CAPITULO 8 Amostragem, Padronizacao e Calibracao Aamostragem & uma das operagbes mais importantes em uma analise quimica, As andlises quimicas empregam ape- nas uma pequena fragao da amostra disponivel. As fragbes de solos arenosos e argiosos, que s4o coletadas para analises, devem ser representatives de todo o material. Conhecer quanto da smostra deve ser coletsdo e como subi vidila, Posteriormente, para se abler a amostra de laboratoro, s80 vitals no processo analtico. A amastragem, padronizagao ea calibrago s40 os pontos deste capitulo. Todas as ts etapas requerem conhecimento de estatistica cr discutido no Capitulo 1, um procedimento analitico consiste em varias etapas importantes. A escola de dado procedimento analitico depende da quantidade de amostra disponivel e, em um aspecto mais amplo, da quantidade de analito presente. Aqui discutiremos uma classificacao geral dos tipos de determinacao baseados nesses fatores. Apés a selecao do método especifico a ser emprega do, uma amostra representativa precisa ser coletada. © processo de amostragem envolve a obtencao de uma pequena quantidade de material que represente de maneira exata todo o material que esta sendo analisado. A coleta de uma amostra representativa é um processo estatistico. A maioria dos ‘métodos analiticos nao é absoluta e necesita que os resultados sejam comparados com aqueles obti dos para materiais padrao, de composigdo exatamente conhecida. Alguns métodos envolvem a com: paracao direta com padrdes, enquanto outros necessitam de um procedimento de calibragao indireto. Aqui discutiremos a padronizacao e a calibragéo com algum detalhe, incluindo 0 uso do método dos ‘minimos quadrados para a construcao de modelos de calibragdo. Este capitulo sera finalizado com uma discussao dos procedimentos utilizados para comparar os métodos anallticos pelo uso de varios critérios de eficiéncia denominados figuras de mérito, BA _| AMOSTRAS E METODOS ANALITICOS Muitos fatores estio envolvidos na escolha de um método analitico especifico, como discutido na Segio IC-1, Entre os fatores mais importantes esto a quantidade de amostra e a concentragao do analito. 8A-1 Tipos de Amostras e Métodos ‘Os métodos analiticos podem ser classificados de muitas formas diferentes. As vezes distinguimos um método de identificagao de espécies, um método qualitativo, de um que determina a quantidade de um cons- tituinte, uma andlise quantitativa. Os métodos quantitativos, como discutidos na Sedo 1B, slo classifica- dos tradicionalmente como gravimétricos, volumétricos ou instrumentais. Outra maneira de se distinguir ‘0s métodos baseia-se na dimensao da amostra e nos niveis dos constituintes.164 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eoors ThoMson Dimensdo da Amostra A dimensao da amostra & muitas vezes utilizada para classificar 0 tipo de andlise realizada, Como mostra do na Figura 8-1, termo maeroanilise ¢ empregado para as amostras com massa superior a 0,1 g. Uma semimicroandlise ¢ realizada em uma amostra na faixa de 0,01 a 0,1 g, enquanto as amostras para uma microanilise estdo na faixa entre 10-4 e 10-? g. Para amostras cuja massa é menor que 10 g, algumas vezes 0 termo ultramicroanilise é empregado. A partir da classificagdo contida na Figura 81, vemos que andlise de uma amostra de 1 g de solo utilizada para a determinacio ; de um possivel poluente poderia ser chamada macroanilise, ao passo oolaole Serimicro * 0.0001 20,01 g Mins, que a andlise de 5 mg de um pé suspeito de ser uma droga ilegal & Ultamicro poderia ser uma microandlise. Um laboratério analitico tipico manu- seia amostras que variam da dimensio macro para a micro ¢ até ‘mesmo para a dimenso ultramicro. As técnicas empregadas para manusear amostras muito pequenas so bastante diferentes daquelas usadas para tratar macroamostras. Dimensfo da Amostra Tipo de Anslise Te Macro <10 Tipos de Constituintes Os constituintes determinados em um procedimento analitico podem abranger uma enorme faixa de con- centragdo, Em alguns casos, os métodos analiticos sdo usados para determinar constituintes majoritérios Esses constituintes esto presentes na faixa de peso relativo entre 1% e 100%, Muitos dos procedimentos gravimétricos e alguns volumétricos, que serao discutidos na Parte III, constituem exemplos de determi- nagdes de constituintes majoritirios. Como mostrado na Figura 8-2, as espécies existentes na faixa de 0,01% a 1% sio geralmente Sianuns~ denominadas constituintes minoritarios, enquanto aquelas pre- (01% (100 ppm)e 1% | Minortarig_Sentes em quantidades entre 100 ppm (0,01%) e 1 ppb so chamadas 1 ppb 100 pom Trapo _constituintes trago, Os componentes existentes em quantidades 1 ppb Vivatrago _menores que I ppb stio normalmente considerados como sendo cons tituintes ultratrago. As determinagies de Hg na faixa de ppb a ppm em amostras de 1 wl. (= 1 mg) de égua de rio podem ser consideradas uma microandlise de um constituinte trago. As determinagdes de constituintes trago e ultratrago so particularmente complexas devido & presenga de interferentes e contaminagdes potenciais. Tipo de Constituinte ma 2 Seainiae £ Te tees Dimensio de amos, = Figura 8-1 Classticagdo dos analitos pela dimensio ds amostra‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «165 Minoriia rape Uratrago 1 pnb ppm o1% Nivel do anstito Figura 8-2. Classiticagdo dos tipos de constitutes pelo nivel do analito Em casos extremos, as determinagGes devem ser conduzidas em salas especiais, que sto mantidas meticulosamente limpas ¢ livres de pocira ¢ outros contaminantes. Um problema geral em procedimentos envolvendo constituintes trago ¢ que a confiabilidade dos resultados geralmente decresce drasticamente com a diminuigdo do nivel do analito. A Figura 8-3 mostra como o desvio padrdo entre laboratérios aumen- ta medida que o nivel do analito diminui 8A-2 Amostras Reais A anilise de amostras reais & complicada devido ao efeito da matriz da amostra. A matriz pode conter espé- cies que tém propriedades quimicas similares as do analito, Essas espécies podem reagir com os mesmos reagentes, tal como 0 analito, ou podem provocar uma resposta instrumental que nao pode ser facilmente so 0 ° 2 = “6 = 10 log da concentagzo Figura 8-3. Erros interlaboratoiais em fungdo ds concentragio do analito. Observe que o desvio padtio relative aumenta Arastcamente & medida que a concentragdo do analito diminai. Na fixa de ultratrago,o desvio padro relativ se aproxima de 100%, (De W. Horowitz, Anal. Chem, 1982, v.54, p. TATA.)166 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Epona ThoMson distinguida daquela do analito, Esses efeitos interferem na determinagao do analito, Se essas interferéneias sio provocadas por espécies estranhas contidas na matriz, entdo freqiientemente so chamadas efeitos de matriz, Esses efeitos podem ser induzidos nao apenas pela amostra, como também por reagentes e sol- ventes empregados no preparo da amostra para a determinagio. A composigdo da matriz que contém 0 analito pode variar com o tempo, como no caso em que os materiais perdem Agua por desidratago, ou sofrem reagdes fotoguimicas durante seu armazenamento, Discutiremos posteriormente os efeitos da matriz e outras interferéncias no contexto da padronizagdo e métodos de calibrago na Segdo 8-C. Como discutido na Seco 1C, as amostras so analisadas, mas especies ou as concentragdes sdo determinadas, Assim sendo, podemos discutir corretamente a determinagao de glicose em soro sangiineo ou a andlise de soro sangiiineo para a determinagao de glicose. > Amostras sdo analisadas, mas os constituintes ou as concentragbes so determinados, 8B | AMOSTRAGEM E MANUSEIO DA AMOSTRA ‘Uma andlise quimica € freqtientemente realizada em apenas uma pequena fragdo do material euja com- posigio seja de interesse. E claro, a composigao dessa fragdo precisa refletir tao proximamente quanto pos- sivel a composigao total do material, se for esperado que os resultados tenham algum valor. O processo pelo qual uma fragao representativa é coletada é denominado amostragem, Muitas vezes, a amostragem & a etapa mais dificil de todo o proceso analitico e a que limita a exatidio do procedimento. Essa afirmagio € particularmente verdadeira quando 0 material a ser analisado for constituido por um grande volume de um liquido ndo homogéneo, assim como um lago, ou um sélido nao homogéneo, como um minério, um solo ou um pedaco de um tecido animal. ‘A amostragem para uma andlise quimica envolve, necessariamente, > Aamostragem é,muitas vezes, 9 estatistica, uma vez que serao tiradas conclusdes acerea de uma quan- e aspecio ais dil déums dade muito maior do material a partir de uma andlise que envolve uma pequena amostra de laboratsrio. Esse & o mesmo processo que discuti- ‘mos nos capitulos 6 ¢ 7, examinando um nimero finito de itens retirados de uma populagio. A partir da observagio da amostra, usamos ferramentas estatisticas,tais como a média e desvio padrlo, para tirar conclusdes sobre a populagdo. A literatura sobre a amostragem & extensiva;! forneceremos apenas uma breve introdugao nesta segao, 8B-1 Obtencdo de uma Amostra Representativa 0 processo de amostragem precisa assegurar que os itens escolhidos sejam representativos de todo 0 mate~ rial ou populagdo. Aqui, os itens escolhidos para andlise so muitas vezes chamados unidades de amostragem ou incrementos de amostragem, Por exemplo, nossa populagdo pode ser de 100 moedas podemos desejar conhecer a concentrago média de chumbo na colegio de moedas. Nossa amostra deve ser composta por cinco moedas. Cada moeda é uma unidade de > As composigses da amostra : Pree ee amostragem ou um inctemento, No contexto estatistico, a amostra cor- laboratério precisam ser responde a varias pequenas partes tiradas de partes diferentes de todo o semelhantes a composigio média material, Para evitar confusdo, geralmente os quimicos chamam a de toda a massa de materiala ser —_golego de unidades de amostragem ou os incrementos de amostragem ‘nals de amostra bruta 7 Ver por etemplo,J.L. Devore. R. Farum, Applied Stats for Engincers and Semis. Pai Grove, CA: Duxbury Press at Brooks'Cole Publishing Co, 1999, p, 188-166; J.C Mille, Slates and Chemometis for Anavtical Chemisty, 4. ed Upper Saddle River, NJ: Prensice: all, 2000, B.'W. Woodget © D. Cooper, Samples and Standards, Londres: Wiley, 1987; ¢ FF. Pita, Pere Gy's Sampling Theory and Sampling Practice. Boca Raton, FL: CRC Pes, 1989‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «167 Para as andlises realizadas no laboratério, a amostra bruta & nor- a ‘malmente reduzida em tamanho para uma quantidade de material opulagdo homogéneo para tomar-se a amostra de laboratério, Em alguns casos, camo os de amostagem de ps, iuidose gases, no tems itens obvi | ‘mente discretos. Esses materiais podem no ser homogéneos e ser cons- Cole uma tituidos em particulas microscépicas de composicées diferentes ou, no Sa caso de liquidos, zonas onde as concentragdes diferem. Com esses mate~ riais, podemos garantir