Norme de protectia muncii in

laboratorul de chimie
Unele reguli nu sunt făcute pentru a fi
încălcate - mai ales în laboratorul de
chimie. Următoarele reguli există
pentru siguranța dumneavoastră și
trebuie respectate întotdeauna.

Laboratoarele sunt locurile în care studenţii sunt expuşi riscurilor

cauzate de existenţa reactivilor chimici, ustensilelor de laborator şi
aparatelor electrice, de aceea studierea normelor de securitate este
obligatorie având scopul de a evita accidentele, sau, eventual, de a
diminua gravitatea lor.
Scopul protecţiei muncii îl
constituie luarea la cunoștință
a potențialelor pericole posibil
de a fi întâlnite în laboratorul
de chimie precum și
prevenirea accidentelor prin
măsuri menite să elimine, să
evite sau să diminueze
acţiunea factorilor de risc
asupra organismului uman.
Principalele pericole
• Pericolele într-un laborator provin
în principal de la substanțe pe
care trebuie să le manipulăm.
Acestea pot fi corozive, toxice,
inflamabile, explozive, având
uneori mai multe din aceste
proprietăți deodată.
• În afara pericolului dat de
substanțe, se adaugă pericolele
legate de folosirea
echipamentelor, cum ar fi
aparatele electrice, sticlăria,
becurile de gaz, plitele.
Studentii care efectueaza lucrari practice în
laboratorul de chimie trebuie sa tina cont
de urmatoarele reguli:
• Studenţii au acces în laborator numai în prezenţa cadrului didactic şi numai
dacă cunosc normele de protecţia muncii referitoare la lucrările practice;
• Una din primele reguli de securitate este buna pregătire a lucrării de
laborator ce urmează a fi efectuată, înainte de începerea ei. O bună
planificare a lucrării și buna cunoaștere a proprietăților substanțelor și a
pericolelor legate de experiment permit realizarea unei manipulări
serioase, în securitate și chiar cu câștig de timp.
• Lucrările vor fi demarate numai după ce studentul este bine documentat
asupra modului de lucru şi după ce a discutat în detaliu planul lucrării cu
cadrul didactic.
• Se interzice efectuarea altor lucrări în afara celor stabilite, iar în laborator
orice problemă neclară studentului este adresată cadrului didactic;
• Este strict interzisă folosirea reactivilior din ambalaje fără etichetă
• Se interzice gustarea și chiar contactul cu pielea a substanțelor chimice
• Mirosirea substantelor se va face cu grija, prin tinerea vasului la distanta și
apropierea vaporilor care se degajă prin mișcarea mâinii deasupra acestuia
• Manipularea reactivilor solizi se face cu linguri sau spatule curate
• Soluțiile de reactivi pentru analiză nu se vor scoate cu pipeta direct din flacon,
ci , mai întâi, se toarnă cantitatea necesară într-un pahar curat, din care apoi
se face pipetarea. Se va avea în vedere ca la transvazarea lichidelor să se țină
sticla cu eticheta spre palmă pentru a evita deteriorarea acesteia
• Substanțele foarte volatile se manipulează în nișă
• Nu este permisă impurificarea reactivilor în timpul manipulării. Nu este
permisă folosirea aceleași ustensile (spatule) pentru mai mulți reactivi decât
după spălare și uscare
• Reactivii solizi nu vor fi cântăriți direct pe talerele balanței, ci pe sticle de ceas
sau în tăvițe de cântărire.
• Acizii concentrați (HCl, H2SO4, HNO3 etc.) se toarnă cu mare atenție,
ștergând-se picăturile cu cârpă sau hârtie
• Diluarea acizilor concentrați în apă se face întotdeauna prin
introducerea acidului în apa în picături si cu agitare continuă
• Este interzis fumatul în laborator precum și în vecinătatea sa imediată
• Este interzis consumul de alimente și băuturi în laborator
• Este obligatorie utilizarea halatelor de bumbac cu mânecă lunga, de
preferință strânse la mânecă
• La utilizarea pipetelor nu se va face aspirarea lichidului în pipetă cu
gura. Se va utiliza o pară de cauciuc sau un alt sistem asemănător
• Părul lung trebuie prins la spate pentru a evita contactul cu
substanțele sau sursele de foc
• Nu se atinge direct cu mana sticlaria care a fost in contact direct cu
focul sau cu o sursă de încălzire, ci se lasa sa se raceasca
• Deschiderea unui recipient din care se pot degaja substanțe nu trebuie
niciodata îndreptată în direcția unei alte persoane, a unei surse de foc sau
căldură sau a unui alt obiect susceptibil de a fi stropit și deteriorat.
• Deșeurile substanțelor periculoase (solvenți, etc) trebuie aruncate în
recipienții prevăzuți pentru aceasta și nu în chiuvetă. Nu se aruncă la chiuvetă
decât substanțe netoxice și solubile în apa, fiind diluate apoi cu o cantitate
mare de apă.
• Întotdeauna trebuie urmărite indicațiile experimentului, renunțând la
amestecurile improvizate sau la creșterea cantităților de reactivi prescrise (de
referatul de laborator sau de cadrul didactic).
• În laborator se va păstra ordine şi curăţenie perfecte; se interzice
îngrămădirea obiectelor necesare pentru desfăşurarea lucrării practice pe
masa de lucru, acestea punându-se la loc imediat după utilizare.
• La încheierea şedinţei de laborator, studenţii sunt obligaţi să facă ordine pe
masa de lucru, să predea ustensilele utilizate şi să se spele pe mâini
Masuri ce trebuie luate
în caz de accident

• Orice accident care survine în

laborator trebuie imediat adus la
cunoştinţă cadrului didactic sau
responsabilului de laborator care
va aprecia gravitatea lui şi va
stabili măsurile de prim ajutor, o
intervenţie imediată putând
preveni o agravare a situaţiei.
• În cazul arsurilor chimice, anularea
efectului trebuie să țină cont de
natura chimică a agresorului
 IDENTIFICAREA EFICIENTEI DE STERILIZARE A
INCINTELOR SI SUPRAFETELOR UTILIZAND DIFERITE
TEHNICI DE STERILIZARE

Metode de sterilizare şi dezinfecţie

Sterilizarea reprezintă procedeul de distrugere completă a tuturor microorganismelor, fie în stare

vegetativă, fie în stare sporulentă.
Metodele de sterilizare sunt multiple şi anume:
Metode fizice:
-metode termice, umede şi uscate;
-filtrarea;
-centrifugarea;
-radiaţiile ultraviolete;
-ultrasunete;
Metode chimice:
- cu agenţi chimici.

1.5.1.Metode fizice de sterilizare

Sterilizarea termică constă în degradarea materialului biologic până la carbonizare. Sub acţiunea
căldurii sunt distruse formele vegetative la temperaturi de 50-60ºC timp de 30 minute sau la 70-75ºC
timp de 10 minute.

