Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. LUCRAREA 4 Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-continuu in industria alimentara, acidul lactic (CsHeOs) este considerat in prezent ca fiind una dintre cele mai utilizate substante chimice pentru conservare, corectia aciditatii sau aromatizare. in plus, acidul lactic si- a gsit aplicatii in industria cosmetic, farmaceutica si chimicd pentru productia de lactat de etil, 2,3-pentandiona, acid propancic, acid acrilic, acetaldehida, dilactati ete. in ultimii ani, consumul de acid lactic a crescut datorité utiizarii sale ca monomer in productia de acid polilactic, un cunoscut material bio-plastic (Wee et al., 2006). Acidul lactic poate fi obtinut atét pe cale biotehnologica, prin procese fermentative, ct si prin sinteza chimica din resurse petroliere. Daca prin sinteza chimica se obtine un amestec racemic de acid (DL)- lactic, prin fermentatie se pot produce izomeri optici puri, 0 conditie esentiala pentru productia de acid polilactic cristalin, adecvat pentru comercializare. Din acest motiv si din faptul c& reprezinta o alternativa atractiva pentru reducerea poluarii mediului cauzaté de industria petrochimica, productia biotehnologicd de acid lactic se bucuré de interes semnificativ in ultimii ani (Abdel-Rahmana et al., 2013) Microorganismele capabile s& produca acid lactic sunt impartite in doua grupuri, si anume bacteriile si fungii, primele fiind cele mai des utilizate. Bacteriile lactice se impart la réndul lor in doua grupuri, homofermentative si heterofermentative. Bacterile__lactice homofermentative transforma glucoza direct in acid lactic, pe cand cele heterofermentative produc, pe langa acid lactic, etanol si COz Cultivarea bacteriilor lactice pentru obtinerea de acid lactic se doreste a fi realizaté pe materii prime ieftine precum amidonul, materialele celulozice, zer sau melasa [3]. Dintre acestea materialele celulozice (e.g. stiuleti de porumb, degeuri din hartie, lemn, fibr de lucerna, trate de gréu, coceni de porumb, paie de grau etc.) se oeLucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. bucura la ora actualé de cel mai ridicat interes datorité abundentei acestora. Productia, la scard pilot sau industriala, de acid lactic se realizeazé in bioreactoare inchise operate atat in regim discontinuu (sarja) cat si jin regim semi-continuu si continu, fiecare prezentand avantaje si dezavantaje. In aceasta lucrare vom studia productia de acid lactic intr-un proces semi-continuu, deoarece este cel mai atractiv pentru domeniul industrial unde se folosesc bioreactoare foarte mari. Un proces continu ar duce la irosirea substratului pentru ca nu va fi consumat complet in timpul procesului, iar un proces discontinuu este ineficient pentru c& steriizarea bioreactoarelor industriale pline cu substrat este aproape imposibilé. Un proces semi-continuu are avantajul ca bioreactorul este sterilizat gol, iar substratul este sterilizat continu in exteriorul acestuia. Procesul va pomi de la un volum de substrat mic, iar bioreactorul va fi alimentat pana va atinge volumul maxim cnd alimentarea va fi oprité. Poate urma o perioada scurta de maturare pentru a permite bacteriilor s4 epuizeze complet substratul, apoi procesul este oprit, iar cultura procesata pentru extragerea acidului lactic (Ifrim et al., 2015) Pentru succesul unui proces de productie biotehnologicé de acid lactic sunt necesare modele matematice eficiente, validate pe date experimentale culese in mai multe puncte de functionare a procesului Procesele biotehnologice sunt putemic neliniare si de aceea apar numeroase incertitudini