a representatividade da amostra obtendo nossos incrementos a partir de diferentes regides de todo o material, A Figura «amos 8-4 ilustra as trés etapas comumente envolvidas na obteng&o da amostra “Se borate. | de laboratério, Ordinariamente, etapa nimero 16 diteta, Com a POPU- piayeg By Gnarls ma lagdo sendo to diversa quanto uma cartela de frascos contendo tabletes {erga dituma smoste do 4e vitaminas, um campo de trigo, eérebro de um rato ou a lama do aborario. A amosta de aboratrio leito de um rio, As etapas niimeros 2 e 3 séo raramente simples e podem _consste em alguns gramas até, n0 demandar uma boa dose de esforgo ¢ engenhosidade. ‘maximo, algumas centenas de grams, Estatisticamente, os objetivos do processo de amostragem so: Pade serconstinda de to pouco 08 obj processo de igem SHO: guanto pate em 10" ou 10" partes de timativa sem tendéncias da “#0 m=" 1. Obter um valor médio que seja uma ‘média da populago. Esse objetivo pode ser atingido apenas se todos os membros da populagio tiverem uma probabilidade igual de | Aamostasem €° procs alo estarem ineluidos na amostra Re ida an mrvantonea tre 2. Obter uma varidncia que seja uma estimativa sem vieses da varidneia | quantidade de material homogeneo da populagao, para que os limites de confianga vilidos para a média | que pode ser convenientemente possam ser enconttados e virios testes de hipsteses possam ser apli- | manuseado no laboratorio © Quando 5, < sy/3, nfo hd razo para melhorar a precisao da to clevada e ndo puder ser melhorada, muitas vezes é interessante mudar medida, A Fquagio 8-1 mostra que para um método de anélise menos preciso, porém mais répido, assim s, é predominantemente determ mais amostras podem ser analisadas em um dado intervalo de tempo. ‘Uma vez que o desvio padrdo em relagdo & média & menor, por um fator de Vi, a aquisigdo de mais amosiras pode methorara preciso, nnado pela incerteza da amostra sob essas condigdes, > A amostra bruta ¢ a colegio 8B-3 A Amostra Bruta de unidades individuais de Idealmente, a amostra bruta é uma réplica em miniatura da massa inteira smosrger Preis St do material a ser analisado. Deve corresponder ao todo do material em CEipudoc ke itgkude do sul composiglo quimicae, se composto por particulas, na dstibuigho tamanho das particulas, do tamanho das particulas. Dimensdo da Amostra Bruta Do ponto de vista da conveniéncia e da economia, é desejével que a amostra bruta pese no mais que abso- lutamente o necessério. Basicamente, 0 peso da amostra bruta ¢ determinado (1) pela incerteza que pode set tolerada entre a composicdo da amostra brita e a do todo, (2) pelo grau de heterogeneidade do todo ¢ (3) pelo nivel do tamanho de particula no qual a heterogeneidade se inicia.? 0 altimo ponto necessita ser detalhado, Uma solugao homogénea bem misturada de um gas ou liqui- do é heterogénea apenas em uma escala molecular e os pesos das moléculas governam o peso minimo da amostra bruta. Um sélido particulado, como um minério ou um solo, representa uma situago oposta FW Yoaden, J. Asoe. Off Anal Chem, 1981, v.50, 9.107 "Pare etre dun atigo sobre peso em funy do tarsnbo de parila, ver GH. Fricke, PG, Mischler, FP, tafe 1, Housmyer, Ana Chem, 17,8. 58,1213‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «169 Nesses materiais, os pedagos individuais do sélido diferem uns dos outros em composigio. Aqui, a hete~ rogencidade desenvolve-se em particulas que podem ter dimensdes da ordem de um centimetro ou mais, & que podem pesar varios gramas, Entre esses extremos situam-se os materiais coloidais e os metais solidi- ficados. Nos primeiros, a heterogeneidade ¢ inicialmente encontrada na faixa de 10-5 em ou menos. Em ‘uma liga, a heterogeneidade ocorre primeiramente nos grios dos cristas. Para obter uma amostra bruta verdadeiramente representativa, um 4 0 nimero de particulas certo nimero N de particulas precisa ser tomado. A magnitude desse ne rimero depende da incerteza que pode ser tolerada e da heterogenei- mostra brata vari entre algumas dade do material. © mimero pode variar de algumas poucas particulas P°¥s* Pasiculas ¢ 10° pariculas até 10”? particulas. A necessidade de um grande nimero de particulas ndo é de grande preocupagdo para ssdrio para compor uma «gases ¢ liquidos homogéneos porque a heterogeneidade entre as particulas ocorre em um primeiro momen- tono nivel molecular, Assim, mesmo uma pequena massa da amostra deverd conter mais que o mimeto de particulas requerido. As particulas individuais de um sélido particulado podem pesar um grama ou mais, contudo, podem evar, algumas vezes, a amostras brutas que pesam vérias toneladas. A amostragem de tais ‘materiais é, no minimo, um procedimento oneroso ¢ que consome bastante tempo. Para minimizar custos & importante determinar 0 menor peso do matetial necessério para gerar a informagao desejada. {As leis da probabilidade governam a composigdo de uma amostra bruta removida aleatoriamente de ‘um material como um todo, Em fangao disso, é possivel prever quanto uma fragao selecionada de um todo & similar a esse todo. Podemos tomar um caso ideal de uma mistura de dois componentes como um primeiro exemplo. Uma mistura farmacéutica contém apenas dois tipos de particulas; particulas do tipo A, contendo o ingredient ativo, e particulas do tipo B, com apenas um material exeipiente inativo. Todas as particulas so do mesmo tamanho. Desejamos coletar uma amostra bruta que permitira determinarmos a porcentagem de particulas contendo o ingrediente ativo no material como um todo. Consideremos que a probabilidade de retirar aleatoriamente as particulas do tipo A seja p ¢ de retirar aleatoriamente particulas do tipo B seja (1 — p). Se NV particulas da mistura forem retiradas, o valor mais provvel para 0 nimero de particulas do tipo A & p¥, enquanto o nimeto mais provavel de partfeulas do tipo B é (1 — p)N. Para essas populagées bindrias, a equagdo de Bemoulli# pode ser utilizada para caleu- lar 0 desvio padrio do nimero de particulas do tipo A retiradas, 7, n= VNpll —p) 62) (0 desvio padrdo relative of § de retirar particulas do tipo A €oy/Np —— Usamos o simbolo «para indicar 0 desvio padirdo relativo de Unio Internacional de Quimica 5) pura e Aplicada (lupac ‘Voeé deve ter em mente que A partir da Equagdo 8-3 podemos obter 0 mimero de partfeulas 7 ¥ma "to. necessario para alcangar um determinado desvio padrdo, como mostra- do na Equagio 8-4 on =P Np V Np 64 TAA Benedeti-Pchley, in Pisical Methods in Chemical Anais, WG. Bed, Ed. 3, Nova York: Academic Press, 1956, p, 183196; A. A, ‘Bencdei- Pichler, Esenial of uanitaive Anais, Capitulo 19, Nova York: Renal Pes, 1986 * Compendium of Analyse Nomenelatre: Definitve Roles, 1997, Intemacional Uni of Pare and Applied Chemisty, preprado por 1, Inczedy, T Lengyel, A.M, Ure, Malden, MA: Blackwell Science, 198, p. 2-8170 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eons Thowson Portanto, se por exemplo 80% das particulas sdo do tipo A (p = 0,8) ¢ 0 desvio padrio relative & 1% (7% = 0,01), o mimero de particulas que perfazem a amostra bruta deve ser 1-08 O8@.01F Portanto, uma amostra aleatéria contendo 2.500 particulas deve ser coletada, Um desvio padrio relativo de 0,1% necessitatia 250 mil particulas. Certamente, um nimero de particulas tao grande deve ser determi- nado por pesagem e nao por contagem, Tomemos o problema mais realistico e consideremos que ambos os componentes presentes na mistu- +a contenham o ingrediente ativo (analito), mas em diferentes porcentagens. As particulas do tipo A con- tém uma porcentagem mais alta do analito, P4, ¢ as particulas do tipo B, uma menor quantidade, Pp. Além disso, a densidade média d das particulas difere das densidades d ¢ dy desses componentes. Estamos inte- ressados em decidir o mimero de particulas e, portanto, o peso que precisamos atribuir a uma amostra com ‘ porcentagem média global do ingrediente ativo P, com um desvio padrio relativo da amostragem de 0, A Equagdo 8-5 pode ser estendida para incluir estas condi ‘dydy\* (Px — Pn\* N= pa -n( a ) (54) 65) A pattir dessa equagdo, vemos que as demandas de precisdo sto onerosas, em termos da dimensdo requeri- da da amostra, por causa da relagdo quadrada inversa entre 0 desvio padrao permitido e 0 mimero de particulas tomadas. Podemos ver também que um grande mimero de particulas precisa ser tomado & medida que @ por- centagem média P do ingrediente ativo se torna menor. grau de heterogeneidade, medido por P, — Pp, tem uma grande influéneia no niéimero de particu- Jas necessério uma vez que N aumenta com 0 quadrado da diferenga da composigao dos dois componentes da mistura, Podemos rearranjar a Equagdo 8-5 para calcular o desvio padrio relativo da amostragem, 66) Se considerarmos que a massa m da amostra seja proporcional ao nimero de particulas € que as outras quantidades na Equagdo 8-6 sejam constantes, o produto de m e a, deve ser uma constante, Essa constante K, & chamada constante de amostragem de Ingamells.* Portanto, K,= mx (7, X 100%)? en em que 0 fator de 100% converte «, para o desvio padrao relative em termos porcentuais, Além disso, quando 7, = 0,01, 7 X 100% = 1% e K, é igual a m. Por conseguinte, podemos interpretar a constante de amostragem K, como a massa minima de amostra necesséria para reduzir a incerteza associada & amostragem a 1%, FC. ingamels cP. Swit, Talanta, 1973, v.20, p. 5‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP, 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «171 © problema de se decidir sobre o peso da amostra bruta para uma substincia sélida é normalmente ainda mais dificil do que esse exemplo, porque a maioria dos materiais ndo apenas contém mais que um componente, mas também apresenta uma faixa de tamanhos de particulas. Na maioria dos casos, 0 primeiro destes problemas pode ser solucionado dividindo-se a 4 pars simplifcaro problema amostra em sistemas imagindrios de dois componentes. Assim, com de definiro peso de uma amostra uma mistura real de substncias, um componente selecionado pode ser _bruta de uma mistura com todas as varias particulas contendo o analito ¢ o outro pode ser todos Yétios componentes, considere ‘0s componentes residuais que contém pouco ou nenhum analito, Apés js ¢.cmosta sia uma mistura serem definidas as densidades médias ¢ os porcentuais do analito para cada parte, 0 sistema ¢ tratado como se tivesse apenas dois com- ponentes. © problema do tamanho de particula varidvel pode ser manejado calculando-se 0 nimero de particu- las que seria necessério se a amostra consistisse em particulas de um iinico tamanho. Entdo, 0 peso da hipotétiea que contenha dois component amostra bruta seria determinado levando-se em consideragdo a distribuigdo do tamanho das particulas. Uma estratégia consiste em calcular 0 peso necessdrio considerando-se que todas as particulas sejam do tamanho da maior delas. Contudo, esse procedimento nao é muito eficiente, ¢ para isso geralmente requer- se a retirada de um maior peso de material que 0 