1.5.1.1. Sterilizarea termică uscată

Incinerarea constă în arderea produselor ce nu pot fi reutilizate (vată, tifoane, materiale de plastic
şi altele care sunt infestate şi care reprezintă un pericol), până la carbonizare la peste 450ºC, în
cuptoare (crematorii).
Incălzirea la incandescenţă este utilizată pentru sterilizarea ansei înainte şi după utilizare şi
constă în încălzirea cu becul de gaz sau cu o lampă cu alcool a firului de platină până la incandescenţă.
Flambarea constă în trecerea rapidă prin flacară a unui obiect din sticlă (pipeta, gâtul flacoanelor
sau eprubetelor, lame, spatule, flacoanelor) în scopul distrugerii microorganismelor.
Sterilizarea în etuvă la cald se aplică pentru sterilizarea sticlăriei de laborator (eprubete, pahare,
cutii Petrii, pipete, baloane de sticlă, dopuri de vată) care a fost ulterior spălată şi uscată.
Se recomandă ca sticlăria să se împacheteze în hârtie pentru a se evita contaminarea ulterioară.
Sterilizarea se realizează prin menţinerea sticlăriei la 180 ºC timp de 2 ore. După două ore se întrerupe
încălzirea şi se lasă ca aceasta să se răcească lent evitându-se astfel spargerea ei. După sterilizarea
sticlăria se depozitează în spaţii special amenajate, curate.

1
 1.5.1.2.Sterilizarea umedă la cald

Acest tip de sterilizare are o eficienţă mai ridicată distrugând microorganismele la o temperatură
mai scăzută în comparaţie cu sterilizarea termică uscată, printr-o putere de penetrare mai mare, prin
denaturarea proteinelor.
Fierberea se utilizează pentru sterilizarea seringilor, a manşoanelor şi tuburilor din cauciuc şi a
instrumentelor metalice. Se realizează în apă distilată prin fierbere timp de 30 minute. Prin fierbere se
distrug formele vegetative ale bacteriilor, virusurilor şi unii spori(tetanos). Pentru a se ridica punctul
de fierbere al apei şi pentru a se evita depunerea de săruri pe suprafaţa materialelor şi ruginirea
acestora se adaugă soluţie de borax cu concentraţia 4-5%.

Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune

Acest tip de sterilizare se realizează în autoclav, în atmosferă de vapori de apă sub presiune şi la
temperatură. Această sterilizare realizează distrugerea completă a tuturor microorganismelor şi a
sporilor. Cu ajutorul autoclavei se sterilizează mediile solide şi lichide în care au fost crescute
microorganismele, apa distilată, mediile de cultură.
De reţinut este faptul că nu se introduc simultan în autoclavă medii şi materiale care urmează a fi
utilizate pentru viitoarele însămânţări cu medii şi materiale care au fost utilizate în analizele
microbiologice anterioare. În funcţie de presiunea de lucru sterilizarea se realizează la temperaturi
diferite astfel:
-0,5 atm, se atinge temperatura de 115ºC, timpul de sterilizare 30 minute;
-1,0 atm, se atinge temperatura de 121ºC, timpul de sterilizare 20 minute;
-2,0 atm, se atinge temperatura de 134ºC, timpul de sterilizare 15 minute.
În tabelul 1 sunt prezentate unele durate, temperaturi şi presiuni de sterilizare pentru diferite medii
de cultură, alte obiecte şi soluţii utilizate în microbiologie.
Tabelul 1. Temperatura, presiunea şi timpul necesar pentru sterilizarea unor medii.
Material sterilizat Temperatura (ºC) Presiunea (atm) Timpul (minute)
Sticlărie curată 121 1 20
Apă, ser fiziologic 121 1 20
Parafină 121 1 20
Săruri minerale 121 1 20
Medii nutritive 121 1 15-20
curente (geloză,
bulion)
Lapte degresat 115 0,7 15
Medii termolabile 110 0,5 20
Glucoza în soluţie 110 0,5 20

Eficienţa sterilizării este evidenţiată utilizând indicatori de sterilizare, benzi de hârtie imprimate
special, a căror coloraţie virează în condiţii sterile. Deasemenea controlul sterilizării se poate face prin
utilizarea unui martor care conţine doar mediu care se incubează în aceleaşi condiţii cu proba. Dacă pe
martor nu apar modificări de culoare şi consistenţă atunci sterilizarea s-a realizat corect.
2
 Sterilizarea cu vapori la 100 ºC se realizează cu ajutorul autoclavei dar la presiune de 1 atm,
această metodă se aplică pentru sterilizarea produselor ce nu suportă temperaturi mai mari de 100 ºC.
Pasteurizarea este o metodă de sterilizare blândă care nu alterează vitaminele, enzimele şi
proteinele. Acest procedeu se realizează la temperatură ridicate, 65 ºC, timp de 30 minute, la 80-90 ºC
timp de 1-2 minute sau la 91-95 ºC timp de câteva secunde şi care constă în distrugerea formelor
vegetative ale germenilor patogeni. Produsele se păstrează închise ermetic la 4 ºC până în momentul
folosirii pentru a se evita germinarea sporilor.
Tidalizarea reprezintă o pasteurizare repetată de 3 ori la intervale de 24 h, este o metodă de
sterilizare completă. Se utilizează pentru sterilizarea produselor sau mediilor de cultură care conţin
glucide, gelatină, lapte şi altele care se degradează la temperaturi mai mari. În intervalul dintre două
pasteurizări succesive, produsele se păstrează la temperatura camerei, când sporii rămaşi se dezvoltă
la forme vegetative care sunt apoi distruse la viitoarea sterilizare.

1.5.1.3 Sterilizarea prin filtrare

Sterilizarea prin filtrarea reprezintă o metodă care se aplică la sterilizarea produselor care nu pot fi
sterilizate pe altă cale şi anume soluţii de vitamine, ser sanguin, oligoelemente şi altele. Această
metodă constă în trecerea unei soluţii printr-un material poros şi reţinerea microorganismelor în
spaţiile acestuia prin fenomene de capilaritate, fenomene superficiale şi adsorbţie. Procesul de filtrare
depinde de proprietăţile soluţiilor care se filtrează (pH, vâscozitate, temperatură, tăria ionică) dar şi de
proprietăţile materialului poros (dimensiune pori, sarcina electrică). Pentru realizarea filtrării trebuie
să existe o diferenţă de presiune între feţele filtrului,aceasta se obţine prin ataşarea sistemului la o
trompă de vid.
Filtrele cele mai utilizate sunt:
Filtrele Seitz (Figura 1) sunt filtre din plăci de azbest care se fixează într-o armătură metalică care
este prevăzută cu o pâlnie şi care se montează prin intermediul unui dop de cauciuc la un balon
Kitasato. Vasul Kitasato este pus în legătură cu o pompă de vid. Filtrul trebuie să fie steril şi se
umezeşte cu apă distilată sterilă înainte de utilizare. Lichidul filtrat trece în balonul de sticlă iar
virusurile sau bacteriile rămân pe filtru.
FiltreleSeitz pot fi :
-filtre pentru bacterii de tip EK1, care reţin bacteriile şi lasă să treacă virusurile;
-filtre pentru virusuri de tip EK2, care reţin virusurile de dimensiuni mari.
Filtrele de sticlă(Schott) sunt filtre constituite dintr-o placă de sticlă poroasă, fixată într-o pâlnie
de sticlă termorezistentă,care funcţionează după acelaşi principiu cu filtrele Seitz. Pentru utilizare
filtrele trebuie sterilizate şi spălate cu mari cantităţi de apă distilată, sterilă. În funcţie de dimensiunea
porilor filtrele pot fi:
-filtre cu pori mari, de tip G (Gross-mare), notate (G1-G5), care reţin microorganisme de tip
bacterii şi drojdii;
-filtre cu pori medii, de tip M (Mittel-mijlociu), care reţin microorganisme de tip bacterii cu
dimensiuni medii şi viruşi cu dimensiuni mai mari;
-filtre cu pori fini, de tip F (Fein-fin), care reţin virusuri.
Avantajele folosirii filtrelor din sticlă:
-permit trecere unor volume mari de lichide;
-nu modifică compoziţia filtratului;
-se curăţă şi se sterilizează uşor;

