio
Administrativo - CEP 59.012-300 - Nata/Rn, e-mail: cep_huol@yahoo.com.br.
Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra com o
pesquisador responsável Karla Danielly da Silva Ribeiro Rodrigues.
2/3
76

Consentimento Livre e Esclarecido
Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados
serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que
ela trará para mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da
pesquisa Estado nutricional em vitamina A e vitamina E de mulheres no seguimento da
lactação, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em congressos e/ou
publicações científicas desde que nenhum dado possa me identificar.
Natal, ___ de ________________de ________.
__________________________________________
Assinatura do participante da pesquisa
Impressão
datiloscópica do
participante
Declaração do pesquisador responsável
Como pesquisador responsável pelo estudo Estado nutricional em vitamina A e

vitamina E de mulheres no seguimento da lactação, declaro que assumo a inteira
responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente e direitos que
foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo, assim como manter sigilo e
confidencialidade sobre a identidade do mesmo.
Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido
estarei infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução 466/12 do Conselho
Nacional de Saúde – CNS, que regulamenta as pesquisas envolvendo o ser humano.
Natal, ___ de ________________de ________.
_______________________________________________
Karla Danielly da Silva Ribeiro Rodrigues
3/3
77
APÊNDICE 3 - Formulário da pesquisa

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO
PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
QUESTIONÁRIO DO PROJETO “ESTADO NUTRICIONAL EM VITAMINA A E VITAMINA E DE
MULHERES NO SEGUIMENTO DA LACTAÇÃO”
Nº: _________
001 Número do questionário __ __ __ [ ]
002 Nome do entrevistador _______________________ [ ]
003 Data de aplicação do questionário __ /__/____ __/__/__
(dd/mm/aaaa) (Dia/Mês/Ano)
CARACTERIZAÇÃO DA ENTREVISTADA
004 Nome: ____________________________________________________
__________________________________________________
Nome da Criança: ___________________________________________________

___________________________________________________
Para qual médico
está marcada a
consulta? ___________________________________________________
005 Endereço: ____________________________________________________
__________________________________________________
Telefone: ___________________________________________________
006 Data de nascimento __ /__/____ [ ]
Qual sua idade em (dd/mm/aaaa)
anos completos?
__ __
007 Atualmente qual seu 01. Solteira 03. Divorciada
estado civil? 02. Casada/ União estável 04. Viúva [ ]
008 Qual seu nível de 01. Analfabeta
escolaridade? 02. Ens. Fundamental Incomp./Parou em que série?______
03. Ensino Fundamental Completo
04. Ensino Médio Incompleto/Parou em que série? ______ [ ]
05. Ensino Médio Completo
06. Graduação Incompleta/Parou em que período? ______
07. Graduada
08. Pós-graduada
00. Não se aplica
009 Fez algum supletivo? 01. Sim _________________________
02. Não
010 Qual sua ocupação? 01. Trabalha _____________________
02. Dona de casa [ ]
03. Não trabalha
011 Número de
moradores na casa? __ __ [ ]
(incluindo o bebê)
012 Qual o rendimento 01.Sem renda
mensal da sua 02. Até 1 salário mínimo (até R$ 937,00)
família? (Devem ser 03. De 1 a 3 salários mínimos (de R$ 937,00 a R$
somados todos os 2.811,00)
rendimentos das 04. De 3 a 5 salários mínimos (de R$ 2.811,00 a R$ [ ]
pessoas da família 4.685,00)
que moram na 05. De 5 a 7 salários mínimos (de R$ 4.685,00 a R$
mesma casa) 6.559,00)
06. De 7 a 10 salários mínimos (de R$ 6.559,00 a R$
9.370,00)
07.De 10 a 20 salários mínimos (de R$ 9.370,00 a
R$18.740,00)
08. Acima de 20 salários mínimos (acima de R$ 18.740,00)
78
09. Não sabe