necessario, Benedetti-Pichler fornece métodos alterna- tivos para calcular 0 peso de uma amostra bruta a ser utilizado.” Uma concluss interessante a partir da Equagio 8-5 & que o nimero de particulas contido em uma amostra bruta ¢ independente do tamanho das particulas. O peso da amostra, certamente, aumenta direta ‘mente com o volume (ou com 0 cubo do didmetro da particula), entdo a redugdo no tamanho da particula de um dado material tem um grande efeito sobre o peso necessério da amostra bruta, Claramente, uma grande quantidade de informagées sobre uma substincia precisa ser conhecida para se fazer uso da Equagio 8-5. Felizmente, podem ser feitas estimativas razoaveis dos virios parimetros da equagdo. Essas estimativas podem ser baseadas na anélise qualitativa de uma substancia, inspegdo visual informagdes da literatura sobre substincias de origem similar. As medidas grosseiras das densidades de varios componentes também podem ser necessérias, EXEMPLO 8-1 Um material de recheio de colunas cromatogrificas consiste em uma mistura de dois tipos de compo- nentes. Considere que a particula média do material que esta sendo amostrado seja aproximadamente esférica, com um raio de 0,5 mm, Grosseiramente, 20% das particulas parecem ser de cor rosa e sao ‘conhecidas por terem cerca de 30% de seu peso formado por uma fase estaciondria polimérica ligada (© analito). As particulas rosas tém uma densidade de 0,48 g/cm. As particulas remanescentes possum uma densidade de cerca de 0,24 g/em* e contém pouco ou nenhuma fase estacionaria polimérica. Que ‘massa do material deve conter a amostra bruta se a incerteza da amostragem deve ser mantida abaixo de 0,5%, em termos relativos? Primeiro calculamos os valores médios para a densidade e para a porcentagem do polimero: d= 0,20 X 0,48 + 0,80 X 0,24 = 0,288 gem? (0,20 X 0,48 X 0,30) g polimerofem? % 100% = 0.10% 0,288 g amostra/em* 1 Oe (continua TAA Benedeti-icher in Posical Method in Chemical Anais, W.G. Berl), v3, 1. Nova Yor: Academic Press, 1986, p. 192,172 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eotors ThoMson Substituindo-se entdo na Equagdo 8-5 temos 048 x 0,24/*/_ 30-0)? oan -020| | (Gast) = 1,11 x 108 particulas necessirias peso da amostra 3g 1 1 pret 4 5p om? 0288 g paricata “om? Amostragem de Solucdes Homogéneas de Liquidos e Gases Para solugdes de liquidos ou gases, a amostra bruta pode ser relativamente pequena, uma vez que ordina- riamente a ndo homogeneidade ocorre em nivel molecular, ¢ mesmo pequenos volumes de amostra vo con- ter mais particulas que o niimero calculado a partir da Equagdo 8-5 analisado deve ser agitado imediatamente antes da amostragem para assegurar que > Solugdes bem misturadas de Tiquidos e gases requerem apenas uma amostra muito pequena Porque sio homogéneas até nivel molecular, Teniiar «populate 1 fer analisadn Calesaraleatoramen 8 fariculas(Equapao 8-5) pan aera ua amosta brute Reduzro amano das paticula ehomogencizar& moses bra Caleta aestoramente N parcuas sim Taocarw amos de Iaborstrio| Remover porter amosta para a anise ne labortério Figura 8-6 Etapas envelvidas na amastragem de um sélido paticulada, . Quando possivel, o Kquido ou gas a ser amostra bruta seja homogénea. Com grandes volumes de solugdes, essa mistura pode ser impossivel; entdo € melhor amostrar varias porgdes do recipiente com ‘um “coletor de anostras”, um frasco que pode set aberto e preenchido fem qualquer local desejado da solugio, Esse tipo de amostragem é importante, por exemplo, na determinagdo de constituintes de liquides expostos 4 atmosfera. Assim, o conteiido em oxigénio da égua do lago pode variar por um fator de 1.000 vezes ou mais em uma diferenea de profundidade de poucos metros Com o advento de sensores portatei nado comum levar o laboratério & amostra em vez de levar @ amostra para o laboratério. A maioria dos sensores, entretanto, mede apenas con- ccentragdes locais e ndo determina a média ou € sensivel a concentragdes, remotas, No controle de processo e outras aplicagdes, as amostras de Iiqui- dos so coletadas das correntes em fluxo. I necessério ter cuidado para que a amostra coletada represente uma fragdo constante do fluxo total ¢ que todas as porgdes da corrente sejam amostradas. Os gases podem ser amostrados por varios métodos. Em alguns «casos, um saco de amostragem é simplesmente aberto e preenchido com © gs; em outros, os gases podem ser absorvides em um liquido ou adsorvidos na superficie de um s6lido. fem anos recentes, tem-se tor- Amostragem de Solids Particulados Muitas vezes ¢ dificil obter uma amostra aleatéria a partir de um mate- rial particulado, A amostragem aleatéria pode ser mais bem realizada enquanto © material esté sendo transferido. Os dispositivos mecanicos, tam sido desenvolvidos especialmente para o manuseio de muitos tipos ‘de materiais particulados. Os detalhes sobre a amostragem desses mate- riis esto além do escopo deste livro, Amostragem de Metais e Ligas ‘As amostras de metais e ligas sio obtidas por meio de limalhas, moagem ou perfuragdo, Em geral, nao ¢ seguro considerar que pedagos de um ‘metal removido da superficie sejam representativos do todo, entio os‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «173 ‘materiais sélidos do interior também precisam ser amostrados. No caso de alguns materiais, uma amostra representativa pode ser obtida serrando-se o material em intervalos aleatérios © coletando o pé residual como amostta, Alternativamente, © material pode ser perfurado, novamente a distdncias espagadas aleato- riamente, com o material removido pela perfuragao sendo coletado como amostra; a broca deve perfurar totalmente 0 bloco ou metade da espessura em cada um dos lados opostos. O material pode ser quebrado misturado ou ainda fundido conjuntamente em um cadinho especial feito de grafite. Muitas vezes pode se obter uma amostra granular vertendo-se o fundido em gua destilada. 8B-4 Preparacao de uma Amostra de Laboratorio Para os s6lidos ndo homogéneos, a amostra bruta pode ser pesada na faixa de centenas de gramas até quilo- ‘gramas, ou mais; portanto, tomna-se necesséria a redugo da amostra bruta para uma amostra de laboratério finamente moida ¢ homogénea, pesando no méximo algumas centenas de gramas. Como apresentado na Figura 8-6, esse processo envolve um ciclo de operagdes que inclui esmagar e moer, peneirar, misturar dividir a amostra (normalmente em metades) para reduzir seu peso. A amostra de laboratério Durante cada divis 0, retém-se 0 peso da amostra que contém o niimero geveria ter 0 mesmo nimero de de particulas determinado a partir da Equagdo 8-5. particulas que a amostra bruta, EXEMPLO 8-2 ‘Um vagio de minério de chumbo contendo galena (~= 70% de Pb) e outras particulas com pouco ou ne- hum chumbo esta para ser amostrado. A partir das densidades (galena ~ 7,6 g/cm?, outras particulas, 5 glem?, densidade média = 3,7 g/cm’) ¢ da porcentagem aproximada do chumbo, a Equagio 8-5 indica que 8,45 X 10° particulas sdo necessdrias para manter o erro relativo da amostragem menor que (0,5%. As patticulas patecem ser esféricas com um raio de 5 mm, Um célculo do peso requerido, simi- lar aquele da Equagdo 8-1, indica que a amostra bruta pesa cerca de 1,6 X 10° g (1,6 toneladas), ‘Queremos reduzir essa amostra bruta para uma amostra de laboratério que pese cerea de 100 g. Como isso pode ser feito? A amostra de laboratério contém o mesmo mimero de particulas que a amostra bruta, ou 8,45 x 10%, Para cada particula, 100g eso médio da panel — Faas 1,18 X 10 g/particulas © peso médio de uma particula esté relacionado com seu raio por meio da equaca0 4 Be peso médio da particula = -x{nfom?] x 3 Se igualarmos estas duas relagdes e resolvermos em relagdo a r, teremos, veg y 3 om) Portanto, a amostra deve ser repetidamente moi ‘cerca de 0,2 mm de diémetr. 1,97 X 10m, ou 0,2 mm misturada e dividida até que as particulas tenham As informagdes adicionais sobre os detalhes na preparagdo de amostras de laboratério podem ser encontradas no Capitulo 35 e na literatura.* Standard Methods of Chemical Anas, KJ, Welcher (ed). 2 Pat A, rincstan, Ni: Van Nostra, 1963, 9. 21-55, Uma exens bibgraia ‘com informapbesespesca solve a amosvagem em sdo compilads por C. A. Bicking, ia eats on Analcal Chom, LM. Kolbe P I Blving (ed), 2 ev 1. Nova York: Wiley, 1978, p. 299,174 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eorora ThoMson 8B-5 Numero de Amostras de Laboratério Uma vez que a amostra de laboratério esteja preparada, a questo que petmanece € quantas amostras devem ser tomadas para a andlise. Se tivermos reduzido a incerteza da medida de forma que ela seja menor que um tergo da incerteza da amostragem, a iltima vai limitar a preciso da andlise, Certamente, o mimero depende do intervalo de confianca que desejamos utilizar para descrever 0 valor médio ¢ o desvio padro do método. Se o desvio padro da amostragem @, for conhecido a partir da experiéneia prévia, podemos usar os valores de z contidos na tabelas (ver Sedo 7A-1), para y= 8 + Mais freqtientemente, usamos uma estimativa de o, e assim precisamos usar as tabelas contendo valores de t (ver Sego 7A-2). IC para ye = 3 + 0 iiltimo termo dessa equagdo representa a incerteza absoluta que podemos tolerar a um nivel de confianga especifico, Se dividirmos esse tetmo pelo valor médio, , podemos caleular a incerteza relativa 7, que € tolerada em um dado intervalo de confianga. 68 9) De fato, 0 emprego de t em vez de z na Equagdo 8-9 leva a uma complicagdo, uma vez que 0 proprio ¢ depende de N. Geralmente, contudo, podemos resolver a equagao por iterago, como mostrado no Exemplo 8.3, ¢ abter 0 nimero desejado de amostras. EXEMPLO 8-3 A determinacao de cobre em uma amostra de 4gua do mar fornece um valor médio de 77,81 g/L e um desvio padrao s, de 1,74 ug/L. (Observacdo: Aqui os algarismos significativos foram mantidos porque esses resultados serdo utilizados mais tarde em um célculo.) Quantas amostras precisam ser analisadas para se obter um desvio padrao relativo de 1,7% no resultado, a um nivel de confianga de 95%? Comegamos considerando um nimero infinito de amostras que fornece um valor de f de 1,96 em um nivel de confianga de 95%, Dado que «7, = 0,017, s, = 1,74 e¥ = 77,81, a Equagao 8-9 gera _ 967 «1.747 ~ooinex isn °° Se arredondarmos esse resultado para sete amostras, encontramos o valor de ¢ de 2,45 pata 6 graus de liberdade, Entdo, um segundo valor de N pode ser calculado usando esse valor de f, que da. = 10,38. Se utilizarmos 9 graus de liberdade e t = 2,26, o préximo valor é V = 8,84. A interago converge com um valor de NV de aproximadamente 9. Observe que poderia ser uma boa estratégia reduzir a incerteza da amostragem; assim, menos amostras seriam necessarias‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «175 8B-6 Manuseio Automatico de Amostras ‘Uma ver que a amostragem tena sido completada e que o miimero de amostrase rplicas tonha sido esco- lhido, inica-se o processamento da amostra(lembre-se da Figura 1-2). Devido a sua confibilidade e aos baixos custos envolvidos, muitos laboratérios estio empregando métodos automiticos de manuseio de amostras. Em alguns cas0s, © manuseio automtico de amostras € utiizado apenas para algumas opera- @8es especiticas, como dissolugdo de amostras e remosdo de interferén- 4 0 manuseio auomatico de cias; em outros, todas as ctapas remanescentes no procedimento anaiti-_amostas pode pemitir maior co sé automatizadas. Dois métodos diferentes de manuscio automatico _velocidade analitica (mais andlises Sto deseritos aqui: o manuseio baseado em uma abordagem em batela- Palade de emo) maiot da, ou disereto, e aquele com base em uma abordagem que emprega 0.9 muanuscio manual de fluxo continuo. smostas ‘Métodos Discretos 0s sistemas que processam amostras de uma maneira discreta muitas vezes imitam as operagGes que se- riam realizadas manualmente. Os robs de laboratério sfo empregados para processar amostras quando pode ser perigoso para o homem estar envolvido ou quando um grande nimero de etapas de rotina & necessirio, Pequenos robés de laboratério tém sido comercializados desde a metade da década de 1980? 