CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC CHẤT ĐỘC

I. Nguyên tắc chung trong phân tích chất độc:

- Khi bị ngộ độc, PTCĐ giúp chẩn đoán, phát hiện nhanh nguyên nhân ngộ độc để có bp
cấp cứu chính xác kịp thời.
- Nhằm xác định loại và nồng độ chất độc trong dịch sinh học: máu, nước tiểu...
- Mẫu rất phức tạp (trong máu có pr, HC, TC, ..), hàm lượng chất độc thấp phải (độ nhạy
của phương pháp):
+ Tiến hành lấy mẫu phù hợp => Dựa vào tính chất của chất độc: biểu hiện triệu chứng
LS
+ Có biện pháp phân lập chất độc, làm sạch (loại tạp, tinh khiết lại, có thể bị mất mẫu
trong qtr lm sạch => làm giàu mẫu ).
+ pp ph.tích thích hợp để có kết quả nhanh & chính xác nhất.
- Quá trình phân tích các chât độc thuờng qua các giai đoạn trên.
 Phân tích chất độc
1. Cách lấy mẫu và bảo quản cho quá trình phân tích:
- Việc lấy mẫu phải phù hợp với việc phân bố và thải trừ của chất độc cần phân tích.
- Các mẫu phân tích thường được lấy: nước tiểu,dịch dạ dày hoặc nước rửa dạ dày,máu.
• Mẫu nước tiểu: rất cần thiết cho phân tích chất độc.
- Có thể lấy V đủ lớn và nồng độ thường cao hơn/máu.
- Các chất chuyển hóa /nước tiểu có thể cản trở việc xác định hàm luợng nhưng thêm
thông tin giúp cho việc xác định loại chất độc chính xác hơn.
- Mẫu được lấy càng sớm càng tốt, đặc biệt là trước khi sửdung thuôc để xử trí và điều
trị.
- Thể tích mẫu lấy khoảng 50mL (với người lớn) và không thêm chất bảo quản.
• Dịch dạ dày: có thể lấy từ dịch nôn / dịch hút rửa dạ dày.
- Mẫu chứa nhiều thức ăn, phân bố không đồng đều nên cần phải tiến hành lọc hay ly tâm
trước khi phân tích.
- Nên lấy mẫu sớm để có lượng chất độc lớn và không có chất chuyển hóa, cũng nên lấy
ngay ở phần đầu vì phần sau nồng độ chất độc thường loãng.
- Thể tích mẫu lấy 20mL và không thêm chất bảo quản.
• Mẫu máu, huyết tương cũng thường được dùng để phân tích chất độc.
- Lấy khoảng 10mL (người lớn) & đựng trong ống có heparin.
- Trường hợp nghi ngờ ngộ độc CO tránh để khoảng không khí phía trên ống đựng mẫu và
sử dụng mẫu máu toàn phần (cả huyết tương và huyết cầu) để định lượng.
• Ngoài các mẫu trên còn lấy các loại mẫu khác như: -phủ tạng (gan); các bộ phận khác
của cơ thể: tóc, móng tay, xương...
2. Chiết chất độc từ mẫu
• Chọn dung môi thích họp để chiết chất độc ra khỏi mẫu.
• Tỷ lệ dung môi thường gấp 5 - 25 lần thể tích mẫu. Để tăng khả năng hòa tan của chất
độc vào dung môi cóthể dùng riêng rẽ hay phối hợp các biện pháp sau:
- Xay với dung môi: khi mẫu cần phân tích là các tổ chức, mô hay thức ăn chứa CĐ.
+ Xay mẫu và dung môi trong 5-15 phút, lấy riêng phần dung môi .
- Lắc với dung môi:
+ với máy lắc / lắc bằng tay với bình chiết.
+ có thể làm trong thời gian dài, dễ thực hiện nhiều lần.
- Chiết liên tục bằng dung môi hay chiết siêu tới hạn:
+ Chiết bằng dung môi: Chiết soxhlet, có thể dùng một dung môi hay hỗn hợp dung môi
chiết. Nguyên tắc là dùng một lượng dung môi nhất định qua hệ thống hồi lưu để lấy
hết các chất cần thiết.
+ Chiết siêu tới hạn: Dung môi chiết khi thay đổi điều kiện áp suất nhiệt độ sôi sẽ thay
đổi. Dung môi trong một điều kiện kết hợp cả áp suất và nhiệt độ để đạt trạng thái trên
nhiệt độ tới hạn, ỏ trạng thái này dung môi vừa thể hiện đặc tính của cả dạng lỏng và
khí. Khi đó dung môi sẽ xâm nhập vào mẫu như dưới dạng khí, nhưng có đặc điểm hoà
tan như một chất lỏng. CO2 thường được lựa chọn cho chiết xuất siêu tới hạn.
