Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor LUCRAREA 1 Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor Cresterea microorganismelor este un termen general care implicd atat cresterea numérului de celule prin reproducere, cat si cresterea dimensiunii celulelor. Pentru a creste, microorganismele trebuie sa aiba acces la hrana (i.e. substrat — surs& de carbon, azot, fosfor, sulf etc.), iar conditiile de mediu trebuie s& fie propice (i.e. pH, temperatura etc.) Cresterea microorganismelor este un proces autocatalitic, adic nu va avea loc fra ca cel putin o celula viabild sa fie prezent& Yisex DP tnx unde S — substrat, X — biomasa si P — produs. Microorganismele (ie. biomasa) consuma substratul pentru formarea de celule noi (nx) si pentru formarea de produsi extracelulari Pentru a ilustra grafic cresterea microorganismelor vom considera unul dintre mecanismele de reproducere — diviziunea celularé (Figura 1.1). 2 2 2 ee > @eeeeee0 “| 2 etc. ete. Figura 1.1. Diviziunea celular& In acest caz, numarul de celule creste in progresie geometrica 2°, 21, 22, 29... 29,Lucrarea 1 — Modelarea cineticd a cresterii microorganismelor. Se poate observa ca viteza de crestere a microorganismelor este proportional cu numarul de celule prezente in cultura in orice moment in timp. Pentru ca numarul total de celule dintr-o cultura poate atinge valori extrem de mari, se foloseste de obicei notiunea de concentratie: numar de celule per unitate de volum (e.g. nr. cel./mL). Totusi, celulele nu se divid sincronic decat in cazuri restranse si, de aceea, este greu de estimat numérul total de celule formate intr-un interval de timp cunoscut, chiar dac& se cunoaste concentratia initial de celule. in plus, masurarea concentratiei de microorganisme se face prin metode directe (numérarea la microscop a celulelor dintr-un volum cunoscut) sau indirecte (c&ntarirea masei uscate de celule, masurarea densitati optice etc.) care au o anumité marjé de eroare. Astfel, pentru a exprima matematic cresterea microorganismelor se foloseste notiunea de viteza specifica de crestere, u, care reprezinta raportul dintre concentratia de biomasé nou formata, dX/dt, pe concentratia de biomasa existenta, X, pe unitate de timp, ¢: 1aXx as 1.4 =a (1.1) Concentratia de biomasa (microorganisme), X, este exprimata ca masélvolum (e.g. nr.cel./mL, gimL etc.). Viteza specifica de crestere, H, va avea unitatea de masura hr’, Timpul este variabila independenté, iar concentratia de biomasa, variabila dependent, Curba general de crestere a microorganismelor O cultura de microorganisme nu poate creste la nesfarsit deoarece exist o cantitate limitata de hrand intr-un volum limitat. Se pot distinge 4 faze diferite de crestere pe 0 curba de crestere a microorganismelor. © curba de crestere este o reprezentare grafic’ a evolutiei concentratiei de biomasa (nr.cel/mL sau g/mL) in functie de timp.Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor > Faza stationara mL sau gimL) Concentratie biomas& (nrc Timp Figura 1.2. Curba general de crestere a microorganismelor Curba general de crestere a microorganismelor prezinta patru faze distincte, aga cum poate fi observat in figura 1.2 (Shuler si Kargi, 2002) 1. Faza de latent sau faza de lag reprezinta perioada de acomodare a microorganismelor la noile conditii de mediu. Din momentul inocularii unor celule intr-un mediu nutritiv urmeaza un interval de timp in care numarul de microorganisme rémane constant sau se modifica foarte putin (1.2) in functie de microorganismul cultivat, aceast& faz de lag poate poate dura céteva minute sau chiar 2 zile, timp in care sunt sintetizate substantele chimice necesare celulei pentru a incepe procesul de reproducere. Atunci cénd numarul de celule viabile inoculate este foarte mic, poate exista o faza de pseudo-lag care nu este rezultatul adaptarii microorganismelor la noul mediu, ci este rezultatul calitatii scézute a inoculului. Astfel, pentru reducerea fazei de latent, microorganismele trebuie adaptate la mediul de cultura inainte de inoculare gi trebuie sa fie tinere si active.Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor 2. Faza de crestere exponential sau faza de crestere logaritmica. Odata ce microorganismele s-au adaptat la noile conditii de mediu, numarul acestora incepe s& creascd exponential. Este etapa in care microorganismele cresc cel mai rapid. Putem exprima matematic formarea de material celular nou, in faza de crestere exponential, rearanjand ecuatia 1.1 (1.3) Avem 0 ecuatie diferentiala care poate fi rezolvata numeric sau analitic. Rearanjand ecuatia 1.3, obtinem: dx = nat (1.4) Notand cu Xo, concentratia initiala de microorganisme la timpul t 0, putem integra ecuatia diferentiala 1.4 * dX [au Aeon ky X “Jo (1.8) obtinand: Inx InXq + ut Sau X = XpeM* (1.6) Astfel, viteza specifica de crestere poate fi calculata din masuratori experimentale cu urmatoarea ecuatie (Liu si Esf, 2017) InX —InXp (17)Lucrarea 1 — Modelarea cineticd a cresterii microorganismelor. Viteza maxima de crestere depinde de fiecare specie de microorganism in parte. Faza de crestere exponential este intervalul in care microorganismele au cea mai intensa activitate metabolica, fiind cel mai important interval in productia industrialas 3. Faza stationaré apare atunci cand unul dintre componenti substratului (sursa de carbon sau unul dintre nutrimente) s-au epuizat sau atunci cand un produs s-a acumulat in exces in mediul de cultura. Cresterea este astfel limitata sau inhibatd, iar cultura de microorganisme atinge faza stationara de crestere. Chiar dacd nu se observa crestere, dX/dt = 0, celulele inca cresc si se reproduc, #0, doar c& numérul de celule care mor este compensat de numarul de celule nou formate, iar activitatea metabolica a microorganismelor este incetinité. Dacé notém cu ys viteza specifica de descrestere a microorganismelor, putem scrie dX OA aux pk = = 1.8) Ge TUX — eX = 0H = Hs (1.8) 4, Faza de descrestere sau de declin are loc atunci cand cultura de microorganisme nu mai are conditiile propice pentru crestere, iar celulele incep s& moaré cu o rata de descrestere mai mare decat rata de crestere, u <4,. Si rata de descrestere poate avea loc exponential, dar este mai lent, de cele mai multe ori, decat faza de crestere exponential pentru c inca mai sunt celule care cresc. Luand in calcul c& cele patru faze de crestere sunt distincte, cea mai potrivité manier& de modelare este modelarea pe zone. Mejoritatea ~modelelor matematice care descriu cresterea microorganismelor se adreseaz& fazei de crestere exponentiale deoarece este cea mai importanté din punct de vedere al productivitatii. Unele modele pot simula si faza stationara, ba chiar si faza de declin. Faza de lag este modelata separat sau nu este modelata deloc deoarece nu este atractiva pentru productie, dorindu- se scurtarea acesteia pe cat posibilLucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor Modele cinetice de crestere a microorganismelor Cel mai simplu model cinetic de crestere este modelul matematic prezentat mai sus (ecuatia 1.3 sau 1.6) care mai poarta si denumirea de model logistic. Pentru reprezentarea graficé a evolutiei concentratiei de biomasa in timp, se va folosi ecuatia 1.6 (integrarea ecuatiei diferentiale 1.3 va duce la acelasi rezultat), in care viteza specifica de crestere, 1, in faza exponentiala, este considerata constant. in continuare este prezentat programul Matlab pentru simular, clear t = linspace(0,100,100); % timp [ore] ma = 0.067 teza specifica de crestere [h-1] x0 = 0.01 concentratia initiala de biomasa [g/L X = X0*exp (mutt) ; concentratia de biomasa[g/Z] plot (t,x)? grid xlabel('Timp [ore]") ylabel("Concentratia de biomasa [g/L]") 45 Concentratia de biomasa [g/L] o 0 2 %0 4 5 6 70 oO 0 100 ‘Timp fore}Lucrarea 1 — Modelarea cineticd a cresterii microorganismelor. Figura 1.3. Evolutia concentratiei de biomasa in timp Se va varia 4 urmarindu-se evolutia concentratiei de biomasé in timp. Rezultatele obtinute sunt prezentate in figura 1.3. Marind valoarea vitezei specifice de crestere, se observa ca modelul logistic va da concentratiei de biomasa valori foarte mari, valori care nu sunt reale deoarece biomasa nu poate creste la nesfarsit. Pentru a rezolva aceasta problema, in modelarea bioproceselor, se folosesc madele empirice de forma 1 = tnax| [fi(fi € 2) (1.9) UNdE Lax este viteza specifica maxima de crestere. f; sunt functii subunitare care penalizeaza viteza specifica maxima de crestere, Aceste functii, fi, exprima relatia dintre viteza specifica de crestere si factorii care o influenteaza precum substratul — fs, oxigenul dizolvat — fo. un produs extracelular — fp etc. Astfel, viteza specifica de crestere nu este constant, ci variazé in timp. Modelul de limitare de substrat (Modelul Monod) Modelul de limitare de substrat este cel mai utilizat model cinetic de crestere a microorganismelor si mai este cunoscut si sub numele de modelul Monod dupa cercetatorul francez Jacques Monod. Acest model prezinté relatia dintre viteza specific& de crestere si concentratia de substrat (ecuatia 1.10) s Homan RES (1.10) unde S este concentratia de substrat iar Ks se numeste constanta de semi-saturatie.Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor K, s Figura 1.4, Modelul de limitare de substrat (modelul Monod) Constanta de semi-saturatie, Ks, reprezint& concentratia de substrat la care viteza specifica de crestere este egala CU max/2, $i descrie afinitatea microorganismului la substrat (Bastain si Dochain, 1990), Acest model pleacd de la premisa cA viteza specifica de crestere este limitata de accesul celulelor la hrana, in sensul c& este cu atat mai mare cu cat concentratia de substrat este mai mare pana la o concentratie maxima de substrat la care viteza specifica de crestere este si ea maxima. Peste aceasta concentratie maxima de substrat, viteza specifica de crestere ramane constantd, Umax: in continuare este prezentat programul Matlab pentru simularea modelului de limitare de substrat. Se va varia Umax $i Ks, urmarindu- se evolutia vitezei specifice de crestere. clear mumax = 0. eza speci maxima de crestere [h-1 Ks = 1; constanta de semi-saturatie [g/L] S = linspace(0,20,100);% conc de substrat [g/L for i = 1:length(s) % viteza specifica de crestere [h-1] ma (i) = mumax*s (i) /(Ks+$(i))+ endLucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor plot (S,mu); grid xlabel('Concentratia de substrat [g/L]") ylabel('viteza specifica de crestere [h*{-1}]") Rezultatele obtinute sunt prezentate in figura 1.5 02 018 0.16 0.06 viteza specifica de crestere [h" 0 2 4 6 8 0 2 4 16 1% 2 Concentratia de substrat [g/L] Figura 1.5. Evolutia vitezei specifice de crestere in functie de substrat (limitare) Modelu! Monod are avantajul ca poate fi liniarizat prin inversare conform ecuatiei Lineweaver — Burke (ecuatia 1.11). Liniarizarea permite identificarea usoaré a parametrilor modelului Monod (1.8. tiax si Ks) prin regresie liniara. 1__Ks "7 3*5 (1.11) Figura 1.6 ilustreaza relatia liniara dintre 1/u si 1/S. Cunoscand y- intercept si panta dreptei prin regresie liniara pe datele experimental, se pot calcula usor parametrii pmax $i Ks.Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor ap Panta = a1 <— y-intercept = 7, kK, us Figura 1.6. Modelul de limitare de substrat liniarizat (modelul Lineweaver — Burke) Modelul de inhibitie de substrat Multe substraturi pot fi consumate de microorganisme in concentratii mici, dar la concentratii mari ele devin toxice, inhiband cresterea, Pentru a simula acest efect inhibitor, in ecuatia 1.10 s-a mai adéugat un termen S?/K,, unde K; reprezinté constanta de inhibit. = Bmax (1.12) Ks +S 43 ou}; I | I I I | I VKK s Figura 1.7. Modelul de inhibitie de substrat -10-Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor Acest termen are valori mici atunci cénd concentratia de substrat este mica, dar creste dramatic la valori mari ale substratului ducand la micsorarea vitezei specifice de crestere, 4. jin continuare, este prezentat programul Matlab pentru simularea modelului de inhibitie de substrat. Se va varia jimax, Ks $i K, urmarindu- se evolutia vitezei specifice de crestere. clear mumax = 0.2; eza speci maxima de crestere [h-1 Ks = 1; constanta de semi-saturatie [g/L] Ki = 20; constanta de inhibitie [g/L] Linspace(0,20,100);% concentratia de substrat [g/l for i = 1:length(s) viteza specifica de crestere [h-1] mu(i) = mumax*S (i) /(Ks+8(i)+(S(i) .*2)/Ki)? end plot (S,mu); grid xlabel('Concentratia de substrat [g/L]') ylabel('viteza specifica de yLim([0 0.21) estere [h*{-1}]") Rezultatele obtinute sunt prezentate in figura 1.8. -14-Lucrarea 1 — Modelarea cinetica a cresterii microorganismelor 02 ota} 016 ota} viteza specifica de crestere [h o 2 4 6 8 0 2 4 6 WB 2 Concentratia de substrat [g/L] Figura 1.8. Evolutia vitezei specifice de crestere in functie de substrat (inhibitie) Alte modele cinetice de crestere Cele doua modele prezentate mai sus acopera o gama larga de scenarii, dar sunt cazuri in care viteza specific de crestere nu se potriveste suficient de bine cu niciunul dintre modele. Exist’ numeroase modele in literatura care acopera diverse alte scenarii, mai jos fiind prezentate doar cateva Modelul Teissier exprima viteza specific’ de crestere printr-o functie exponential de substrat. H = Has ( -e *) (1.13) -12-Lucrarea 1 — Modelarea cineticd a cresterii microorganismelor. Modelul de inhibitie de produs exprima viteza specifica de crestere ca © functie atat de substrat (limitare) cat si de produs (inhibitie). = [)——s> (1.14) Modelul dublu Monod exprima viteza specifica de crestere ca find limitata de doua substraturi simultan, eer (s) mes =) (1-18) Modelul cu putere toxica este un model care exprima viteza specifica de crestere ca o functie atat de substrat (limitare) ct si de produs (inhibitie), Inhibitia, in acest caz, este mai accentuaté decat in cazul ecuatiei 1.14 Ss oe (1.16) (ks +9)(1 oa Bibliografie Bastain G si Dochain D, On-line Estimation and Adaptive Control of Bioreactors, 1990, Elsevier, Amsterdam, NL. Liu S gi Esf S. Bioprocess Engineering. Kinetics, Sustainability, and Reactor Design. Editia a 2-a. Elsevier, 2017. Shuler ML si Kargi F. Bioprocess Engineering. Basic Concepts Prentice Hall PTR, 2002 -13-Lucrarea 1 — Modelarea cineticd a cresterii microorganismelor. Cerinte 1. $8 se introduca in Matlab toate exemplele prezentate in aceasta lucrare. 2. S se identifice prin regresie liniara, folosind functia Matlab polyfit, parametrii modelului de limitare de substrat, jtmax $i Ks, cu ajutorul ecuatiei 1.11, Lineweaver — Burke, folosind urmatorul set de date: Substrat [g/L] _| Viteza specific de crestere [1/h] 1 0.10 0.02 2 2.31 0.08 3 4.52 0.09 4 673 0.10 5 8.94 0.10 6 14.16 0.10 7 13.37 0.14 8 15.58 0.10 9 17.79 0.40 10 20.00 0.414 3. Sa se simuleze in Matlab modelele cinetice 1.13 — 1.16 pentru un domeniu de concentratii de substrat cuprins intre 0 — 20 gi/L si de produs cuprins intre 0 — 10 g/L. Pentru al doilea substrat, 5», din ecuatia 1.15 se va folosi domeniul de concentratti 0 - 2 mg/L. aan