00.Não respondeu
013 Número de filhos? __ __ [ ]
014 Número de abortos? __ __ [ ]
015 Possui alguma 01. Sim ___________________________ [ ]
doença? 02. Não
016 Atualmente você 01. Sim Se sim, quantos cigarros ao dia? _________ [ ]
fuma? 02. Não
017 Utilizou algum 01. Sim ___________________________ [ ]
medicamento, 02. Não
vitamina ou
suplemento durante
a gestação? Se sim,
qual?
018 Tomou a megadose 01. Sim
de Vitamina A após o 02. Não
parto?
019 Realizou 01. Sim ___________________________ [ ]
acompanhamento 02. Não
nutricional após o
parto? Se sim,
quantas vezes?
020 Utilizou algum 01. Sim ___________________________ [ ]
medicamento, 02. Não
vitamina ou
suplemento após o
parto? Se sim, qual?
DADOS DO PARTO
021 Qual foi seu peso na última _______kg [ ]
consulta da gestação? 00. Não se aplica
022 Data do parto/ Horário __/__/__ __/___/____
(dd/mm/aaaa)
___ h
023 Tipo de parto 01. Normal [ ]

02. Cesário
00. Não se aplica
024 Sexo do Recém-nascido 01. Masculino [ ]
(RN) 02. Feminino
025 Peso ao nascer do RN ______kg [ ]
026 Comprimento nascer do ______cm [ ]
RN
027 Estado nutricional do RN 01. <1500g muito baixo peso [ ]
02. 1500-2500g baixo peso
03. 2500-4000g adequado
04. >4000g Macrossomia
028 Idade gestacional ________ sem [ ]
029 Intercorrências da criança ___________________________________
ao nascer ___________________________________
___________________________________
79
DADOS ANTROPOMÉTRICOS
030 Altura atual _______ m [ ]
00. Não se aplica
031 Peso atual (30-60 dias) _______kg [ ]
00. Não se aplica
032 Estado nutricional atual 01. Baixo peso (IMC<18,5 kg/m2) [ ]

(30-60 dias): 02. Normal (IMC 18,5 - 24,9 kg/m2)
IMC = _______ 03. Sobrepeso (IMC 25 - 29,9 kg/m2)
04. Obesidade (IMC ≥ 30,0kg/m2)
00. Não se aplica
033 Perda peso: 01. Sim [ ]
___________________________
02. Não
034 Intercorrências: ___________________________________
___________________________________

00. Não se aplica

00. Não se aplica
___________________________
02. Não
___________________________________

00. Não se aplica

05. 00. Não se aplica
___________________________
02. Não
___________________________________
80
ALIMENTAÇÃO DA CRIANÇA
043 Alimentação infantil dia 30-60 (A) 01. Aleitamento materno exclusivo [ ]
______________________ 02. Aleitamento materno (LM e outros leites/fórmulas)
______________________ 03. Leite materno + Alimentação complementar
______________________
______________________ Número de Mamadas ao dia (Quando não for AME)?
044 Alimentação infantil dia 60-90 (B) 01. Aleitamento materno exclusivo [ ]
______________________
045 Alimentação infantil dia 120-180 (C) 01. Aleitamento materno exclusivo [ ]
______________________
DADOS DA COLETA
046 Sangue e leite 30-60 dias (A) Data da Coleta: __ / ___ / _____
Horário da coleta: ___: ____
Horário da última refeição: ___: ____
047 Sangue e leite 60-90 dias (B) Data da Coleta: __ / ___ / _____
048 Sangue e leite 120-180 dias (C) Data da Coleta: __ / ___ / _____
Data: _____________Assinatura do entrevistador: ___________________________________

81
( ) 30-60 dias (A)

Nº: _________ ( ) 60-90 dias (B)
RECORDATÓRIO 24 HORAS ( ) 120-180 dias (C)
Nome: ________________________________________________________________
Peso: _______________ Altura: _____________________
Faz uso de suplemento nutricional? ( ) Sim, qual? _________________ ( ) Não
REFEIÇÃO ALIMENTO MEDIDA CASEIRA QTDE OBS.