asupra parametrilor cinetici, acestia putand varia pe parcursul intregului proces de fermentatie. Modelele matematice trebuie s& fie suficient de simple incét s& poata fi manipulate matematic dar, in acelasi timp, indeajuns de complexe incat s& descrie riguros procesul biotehnologic. De asemenea, modelele matematice trebuie s& fie validate pe baza datelor experimentale colectate, astfel incat s& devind utile pentru etapele urmatoare si s4 poata fi ugor transpuse pe alte instalatii, Pe baza acestor modele matematice, se dobandesc cunostinte solide asupra proceselor biotehnologice, se pot proiecta echipamente si experimente si se pot dezvolta algoritmi de control avansati pentru maximizarea productiei SoreLucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologicd a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. Modelele matematice care descriu procesele semi-continue de productie biotehnologica a acidului lactic in bioreactor sunt modele structural-functionale exprimate prin ecuatii dinamice de bilant, Rata acumularii de mas& a oric&rui component é din cadrul unui sistem, exprimata luand in considerare bilantul de masa, regrupeaza doud tipuri de termeni: - termeni de conversie (ce descriu cineticile reactillor chimice si biologice si randamentele de conversie), - termenii de transport (ce descriu tranzitia masei prin proces, in stare lichida si/sau gazoasa, si fenomenele transferului de faza). Modelu! dinamic general pentru procese semi-continue ia in calcul faptul co cultura semi-continua presupune ca alimentarea reactorului cu mediu proaspat de cultura se realizeaza prin unul sau mai multe fluxuri, pana la un volum maxim de lucru, timp in care debitul de iesire, Foue = 0. Astfel, volumul culturi, V, variaza in timp si, ca urmare a acestui fapt, 0 ecuatie dinamica individual trebuie scrisé pentru a descrie dinamica acestuia (pentru simplificare F,, este notat F') a (4.1) a Modelul dinamic general rescris pentru un proces semi-continuu (a fost dezvoltat in lucrarea 2), are urmatoarea formas F F nt pOo pe (42) unde ¢; este concentratia componentului i, cio este concentratia componentului i in fluxul de alimentare, iar r; este rata volumetrica de productie sau de consum a componentului i. a5Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. Modelul dinamic de productie biotehnologica a acidului lactic Modelul dinamic care face obiectul acestui studiu se adreseaza culturilor axenice de bacterii lactice homofermentative care cresc in bioreactoare cu amestecare completa. intrucat un singur substrat este convertit intr-un singur produs final (j.e. acid lactic), modelarea matematicd trebuie si se concentreze asupra celor trei procese fundamentale: cresterea bacteriana, consumul substratului si formarea produsului, Astfel, majoritatea modelelor matematice care se gasesc in literatura de specialitate consta in trei variabile de stare si anume: concentratia de biomasa, X, concentratia de substrat, si concentratia de produs, P (Luedeking si Piret, 1959; Bouguettoucha et al, 2011), Este bine cunoscut faptul c& odaté ou cresterea concentratiei de acid lactic scade viteza de crestere bacteriana si de aici insasi viteza de formare a produsului F Figura 4.1, Bioreactor cu amestecare complet pentru productia biotehnologica de acid lactic in regim semi-continuu Figura 4.1 ilustreaza un bioreactor cu amestecare completa operat in regim semi-continuu pentru productia biotehnologica de acid lactic. eaeLucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologicd a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. Un volum minim, Vinin, de mediu de