0 sistema robstico & controlado por um computador que foi programado pelo usuétio, Robés de labo- ratério podem ser usados para diluir, filtrar, separar, moer, centrifugar, homogeneizar, extrair e tratar amostras com reagentes. Eles também podem ser programados para aquecer e agitar amostras, dispensar volumes medidos de liquidos, injetar amostras em colunas cromatogriticas, pesar amostras ¢ transporté- las para a medida em instrumentos apropriados. Alguns processadores discretos de amostras automatizam apenas a etapa de medida de todo 0 pro- cedimento ou poucas etapas quimicas e a etapa de medida, Um tipo, baseado no uso da forga centrifuga, mistura amostras ¢ agentes ¢ os transfere para um instrumento fotométrico, para a realizago da medida je de reagoes ‘Outro tipo, com base em uma tecnologia que usa multicamadas de filmes, desenvolve uma quimiicas ou processos fisicos de uma forma sequencial."° ‘Métodos em Fluxo Continuo Nos métodos em fluxo continuo, a amostra éinserida em um fluido trans- 4 0s dois tipos de analisadores portador, no qual iniimeras operaydes podem ser desenvolvidas antes que _ Sm wx0 continua slo 9 analisador cela seja enviada para 0 detector em fluxo, Assim sendo, esses sistemas. $uj;<.dor por injerdo em fluxo, funcionam como analisadores autométicos que podem realizar nao ape- nas operagées de processamento da amostra, mas também a etapa final | q qispersdo ¢ um alargamento de «de medida. Operagées de processamento de amostras,tais como adigdo de | banda ou um fendmeno de mistura reagentes,diluigdo, incubagao, mistura,didlise, extragdo, e muitas outras, | que € resultado do acoplamento podem ser implementadas entre o ponto de introdugd0 da amostra e a_| 6° esoamerto do ide coma detecgdo, Existem dois tipos diferentes de sistemas em fluxo continuo: | {store as nares gecononte de analisadores em fluxo segmentado ¢ analisadores por injego em fluxo. | um graciente de concentraao. © analisador em fluxo segmentado divide a amostra em segmentos diseretos separados por bothas de gas, e pode ser visto na Figura 8-7a, Como apresentado na Figura 8-7b, as bolhas geram barreiras para prevenir que a amostra se espalhe a longo do tubo, como resultado do proceso de dispersio. Portanto, as bolhas confinam a amostra ¢ minimizam a contaminagdo entre diferentes amostras. Elas também aumentam a mistura entre as amostras ¢ os reagentes. Os perfis de concentrago do Par ume descr de robs de Inboratro, ver GJ Kost (ed), Handbook of Clinical Automation, Robotics and Optimization. Nova York: Wile; 1996;1.R. Swimalis 6. L. Hawk, Advances in Laboratory Automaton Robotics Hopkinto, MA: Zymatk Comp, 1998; V, Bony, Anal Com, 190, n, 62, p. 337A; JR. Sra, J. Chm. Hae, 1988, v. 6, p. AB; 199, ¥ 67, 9. A20; W. J. lust 1. W. Mortimer, Laboratory Robotics, Nove York VCH Publishers, 1987 1 Para uma discustto ris extensiva de aalisadoesautométeosbasetdos em mullicamadas de flies, ver D, A, Skoog F. J, Holler eT A Nieman, Principles of Insrumental Analysis, 8.04. Belmont, CA: BrooksiCole, 1998, p. 885-849.176 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eons ThoMson analito so exibidos na Figura 8-7e. As amostras sio introduzidas no amostrador como pequenas zonas de composigio uniforme (plugues, & esquerda). Um alargamento devido a dispersdo ocorre até © momento em que a amostra alcanga o detector. Além disso, os sinais mostrados a direita da figura sao usados tipicamente para obter informagées quantitativas sobre o analito, As amostras podem ser analisadas a uma velocidade de 30 a 120 por hora, sistema denominado anélise por inj em fluxo (do inglés Flow Injection Analysis — FIA) é um desenvolvimento mais recente." Nesse processo, as amostras sdo injetadas a partir de uma alga de injegdo em um fluido transportador contendo um ou mais reagentes, como mostrado na Figura 8-8a, A amostra dispersa-se de uma forma controlada antes de alcangar 0 detector, como iustrado na Figura 8-8b. A injegdo da amostra em uma corrente de reagente gera o tipo de resposta descrito & dircita da figu- ra, Nos sistemas FIA de zonas coalescentes, ambos, a amostra ¢ o reagente, sto injetados em fluxos transportadores ¢ misturados em um misturador em forma de 'T (te). Tanto nos sistemas FIA normal quanto no de zonas coalescentes, a dispersdo da amostra é controlada pela dimensio da amostra, a vazdo do fluido transportador e o comprimento ¢ o didmetro do tubo. Também é possivel parar o fluxo quando Dispostivo at ‘Bobina de para retirads — oF sbolbas — [Dasaor Parodsscare Parse escate Bombs| ® Sopmento cid ar a amosta a a. Disegdo do xo —> Liquide o [aL : i Sa © Concentrasd0 Figura 8-7 Analisador em fluxo continuo segmentado. (a) As amostas sioaspiradas a paride fascos pelo amostragor¢ ‘bombeadas para dentro do dispositive, no qual sfo misturadas com um ou mais reagenes, O ar também ¢intgoduzide para Ssegmentar as amostas com bothas, Geralmente as bolhas so removidas por um dispositive antes que o fluxo aleanceo deteetor, ‘A amostra segmentada éexibida mais detalhadamente em (b).As bolhas minimizam a dispersdo da amostra, que pode causar alargamento das zonas e conlaminagdo eaze as diferentes mostra Os pefis de concentragdo do analito ne amosiradar ¢ no detector sto apresentados em (c), Normalmente, a altura do pico da amosta esti relacionada com a concentragio do anait, 5 Para mais infrmapeesbre FIA ver J. Ruzicka EH. Hansen, Flow Injection Analysis, 2 ed. Nova York: Wiley, 1988; M, Valezel¢ DM, Logue de Casto, Faw Injection Analysis: Principles and Applications. Chichester, Igate: lis Horwood, 1987 B, Kalberg ¢G.E. Pacey, low Injection Analysis: A Practical Guid, Nova York: Elsevier, 1989; JP. Smith eV. Hinsoo-Smith, Anal Chem, 2002 0.74, p. 385A.‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «177 ‘a amostra alcanga o detector, para permitir que perfis de concentragio em fungo do tempo sejam medi- dos em métodos cinéticos (ver Capitulo 29), Os sistemas por injerdo em fluxo também podem incorporar varias unidades de processamento de amostras, como médulos de extrag2o com solventes, médulos de aquecimento e outros. Em sistemas FIA as amostras podem ser processadas a taxas que variam entre 60 e 300 por hora. Em trabalhos recent sistemas FIA tém sido miniaturizados tanto para dimensio de capilares (didmetro interno entre 20 ¢ 100 4m) quanto para microchips (ver Destaque 8-1).”” Esses analisadores em miniatura tém o potencial de per- ‘mitir manipulagdes € medidas em amostras to pequenas quanto células individuais e de minimizar a quan- tidade de reagentes consumida na andlise. jp Reapeate 1 Vavula is Sf] = 1 Alga de Parc devcate amostrager o Resposta do Drapes por sts [=~ 2 Diego do fx » Figura 8-8 Analisador por injogdo em fluxo, Em (a) a amostra & cartegada a partir de um amostador para ume alga de amostragem om uma vélvula de amostragem. A vilvula, mostrada na posigdo de earregamento da amostra,apresenta também ‘uma segunda posigdo de injegto,identifiada por lishas pontilhadas. Quando posicionada para injeglo, a corent liguida contendo o reagente fui através da alga de amostragem. A amosta eo eeagente misturam-se ereagem na bobina de mistua antes de aleangaro detector. Nessec2s0, a 70na da amosra dispersa-se antes de atingr 0 detector. (6) O perfil de concentraga0 resullante(resposta do detector) depende do grau de dispersdo. 7 Exemplos de sistemas FLA em miniatura podem ser encontrado em D. M. Spence eS.R. Crouch, Anal. Chem, 1997, 0.69, p.165;A. G Had DE. Raymond, JW, Halliwell S.C, Jacobson eJ.M. Ramsey, Anal. Chem, 1997, 68.3407178 Paes Labeon-a-Chip'> FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ EpiroRs THOWsON © conceito de ter um laboratério completo em um chip tem evoluido nos tltimos anos. A mi- niaturizagao das operagdes de laboratério para a escala de um chip promete reduzit 03 custos analiticos pela diminuigo do consumo de rea- gentes, pela automatizagio dos procedimentos e pelo aumento no nimero de anélises que pode ser feito em um dia, Existem varias estratégias para implementar 0 conceito lab-on-a-chip. A de maior sucesso usa a mesma tecnologia da foto- litografia, desenvolvida para a preparagio de circuitos eletrénicos integrados. Essa tecnologia € empregada para produzir as vélvulas, sistemas de propulsio © cémaras de reagio necessérias para realizar as andlises quimicas. O desenvol- vimento de dispositives microfluidicos € uma rea de pesquisa ativa que envolve cientistas engenheiros de laboratérios académicos © in- dustriais."* Placassuperires com canas ‘Varios sistemas de propulsio de fluidos tém sido investigados, incluindo eletroosmose (ver Capitulo 33), bombas mecanicas microfabricadas e hidrogels que imitam msculos humanos. Tanto as técnicas de injego em fluxo, quanto os métodos de separagio como a cromatografia liquida (ver Capitulo 32), eletroforese capilar e cromatografia capilar eletrocinética (ver Capitulo 33), t8m sido implementados. A Figura 8D-1 mostra 0 esquema de uma microestrutura usada em FIA ou em FIA combinado com eletroforese. Esse tipo de sistema € chamado, muitas vezes, de sistema de anélise quimica total miniaturizado, ou p-TAS. (0s dispositivos lab-on-a-chip tém sido empre~ gados em pesquisas para separar ¢ detectar explo- sivos, seqlenciar DNA, determinar espécies. de importéncia clinica e andlise discriminatéria para drogas. Esses dispositivos devem se tomar mais, importantes com o amadurecimento da tecnologia Figura 8D-1 z= Plas inferiotes com eletrodos @ CCaregndor Reagener ox Fase mivel — : Detetor S¥ Descane Ineo Capita para deamosta cletoorese © Representa esquemétics de uma microestruturafabricada combinando FIA com ume separapo capil letroforética (a) Duas placas de vido sto usadas em uma estraturana forma de um sandufche. A placa superior contém a ‘estrtura com canais (30 um de largura por 10 ym de profundidade) ea place inferior possu eletwodos que contrelam 0 ffuxo. (b) As amostras so injtadas, mistradas com os reagents ccarregadas para o detector. Uma separagio eletrofoética também pode ser realizada, se desejado. Os detectores ttm sido de condutvidade,eletroquimico e de Mluoreseéncia (Modificado a partir de A. Manz, J.C. Fettnger,E. Verpoorte, I. Lud, I. M. Widmer e D. J. Harrison, Trends in Analytical Chemistry (TRAC), 1991, n. 10, . 