3
 -sunt rezistente la factori fizici şi chimici;
-se regenerează periodic, menţinându-se în H 2 SO 4 concentrat timp de 24 ore după care se trece
succesiv 1 litru de KMnO4 1‰, 1 litru de acid oxalic 1% şi 3 litri de apă distilată.
Membranele filtrante polimerice (Figura 2) sunt filtre de unică folosinţă constituite din mase
plastice, esteri celulozici şi altele. În funcţie de domeniul de utilizare membranele sunt:
-pentru viruşi, cu diametrul porilor φ=0,025μm;
-pentru bacterii, cu diametrul porilor φ=0,22μm;
-pentru drojdii , cu diametrul porilor φ=0,45μm.
Avantajele utilizării acestui sistem de filtrare sunt similare cu cele ale utilizării filtrelor de sticlă,
cu menţiunea că membranele filtrante nu se regenerează, sunt de unică folosinţă;

1.5.1.4. Sterilizarea cu radiaţii

Sterilizarea cu radiaţii presupune utilizarea radiaţiilor de tip UV, gama şi ultrasunete.

Sterilizarea cu raze UV
Aceasta este o metodă completă de sterilizare care distruge atât formele vegetative cât şi pe cele în
formă de spori. Radiaţiile UV cu lungimea de undă cuprinsă între 2537-2800 Å sunt absorbite de
ADN-ul celulelor şi determină sinteza unor proteine cu efect mutagen sau blochează replicarea cu
efect letal. Există şi bacterii rezistente la UV.
Radiaţiile cu lungimea de undă cuprinsă între 136-4000 Å şi energie joasă sunt utilizate pentru
sterilizarea mediilor transparente precum aerul şi a suprafeţelor plane.

Sterilizarea cu radiaţii γ (gama)

Aceasta este o metodă completă de sterilizare care distruge atât formele vegetative cât şi pe cele în
formă de spori. Radiaţiile gama cu lungimea de undă cuprinsă între 0,005 şi 1,4 Å cu energie şi viteză
mare produc ionizări ale substratelor iradiate care determină moartea acestora. Această metodă este
utilizată pentru sterilizarea obiectelor din maerial plastic cu unică utilizare (tuburi de cateter, pense,
seringi, pipete, anse, tuburi etc.).
4
 Sterilizare cu ultrasunete (US)
Undele cu frecvenţa υ ≥20KHz, obţinute în urma trecerii unui curent electric alternativ de înaltă
frecvenţă printr-un cristal de cuarţ determină dezintegrarea pereţilor celulari bacterieni şi dispersia
conţinutului celular în mediu (cavitaţie). Acest procedeu se foloseşte pentru sterilizarea sucurilor din
fructe, mustului, laptelui, vaccinurilor, produselor farmaceutice etc.

1.5.2.Metode chimice de sterilizare

Agenţii chimici de sterilizare au proprietatea de a inhiba creşterea microorganismelor
(microbiostatic) - antisepticele, sau de a distruge microorganismele (microbiocid) – dezinfectantele,
cu care vin în contact. Efectele agenţilor chimici asupra microorganismelor depind de natura,
concentraţia şi timpul de acţiune.

1.5.2.1. Antisepticele distrug doar formele vegetative nu şi sporii. Substanţele chimice au

concentraţii mici, se pot aplica direct pe ţesuturile vii şi nu trebuie să fie toxice, caustice şi iritante.
Dintre antisepticele cele mai des utilizate amintim:
-acid boric, soluţie, concentraţie 3-4%, antiseptic al mucoaselor;
-alcool etilic, soluţie, concentraţie 70%, antiseptic al tegumentelor;
-azotat de argint, soluţie, concentraţie 1%, antiseptic al mucoasei conjunctive;
-hipoclorit de sodiu, soluţie, concentraţie 0,5%clor activ, antiseptic al plăgilor;
-iodul, soluţie alcoolică, concentraţie 1-5%, antiseptic al tegumentelor;
-apa oxigenată, soluţie, concentraţie 3%, antiseptic al plăgilor;
-permanganatul de potasiu, soluţie, concentraţie 0,1‰, antiseptic al mucoaselor;
-hexaclorofen, soluţie, concentraţie 1%, antiseptic al tegumentelor şi mucoaselor;
-detergenţi cationici (săruri de amoniu) soluţie, concentraţie 1% în săpun, antiseptic al
tegumentelor şi plăgilor;
-detergenţi anionici şi săpunuri de Na+ şi K+, agenţi de spălare manuală.

1.5.2.2. Dezinfectantele sunt substanţe care au toxicitate ridicată, care distrug atât
microorganismele cât şi tesuturile vii şi care pot fi aplicate numai pe suprafeţe nevii pentru distrugerea
agenţilor patogeni.
Un dezinfectant trebuie să îndeplinească anumite condiţii şi anume:
-să acţioneze asupra unui număr mare de agenţi patogeni;
-să producă inactivitate ireversibilă a germenilor în condiţiile mediului;
-să fie puţin toxic pentru om şi animale;
-să fie stabil şi să-şi păstreze calităţile cât mai mult timp;
-să fie ieftin şi uşor de manevrat.

Substanţe dezinfectante:
-mertiolatul de sodiu soluţie 1/2000, utilizat pentru dezinfecţia mânilor, a instrumentelor
contaminante şi a obiectelor din piele şi de cauciuc;
-formol -aldehida formică, soluţie 40% în apă utilizat pentru conservarea prepartelor biologice,
soluţie 5% în apă dezinfectant al instrumentelor şi suprafeţelor de lucru;
-alcool etilic-soluţie 96%;

5
 -amestec sulfocromic100g bicromat de potasiu/2L apă distilată şi 1L H 2 SO 4 tehnic;
-fenolul, soluţie, concentraţie 3-5%, dezinfectant al suprafetelor;
-crezolii, soluţie, concentraţie 5% în apă fierbinte;
-varul cloros, 1 kg var cloros/10L apă, dezinfectant al suprafeţelor;
-cloraminele, 25% clor activ, dezinfectant al grupurilor sanitare;
-permanganat de potasiu, soluţie 1‰, 1-5000. 1/10000;
-acid sulfuric, soluţie, concentraţie 5%, dezinfectant al podelelor;
-acid clorhidric, se utilizează pentru sterilizarea unor piei de animale moarte, a grupurilor sanitare;
-acidul azotic, soluţie 2% la 40ºC distruge germenii sporulaţi;
-hidroxidul de sodiu, soluţie, concentraţie 1-3%, dezinfectant mobilier;
-clorul gazos, concentraţie 2-3mg/L, dezinfectant al apei potabile;
-clorura mercurică, soluţie, concentraţie 1%, dezinfectant al preparatelor proaspete şi al
suprafeţelor de lucru;
-hipoclorit de sodiu, soluţie, concentraţie 25% clor.