culturé este inoculat, apoi bioreactorul este alimentat continu pana la umplerea acestuia, Visin in timpul procesului debitul de iesire Fy. = 0. Modelul dinamic descrie variatia in timp a concentratiilor de biomasa, substrat si acid lactic total, Pe baza modelului dinamic general (4.2) se poate descrie variatia biomasei prin urmatoarea expresie’ ax Fy aa any (43) unde 1 este rata volumetrica de crestere a biomasei Pe baza aceluiasi formalism matematic variatia in timp a concentratillor de substrat si produs vor fi descrise de urmatoarele expresii ds F pa < (50 - 4.4) tp So-S) (4.4) ap fal (4.5) unde 7; si 7 sunt ratele volumetrice de consum a substratului si de formare a produsului, iar Sy este concentratia de substrat din mediul de cultura proaspat. Modelele cinetice pentru procesele de fermentatie lactica au o serie de caracteristici comune, precum - sunt modele empirice care inglobeaza in mod uzual functii pentru limitarea de substrat, inhibitia de substrat, inhibitia de produs si pentru moartea sau intretinerea celulara, = la concentratii mici de acid lactic (e.g. aplicatii din industria alimentara) toate ratele procesului de fermentatie lactica pot fi exprimate ca functii stoichiometrice ale ratei de crestere, cu alte -60-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. cuvinte, formarea acidului lactic este asociaté cu cresterea bacterian: - la concentratii mari de acid lactic, formarea produsului este in general partial asociaté cu cresterea microbiana, ducand la utilizarea unei clase specifice de modele cinetice (i.e. modele de tip Luedeking-Piret) Cresterea bacteriilor lactice rezulté din diferenta dintre rata volumetrica de crestere, 1X, si rata volumetric& de deolin, KzX (4.6). Ty = UX — KaX (48) Rata specifica de crestere, , este exprimata prin modele empirice (eg, de tip Monod, Haldane, Contois, Tessier etc.) in care o rata specific maxima de crestere, max, este penalizata prin inmultirea cu valori subunitare date de functii care descriu limitarea de substrat, inhibitia de substrat $i produs, inhibitia de pH etc. Model cinetic prezentat de Boonmee et a/., 2003 gsi apoi modificat de Nandasana si Kumar, 2008 a fost adoptat in aceasta lucrare: ime) asym I) unde K,, este constanta de limitare cu substrat pentru procesul de crestere bacteriana, K;, constanta de inhibitie cu substrat pentru procesul de crestere bacteriana si K,,. este constanta de inhibitie cu produs pentru procesul de crestere bacteriana. Pentru rata volumetric’ de consum a substratului s-a adoptat urmatoarea expresie matematica: unde q, este rata specific de consum a substratului, dar Fala specificé maxima de consum a substratului, iar Ks, Kis $i Kps aU -61-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologicd a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. aceeasi semnificatie ca mai sus doar c sunt date pentru procesul de consum al substratului Rata volumetrica de formare a produsului este exprimaté printr-un model de tip Luedeking-Piret, care trateaza aceasta rata ca fiind partial asociatd cu procesul de crestere bacteriana: Ss wnt ok 0% tone (5)( : Ki ms) eMKex (4.9) Modelul poate fi simplificat daca se consider c& Kys = Ksp, Kis = Kip Si Kps = Kpp (Nandasana si Kumar, 2008). in plus, daca qp max = Bdzmax, atunci ecuatia 4.9 poate fi sorisé dup& cum urmeazé = ar, — Br; (4.10) unde qp este rata specifica de formare a produsului, dpmar este rata specifica. maxima de formare a produsului, « este constanta de asociere cu cresterea bacteriana si # este constanta de non-asociere cu cresterea bacteriana. Parametrii modelului matematic au fost identificati pe