144, com a permissio de Elsevier Science) Para mais deuthes ver D.Figeys, nal. Chem. 2000, v.72, . 330A, M VerN.A. Polson e M.A, ayes, Anal Chen, 2001, 6.73, 313A,‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «179 8C_| PADRONIZACAO E CALIBRACAO Uma parte muito importante de todos os procedimentos analiticos ¢ o processo de calibrago e padroniza- do. A calibragio determina a relagdo entre a resposta analitica e @ concentrago do analito. Geralmente isso € realizado pelo uso de padres quimicos. No estudo de caso das mortes dos cervos do Destaque 1-1, a concentracio de arsénio foi encontrada pela calibragao da escala de absorbancia de um espectrofotémetro com solugdes com concentragées conhecidas de arsénio. Quase todos os métodos analiticos requerem algum tipo de calibragdo com padres quimicos. Os métodos gravimétricos (ver Capitulo 12) ¢ alguns métodos coulométticos (ver Capitulo 22) estdo entre os poucos métodos absolutes que nido dependem da calibragao com padrdes quimiicos. Diversos tipos de procedimentos de calibrago so descritos nesta seed. 8C-1 Comparagao com Padrdes Dois tipos de métodos de comparagio sdo descritos nesta seo: a técnica de comparagio direta e 0 pro- cedimento de titulagao, Comparacao Direta Alguns procedimentos analiticos comparam uma propriedade do analito (ou o produto de uma reago com © analito) com um padrio, de maneira que a propriedade que esta sendo avaliada se iguale com aquela do padiao. Por exemplo, nos primeiros colorimettos, a cor produzida como resultado de uma reagao quimica do analito era comparada com aquela produzida pela reag2o dos padres. Se a concentra¢o do padrio variava devido & diluigo, era possivel obter uma cor relativamente parecida. A concentrago do analito era centdo igual & concentragdo do padrio apés a diluigdo. Esse procedimento é chamado de comparagio de nulo ou método de igualizagao.'® Em alguns instrumentos modemos uma variagdo desse procedimento € usada para determinar se a concentragio do analito excede ou é menor que algum nivel de referéncia, O Destaque 8-2 fornece um exemplo de como um comparador pode ser empregado para determinar se o nivel de aflatoxina em uma amostra excede o nivel que seria indicativo de uma situagdo téxica. A concentragdo exata de aflatoxina no & necessiia; apenas uma indicagao de que o nivel de referéncia tenha sido excedido & necessiria Altermativamente, uma comparagao simples com varios padres pode ser usada para indicar a eoncentraga0 aproximada do analito, DESTAQUE Um Método Comparativo para Aflatoxinas!® As aflatoxinas so potenciais carcinogénicos pro- _aflatoxinas consiste em um imunoensaio baseado duzidos por certos fungos que podem ser encon- em ligagdo competitiva. Esses ensaios serdo dis- trados no milho, amendoim e outros alimentos. _ cutidos posteriormente no Destaque 11-1 Eles no tém cor, odor nem sabor. A natureza t6- Na anélise, os anticorpos especificos para as xica das aflatoxinas tornou-se evidente devido a aflatoxinas recobrem a base de um compartimen- uma grande “mortandade de perus” ocorrida na to plistico ou cavidade microtituladora, em um Inglaterra em 1960. Um método de detecgdo de arranjo. (continua) 35 Ver, por excita H.V; Masta JD. Wineforder, Amal. Chem. Acta, 1960, v.20, p. 283; Ramsey ¢ C. G. Eke, Anal. Chem. 1965, ¥ 37,9. 1073 © PR Kraus, AP Wade, SR. Croh, JF Holland eB. M Milt, Anal. Chom 1988, v.60. 1387180 A aflatoxina comporta-se como antigeno. Durante a andlise, uma reagio enzimética leva & formago de um produto azul. A medida que a concenttacao de aflatoxina na amostra aumenta, a cor azul diminui de intensidade, O instrumento de medida da cor é 0 comparador de fibra éptica bbasico exibido na Figura $D-2. 0 instrumento pode ser usado para comparar a intensidade da cor dda amostra com aquela da solugdo de referéneia Refertnia cl e, FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ pron THOWsON para indicar seo nivel de aflatoxina excede o nivel limite. Em outro modo, uma série de padres com concentragdes crescentes pode ser colocada no compartimento da refeténcia, A concentragdo de aflatoxina na amostra € aquela entre os dois padres com concentragées.ligeiramente mais altas ¢ ligeiramente mais baixas que a do analito, como mostrado pelos indicadores verde e vermel- ho dos diodos emissores de luz (LEDS). ‘Amos Refertacia Amos Refetacia Figura 8D-2 _Comparador éptico. (a) Uma fibra Spica que se divide em dois segmentos earrega a luz do diodo emissor de luz (LED) até as cavidades que contém a amostra ca referencia em um suporte para place microtiuladora, As amostas ‘contendo quantidades desconhecidas do anslito séo colocadas no suporte de cavidades microitladoras. Se a amostra ‘contém mais allatoxina que o pad (b), a cavidade da amosira absorve menos lz que ado padi a 650 nm. Um cizcuito efetrOnieo acende um LED vermetho para indicar uma quantidade perigosa de alatoxina, Se @ amostr tiver menos ailatoxina que padrio (c), um LED verde se acende‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizagao e Calibragao 181 Titulagoes As titulagdes estio entre os procedimentos analiticos mais exatos. Em uma titulagdo, o analito reage com um reagente padronizado (0 titulante) em uma reagdo de estequiometria conhecida, Geralmente, a quanti- dade de titulante é variada até que a equivaléncia quimica seja alcangads, como indicado pela mudanga de cor de um indicador quimico ou pela mudanga na resposta de um instrumento. A quantidade do reagente padronizado necessiria para atingir a equivaléncia quimica pode ser relacionada com a quantidade de ana lito presente. Portanto, a titulagao é um tipo de comparagao quimica. Por exemplo, na titulagdo do dcido forte HCI com a base forte NaOH, uma solugdo padronizada de NaOH ¢ usada para determinar a quantidade de HCl existente. A reagio & HCl + NaOH > NaCl + H,0 A solugdo padronizada de NaOH é adicionada de uma bureta até que um indicador como a fenolf taleina mude de cor. Nesse ponto, chamado ponte final, 0 nimero de mols de NaOH adicionado & apro- ximadamente igual ao mimero de mols de HCI inicialmente presente. © procedimento de titulagdo é bastante geral e pode ser empregado para uma variedade de determi- nagdes, Os capitulos 13 17 discutem 0 método de titulagdo com mais detalhes. As titulagdes deido-base, de complexagdo e de precipitagdo sto descritas 8C-2 Calibracdo com Padrao Externo Um padrao externo é preparado separadamente da amostra, Em contraste, um padtado interno € adiciona- do a pripria amostra, Os padres de arsénio utilizados para calibrar a escala de absorbancia do espectro- fotdmetro no Destaque 1-1 foram padrdes extemnos usados na determinagao de atsénio, Padres externos sdo utilizados para calibrar instrumentos e procedimentos quando nao ha efeitos de interferéncia de com- ponentes da matriz na solugdo do analito. Uma série desses padres extemos contendo o analito em con- centragdes conhecidas € preparada, Idealmente, trés ou mais dessas solugdes s4o usadas no processo de calibragao, Em algumas anélises de rotina, entretanto, uma calibragao com dois pontos pode ser conside- rada confidvel. A calibragdo € realizada obtendo-se o sinal de resposta (absorbancia, altura do pico, rea do pico) como uma fungdo da concentragao conhecida do analito. Uma curva de calibragao & preparada colocando- se os dados em forma de grafico ou ajustando-os por meio de uma equagao matematica adequada, como a relagdo linear utilizada no método dos minimos quadrados. A préxima etapa € a da previsio, na qual o sinal de resposta obtido para a amostra ¢ usado para prever a concentragdo desconhecida do analito, cs, a partir da curva de calibragdo ou pela equagdo de melhor ajuste. Entio a concentragdo do analito na amostra ori- ginal ¢ calculada a partir de cy pela aplicagio dos fatores de diluigo apropriados decorrentes das etapas de reparago da amostra 0 Método dos Minimos Quadrados Uma curva de calibragao tipica é mostrada na Figura 8-9 para a determinagdo de isoctano em uma amostra de hidrocarboneto, Aqui uma série de padres de isoctano foi injetada em um cromatégrafo a gas e a drea do pico do isoctano foi obtida como fungao da concentragdo. A ordenada & o eixo da varidvel dependente (area do pico), enquanto a abscissa ¢ a varidvel independente (mol de isoctano, em porcentagem). Como & tipico € normalmente desejével, o gréfico se aproxima de uma linha reta. Observe, contudo, que, devido aos e1tos indeterminados envolvidos no processo de medida, nem todos os dados caem exatamente na linha reta, Portanto, o analista precisa tentar tragar “a melhor” linha reta entre os pontos. A andlise de regressio fomece um meio para a obtengao de forma objetiva dessa linha e também para especificar as incertezas associadas com 0 seu uso subseqiiente. Consideramos aqui apenas o método dos minimos quadrados para dados bidimensionais182 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eortora ThoMson ‘ons, +8) } 50 40 30 y, Atea do pico, unidades x Concentasto de isctano, mol % Figura 8-9 Curva de calibro para a determinagdo de isoctano em uma mistura de hidrocarbonetos. Consideracdes sobre 0 Método dos Minimos Quadrados Duas consideragdes sto feitas no uso do método dos minimos quadrados. A primeira & que existe uma relago verdadeiramente linear entre a resposta medida y ¢ a concentragdo analitica do padrdo x. A relagdo matemética que descreve essa consi- deragdo é denominada modelo de regressio, que pode ser representada como yam +b em que b é o intereepto (0 valor de y quando x for zero) e m, a inclinagao da linha (Figura 8-10). Também consideramos que qualquer desvio de pontos individuais da linha reta é decorrente de erros na medida. Isto & considetamos que nao hé erro nos valores de x dos pontos (concen- tragdes). Ambas as consideragdes so apropriadas para muitos méto- dos analiticos, mas tenha em mente o seguinte, sempre que existe uma pimercepte=b incerteza significativa nos dados contidos em x, a andlise linear dos ‘minimos quadrados pode no fornecer a melhor linha reta. Nesse caso, i ‘uma anilise de correla¢o mais complexa pode ser necesséria, Além # disso, a andlise dos minimos quadrados simples pode no ser apro- priada quando as incertezas nos valores de y variam significativamente c ‘ em relagio a x. Dessa forma, pode ser necessirio aplicar diferentes Figura 8-10. A inci ‘pesos aos fatores e realizar uma anslise de mfnimos quadrados pon- imtereepo de uma linha ret derada, Tnclinasto=m‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP, 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «183 Obtengdo da Linha dos Minimos