1.5.2.3. Sterilizarea cu ajutorul gazelor

Pentru sterilizarea cu ajutorul gazelorseutilizează agenţi alchilaţi de tip formol şi oxid de etilenă.
Acest procedeu de sterilizare este utilizat pentru sterilizarea materialelor din plastic de unică folosinţă
sau a încăperilor contaminate. Sterilizarea camerelor se face prin vaporizare formolului diluat în 2-4
părţi cu apă, cu ajutorul autoclavei.Încăperile trebuie să fie perfect închise ermetic, procedura durează
6-8 ore, după care încăperile trebuie să fie bine aerisite.

TEHNICI DE CONTROL AL GRADULUI DE IGIENĂ DINTR-UN LABORATOR DE

MICROBIOLOGIE

În vederea identificării gradului de igienă dintr-un laborator de microbiologie se fac numeroase

teste periodice. Cele mai importante sunt: controlul microbiologic al suprafeţelor de lucru (test de
sanitaţie) şi determinarea microflorei din spaţiile de lucru.

1.4.1. Controlul microbiologic al suprafeţelor de lucru (test de sanitaţie)

Prelevarea probelor se face de pe pereţii interiori ai incintei bacteriologice şi suprafaţa de lucru,
înainte de începerea lucrului. Testul de sanitaţie se efectueaza în fiecare zi.

Materiale necesare (pentru o probă):

-şablon cu latura de 5 cm, sterilizat;
-tampoane de vată hidrofobă sub forma cilindrică cu dimensiuni de 2-2,5cm x 0,5-1cm, aşezate în
cutii Petri şi sterilizate prin autoclavare;
-câte o eprubetă cu: ser (apă) peptonat steril 1‰, sterilă,
-două plăci Petri sterile;
-pipete gradate sterile(1, 2 şi 10ml);
-pense sterile.

6
 Modalitate de prelevare probă:
Înainte de folosire se umezeşte tamponul de vată într-un ml de ser fiziologic steril 1% într-o
eprubetă.
Se şterge o suprafaţă de 25 cm2 (interiorul şablonului), trecând tamponul în trei direcţii diferite (a
doua perpendiculară pe prima şi a treia oblic pe amândouă, în diagonală), concomitent cu rotirea
tamponului.
Se introduce tamponul în eprubeta iniţială, peste care se adaugă 9 ml ser peptonat. După un repaus
de 10-15 minute se face o agitare puternică pentru omogenizarea concentraţiei bacteriene, obţinându-
se suspensia brută de lucru. Agitarea se realizează prin lovirea energică a eprubetei de palmă de 30-40
de ori.

Însămânţarea şi incubarea probelor

Determinarea numărului de germeni/cm2
Din suspensia brută de lucru se mai execută o diluţie în apa peptonată sterilă şi rezultă o diluţie de
10 . Ambele probe se vor incorpora în geloza nutritivă topită şi răcită la 45-500C.
-1

Se incubează 48 ore la 370C.

Examinarea probelor şi interpretarea rezultatelor

Se fac după 48, respectiv 72 de ore de la însămânţare.

1.4.2. Determinarea microaeroflorei din spaţiile de lucru

Determinarea microflorei din spaţiile de lucru se efectuează săptămânal şi reprezintă un indicator

al potenţialului infecţiilor aerogene din spaţiile de lucru.
Materiale necesare:
-două plăci Petri sterile, dintre care una reprezintă proba martor;
-mediu geloză nutritivă sterilă, topită şi răcită la 45°C.

Mod de lucru:
În cele două plăci Petri, se toarnă geloză nutritivă sterilă, topită şi răcită la 45°C.
Determinarea se face în perioada de maximă activitate (în timpul testului de prezumţie).
În fiecare încăpere din laboratorul de microbiologie, se utilizează câte două plăci Petri cu mediu
geloză nutritivă sterilă, una din plăci, reprezentând proba martor. Se notează plăcile din fiecare
încăpere. Placa Petri care este lăsată ca martor se acoperă imediat cu capacul. Cealaltă placă Petri se
lasă descoperită pentru a expune geloza nutritivă germenilor din aer. Perioada de expunere este de 15
minute.

Incubarea:
Incubarea celor două plăci se face la termostat, la 37°C, timp de 24h, după care se mai ţin 24h la
temperatura camerei.
Determinarea numărului de germeni din aer se stabileşte prin numărarea coloniilor crescute pe
suprafaţa gelozei nutritive.

7
 Interpretare:
-nu se admite prezenţa coloniilor.
Dacă după 48h, se constată dezvoltarea coloniilor pe geloză nutritivă, se face dezinfecţia totală, în
laborator şi se repetă testul.

Prelucrarea rezultatelor:

Calculul numărului de colonii (germeni)

Determinarea numărului de germeni/cm2

Se ţine cont că 1 ml din suspensia brută însămânţată conţine a 10-a parte din germenii recoltaţi de
pe o suprafaţă de 25cm2, iar 1 ml diluţie decimală 10-1 conţine a 100-a parte. Se raportează media
coloniilor dezvoltate pe ambele plăci la 1cm2 suprafaţă:

(Nr. germeni suspensie brută x10)+(Nr. germeni dilutie decimală x100) =germeni/cm2.
2x suprafaţă şablon

Se numără coloniile care s-au dezvoltat atât la suprafaţă cât şi în interiorul gelozei, (cu ochiul
liber sau prin lupa). Cutiile care conţin mai mult de 300 de colonii nu se iau în calcul.

Numărul de bacterii mezofile (n):

n=
∑ (nd ) ; [UFC/cm3]
NV
unde: n= numărul de colonii care s-au dezvoltat într-o cutie Petri;
d= inversul diluţiei probei însămânţate;
N= numărul de cutii Petri luate în calcul;
V= volumul de probă luat în lucru, în cm3;
UFC= unităţi formatoare de colonii.

Eficenţa de sterlizare (η):

numar de microorganisme dupa sterlizare

η= ⋅ 100, %
numar initial (martor )

Calculul densităţii de microorganiseme pe unitatea de suprafaţă (ρ):

numar de microorganisme dupa sterlizare ⋅ V

ρ= , UFC / cm 2
sup rafata slablonului

unde:
V= numărul de mililitri luaţi ȋn probă
8
Figura 2. Moduri de distribuire a coloniilor ȋn funcţie de metoda de sterlizare utilizate

9
 Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotic a speciilor
microbiene. Antibiograma

Datorita specificitatii lor de actiune, antibioticele manifesta eficienta diferita fata de diferite
specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic defineste
spectrul de activitate al antibioticului respective. In functie de numarul si diversitatea speciilor
microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi (Fig. 1):

• Larg ( de exemplu, spectrul de actiune al tetraciclinei este reprezentat de Gram-negativ,

inclusive chlamidii si rickettsii si Gram-pozitive: peniciline sau active in special fata de
specii Gram-pozitive, dar si Gram-negative, inclusive chlamidii; nitrofuranii, rifampicina,
sulamidele sunt active pe un numar mare de specii bacteriene Gram-pozitive si Gram-
negative si pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente);
• Ingust ( novobiocina este activa pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar si pe
coci si bacilli Gram-negativi, cum ar fi hemofilii si pasteurelele, glicopeptidele, bacitracina
pe bacteria Gram-pozitive);
• Limitat (nitroimidazoli sunt active doar pe microorganismele anerobe).