3. Phân lập các chất độc:
• Chọn lựa pp phân lập dựa vào đặc điểm lý hóa của chất độc:
- Vô cơ hóa: nhóm KL vô cơ
- PP cất kéo hơi nước: chất dễ bay hơi cả vô cơ và hữu cơ
- Chiết bằng dm hữu cơ các chất độc ko bay hơi/H2O
• Làm sạch chất độc hơn nữa => mẫu sạch hơn nhưng mất 1 lg mẫu # làm giàu mẫu => lg
mẫu tăng nồng độ => máy vs độ nhạy thik hợp ms phát hiện đc.
4. Phân tích các chất độc:
- Định tính: Phản ứng định tính để xác định chất độc.
- Định lượng: Hàm lượng chất độc được ĐL bằng pp thích hợp:
+ Với chất độc vô cơ: AAS(QP hấp thụ ntu), ICP (quang phổ phát xạ plasma), cực phổ...
+ Với chất độc hữu cơ: LC (lỏng), GC (chất dễ bay hơi), TLC, CE (điện di => tách rất tốt do
mẫu nhiều tạp), LC/MS...(MS: khối phổ => các định khối lg phân tử 1 chất => cấu trúc 1 chất
=> định tính).
II. Vô cơ hóa và phân lập các kim loại:
- VCH là quá trình oxy hóa đốt cháy chất hữu cơ để giải phóng KL dưới dạng ion
- Trong một số TH, qtr vô cơ hóa đốt cháy ko hoàn toàn chất HC thành H2O và CO2 mà
trở thành HCHC đơn giả, kém bền vững, dễ bị phá hủy hơn
- Các phương pháp VCH phổ biến là:
+ Vô cơ hóa khô (hay phương pháp đốt)
+ Vô cơ hóa ướt (dùng acid với các tác nhân oxy hóa khác => hay dùng vs các KL nặng)
- Mẫu thử:
+ Nếu mẫu thử là máu, nước tiểu thì phải đong trước (để ĐL 1 khoảng), có thể cho thêm
một ít Na2CO3 rồi cô cách thủy đến khô.
+ Nếu mẫu thử rắn (thức ăn, phủ tạng...) thì phải nghiền nhỏ.
+ Mẫu thử có cồn thì phải loại cồn thì phải loại cồn bằng đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (40-
50 O C) để tránh gây nổ khi VCH bằng hỗn hợp HCl và KClO3.
2.1. Phương pháp vô cơ hóa ướt: (2 phương pháp)
❖ Phương pháp vô cơ hoá bằng clo mới sinh (HCl + KClO3):
• Nguyên tắc:
KClO3 + 6 HCl => KCl + 3Cl2 + 3 H2O
Cl2 + H2O => 2 HCl + [O]
- Oxy nguyên tử sinh ra trong phản ứng sẽ phá huỷ chất hữu cơ chuyển nó thành H2O và
CO2. Các kim loại sẽ ở dạng muối clorid. (chất oxh: vừa Cl2, vừa là O ms sinh)
- Nhược điểm:
+ Thời gian đốt tương đối lâu, nhất là thời gian đuổi khí clo.
+ Vô cơ hoá không được hoàn toàn.
+ Gây mất mát một số kim loại: As, Hg (dễ bay hơi), Pb, Cu.
+ Phương pháp này trong thực tế ít được sử dụng.
❖ Phương pháp vô cơ hoá bằng chất oxh mạnh trong H2SO4: (chất oxh cuối cùng là O
nguyên tử)
• Phương pháp vô cơ hoá bằng hỗn hợp H2SO4 và HNO3:
- Nguyên tắc:
H2SO4 => H2SO3 + [O]
H2SO3 =>SO2 + H2O
HNO3 => H2O + 2 NO + 3 [O]
NO => N2 + 2[O]
Vai trò của acid H2SO4 và HNO3 là oxy hoá các chất hữu cơ. Đầu tiên acid H2SO4 có thế
năng oxy hoá thấp nhưng sau mẫu thử bị mất nước nên nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng lên
và làm tăng tác dụng oxy hoá của H2SO4.
 Pp phổ biến nhất để vô cơ hóa đa số kim loại độc.
- Ưu điểm: + Thời gian phá mẫu ngắn
+ Độ nhậy cao với nhiều cation
 + Thể tích dịch VCH nhỏ
- Nhược điểm: có thể mất mẫu dễ bay hơi như Hg...