Quadrados Como ilustrado . Quando a janela Ftapa rmiimero 2 de 4 aparecer, clique em Avangar> novamente. Clique na opedo Linhas de Grade € marque Linhas de Grade Principais sob Eixo dos Valores (X). Entio clique na opgio Titulo € marque x no campo Eixo dos Valores (X) € y no campo Eixo dos Valores (Y). Finalmente, clique em Avangar> e depois em Concluir> para produzir o seguinte grafico dos dados.192 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eotors THoMson Outra vez clique em qualquer ponto graficado com o botio direito do mouse e, depois, clique em Adicionar Linha de Tendéncia... Na opedo Tipo, selecione Linear. Em opgdes, marque Exibir equaga0 no grafico ¢ Exibir valor do quadrado de R no gréfico. Entdo clique em OK. A espessura da linha pode ser ajustada clicando-se com 0 botio direito do mouse sobre @ linha ¢ selecionando Formatar Linha de Tendéncia.,..Em Padtdes, selecione uma linha com a espessura desejada, Voc® também pode mover o texto da equagao e do R? para um local mais conveniente, como indicado no grafico a seguir. y= 20005 402557 R= 09877 Como uma extensdo a esse exercicio, modifique sua planilha para incluir uma coluna de residuos, co- ‘mo mostrado na Tabela 8-2, Crie um grafico dos residuos em fungdo de x. Os grificos dos residuos podem ajudé-to a detectar qualquer desvio sistemiético dos pontos experimentais a partir da reta dos minimos quadrados. Tenha a certeza de gravar sua planilha em um arquivo para referéncia e para uso na analise de dados de laboratério. Embora tenhamos focalizado nas calibragdes com base em relagdes lineares, existem casos na quimica analitica nos quais a calibragao nao-linear & empregada, Algumas vezes a relagdo entre a resposta analitica € a concentragdo é inerentemente ndo-linear. Em outras, os desvios da linearidade surgem porque as solugdes no se comportam idealmente. Em ambos os casos, a regressio niio-linear pode ser utilizada para desenvolver 0 modelo de calibragao."* Erros na Calibracdo com Padrdo Externo Quando os padres extemos sdo usados, considera-se que quando a mesma concentrago do analito esti- ver presente na amostra € no padrio, a mesma resposta serd obtida. Assim, a relagdo funcional da cali- bragdo entre a resposta e a concentragdo do analito também deve-se aplicar & amostra ‘Normalmente, em uma determinacao, a resposta original do instrumento nao & utilizada. Em vez disso, a resposta analitica é corrigida por meio da medida de um controle (branco). branco ideal é idéntico & amostra, mas sem o analito. Na prética, com amostras complexas, ¢ muito dispendioso ou impossivel preparar um branco ideal e um compromisso precisa ser estabelecido. Muito frequientemente, um branco real & tanto um branco do solyente, contendo © mesmo solvente no qual a amostra foi dissolvida, como um branco do reagente, contendo o solvente mais os reagentes usados no preparo da amostra, Mesmo com corregdes para o branco, virios fatores podem causar falhas nas consideragdes bisicas do miétodo do padrio extemno. Os efeitos de matriz decorrentes da existéncia de espécies estranhas na amostra, que nao estdo presentes nos padres ou no branco, podem fazer que os analitos e os padrdes de igual con- centragao fornegam respostas diferentes. As diferengas em varidveis experimentais no momento da medida do branco, da amostra e dos padres também podem invalidar uma calibragao estabelecida. Mesmo quando a consideragdo bisica ¢ vilida, os erros podem ocorrer devido & contaminago durante a amostragem ou nas etapas de preparagio da amostra, Ver. M Bates eG. Wats, Nonlinear Repression Anas and ts Applications. Nova York: Wiley, 1988‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao «193 (0s eros sistematicos também podem ocorrer durante o processo de calibro, Por exemplo, se os padres forem preparados incorretamente, um erro vai acontecer. A exatidiio com a qual os padrdes siio preparados depende da exatidao das técnicas gravimétricas e volumétricas, assim como do equipamento utilizado. A forma «qimica dos padres precisa ser idéntica aquela do analito na amosia;o estado de oxidagao, a isomeria ou a complexagdo do analito podem alterar a respost. Uma ver preparadss, a8 « Pars vier 0s eos concentragdes dos padrées podem variar em decor da volatilizagdo, ou da adsorgao as paredes de recipientes. A contaminagdo s dos padres tamlsim pode resular em concenragBes mais elevadas que @ fs) stdoqumio presi se esperado para oanalito, Um eno sistematico pode ocomter se existiralguma 0 SMCs emiticos cia da decomposigo, na calibrago, os padrées precisam ser preparados de forma exata e tendéncia no modelo de calibrago. Por excmplo, os erros podem surgir se estaveis com relagao a sua 4 fungio de calibragdo for obtida sem o uso de padres suficientes para concentrado, pelo menos durante se obter boas estimativas estaisticas dos pardmetros. © processo de calibrasdo. Os erros aleatérios também podem influenciar a exatiddo dos resultados obtidos a partir de curvas de calibrago, Da Equacio 8-18, pode-se observar que o desvio padrio na concentragdo s, do analito, obtido de uma curva de calibrago, ¢ minimo quando a resposta J, se aproxima do valor médio #. O ponto %,5 representa o centro da reta de regressdo, Os pontos préximos desse valor so determinados com mais certeza que aqueles mais distantes da regido central. A Figura 8-11 mostra uma curva de calibragao com Ti- mites de confianga. Observe que as medidas feitas préximas do centro da curva fornecerdo menor incerteza na concentragdo do analito que aquelas feitas nos extremos. 8C-3 Minimizacao de Erros em Procedimentos Analiticos Existem diversas etapas que podem ser efetuadas para assegurar a exatidao em procedimentos analiticos.'® ‘A maioria delas depende da minimizagao ou correo de erros que podem ocorrer na etapa da medida, Devemos observar, entretanto, que a exatidio e a precisio globais de uma anilise podem estar limitadas no pela etapa de medida, mas por fatores como amostragem, preparo da amostra ¢ calibragdo, como dis- cutido anteriormente neste capitulo, Figura 8-11 Efsito da incertcza da curva de calibraglo. As linhas pontihadas mostra os limites de confianga para as concentragbes determinadas pela reta de reressio. Observe que as incertezas aumentam nas extremidades do grafico. [Normalmeate,estimamos a incerteza na concenteagdo do analito apenas por meio do desvio padtio da resposta, A inceteza ne curva de calibragio aumenta a incerteza na concentrasdo do enalito de s.atés,' como mostrado, 55 Pura uma discussto mais extensiva sobre a misimizapo de crs, vr J.D. Ingle Ie , R. Croue, Spctrochemical Analysis, Upper Saddle River, NF Prete, 1988, p 176-183,194 — FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eorors Thowson Paes Calibragao Multivariada 0 procedimento dos minimos quadrados descrito é um exemplo de um procedimento de calibragio uni- variado porque apenas uma resposta ¢ usada por amostra. O processo de relacionar respostas instru- ‘mentais miltiplas com um analito ou mistura de analitos ¢ conhecido como calibragio multivariada. (05 métodos de calibragao multivariada”® tém-se tornado bastante populares nos anos recentes & medi- da que novos instrumentos que produzem respostas multidimensionais se tomam disponiveis {absorbancias de varias amostras em miiltiplos comprimentos de onda, espectros de massa de compo- nentes separados cromatograficamente, ¢ assim por diante). Esses métodos so bastante poderosos. Podem ser utilizados para determinar simultaneamente méltiplos componentes presentes em misturas ¢ fornecer redundéncia em medidas para melhorar a preciso. Lembre-se de que a repetigo de uma medida N vezes fomece uma melhora em VN da preciso do valor médio. Esses métodos também podem ser usados para detectar a presenga de interferéncias que no seriam identificadas em uma cali- bragdo univariada. As técnicas multivariadas so métodos inversos de calibragao, Nos métodos de minimos quadra- dos, muitas vezes chamados métodos dos minimos quadrados clissicos, a resposta do sistema é mo- delada como uma fungdo da concentragdo do analito. Nos métodos inversos, as concentragdes sio tratadas como fungdes das respostas. O tltimo apresenta algumas vantagens de forma que as concen- tragdes podem ser exatamente previstas, mesmo na presenga de fontes de interferéncia quimica e fisi- ca, Nos métodos cléssicos, todos os componentes do sistema precisam ser considerados no modelo ‘matemitico produzido (equacdo da regressio). Os métodos de ealibragdo multivariada comuns sto a regressio linear miiitipla, a regressao de ‘mfnimos quadrados parciais e a regressio de componentes principais. Estas diferem exatamente na maneira pela qual as variagdes nos dados (respostas) sdo usadas para prever a concentragdo. Estio disponiveis no mercado programas de computador de varias empresas que realizam calibrago multi- variada, © uso de métodos estatisticos multivariados para a anélise quantitativa ¢ parte de uma disci- plina da quimica chamada quimiometria, ‘A determinagao multicomponente de Ni(II) e Ga(II1) em misturas é um exemplo do uso da cali- bragdo multivariada.”! Ambos os metais reagem com 4-(2-piridilazo)-resorcinol (PAR) para formar produtos coloridos. Os espectros de absorgao dos produtos so ligeiramente diferentes e se formam em velocidades ligeiramente diferentes. Pode-se tirar vantagem dessas pequenas diferengas para realizar determinagdes simulténeas dos metais em misturas. Em uma andlise, 16 misturas de padres contendo 108 dois metais foram empregadas para obtet 0 modelo de calibragao, Um espectrofotémetro com arran- jo de diodos que monitora miiltiplos comprimentos de onda (ver Capitulo 25) coletou dados para 26 intervalos de tempo ¢ 26 comprimentos de onda. As concentragdes dos metais, na faixa de mol L~1, foram determinadas por regressio de minimos quadrados parciais e por regressio de componentes prin- cipais em misturas desconhecidas a pH 8,5, com erros relatives menores que 10%. Vx. \a Seon vane Sf q Estrutura quimiea do 4-2 piridiazo) resorcinol ‘Modelo molecular do PAR. 38 Para uma discutso mais extensive er K, R. Besbe, R. J Pelle M.B, Sesh 1998; H, Martens eT Noes, Mulvariate Calibration. Nove York: Wiley 198, 21 Callen eS. R Crouch, Anal Chem det, 200, 407, p. 13S CChemometrice: A Prati Guide, Copia, Nova York: Wily,‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP, 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «195 Separacées tratamento da amostra realizado por métodos de separagdo ¢ uma maneira importante de minimizar os erros devido a possiveis interferéncias da matriz. da amostra, Técnicas como filtragao, precipitagao, dislise, extragdo com solvente, volatilizagdo, troca idnica e cromatografia sao todas iiteis para tomar a amostra livre de potenciais constituintes interferentes. A maioria dos métodos de separagao é, entretanto, lenta e pode aumentar as chances de que parte do analito seja perdida ou que a amostra seja contaminada. Em ‘muitos casos, contudo, as separagdes sdo