Fig.1. Spectrele de actiune ale principalelor antibiotice si ale altor agenti chimioterapici
 In cadrul aceleiasi specii microbiene, pot exista diferente mari de sensibilitate a diferitelor
tulpini fata de un anumit antibiotic, astfel ca stabilirea tratamentului cu antibiotic in clinica
necesita izolarea de la bolnav la tulpini microbiene care reprezinta agentul etiologic al interfetei
respective (mai ales daca acesta apartine unor genuri si specii supuse fenomenului de dobandire
a rezistentei chimice) si determinarea spectrului sau de sensibilitate la antibiotice.
Evaluarea in vitro a eficientei unui antibiotic se realizeaza prin masurarea a 3 parametrii,
care variaza in functie de concentratia antibioticului si de timpul sau de actiune:
• Concentratia minima activa (=C.M.A.) – este concentratia la care antibioticul poate
induce anumite perturbari in activitatea metabolica a microorganismelor, fara a
afecta capacitatea de multiplicare si viabilitatea microorganismelor;
• Concentratia minima inhibitory (=C.M.I.) – este concentratia la care un antibiotic
inhiba multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);
• Concentratia minima bactericida (=C.M.B.) – este concentratia la care un antibiotic
are actiune letala asupra microorganismelor (efect bactericid).
Cunoasterea acestor parametric prezinta o importanta clinica deosebita, deoarece, pentru
unele antibiotice, concentratia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest motiv, unele
antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotic bacteriostatice.
Pe langa valoarea C.M.I. determinata in vitro, in alegerea tratamentului cu un anumit
antibiotic, trebuie sa se tina cont si de calitatile farmacologice ale antibioticului respective (ex.
posibilitatea de realizare de concentratii active la nivelul focarului de infectie), de eventualele
efecte secundare si de starea fiziologica a bolnavului.
Tehnica de evidentiere a sensibilitatii la antibiotice a unei tulpini microbiene se numeste
antibiograma. Antibiograma trebuie practicata in mod obligatoriu in cazul microorganismelor
patogene, supuse fenomenului de dobandire a rezistentei, inaintea inceperii oricarui tratament cu
antibiotice.
Dupa spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (in care tulpina
microbiana de testat este pusa in contact cu diferite antibiotice aflate intr-o anumita concentratie),
se pot practica teste cantitative prin determinarea valorii C.M.I. (in care tulpina microbiana este
pusa in contact cu concentratii crescatoare ale aceluiasi antibiotic).

Metode calitative de determinare a spectrului de susceptibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetrica (Kirby-Bauer)

Este o metoda foarte simpla si rapida, care permite determinarea concomitenta a spectrului
de sensibilitate a germenului si a valorii C.M.I. in vederea calcularii dozelor terapeutice de
antibiotice. Metoda are mai multe variante, in practica folosindu-se curent tehnica discurilor
impregnate cu antibiotic, standardizata, recomandata de NCCLS (National Committee for Clinical
Laboratory Standardisation).
O serie de factori cum ar fi: tulpina microbina studiata (densitatea inoculului, specia, varsta
culturii), mediul de cultura (compozitia mediului, pH-ul, densitatea si grosimea stratului de
mediu), tehnica folosita si criteriile de interpretare a rezultatelor obtinute pot influenta rezultatele
unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuata in conditii standardizate,
reproductibile, conform indicatiilor forurilor internationale in domeniu.
Principiul metodei: pe suprafata unui mediu agarizat insamantat “in panza” cu un inocul
standardizat, obtinut din tulpina de testat, se plaseaza la distante egale discuri impregnate cu solutii
de antibiotic de o anumita concentratie care vor difuza in mediu, realizand un gradient de
concetratie invers proportional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distant fata de disc. Daca
tulpina este sensibila la un anumit antibiotic, cresterea microbiana va fi inhibata pe o anumita
suprafata in jurul discului ce contine antibioticul respective, suprafata denumita zona de inhibitie
a cresterii.
Determinarea valorii CMI prin aceasta metoda este posibila datorita existentei unei
corelatii liniare intre diametrul zonei de inhibitie a cresterii si concentratia antibioticului, corelatie
care a permis trasarea unor curbe de concordanta intre dimensiunea zonelor de inhibitie (in mm),
obtinuta cu discuri cu continut fix de antibiotic si valoarea C.M.I. (exprimata in µg/ml) determinate
prin metoda dilutiilor. Prin raportare la aceste curbe, s-au determinat, plecand de la dimensiunea
zonei de inhibitie a cresterii, care este valoarea C.M. I. pentru un anumit antibiotic, fata de o
anumita tulpina. Datele obtinute prin testarea unui numar mare de tulpini apartinand unor diferite
genuri si specii microbiene de importanta clinica au permis realizarea unor tabele de concordanta
utile in interpretarea rezultatelor testelor difuzimetrice de determinare a sensibilitatii tulpinilor la
substante antimicrobiene.
Materiale necesare:
• Placi petrii (Φ = 10 cm) in care s-a repartizat mediul MUELLER-HINTON (fara
glucoza_ agarizat 1.5 % (pH = 7.2-7.4) cu grosimea de 4 mm. Suprafata mediului
trebuie sa fie uscata (placile pastrate la frigider, se vor incubi 20 minute la 37 ᵒC in
acest scop);
• Inoculul este reprezentat de o suspensie in bullion Mueller Hinton sau in A.F.S.
realizata dintr-o cultura tanara (4-5 colonii isolate) dezvoltata pe un mediu solid, in
varsta de 15-18 h, cu o densitate de 1-3x108 UFC/ml ajustata nefelometric (etalon
McFarlandv0.5 = 1.5 x 108 UFC/ml) sau spectrophotometric, prin masurarea
absorbantei la 660 nm (A660 = 0.12);
• Tulpini de referinta: S.aureus ATTC 25923, S. pneumonia ATCC 49619, E.coli
ATTC 25922, E.coli ATCC 35218, P.aeruginosa ATCC 27853, H.influenzae
ATCC 49247, H.inluenzae ATCC 49766;
• Tampoane de vata sterile sau pipete gradate sterile;
• Truse cu discuri pentru antibiograme, standardizate (Φ = 6.3 mm) conform
recomandarilor NCCLS (ex. discuri OXOID); inainte de utilizare, este necesara
echilibrarea termica a discurilor prin mentinerea lor la temperature camerei timp de
5-10 minute (trusele sunt stocate la 4ᵒC/-20ᵒC);
• Tabele interpretative, standardizate, actualizate, cu punctele critice (puncte de
rupture ale valorilor C.M.I.) pentru antibioticele testate.
Mod de lucru (Fig.2.)