/HORÁRIO/
LOCAL
DATA: _____/ _____/ _____ Responsável: __________________________________

82
APÊNDICE 4 - Orientações às lactantes

83
84
APÊNDICE 5 – Publicações e projetos relacionados a dissertação
Artigos em fase de submissão

1 – Silva, A.G.C.L et al. Relationship between dietary intake and vitamin A and
vitamin E concentrations in the serum and breast milk of women over the course of
lactation. Maternal and Child Nutrition.
2 – Mata, A.M.B.; Silva, A.G.C.L et al. Influence of dietary intake of polynesaturated
fatty acids in the concentration of alpha-tocopherol of human Milk. British Journal of
Nutrition.
Publicações em congressos/eventos científicos

1 – Mendonça, B.M.A; Fernandes, E.AD.; Oliveira, J.L.D.; Silva, L.T.P.; Silva, N.L.N.;
Rebouças, A.S.; Silva, A.G.C.L.; Dametto, J.F.S.; Ribeiro, K.D.S.; Dimenstein, R.
Concentrações de retinol e alfa-tocoferol no leite maduro. Congresso Brasileiro de
Extensão Universitária. 2018.
2 – Felgueiras, V.F.; Silva, R.L.M.; Sousa, A.L.; Medeiros, J.O.; Rebouças, A.S.;
Silva, A.G.C.L.; Dametto, J.F.S.; Ribeiro, K.D.S.; Dimenstein, R. Orientações do
consumo de alimentos fontes de vitamina A e vitamina E para lactantes. Congresso
Brasileiro de Extensão Universitária. 2018.
3 – Silva, D.C.N.; Oliveira, A.M.; Melo, A.T.M.; Carneiro, B.R.; Silva, E.A.F.;
Rebouças, A.S.; Silva, A.G.C.L.; Dametto, J.F.S.; Ribeiro, K.D.S.; Dimenstein, R.
Promoção do aleitamento materno exclusivo e doação ao banco de leite humano.
Congresso Brasileiro de Extensão Universitária. 2018.
4 – Silva, D.C.N.; Rebouças, A.S.; Silva, A.G.C.L.; Ribeiro, K.D.S.; Dimenstein, R.
Caracterização e prevalência de aleitamento materno exclusivo em uma população
atendida na rede pública de saúde de Natal/RN, Brasil. IV Congresso Norte e
Nordeste de Nutrição Clínica e Esportiva. 2018.
Projeto de pesquisa cadastrado Propesq

PVD14419-2017 Estado nutricional em vitamina A e vitamina E de mulheres
lactantes.
1 bolsa.
85
Projeto de extensão cadastrado Proex

PJ025-2017 O cuidado nutricional da mulher que amamenta: práticas de promoção
ao aleitamento materno e combate a deficiência de vitamina A e vitamina E no
binômio mãe-filho.
3 bolsas.
PJ187-2018 O cuidado nutricional da mulher que amamenta: práticas de promoção

ao aleitamento materno e combate a deficiência de vitamina E no binômio mãe-filho.
86
ANEXOS
87
ANEXO 1 - Referencial para avaliar o crescimento intrauterino segundo índice peso

ao nascer para a idade
2.1 - Recém-nascidos pré-termo (<37 semanas) (VILLAR et al., 2014)
88
89
2.2 - Recém-nascidos termo (≥ 37 semanas) (WHO, 2006)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

ANA GABRIELLA COSTA LEMOS DA SILVA

ESTADO NUTRICIONAL EM VITAMINA A E VITAMINA E DE MULHERES

ANA GABRIELLA COSTA LEMOS DA SILVA

ESTADO NUTRICIONAL EM VITAMINA A E VITAMINA E DE MULHERES

Dissertação de mestrado apresentada ao

Orientador (a): Prof (a). Dr (a). Karla Danielly

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Silva, Ana Gabriella Costa Lemos da.

Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Universidade Federal do

1. Aleitamento materno - Dissertação. 2. Retinol -

RN/UF/BSCCS CDU 613.287.2

ANA GABRIELLA COSTA LEMOS DA SILVA

ESTADO NUTRICIONAL EM VITAMINA A E VITAMINA E DE MULHERES

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Nutrição

Aprovada em ____ de ___________________________ de ________.

Profa Dra Lúcia de Fátima Campos Pedrosa

Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição

Ao professor Roberto Dimenstein pelo acolhimento no laboratório, por ter aceitado

À professora Karla Danielly por ter aceitado me co-orientar, e, posteriormente,

À Juliana Dametto e Larissa Lira pelo acolhimento e ensinamentos iniciais no

À Amanda Rebouças pela amizade e apoio no desenvolvimento desse trabalho.

Às alunas de iniciação científica do laboratório, sem elas o desenvolvimento desse

Às técnicas de enfermagem que ajudaram nas coletas de sangue das mães,

Às mães que se dispuseram a participar dessa pesquisa e por terem permitido

À minha turma de mestrado, principalmente, às minhas amigas Beatriz Luz, Karen

À UFRN e o Programa de Pós-graduação em nutrição, professores e funcionários,

Aos profissionais do ambulatório de pediatria do Hospital Universitário Onofre Lopes

A todos, muito obrigada!

Palavras-chaves: Aleitamento materno, retinol, alfa-tocoferol, lactação, consumo

In lactation, women need a greater nutritional intake both to replenish nutrients

Key-words: Breastfeeding, retinol, alpha-tocopherol, lactation, food consumption.

Quadro 1 – Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina A para

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AI Adequate Intake (Ingestão adequada)

QFA Questionário de frequência alimentar

secretado é denominado colostro e contem altas concentrações das vitaminas

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A composição do leite materno muda ao longo da lactação 19. Lee e

A capacidade de sintetizar compostos com atividade de vitamina A está

Quadro 1. Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina A para

Estágios da vida EAR (µg/dia) RDA/AI* (µg/dia) UL (µg/dia)

4.2.2 Vitamina A e lactação

4.2.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina A

Não se sabe ainda as consequências da suspensão da suplementação de

Quadro 2. Recomendações dietéticas (EAR, RDA, AI e UL) de vitamina E para

4.3.2 Vitamina E e lactação

toxicidade do oxigênio, evitando o aparecimento da DVE76. Além disso, a

4.3.3 Indicadores do estado nutricional e deficiência de vitamina E

ou número de coletas de leite materno ou sangue inferior a três. Assim, inicialmente

5.2 COLETA DE DADOS

polipropileno embalado em folha de alumínio e transportados em temperatura de

Figura 1. Desenho da coleta de dados da pesquisa.

5.3 EXTRAÇÃO DO RETINOL E ALFA-TOCOFEROL NO LEITE E SORO

5.3.2 Extração do retinol do soro materno e alfa-tocoferol do leite e soro

adicionado menor volume de etanol. A apresentação esquemática da metodologia

Figura 2. Esquema ilustrativo do processo de extração de retinol e alfa-tocoferol do

5.4 PREPARO DO PADRÃO DE RETINOL

Padrão estoque 1 mg de retinol + 1 mL de etanol absoluto

Padrão de trabalho 1 0,1 mL de padrão estoque + 0,9 mL de etanol absoluto

Padrão de trabalho 2 0,1 mL de padrão trabalho 1 + 0,9 mL de etanol absoluto

Figura 3. Esquema das diluições do padrão de retinol para leitura no

Aprovada em de _______________ de .

Data: _Assinatura do entrevistador: _______________________

Data: _Assinatura do entrevistador: _______________________

Data: _Assinatura do entrevistador: _______________________

Peso: _ Altura: _______

DATA: ___/ _/ _ Responsável: ________________________________