a nica forma de eliminar espécies interferentes. Alguns instru- mentos modemos incluem um sistema de pré-tratamento automatic que contém uma etapa de separaga0 {injego em fluxo ou cromatografia). Saturacdo, Modificacdo de Matriz e Mascaramento (0 método da saturagio envolve a adigdo da espécie interferente nas amostras, padres e brancos para que © efeito da interferéncia se tome independente da concentragao original da espécie interferente na amostra, Isso pode, entretanto, degradar a sensibilidade e a detectabilidade do analito. Um modificador de matriz é uma espécie, no uma espécie interferente, adicionada as amostras, padres ¢ brancos em quantidades suficientes para provocar uma resposta analitica independente da con- centragdo da espécie interferente. Por exemplo, uma solugdo-tampio pode ser adicionada para manter 0 pH dentro de limites, a despeito do pH da amostra, Algumas vezes um agente mascarante é adicionado, 0 qual reage seletivamente com a espécie interferente para formar um complexo que nao interfere. Em ambos os métodos é preciso tomar cuidado para que os reagentes adicionados no contenham ‘quantidades significativas do analito ou de outras espécies interferentes, Diluigdo e Equiparagao de Matriz Algumas vezes métado da diluigao pode ser itl se a espécie interferente ndo produz um efeito signi- ficativo abaixo de um certo nivel de concentracdo. Com esse método, o efeito da interferéncia é mini- mizado simplesmente pela diluigdo da amostra, A diluigo pode influenciar nossa habilidade de detectar 0 analito ou de medir sua resposta com exatidao ¢ preciso, assim sendo, deve-se tomar cuidado no uso desse método, © método de equiparagio de matriz.tenta duplicar a matriz da amostra pela adigao dos constituintes ‘majoritirios da matriz aos padrdes e ao branco. Por exemplo, na aniilise de amostras de agua do mar para a determinagdo de metais trago, os padres podem ser preparades 6M 4 po. um procedimentos podem uuma égua do mar sintética contendo Na*, K*, Cl, Ca?*, Mg?* © ou Ser minimizaios por mio da {tos componentes. As concentragdes dessas espécies so bem conheci~ saturaeo com especies as na Agua do mar e so praticamente constantes. Em alguns casos, 0 interferentes, pela adigdo de analito pode ser removido da matriz original da amostra e os compo- ™oliicadores de matriz ou < agentes mascarantes, pla diluiglo nentes remanescentes podem ser usados para preparar padrBes ¢ bran~ {i sinosina ou pela cxiparagde & cos. De novo, precisamos ser cuidadosos para que os reagentes adi- matriz da amostra cionados nao contenham 0 analito ou provoquem efeitos de interferéncia adicionais, ‘Método do Padrao Interno No método do padrao interno, uma quantidade conhecida da espé- Um pare interno uma especie ie que atua como referéncia ¢ adicionada a todas as amostras, | Ui" Passe nero § um padrdes e brancos. Entio o sinal de resposta néo € aquele do proprio. | fsicamente siniar 0 anato, que é analito, mas sim da raziio entre o sinal do analito e 0 da espécie de} adiionada a amostras, padrdes¢ referéncia. E preparada, como de maneira usual, uma curva de cali- } brancos. A razao entre as respostas bragto na qual oeixo y €arazto entre as resposts eo eixo x, a con- | Sanaa dopant ¢ centragdo do analito nos padrdes. A Figura 8-12 ilustra 0 uso do. | J toncentragto do anaito ‘método do padrdo intemo para respostas na forma de pico.196 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eons Towson (© método do padrao intemo pode compensar certos tipos de erros se estes influenciam tanto 0 analito como a espécie de referéncia na mesma proporedo. Por exemplo, se a temperatura influencia ambos, o anali- to ea espécie de referéncia, com a mesma intensidade, o uso da razdo pode compensar as variages na tem- pperatura. Para a compensagdo ocorrer, deve-se escolher uma espécie de referéncia que tenha propriedades quimicas e fisicas similares Aquelas do analito. © uso de um padtao interno em espectrometria de chama é ilustrado no Exemplo 8-7. Método das Adicdes de Padrao Usamos 0 método das adigdes de padro quando for dificil ou impossvel fazer uma cépia da matriz. da amostra. Em geral, a amostra ¢ “contaminada” com uma quantidade ou quantidades conhecidas de uma solugdo padrio contendo 0 analito. No método das adigdes de padrio de um iinico ponto, duas porgdes da amostra so tomadas. Uma porgio ¢ medida como de costume, mas uma quantidade conhecida da solugo padrio ¢ adicionada & segunda porgdo. As respostas para as duas porgGes so enti empregadas para calcular a concentragdo desconhecida, assumindo-se uma relagdo linear entre a resposta e a concen- tragao do analito (ver Exemplo 8-8), No método das adigdes maltiplas sdo feitas as adigdes de quanti- Pradrdo meena Avalito Pade interno Padrto interna Resposts 2 : Aalto ° 6 T 2 3 4 5 Tempo Figura 8-12 ttustragio do método do padrdo intemo, Uma quantidade fixa da espécie conta no padrdo intemo éadicionada a amostas, padres e brancos. Os prficos da eurva de calibragdo contém a razao ene osinal do aalit eo do padro interno contra a concentragao do analit,Skoos, Hour, CRouct CAP. 8 dades conhecidas da solugdo padrdo do analito a varias porgdes da amostra ¢ uma curva de calibragdo com as multiplas adigdes é obtida. © método das adigdes multiplas permite verificar se existe uma relagao linear entre a resposta e a concentragao do analito, Posterior mente discutiremos 0 método das adigdes miltiplas no Capitulo 26, em que cle & utilizado em conjunto com a espectroscopia de absorgio molecular (Figura 26-8), © método das adiges de padrdo & bastante poderoso quando uti- lizado adequadamente. Primeiro, precisamos ter uma boa medida do branco para que espécies estranhas no contribuam para a resposta analitica. Segundo, a curva de calibragdo para o analito precisa ser linear nna matriz da amostra. © método das miltiplas adigdes permite uma ve- rificagdo dessa consideragdo. Uma desvantagem significativa do méto- ‘Amostragem, Padronizago e Calibracao 197 No método das adigaes de padrao, uma quantidade conhecida da solucao padrao contendo 0 analita € adicionada a uma porgse da amostra. As respostas antes € depois da acicdo s20 medidas € posteriormente usadas para obter 8 concentragao do anaiito Alternativamente, as multiplas adigbes so feitasa diversas porgoes da amosta. A adkgao de ppadrao considera uma resposta linear. Isso deve ser sempre confiemado ou 0 método das Aadigdes mulkiplas deve ser do das adig adigdes e medidas. O principal beneficio s miltiplas é€ o tempo extra requerido para se fazer as 4 potencial compensagio de tempregado para se vericar a lineardade. efeitos de interferéneias complexas que podem ser desconhecidas para o usuario. EXEMPLO 8-7 AAs intensidades das linhas de emissdo em chama podem ser influenciadas por uma variedade de fatores instrumentais, incluindo a temperatura da chama, a vazio da solugdo ¢ a eficiéncia do nebu- lizador. Podemos compensar as vatiagdes desses fatores pelo uso do método do padrio interno. Aqui, adicionamos a mesma quantidade do padrio interno a misturas contendo quantidades conheci- das do analito e de amostras com concentracdes, ppmde 0.10 050 1,00 5.00 10,00 Aosta Constria uma planilha para determinar a razo entre as intensidades para o sédio e para 0 litio © faga um gréfico da razo versus ppm de sédio, Faga também um grifico da intensidade para o sédio versus ppm de sédio. Determine a concentragdo da amostra e seu desvio padrao. A planilha é apresentada na Figura 8-13. Os dados so inseridos nas colunas de A a C. Nas células de D4 até D9, as razies entre as intensi- dades sio calculadas pela formula mostrada na célula de documentagdo A22. Um grifico da desconhecidas do analito. Entio, tomamos a razdo centre as intensidades da linha do analito © aquela do padrio intemo, © padrio intemo deve estar ausente na amostra a ser analisada. Na determinagéo de sédio por emissdo em chama, olitio ¢ freqiientemente adicionado como um padréo intemo. Os seguintes dados foram obtidos para solugdes contendo Na € 1,000 ppm. de litio. Je de emissto de Li 36 80 128 ot B 95 curva de calibragdo normal esti. representado como 0 gréfico superior na figura. O grifico infe- rior é 0 da curva de calibragao para o padrio inter- no. Observe a melhoria na curva de calibragdo quando se utiliza 0 padrdo interno. As regressdes lineares so calculadas nas células de B11 a B20 usando a mesma estratégia descrita na Segaio 8C-2, Os célculos so realizados pelas formulas exi- bidas nas células de documentago A23 a A31. A concentragao de sédio na solugdo desconhecida é de 3,55 40,05 ppm. (continua)198 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ Eons TwoMson Bata =e | dx ck brs prop esd cho 2 VID pend credo co pain rer ® a gomeen lw fe tala z Tio off izes 4 secsseonaase, ea om 0 a optes eer 3 im ip ay oatns ' 7 soos 31 antes Hy a jm 3s 7a oasis 4 [2 nesta a4 95 Oe516 ‘ Fi Eauasso daregessao 1iincrngs icons 2 Piz] itera osc [lcoestia;® danosia 35058 0 [i analse dot oo apn aa eno eon vom0 [15 gato em ¥ coe tele = ppm dena 71S rive sre any fanra) OSS -" [iiltewinpeddoeme ones xs ‘sos yop [20 Documemaes0 Sone [cain oerBuca Ei 2 [Cals PHENO A 3 om aula o-INTERCEDTONASII-EN 3 [asicouspepsargen See 25 aus BEPAD A D8 ALAA) a 2 | cous Bib=COUNTIUDA AS) 3 Casiser Desa one 25 coum Bi=vEDADION ° 21) CoLin B12nsra onion davis ‘a i a as on aon 31 Cain EMCI SaRTC + VECO BG 2AEBIVIPST) eee 2 ppm done [33] Figura 8-13 Planilha para ilustrar © método do padro intemo para a determinagio de sdio por emissdo em chama EXEMPLO 8-8 ‘0 método das adigdes de padrio de ponto tinico foi empregado na determinacdo de fosfato pelo méto- do do azul de molibdénio, Uma amostra de 2,00 mL. de urina foi tratada com os reagentes de azul de molibdénio para produzir uma espécie que absorve a 820 nm, apés isso a amostra foi diluida para 100,00 mL. Uma aliquota de 25,00 mL. proporcionou uma leitura no instrumento (absorbancia) de 0,428 (solusdo 1). A adigdo de 1,00 mL de uma solugdo contendo 0,0500 mg de fosfato a uma segun- da aliquota de 25,00 mL. forneceu uma absorbncia de 0,517 (solugdo 2). Utilize esses dados para cal- cular a concentragao de fosfato, em miligramas por litro na amostra, considerando uma relagao linear entre a absorbancia e a concentragio de fosfato e a realizago de uma medida para o branco. Modelo molecular para o fon fosfato (PO}-)Skoos, Hower, Crouch CAP, 8 Amostragem, Padronizacao e Calibraao «199 ‘A absorgio da primeira solugio é dada por Aya keg ‘em que cs & a concentragao desconhecida de fosfato na primeira solugdo ¢ k, a constante de propor cionalidade. A absorbancia da segunda solugao & dada por % nna qual Vy 6 0 volume da solugao de fosfato de concentragdo desconhecida (25,00 mL), Vp € 0 volume da solugo padrdo de fosfato adicionada (1,00 mL), 7, € 0 volume total apés a adigdo (26,00 mL) € cp, a concentragdo da solugio padrao (0,500 mg mL). Se resolvermos a primeira equagio para k, substi- tuirmos o resultado na segunda equacao e resolvermos para c4, obtemos = 0,0780 mg mL-! Esta 6a concentragdo da amostra diluida. Para obter a concentragdo na amostra de urina original, pre= cisamos multiplicar por 100,00/2,00. Portanto, cconcentragdo de fosfato = 0,00780 mg mL-" X 100,00 mL2,00 mL. 390 mg mL=! FIGURAS DE MERITO PARA 8D | METODOS ANALITICOS Os procedimentos analiticos so caracterizados por inimeras figuras de mérito, como exatiddo, preciso, sensibilidade, limite de detecgdo e faixa dindmica, No Capitulo 5 discutimos os conceitos gerais de exatiddo e preciso, Aqui, descrevemos aquelas figuras adicionais de mérito comumente utilizadas © dis- cutimos a validagdo e a forma da relatar os resultados analiticos. 