1. Inocularea mediului se realizeaza:

➢ Prin insamantarea “ in panza” cu ajutorul tamponului de vata sterile – se imbiba tamponul

in inocul, se indeparteaza excesul de inocul rotind si presand usor tamponul pe peretii
interiori ai tubului, dupa care se descarca tamponul pe suprafata placii prin miscari
orizontale si apoi vertical, finalizate cu descrierea unui cerc marginal;
➢ Prin inundare cu ajutorul unei pipete – se repartizeaza in placa un volum sufficient (1-2 ml)
din inoculul bacterian pentru a realize acoperirea uniforma a intregii suprafete a mediului
prin rotirea placii, dupa care se aspira excesul de inocul cu ajutorul pipetei.
 In vederea uscarii suprafetei mediului, placile se lasa cu capacul intredeschis 30 minute la
temperatura camerei sau 15 minute la 37 ᵒC.
2. Dispunerea individuala a discurilor impregnate cu antibiotic se realizeaza cu ajutorul
unei pense sterile flambata in prealabil sau a dispozitivului Oxoid. Plasarea discurilor pe suprafata
mediului se faca la o distant de 3 cm intre ele (masurata fata de centrele discurilor) si la cel putin
1.5 cm de marginea placii. Dupa depunere, discul se apasa usor cu pensa pentru a asigura contactul
intim suprafata mediului. Pentru dispunerea discurilor de antibiotic se pot utiliza si dispozitive
speciale (dispencer) care permite dispunerea simultana si echidistanta a discurilor de antibiotic pe
placa.
Dupa dispunerea discurilor, placile se lasa in repaus la temperature camerei 20-30 minute,
pentru a asigura predifuzarea uniforma a antibioticelor in mediul inainte de inceperea multiplicarii
microorganismelor.
3. Incubarea placilor se realizeaza timp de 16-18 h la 37 ᵒC, cu capacul in jos.
4. Controlul de calitate se realizeaza prin testarea pe o alta placa, in aceleasi conditii a
tulpinii de referinta adecvate.
5. Citirea rezultatelor se realizeaza prin masurarea diametrelor zonelor de inhibitie a
cresterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. In cazuri de urganta
clinica se poate realize o prima citire la 6-8 h de la incubare.
6. Interpretarea rezultatelor se face in functie de dimensiunea zonelor de inhibitie a
cresterii, exprimand rezultatul cu termenii de tulpina sensibila (S), rezistenta (R) sau intermediar
sensibila (I), conform tabelelor NCCLS pentru metoda difuzimetrica recomandata de NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA) (Tabel 1).
Termenii S, I, R definesc defapt si categoriile de antibiotic, in functie de efectul lor clinic,
dupa cum urmeaza:
❖ Categoria S, inseamna ca exista o mare probabilitate ca antibioticul respective, administrat
in doze obisnuite, sa elimine infectia determinate de tulpina testate (C.M.I. are valori net
inferioare celor ale concentratiilor normale obtinute in urma administrarii unei doze
obisnuite);
❖ Categoria I, inseamna ca exista probabilitatea ca antibioticul respective sa fie eficient in
vivo prin administrarea locala sau prin realizarea in mod fiziologic de concentratii mari la
nivelul unor organe sau tesuturi (rinichi, ficat, cai biliare) la nivelul carora este localizat
procesul infectios;
❖ Categoria R inseamna ca, cel mai probabil, administrarea antibioticului respectiv nu va
determina eliminarea din organism a agentului infectios a carui sensibilitate a fost testate.
La citirea si interpretarea rezultatelor se iau in considerare diametrele zonelor de inhibitie
lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber.
Aparitia de colonii la marginea sau in interiorul zonei de inhibitie se poate datora urmatorilor
factori:
▪ Cultura este mixata sau suprainfectata;
▪ Cultura este pura, dar prezinta celule heterorezistente;
▪ Aparitia de mutante rezistente;
▪ Dezvoltarea tardiva a unor celule, de fapt sensibile, si aparitia de colonii dupa ce
antibioticul s-a diluat prin difuzie in mediu.
Tabel.1. Cheia interpretare a rezultatelor testarilor cantitative si difuzimetrice de sensibilitatea
conform standardelor M7-A3 ale NCCLS (1993).

Agentul antimicrobian CMI (µg/ml) Diametrul zonei de inhibitie (mm)

Sensibil Intermediar Rezistent Sensibil Intermediar Rezistent
beta-lactami
Peniciline
Penicilina
N.gonorrhoeae ≤ 0.06 0.12-1.0 ≥ 2.0 ≥ 47 46-27 ≤ 26
Stafilococi ≤ 0.12 - ≥ 0.25 ≥ 29 - ≤ 28
Enterococi ≤ 8.0 - ≥ 16 ≥ 15 - ≤ 14
Streptococi (altii decat ≤ 0.12 0.25-2.0 ≥ 4.0 ≥ 28 27-20 ≤ 19
pneumococi)
S.pneumoniae ≤ 0.06 0.12-1.0 ≥ 2.0
L.monocutogenes ≤ 2.0 - ≥ 4.0 ≥ 20 - ≤ 19
Meticilina (stafilococi) ≤ 8.0 - ≥ 16 ≥ 14 13-10 ≤ 9.0
Oxicilina
Stafilococi ≤ 2.0 - ≥ 4.0 ≥ 13 12-11 ≤ 10
S. pneumonia ≤ 0.06 - - ≥ 20 - -
Ampicilina
H. influenza ≤ 1.0 2.0 ≥ 4.0 ≥ 22 21-19 ≤ 18
Enterobacteriaceae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 17 16-14 ≤13
Stafilococi ≤ 0.25 - ≥ 0.5 ≥ 29 - ≤ 28
Enterococi ≤ 8.0 - ≥ 16 ≥ 17 - ≤ 16
Alte organism Gram- ≤ 0.12 0.25-2.0 ≥ 4.0 ≥ 30 29-22 ≤ 21
pozitive
Carbenicilina
P.aeruginosa ≤ 128 256 ≥ 512 ≥ 17 16-14 ≤ 13
Alte organism Gram- ≤ 16 32 ≥ 64 ≥ 23 22-20 ≤ 19
negative
Piperacilina
P.aeruginosa ≤ 64 - ≥ 128 ≥ 18 - ≤ 17
Alte organism Gram- ≤ 16 32-64 ≥ 128 ≥ 21 20-18 ≤ 17
negative
Ticarcilina
P.aeruginosa ≤ 64 - ≥ 128 ≥ 15 - ≤ 14
Alte organism Gram- ≤ 16 32-64 ≥ 128 ≥ 20 19-15 ≤ 14
negative
Asociatii beta-lactami/
Inhibitori de beta-
lactamaza
Amoxicilina – acid
clavulanic
H influenzae ≤ 4/2 - ≥ 8/4
Stafilococi ≤ 4/2 - ≥ 8/4 ≥ 20 - ≤ 19
Alte organism ≤ 8/4 16/8 ≥ 32/16 ≥ 18 17-14 ≤ 13
Ampicilina-sulbactam
H infuenzae ≤ 2/1 - ≥ 2/4
Enterobacteriacee si ≤8/4 16/8 ≥ 128/4 ≥ 15 14-12 ≤ 11
stafilococi ≥ 128/4