• VCH bằng hỗn hợp acid sulfuric, nitric và percloric:
Hiện nay phương pháp này được sử dụng rộng rãi cùng với phương pháp sulfonitric. Tác
dụng của acid percloric tác dụng chủ yếu ở giai đoạn cuối của quá trình vô cơ hoá. Khi nhiệt
độ lên cao (203°C) acid percloric làm tăng thế oxy hoá để phá huỷ chất hữu cơ.
- Nguyên tắc: 2HNO3 => 2NO2 + H2O2
H2SO4 => SO2↑+ H2O2
2HClO4 => Cl2O6 + H2O2
 Pp phổ biến nhất để vô cơ hóa đa số kim loại độc.
- Ưu điểm: + Oxy hóa được gần hoàn toàn các chất hữu cơ (99%)
+ Oxy hóa ion kim loại nhiều hóa trị đến hóa trị cao nhất
+ Rút ngắn 2,5-3 lần so với pp sulfonitric
+ Thể tích dịch VCH nhỏ.
- Nhược điểm: + Có thể mất mẫu dễ bay hơi như Hg...
+ Có thể bya hơi ra nhiều chất khí độc: NO2, SO2,...
+ Tốn nhiều hóa chất hơn
• Phương pháp dùng H2SO4 và NH4NO3:
- Nguyên tắc:

- Ưu điểm: Phương pháp này đỡ gây nguy hiểm cho người làm việc.
• Phương pháp dùng H2SO4 và H2O2:
- Nguyên tắc:
H2O2 => H2O + O
H2SO4 => SO2↑+ H2O2
- Ưu điểm: Phương pháp này cũng có ưu điểm như các phương pháp trên và ưu điểm hơn
là ít toả khí độc.
- Nhược điểm: Giá thành cao
2.2. Phương pháp vô cơ hóa khô:
Để vô cơ hoá theo phương pháp này ngưòi ta đun mẫu thử với một số muối có tính oxy hoá
ở dạng bột như KNO3, NH4NO3 hay có thể tiến hành đốt đơn giản.
• Đốt với hỗn hợp Na2CO3 và NaNO3
- Ít được sử dụng, lượng mẫu thử nhỏ ( 5-10g ). Mất 1 số KL khi đốt ở nhiệt độ cao.
- Có thể tìm một số CĐ trong một khối lượng nhỏ mẫu thử như tìm As trong nước tiểu,
tóc, móng tay...
- Phương pháp này thường được dùng để bổ sung cho Pp “ clor mới sinh”
• Phương pháp đốt đơn giản: phương pháp này dùng xác định sự có mặt của các muối của
Bi, Zn, Cu, Mn, .... nhưng ngày nay ít dùng.
2.3. Phương pháp loại chất oxy hóa khỏi dịch vô cơ :
- Sau khi VCH, chất lỏng thu được đều chứa một lượng chất oxy hóa thừa như nitrogen
oxyd hay vết acid nitric. Cần loại chất oxy hóa khỏi dung dịch vô cơ hóa
- Các cách có thể loại chất oxy hóa thừa:
+ Dùng formaldehyd
+ Dùng ure
+ Dùng natri sulfit

III. Phân lập các chất độc hữu cơ bằng cất kéo hơi nước: chất độc dễ bay
hơi và bền với nhiệt
3.1. Cơ sở của phương pháp cất kéo hơi nước:
- Đun hỗn hợp 2 chất A và B không hoà tan vào nhau thì áp suất hơi riêng phần của chúng
tăng lên và không phụ thuộc vào nhau.
- Khi tổng áp suất hơi riêng phần (P = PA + PB) bằng áp suất khí quyển trên bề mặt thì hỗn
hợp đó sôi.
 Như vậy mỗi chất/hỗn hợp sẽ sôi ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của nó.
- Cấu tạo:
+ Bình sinh hơi làm bằng đồng hoặc thép không gỉ (1).
+ Bình đựng mẫu thử (2) đặt trong nồi cách thủy (3).
+ Ống sinh hàn (4) ngưng tụ pha hơi đưa vào bình chứa mẫu (5)
Đặt bình (2) vào nồi cách thủy (3) nối vs ống sinh hơi (1)
Cất nhỏ lửa rồi bốc hơi từ từ, sản phẩm hứng vào bình (5). Phân tích các chất độc từ bình
cất đc
- Đặc điểm của mẫu thử:
+ Mẫu thử được xay nhỏ cho vào bình, thêm nước cất để có hỗn hợp sệt. Acid hoá mẫu
bằng acid tartric hay acid oxalic 10%. Tránh acid hoá mẫu bằng acid vô cơ vì chúng có thể
phá huỷ một số chất độc, ví dụ như acid cyanhydric bị phá huỷ trong môí trường H2SO4.
3.2. Cách lấy mẫu để phân tích các chất độc từ dịch cất được:
• Theo Svaicova :
- Dịch cất được hứng vào 4 bình.