date experimentale provenite de la 0 cultura de Enterococcus (Nandasana si Kumar, 2008) si sunt prezentati in tabelul 4.1 pentru diferite valori ale pH-ului Tabel 4.1. Parametrii modelelor cinetice in functie de pH Parametru pH. cinetic 5 6 7 8 9 Ema 0.79 760 | 460 | 751 | 0.40 Ky 167.46 | 167.46 | 167.46 | 167.46 | 167.46 K, oss | 089 | o89 | 089 | 089 Kis(= Kip) | 303.17 | 303.17 | 303.17 | 303.17 | 303.17 Kes(= Kep) o1o | o10 | of0 | 010 | 010 Kyx 379 | 1429 | 17.50 | 1667 | 1967 Kys(= Kp) 631 | 2800 | 3889 | 3684 | 30.56 -62-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. Ka 0.0035 | 0.003 | 0.003 | 0.003 | 0.0055 sax 1.76 2.62 3.00 257 1.01 Gpmax 1.48 2.43 267 2.29 0.86 aw 0.79 0.15 0.20 0.26 0.71 In continuare este prezentat programul Matlab pentru simularea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Se va crea un fisier functie cu denumirea “lactic.m’, care va contine cele 4 ecuatii diferentiale ale modelului: concentratia de biomasa, concentratia de substrat, concentratia de acid lactic format si volumul culturii. Pompa de alimentare va introduce substratul, F, in bioreactor pana cand volumul cutturii va atinge volumul maxim util, Viner. Dac& debitul de intrare nu este conditionat de volumul maxim util, iar ecuatia de volum este ignorata, modelul dinamic de productie a acidului lactic poate fi folosit si pentru procese continue. function dxdt = lactic(~,x) global mumax Ksx Kix Kpx Kd global Kss Kis Kps qsmax global Ksp Kip Kpp gpmax a global Vmax F SO Viteza specifica de crestere ma = mumax* (x (2) /(Ksx+x (2) ))* (Kix/ (Kix+x(2))) 20 = Kd*x(1); (2)/ (Kes+x(2)))*(Kis/(Kists(2)))*... det) s nant ((2) / (K exp (-#(3)/1 %(2)))*(Kip/ (Kiptx ) (1) 7 Debitul de alimentare cu (4) < Vmax F = 1.5; else F=0; strat [m3/h] -63-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu, % _Variabile de stare Concentratia de biomasa [g/L] dxdt (1) = rx - F/x(4)*x(1)7 Concentratia de substrat [g/L] dxdt (2) = rs + F/x(4)*(S0 - ¥(2)); % Concentratia de acid lactic [g/L] dxdt (3) = rp - F/x(4)*2(3)7 ® Volumal util [m3] oxdt (4) = Fy dxdt = dxdt end Programul principal care apeleaza fisierul functie “lactic.m” contine parametrii modelului matematic, variabilele de operare (F si Vax) parametrii necesari integrarii si instructiunile pentru reprezentarea grafic a celor 4 variabile de stare. clear; close all global mumax Ksx Kix Kpx Kd global Kss Kis Kps gsmax global Ksp Kip Kpp gpmax a global Vmax F SO 2 _Parametrii modelul cinetic de crestere a biomasei mumax = 1.6; viteza specif. max. de crestere [h-1] Ksx = 0.89; % ct. de limitare cu substrat [g.L-1] Kix = 167.46; % ct. de inhibitie cu substrat [g.L-1] Kpx = 17.50; % ct. de inhibitie cu produs [g.L-1] Kd = 0.003; % coeficient de declin [h-1] ® _Parametrii modelul cinetic de consum al substratului Kss = 0.1; % ct. de limitare cu substrat [g.1-1] Kis = 303.177 c Kps = 38.89; & qsmax = 3.00; + de inhibitie cu substrat [g-L-1] de inhibitie cu produs [g.L-1] rata specifica max. de consum a substratului [g-g-1.h-1] -64-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu, % _Parametrii modelul cinetic de producere a ac. lactic Ksp = Kse; 3 ct. de limitare cu substrat [g.L-1] Kip = Kis; ct. de inhibitie cu substrat [g.L-1] Kpp = Kpsi ct. de inhibitie cu produs [g.L-1] qomax = 2.67; rata specifica maxima de formare a produsului [g.g-1-h-1] a = 0.20; # ct. de asociere cu cresterea bacteriana din modelul Luedeling- Piret [g.g-1] vmax = 107 % vol. max. util al bioreactorului [m3] &F= 07 % debitul de alim. substrat [m3/h] x0 = [0.1 100 0.001 2]; % conditiile initiale ale variabilelor de stare 80 = x0(2); % concentratia de substrat din mediul de cultura proaspat to=0 ® timpul initial [h) tfin = 207 % timpul final [hj [t,x] = ode45(@lactic, [t0 t£in],x0); figure (1) subplot (2,2, 1) plot (t,x(:,1))# grids grid minor xlabel('Timp [ore] ") ylabel({*Concentratia de’, 'biomasa (g.