Peperacilina – tazobactam ≤ 1/4 - ≥ 2/4

H influenzae ≤ 64/4 - ≥ 128/4 ≥ 18 - ≤ 17
P. aeruginosa ≤ 16/4 32/4-64/4 ≥ 128/4 ≥ 21 20-18 ≤ 17
Alte organism Gram- ≤ 8/4 - ≥ 16/4 ≥ 18 - ≤ 17
negative
Stafilococi ≤ 64/2 - ≥ 128/2 ≥ 15 - ≤ 14
Ticarcilina-acid clavulanic ≤ 16/2 32/2-64/2 ≥ 128/2 ≥ 20 19-15 ≤ 14
P.aeruginosa
Alte organism Gram- ≤ 8/2 ≥ 16/2 ≥ 23 - ≤ 22
negative
Stafilococi
Cefalosporine si cefeme
Cefaclor ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 20 19-17 ≤ 16
H. influenzae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Alte organisme ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Cefalotina
Cefamandol ≤ 4.0 8.0 ≥ 16 ≥ 18 17-15 ≤ 14
H. influenzae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Alte organisme ≤ 8.0 16 ≥ 32
Cefazolina
Cefepim ≤ 2.0 - - ≥ 26 - -
H. influenzae ≤ 0.05 - - ≥ 31 - -
N. gonorrhoeae ≤ 0.05 1.0 ≥ 2.0
S.pneumoniae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Alte organisme
Cefixima ≤ 1.0 - - ≥ 21 - -
H. influenzae ≤ 0.25 - - ≥ 31 - -
N. gonorrhoeae ≤ 1.0 2.0 ≥ 2.0 ≥ 19 18-16 ≤ 15
Alte organisme ≤ 16 32 ≥ 32 ≥ 21 20-16 ≤ 15
Cefoperazona
Cefotaxima ≤ 2.0 - - ≥ 26 - -
H. influenzae ≤ 0.5 - - ≥ 31 - -
N. gonorrhoeae ≤ 0.5 1.0 ≥ 2.0
S.pneumoniae ≤ 8.0 16-32 ≥ 64 ≥ 23 22-15 ≤ 14
Alte organism
Cefoxitina ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 28 27-24 ≤ 23
N. gonorrhoeae ≤ 8.0 16.0 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Alte organisme
Ceftazidim ≤ 2.0 - - ≥ 26 - -
H. influenzae ≤ 0.05 - - ≥ 31 - -
N. gonorrhoeae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-15 ≤ 14
Alte organisme
Alti betalactami
Aztreonam ≤ 2.0 - - ≥ 26 - -
H. influenzae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 22 21-16 ≤ 15
Alte organisme
Imipenem ≤ 4.0 - - ≥ 16 - -
H. influenzae ≤ 0.12 0.25-0.5 ≥1.0
S.pneumoniae ≤ 4.0 8.0 ≥ 16 ≥ 16 15-14 ≤ 13
Alte organisme
Amino-glicozide ≤ 16 32 ≥64 ≥ 17 16-15
Amikacina ≤ 14
Gentamicina ≤ 500 - ≥ 500 ≥ 10 9.0-7.0
Enterococi (nivel inalt de ≤ 6.0
rezistenta) ≤ 4.0 8 ≥ 16 ≥ 15 14-13
Alte organism ≤ 16 32 ≥ 64 ≥ 18 17-14 ≤ 12
Kanamicina ≤ 13
Streptomicina ≤ 2000 - > 2000 ≥ 10 9.07-7.0 ≤ 6.0
Enterococi (nivel inalt de - - - ≥ 15 14-12 ≤ 11
rezistenta) ≤ 4.0 8.0 ≥ 16 ≥ 15 14-13 ≤ 12
Alte organism
Tobromicina ≤ 4.0 - - ≥ 12 - -
Macrolide ≤ 0.5 1.0 ≥ 2.0 ≥ 18 17-14 ≤ 13
Azitromicina ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 18 17-14 ≤ 13
H. influenzae
S.pneumoniae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 13 12-11 ≤ 10
Alte organisme ≤ 0.5 1.0 ≥ 2.0 ≥ 21 20-17 ≤ 16
Claritromicina
H. influenzae
S.pneumoniae
Macrolide ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 18 17-14 ≤ 13
Claritromicina
Alte organism ≤ 0.5 1.0-2.0 ≥ 4.0 ≥ 21 20-16 ≤ 15
Eritromicina ≤ 0.5 1.0-4.0 ≥ 8.0 ≥ 23 22-14 ≤ 13
S.pneumoniae
Alte organisme
Quinolone ≤ 1.0 - - ≥ 21 - -
Ciprofloxacin ≤ 0.06 - - ≥ 36 - -
H. influenzae ≤ 1.0 2.0 ≥ 4.0 ≥ 21 20-16 ≤ 15
N. gonorrhoeae ≤ 16 - ≥ 32 ≥ 19 18-14 ≤ 13
Alte organisme ≤ 4.0 8.0 ≥ 16 ≥ 17 16-13 ≤ 12
Acid nalidixic
Norfloxacin ≤ 2.0 - - ≥ 16 - -
Ofloxacin ≤ 0.25 - - ≥ 31 - -
H. influenzae ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 16 15-13 ≤ 12
N. gonorrhoeae ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 16 15-13 ≤ 12
S.pneumoniae
Alte organisme
Altele ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 29 28-26 ≤ 25
Cloramfenicol ≤ 4.0 - ≥ 8.0 ≥ 21 - ≤ 20
H. influenzae ≤ 8.0 16 ≥ 32 ≥ 18 17-13 ≤ 12
S.pneumoniae ≤ 32 64 ≥ 128 ≥ 17 18-16 ≤ 14
Alte organisme
Nitrofurantoina ≤ 1.0 2.0 ≥ 4.0 ≥ 20 19-17 ≤ 16
Rifampicina ≤ 1.0 2.0 ≥ 4.0 ≥ 19 18-17 ≤ 16
H. influenzae ≤ 1.0 2.0 ≥ 4.0 ≥ 20 19-17 ≤ 16
S.pneumoniae
Alte organisme ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 29 28-26 ≤ 25
Tetracicline ≤ 0.25 0.5-1.0 ≥ 2.0 ≥ 38 37-31 ≤ 30
H. influenzae ≤ 2.0 4.0 ≥ 8.0 ≥ 22 21-18 ≤ 17
N. gonorrhoeae ≤ 4.0 8.0 ≥ 16 ≥ 19 18-15 ≤ 14
S.pneumoniae ≤ 8.0 - ≥ 16 ≥ 16 15-11 ≤ 10
Alte organisme
Trimetoprim
Trimetoprim- ≤ 1/19-2/38 ≥ 4/76 ≥ 16 15-11 ≤ 10
sulfametoxazol 0.5/9.5 1/19-2/38 ≥ 4/76 ≥ 19 18-16 ≤ 15
H. influenzae ≤ - ≥ 4/76 ≥ 16 15-11 ≤ 10
S.pneumoniae 0.5/9.5
Alte organisme ≤ 2.0/38 - - - -
Vancomicina 8-16 ≥ 32 16-15 ≤ 14
S.pneumoniae ≤ 1.0 8-16 ≥ 32 ≥ 17 11-10 ≤ 9.0
Enterococi ≤ 4.0 ≥ 17
Alte organism Gram- ≤ 4.0 ≥ 12
pozitive
 Metoda discurilor poate fi utilizata si pentru testarea activitatii antimicrobiene a
antisepticelor, dezinfectantelor si fitoncidelor. In acest scop substantele antiseptice, dezinfectante
sau extractele vegetale (pentru testarea preliminara a fitoncidelor, trituratul de planta se aplica pe
suprafata mediului inoculate in panza cu suspensie bacteriana).
Daca se urmareste determinarea concentratiei unui antibiotic in ser sau in alt produs
biologic, in cursul unui tratament cu antibiotic, se traseaza curbele.
Antibiograma difuzimetrica permite, de asemenea, determinarea pattern-urilor de
rezistenta constitutive, intrinseca, native, precum si detectarea fenotipica a unor mecanisme
de rezistenta dobandita.
Rezistenta la agentii antimicrobieni a aparut atat la o varietate foarte mare de agenti
etiologici ai infectiilor nosocomiale, cat si la agentii patogeni clasici. Emergenta si raspandirea
tulpinilor bacteriene multirezistente depinde foarte mult de un numar mare de factori (mutatii in
genele de rezistenta la antibiotic, schimbul de informatie genetica intre microorganism prin
intermediul plasmidelor), evolutia presiunii selective exercitate de antibiotice in spitale, care a
condus la selectarea de tulpini bacteriene multirezistente si, nu in ultimul rand, la incapacitatea
unor metode de a detecta emergent fenotipurilor de rezistenta la unele tulpini bacteriene.
Principalele mecanisme biochimice de rezistenta la antibiotice sunt reprezentate de:
➢ Inactivarea antibioticului pe cale enzimatica (beta-lactamaze care inactiveaza
antibioticele beta-lactamine, enzime inactivatoare ale cloramfenicolului,
aminozidelor, fosfomicinei);
➢ Modificarea tintei specifice a antibioticului (by-pass) (beta-lactami,
aminoglicozide, quinolone, rifampicina, tetraciclina, glicopeptide, macrolide,
sulfamide, trimetroprim);
➢ Eliminarea activa (efluxul active) a antibioticului din celula bacteriana (beta-
lactami, tetraciclina, quinolone, macrolide);
➢ Diminuarea necesitatii celulei bacteriene pentru o anumita enzima sau cele
metabolic afectate de prezenta antibioticului (nitrofurani).
Plasarea antibioticelor pe placa intr-o anumita ordine permite citirea interpretative a
testelor de sensibilitate la antibiotic (concept introdus de Patrick Courvalin in 1992) si detectarea
fenolica a unor mecanisme de rezistenta la antibiotic.
 1. DETERMINAREA CALCIULUI DIN
FLUIDE BIOLOGICE