8D-1 Sensibilidade e Limite de Deteccao Muitas vezes a palavra sensibilidade ¢ usada na descrigdo de um método analitico. Infelizmente, ¢ oca- sionalmente empregada de maneira indiscriminada e incorreta. A definigo mais freqiientemente uutilizada de sensibilidade & a sensibilidade da calibraco, ou a variago no sinal de resposta pela variago da unidade de concentragio do analito. A sensibilidade da calibragdo é, portanto, a inclin c curva de calibragio for linear, a sensibilidade seré constante e independente da concentragio. calibragao ndo for linear, a sensibilidade variaré com a concentragao e no tem um valor tinico, A sensibilidade da calibragio ndo indica quais as diferengas de concentrago que podem ser de- tectadas. O ruido presente nos sinais de resposta precisa ser considerado a fim de que se possa expressar uantitativamente as diferengas passiveis de serem detectadas. Por essa razdo, algumas vezes o termo sen- sibilidade analitica ¢ utilizado, A sensibilidade analitica ¢ a razao entre a inclinagdo da curva de calibragao € 0 desvio padrao do sinal analitico a uma dada concentragdo do analito. A sensibilidade analitica &, geral- mente, fortemente dependente da concentragao.200 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ EpitoRA Towson O limite de detecgao (LD) € 2 menor concentragdo que pode ser distinguida com um certo nivel de confianga. Toda técnica analitica tem um limite de deteceao. Para os métodos que empregam uma curva de calibragdo, o limite de detecgao é definido como a concentragio analitica que gera uma resposta com um fator de confianga k superior ao desvio padro do branco, sy, de acordo com a Equagdo 8-22. is, = (8-22) em que m & sensibitidade da calibragao, Normalmente, 0 fator k & escolhido como 2.ou 3. Um valor de k de 2 corresponde a um nivel de confianga de 92,1%, enquanto um valor de 3 corresponde a um nivel de confianga de 98%.22 Os limites de detecgdo relatados por pesquisadores ou por fabricantes de instrumentos podem nao ser aplicaveis a amostras reais. Os valores descritos sao geralmente obtidos a partir do uso de padrdes ideais em instrumentos otimizados. Esses limites so tteis, entretanto, na compara¢o de métodos ou instrumentos. 8D-2 Faixa Dindmica Linear Muitas vezes a faixa dinimica linear de um método analitico refere-se a faixa de concentragdo que pode ser determinada com uma curva de calibragao linear, © limite inferior da faixa dindmica é geralmente con- siderado como o limite de detecgao. O limite superior da faixa & normalmente tomado como a concentragao nna qual o sinal analitico ou a inclinagdo da curva de calibragdo desvia-se por uma quantidade especifica da relagdo linear. Em geral, um desvio de 5% da linearidade ¢ considerado como o limite superior. Os desvios da linearidade so comuns em concentragdes elevadas por causa da resposta ndo ideal de detectores ou de- vido a efeitos quimicos. Algumas técnicas analiticas, como a absorgao espectrofotométrica sdo lineares apenas em uma a duas ordens de grandeza, Outros métodos, tais como espectrometria de massas, exibem linearidade em quatro a cinco ordens de grandeza, TD ‘Concenragto Figura 8-14 Curva de calibragdo da respost, R, versus a concentraglo,c. inclinago da curva de calibragso & chamada sensbilidade da caibraglo, m.O limite de doteegdo, LD, representa a menor concentragdo que pode ser medida em um nivel de confianga determinado 3 VerF-D Taper 8. R Crouch, Specrochemical Analysis, Upper Saddle River, NF: Prentice-Hall, 1988p. 174,‘Skoos, West, HOLLER, CROUCH CAP. 8 Amostragem, Padronizacao e Calibragao 201 Uma curva de calibragio linear é preferida devido a sua simplicidade matematica e porque toma mais ficil a detecgdo de uma resposta andmala. Com uma curva de calibragao linear, podem ser empregados um niimero menor de padrées ¢ um procedimento de regressao linear, As curvas de calibragdo ndo-lineares podem ser utilizadas, porgm mais padrées s4o necessarios para se estabelecer a fungao de calibragéo. Uma faixa dindmica linear ampla é desejével porque uma ampla faixa de concentragio pode ser determinada sem a necessidade de diluigdo. Em algumas determinagdes, como, por exemplo, a determinago de sédio em soto sangiiineo, apenas uma pequena feixa dindmica € necesséria devido as variagbes nos niveis de sédio em seres humanos serem bastante pequenas, 8D-3 Garantia de Qualidade de Resultados Analiticos ‘Quando os métodos analiticos sdo apticados a problemas do mundo real, a qualidade dos resultados, assim ‘como a qualidade do desempenho das ferramentas ¢ instrumentos usados, precisa ser constantemente ava- liada. As maiores atividades envolvidas sao 0 controle de qualidade, a validagao dos resultados e a apre- sentaglo de resultados. Aqui descrevemos brevemente cada uma delas, Graficos de Controle Um grifico de controle é um grifico seqlencial de alguma caracteris- | Um grtico de controle consiste tica que € importante na garantia de qualidade. O grifico também | enum ersfcosomendal de alguma caractristica que mostra 0s limites estatisticos da variagdo que so permissiveis para a | SImumacrarienavea ee caracteristica que esté sendo medida, Como um exemplo, considere a monitoragdo do desempenho de uma balanga analitica moderna, Ambas, a exatidao ¢ a precisdo da balanga, podem ser monitoradas pela determinagdo periédica da massa de um padrao, Podemos determinar se as medidas em dias consecutivos esto dentro de certos limites da ‘massa do padrio. Esses limites so chamados limite superior de controle (LSC) limite inferior de con- trole (LIC). E sio definidos como isc =p += VN Lic =- =a VN ‘em que 4 6a média da populacao para as medidas da massa; c, 0 desvio padrdo da populagao para as medi- das; € N, o mimero de réplicas que sao obtidas pata cada amostra, A média da populagdo e 0 desvio padrio para a massa padrdo precisam ser estimados a partir de estudos preliminares. Observe que o LSC e 0 LIC representam trés desvios padrdo para cada lado da média da populagdo e formam uma faixa na qual espera- se que a massa medida esteja contida em 99,7% das vezes. ‘A Figura 8-15 corresponde a um grifico de controle tipico para uma balanga analitica. Os dados de ‘massas foram coletados durante 20 dias consecutivos para uma massa padrio de 20,000 g certificada pelo NIST. A cada dia, cinco réplicas de determinagSes eram realizadas. A partir de experimentos independentes, foram encontrados os valores da média da populagdo ¢ do desvio padrio, 4 = 20,000 g o = 0,00012 g, respectivamente. Para a média de cinco medidas, 3 X (0,00012/V'5) = 0,00016. Assim, o valor do LSC € igual a 20,00016 g e 0 valor do LIC & igual a 19,9984 g, Com esses valores e as médias das massas para cada dia, o grafico de controle exibido na Figura 8-15 péde ser construido, Enquanto o valor de média das amostras permanecer entre o LSC € o LIC, diz-se que a balanga esté sob controle estatistico. No 172 dia, a balanga ficou fora desse controle ¢ foi feita uma investigagdo para descobrir as causas. Nesse exemplo, a balanga nao foi limpa de forma adequada naquele dia, entdo havia poeira em seu prato. Desvios sistemati- cos em relagdo a média sao relativamente faceis de observar em um grafico de controle, aa nai informages, ver J. K Taylor, Quality Assurance of Chemical Measurements. Chesca MI: Lewis Publishers, 1987202 FUNDAMENTOS DE QUIMICA ANALITICA ~ EpitoRA Towson - Isc og = 20,0001 F . 4 we a = sooo * as 3 2 19,9999 y 19,998 1 1 1 1 ° s 10 is 20 25 ‘Amosta (ia) Figura 8-15 Grifio de controle para uma balanga anata moderna. Os resultados parecer flutuar normalmente ao redor da rédia, exceto aguele obtido no 178 da. Apés investigagbes,concluiu-se que o valor questiondvel fo resultado do fat de o prato ‘dabalanga no estar limpo. Estruturado perdxido de benzaila Modelo molecular do perSxid de benzotla Em outro exemplo, um gréfico de controle foi usado para monitorar a produgdo de medicamentos contendo perdxido de benzofla, os quais so usados no tratamento de acne. O peréxido de benzoila é um bactericida que ¢ efetivo quando aplicado a pele como um creme ou gel contendo 10% do ingrediente ativo, Essas substincias sto reguladas pela agéncia governamental denominada Food and Drug Administration — FDA. As concentragdes de perdxido de benzoila precisam, portanto, ser monitotadas e mantidas sob con- trole estatistico, © perdxido de benzoila ¢ um agente oxidante que pode ser combinado com um excesso de iodeto para produzir iodo, que é titulado com uma solugdo padrao de tiossulfato de s6dio para fornecer uma medida da concentracdo de perdxido de benzoila na amostra grifico de controle da Figura 8-16 mostra os resultados para 89 cortidas da produgdo de um creme contendo uma concentragao nominal de 10% em peréxido de benzoila, medidos em dias consecutivos, Cada amostra é representada por um porcentual médio de peréxido de benzoila determinado a partir dos resultados de cinco titulagdes de diferentes amostras analiticas do creme. O grifico mostra que, até 0 $32 dia, o processo de produgdo estava sob controle estaistico, com flutuagSes aleatérias normais na quantidade de persxido de benzoila, No 83° dia, o sistema ficou fora de controle, com ‘um dristico aumento sistemitico no LIC, Esse aumento provocou uma preocupagao consideravel na planta de produgdo até que sua fonte foi descoberta e corrigida. Esses exemplos revelam como griticos de controle so efetivos na apresentagdo de dados de controle de qualidade em uma variedade de situa Validagao A validagao determina a adequacdo de uma anilise no sentido de fomecer a informagao desejada. Pode ser aplicada a amostras, metodologias e dados. Muitas vezes é feita pelo analista, como também por um supervisor. Freqientemente, a validagio de amostras ¢ empregada: para aceitar amostras como membros de uma populagdo que esti sob estudo; para admitir amostras para medidas; para estabelecer a autenticidade de amostras; ¢ para permitir uma nova amostragem, se necessério, No processo de validacao, as amostras podem ser rejeitadas devido a questées relacionadas com sua identidade, com a manipulago das amostras ou 0 ‘conhecimento de que o método de coleta das amostras ndo era aptopriado ou inspirava dividas. Por exem- plo, a contaminagdo de amostras de sangue a ser usada como prova em um exame forense, durante a coleta, seria uma razo para rejeigao das amostras.