{L)*{-1})"})7 subplot (2, 2,2) plot (t,x(?,2))+ grid; grid minor xlabel('Timp [ore] ') ylabel({'Concentratia de’, 'substrat (g.{L}*{-1})"})+ ylim( [0 190)) subplot (2,2, 3) plot (t,x(:,3))7 grid; grid minor xlabel('Timp [ore] ') ylabel({'Concentratia de’, ‘acid lactic (g.{L}*{-1})"})7 -65-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a subplot (2, 2,4) plot (t,x(:,4))# grids grid minor xlabel('Timp [ore] ") ylabel('Volum de cultura (L)"); Rezultatele obtinute in simulare sunt prezentate in figurile 4.2 - 4.5. Se poate observa ca la atingerea volumului maxim, Viner = 10 m3, substratul exista in cantitate mare in bioreactor, iar pentru epuizarea completa a acestuia au mai fost necesare mai bine de 10 ore Concentratia de biomasa (@.L") 2 4 6 8 0 2 4 © 1% 2 Timp fore} Figura 4.2. Variatia in timp a concentratiei de biomasa -66-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului la 100) > Concentratia de substrat (9.L") 0 2 4 6 8 0 2 4 6 % 2 ‘Timp fore) Figura 4.3, Variatia in timp a concentratiei de substrat 100 Concentratia de ‘acid lactic (g.L") eta tee ter 0 ect et) feo co Timp [ore] Figura 4.4. Variatia in timp a concentratiei de acid lactic format -67-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologica a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. Volum de cultura (L) 2 4 6 8 0 2 4 6 8 2 Timp fore} Figura 4.5. Variatia in timp a volumului de cultura din bioreactor Profilul de alimentare cu substrat a bioreactorului poate fi ales in asa fel incat productivitatea s& fie optima dar, in acelasi timp, durata de operare sa nu fie prea lunga, De aceea, debitul de alimentare, Fin, este o variabila de comanda care poate fi controlata cu ajutorul unui regulator. Bibliografie Abdel-Rahmana MA, Tashiroc Y, Sonomoto K. Recent advances in lactic acid production by microbial fermentation processes Biotechnology Advances. 2013; 31(6):877-902 Boonmee M, Leksawasdi N, Bridge W and Rogers PL. Batch and continuous culture of Lactococcus lactis NZ133: experimental data and model development. Biochem. Eng, J. 2003; 14:127-135. Bouguettoucha A, Balannec B and Amrane A. Unstructured Models for Lactic Acid Fermentation — A Review. Food Technol, Biotech 2011; 49:3-12. -68-Lucrarea 4 - Modelarea procesului de productie biotehnologicd a acidului lactic. Studiul unui proces semi-discontinuu. lfrim GA, Baicu L, Caraman S, Titica, M. Dynamic modeling of the pH in lactic acid fermentation processes. 19th International Conference on System Theory, Control and Computing, ICSTCC 2015, Oct.14 16, Cheile Gradistei, Romania, IEEEXplore Digital Library, 2015:225-230. Luedeking R and Piret EL. A kinetic study of the lactic acid fermentation. Batch process at controlled pH. J. Biochem. Microbiol 1959; 4:393-412. Nandasana AD and Kumar S. Kinetic modeling of lactic acid production from molasses using Enterococcus faecalis RKY1 Biochem. Eng. J. 2008; 38:277-284. Wee YJ, Kim JN, Ryu HW. Biotechnological Production of Lactic Acid and Its Recent Applications. Food Technology and Biotechnology. 2006; 44(2):163-172 Cerinte 1.88 se introducé in Matlab modelul pentru producerea biotehnologica a acidului lactic. 2.$& se simuleze modelul matematic pentru producerea biotehnologica de acid lactic pentru una dintre valorile de pH 5, 6, 8 sau 9 si sA se compare grafic cu simulérrile anterioare pentru pH 7 -69-