- Bình 1 (có 2 mL dd NaOH 5%), cất lấy 15mL.
- Cất tiếp vào 3 bình khác mỗi bình lấy 25-50mL.
- Nếu dương tính chất nào thì cất cho đến khi không còn phản ứng chất đó trong dịch cất.
- Bình 1 để xác định cyanid và dẫn xuất halogen mạch thẳng, methanol, ethanol...
- Các dịch cất ở các bình sau dùng để kiểm tra lại khi cần.
• Theo Kohn-Abrest:
- Tiến hành với 300g mẫu thử để lấy 300mL dịch cất.
- Nhận xét màu, mùi dịch cất.
- Lấy khoảng 50mL (1/6) dịch cất để tìm dẫn xuất halogen mạch thẳng, cloral hydrat,
crezol...
- Phần còn lại cất lần thứ 2 lấy 100mL. Sau đó cất thêm lần thứ 3 lấy 35mL.
- Lấy nửa dịch cất lần cuối để xác định cyanid, phenol, cloroform....nửa còn lại xác định
rượu.
IV. Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ:
4.1. Nguyên tắc chung:
- Chiết là một quá trình đặc biệt phân bố một chất giữa hai pha lỏng không trộn lẫn vào
nhau, thường là giữa các dung môi hữu cơ và nước.
- Lắc để tăng tốc độ phân bố chất tan giữa 2 chất lỏng.
- Quá trình lắc ở mức độ thích hợp.
- Đạt tới trạng thái cân bằng, ngừng lắc và tách riêng dm chiết.
- Hiệu suất chiết CĐ từ một mẫu thử phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
- Vd: chiết lỏng lỏng,..
4.2. Quá trình chiết:
Quá trình chiết thường bao gồm các giai đoạn sau:
a. Xử lý sơ bộ mẫu thử:
- Có nhiều mẫu thử không phải qua giai đoạn này.
- Giai đoạn này tạo điều kiện cho chất độc dễ dàng chuyển sang dung môi hữu cơ như :
Cắt liên kết protein (Chiết morphin trong nước tiểu cần thủy phân trong dd HCl..)
- Nhằm làm giàu chất phân tích như: cồn-acid, nước- acid...
b. Chọn điều kiện cho quá trình chiết xuất:
- Quá trình chiết để xác định CĐ thường được tiến hành ở cả môi trường acid và môi
trường kiềm.
- Việc chiết xuất ở môi trường acid có thể sẽ có nhiều tạp chất.
- Tuy nhiên nếu chất phân tích không chiết ở môi trường này thì vẫn nên loại bỏ bớt tạp
chất bằng chiết qua pH acid trước khi chiết ở môi trường kiềm.
c. Loại tạp trong dịch chiết:
- Dịch chiết ether/cloroform thường có nhiều tạp chất nên việc loại bớt tạp chất có trong
dịch chiết là cần thiết. Có nhiều cách để thực hiện quá trình này như:
+ Cho qua cột than hoạt tính hoặc cột ionit.
+ Thăng hoa để lấy chất độc (barbiturat)
+ Chiết lặp lại nhiều lần ở 2 môi trường acid (để lấy base yếu) hoặc dd nước kiềm (để lấy
acid yếu).
- Phương pháp chiết lại
+ Các CĐ có tính acid tan/dm khi chiết ở môi trường acid thì chuyển thành muối tan/nước
bằng cách lắc dịch chiết với dd NaOH. Lấy lớp nước, acid hóa và chiết lại bằng ether vài lần.
+ Dịch chiết ở môi trường kiềm thì lắc vài lần với dd acid nước. Lấy phần nước gộp lại và
kiềm hóa rồi chiết bằng dm vài lần. Có thể làm nhiều lần như vậy để loại tạp trong dịch
chiết.
- Phương pháp trao đổi ion
+ Trước khi định lượng alcaloid có thể tinh khiết hóa bằng cách cho dung dịch nước của
muối alcaloid qua cột cationid, alcaloid được giữ lại ở cột.
+ Rửa cột bằng nước cất đến phản ứng trung tính.
+ Đẩy alcaloid khỏi cột bằng 50mL dd acid với tốc độ 2mL/phút.
+ Thường dùng cellulose đã oxy hóa làm chất trao đổi có ưu điểm là liên kết của nó với
alcaloid rất yếu nên có thể dùng acid đẩy ra nhanh và hoàn toàn.
4.3. Một số phương pháp chiết chất độc:
- Chiết bằng dung môi: Là kỹ thuật sử dụng dung môi hữu cơ để chiết chất phân tích từ
mẫu đã làm nhỏ.
- Chiết siêu tới hạn – SFE
- Chiết pha rắn – SPE