Centrifugación

Baseada na distinta velocidade de desprazamento das partículas nun medio líquido ao seren sometidas a un campo
centrífugo (sedimentan antes as de maior masa)

Conseguirase a mesma separación en dúas centrífugas cando coincidan as súas FCR (g), non as súas rpm

FCR (g) = (rpm)2 * 1,118*10-5 * r(en cm)

Tipos de centrífuga

Flotante  Cantidade reducida de mostra (200 ml)

Segundo o rotor Fixo/Angular  Campo centrífugo non uniforme (ata 5L de mostra)

Vertical  Campo centrífugo uniforme. Sedimentación rápida, grande volumen

de mostra. O material cae se non está moi compactado.

Baixa velocidade: Ata 5000 rpm. Útiles para partículas grandes, células...

Microfugas: Ata 1000 rpm. Usa eppendorf. Usada en bioloxía molecular.

Segundo a velocidade

Centrífugas de alta velocidade: 18-25000 rpm. Refrixeradas. Algunhas fan

baleiro. Para fraccións celulares

Ultracentrífugas: 50000 rpm Frío e baleiro (analíticas e preparativas)

Tubos: De diversos materiais e capacidades. Cada un úsase nun tipo de centrífuga xa que teñen aguantes
diferentes á rotura.

Seguridade:

- Escoller o rotor/tubos axeitados

- Equilibra-la centrífuga de xeito simétrico
- Non forza-la parada da centrífuga
- Comproba-la velocidade cada tres meses cun tacómetro externo
- Comproba-lo temporizador
- Manter limpa

Técnicas de centrifugación
 Analítica: Orientada á determinación de parámetros moleculares ou avalia-la pureza da
mostra.

Tipos Diferencial

Preparativa: Separación de compoñentes Zonal

Gradiente de
densidade
Isopícnica

Preparativa
 Diferencial (separación por tamaño)
- A máis común. Trala centrifugación hai un pellet sedimentado e un sobrenadante.
- Non se pode saber onde queda a partícula desexada.
- Moi útil para illar células ou orgánulos
- Para separa varios compoñentes úsase o proceso de centrifugación diferencial (a aplicación
de varios campos centrífugos crecentes por máis tempo)
- Rotores angulares/verticais polo volume e a velocidade de sedimentación.
 Úsase para: eliminación de procariotas, precipitación de enzimas...
 Gradiente de densidade
- Permite separación de compoñentes e realización de medidas analíticas.
- O soporte é fluído cunha densidade que aumenta da zona superior (onde se coloca a
mostra) á inferior. O gradiente conséguese cun soluto de baixa masa molecular.
 Isopícnica/de equilibrio (separación por densidade)
- Aplicación zonal ou non da mostra
- Usa gradientes autoxerados.
- A densidade máxima do gradiente final ten que ser superior á densidade das partículas
- As especies sedimentantes móvense polo gradiente até chegar a un punto onde coinciden a
súa densidade e a do gradiente
- O medio de centrifugación adoitan ser sales de metais alcalinos (CsCl)
- Separa partículas de diferente densidade pero mesmo tamaño (orgánulos, ácidos
nuclécicos... pero non proteínas)
 Zonal (separación por S)
- Mostra na parte superior dun gradiente de densidade preformado
- Rotor flotante
- As partículas sedimentan a través do gradiente en función de S
- A densidade da mostra ten que ser superior á do gradiente
- Volumes pequenos
Analítica
-Necesita concentracións de 1 mg/ml
-Compoñentes como os da preparativa máis un sistema de observación
-Os recipientes son cilindros cunha perforación e base de lámina de cuarzo
-Coa sedimentación créanse tres zonas: disolvente  disolución  soluto amosando un incremento da
absorbancia ao pasar do disolvente á disolución sendo a absorbancia proporcional á concentración
-As variacións mídense en gráficas
o c/x. Sigmoideas. A pendente é a fronte de sedimentación. Mídese con UV
o dc/dx. Pico. O pico é a fronte. Mídese con interferencias/Schlieren
 Úsase para: Saber se un illado é puro, medir actividade enzimática,
calcular S, averigua-la proporción relativa de compoñentes.
 Contínuos
Lineais
Discontínuos
Gradientes
Non lineais

Gradientes:

- Solvente nunha columna a diferentes concentracións

- Úsanse solutos de baixo peso molecular
o Sacarosa para proteínas demasiado viscosa e osmoticamente activa
o Ficoll para separación de células e partículas por centrifugación zonal
o Sales de metais alcalinos para ácidos nucléicos por centrifugación isopícnica

Solutos

- Intervalo de densidade suficiente

- Nin hiper nin hipo-osmóticos
- Non interferir co método de ensaio
- Pode ser eliminado do produto
- Non debería absorber UV/luz visíbel
- Barato e estandarizábel
- Nin corrosivo nin inflamábel

Parámetros do gradientes

- Material
- Forza iónica
- Viscosidade
- pH
- Ósmose
- Presenza de axentes estabilizantes
 Lineais
- A densidade aumenta linealmente coa distancia dende o centro de rotación
 Discontínuos (orgánulos, virus): Depósito escalonado de disolucións de diferente
densidade vanse colocando as disolucións en capa de máis a menos densa. Se se
deixan repousar transfórmanse nun gradiente contínuo.
o Gradientes preformados: A densidade da mostra ten que ser superior á do gradiente.
Úsabse nas separacións baseadas no S (zonal).
o Gradientes autoxerados: Úsanse en separacións por densidade (isopícnicas). A
densidade da mostra non debe superar á do gradiente A separación final é
independente do tempo (centrifugación de equilibrio). Autoxerados porque o gradiente
se crea na propia centrifugación.

 Non lineais
Cámaras contínuas/mezcladores de gradientes.
Úsanse para mostras con altas concentracións de partículas cun amplo rango de densidades

Recolección de mostras trala centrifugación en gradiente:

Depende do tubo, obxectivo e características pode ser con punción no tubo, bomba peristáltica de
succión, introdución no fondo dunha disolución de maior densidade...