Scopul lucrǎrii
Se urmăreşte determinarea calciului din fluide biologice aplicȃnd două
metode şi anume:
- Metoda spectrometrică de absorbţie atomică. Metoda se aplică
pentru conţinuturi de calciu de 0,5 … 5 mg/dm3.
Eroarea metodei este de ± 10%.
Metoda se aplică şi ȋn cazul probelor care au un conţinut pȃnă la 250
mg Ca/dm3, prin diluarea probei pentru ca valorile citite la aparat să
se ȋncadreze ȋn domeniul de liniaritate al curbei de etalonare.
- Metoda complexonometrică. Metoda se aplică pentru conţinuturi de
calciu de 5…100 mg/dm3.
Metoda se aplică şi ȋn cazul probelor care au un conţinut de calciu
mai mare de 100 mg/dm3, după dizolvarea corespunzătoare a probei.

1. Generalităţi
Calciu ionic

Determinarea calciului ionic oferă indicaţii despre efectul proteinelor

totale şi albuminei asupra nivelului calciului seric. Un pacient poate avea un
nivel crescut al calciului total şi cu un nivel normal al calciului ionic datorită
creşterii proteinelor totale şi/sau albuminei, aşa cum se ȋntȃmplă ȋn condiţii
de deshidratare sau ȋn mielomul multiplu.
Femeile prezintă o variaţie diurnă a calciului ionic şi a hormonului
PTH (hormonul paratiroidian) intact mai mare decȃt barbaţii. Există o relaţie
invers proporţională ȋntre concentraţia calciului ionic şi cea de fosfor.
Fracţiunea ionizată a calciului seric tinde să scadă ȋn caz de alcalinizare a
sȃngelui, cȃnd creşte capacitatea proteinelor de a fixa calciul.
Aproximativ jumatate (45%) din cantitatea totală de calciu plasmatic
este legată de albumină (şi doar o mică porţiune de globuline) sub formă
neionizată şi nedifuzibilă, constituind o formă inactivă fiziologic. O
cantitate mică de calciu (5%) este difuzibilă dar neionizată, fiind
reprezentată de citrat, fosfat si bicarbonat de calciu.
Restul calciului plasmatic se găseşte sub formă ionică sau liberă şi
constituie fracţiunea fiziologic activă ȋn procesele de hemostază şi de reglare
a excitabilităţii neuromusculare.

Calciu seric

Calciul este componentul mineral major al oaselor. Aproximativ

99% din cantitatea de calciu din organism se află ȋn oase şi dinţi, care
constituie un rezervor imens pentru menţinerea nivelului calciului seric, iar
restul este distribuit ȋn lichidele biologice şi ţesuturi moi. Ionii de calciu
joacă un rol important ȋn transmiterea impulsurilor nervoase, contracţia
musculară, funcţia cardiacă şi ȋn procesele de coagulare.
Reglarea hormonală a metabolismului calciului ca şi cea a fosforului
este complexă. Relaţiile reciproce ȋntre intestinul subţire, schelet, rinichi şi
sistemul endocrin, ȋn particular paratiroidele, menţin homeostazia calciului
şi fosforului. De asemenea, calcitonina, vitamina D, estrogenii, androgenii
sunt factori care influenţează nivelul calciului.
Cantitatea de proteine din sȃnge afectează nivelul calciului, deoarece
45% din calciul seric este legat de proteine. Astfel scăderea albuminei serice
determină scăderea calciului seric total.
Concentraţii anormale de calciu seric pot indica disfuncţii
paratiroidiene, boli ale oaselor, carcinoame, sindrom de malnutriţie şi
malabsorbţie, carenţa de vitamina D şi boli renale. 90% din cazurile de
hipercalcemie apar ȋn context de hiperparatiroidism, ca manifestare
paraneoplazicăa sau ȋn afecţiuni granulomatoase.

Calciu urinar
Homeostazia calciului este menţinută de hormonul paratiroidian. Cea
mai mare parte a calciului se elimină prin materiile fecale, iar o cantitate
mică de calciu este excretată ȋn urină, ȋn funcţie de aportul de calciu din
dietă. Creşterea calciului urinar rezultă din creşterea absorbţiei intestinale,
scăderea reabsorbţiei tubulare, resorbţia sau pierderea calciului din oase şi
ȋnsoţeşte aproape ȋntotdeauna niveluri crescute ale calciului ȋn sȃnge. Atunci
cȃnd calciul este excretat ȋn cantităţi crescute, favorizează producerea
nefrolitiazei şi nefrocalcinozei, ȋn special dacă se asociază cu un aport
proteic crescut.
Determinarea calciului urinar este importantă ȋn diagnosticul
hipercalcemiei responsabile de apariţia calculilor renali.

2
 1. Recoltare

Recomandările pentru determinarea calciului ionic se pot face

pentru următoarele situaţii: evaluarea fracţiunii biologic active a calciului la
gravide, nou-născuţi, transfuzii masive de sȃnge citratat, disproteinemii
(pierderi renale de proteine, mielom multiplu, inflamaţii active cronice, stări
postoperatorii, pacienţi care necesită ȋngrijiri medicale intensive), boli renale
terminale, hipercalcemie malignă (ȋn special ȋn prezenţa unui PTH intact
normal), hiperparatiroidism şi acidoză.
Recomandari pentru determinarea calciului seric - Recoltarea se
face din doi ȋn doi ani, la pacienţi cu vȃrsta peste de 50 ani, pentru
screening-ul osteoporozei (ȋmpreună cu măsurarea ȋnalţimii şi greutăţii); in
tetanie (investigarea tipului hipocalcemic); fracturi spontane, dureri osoase,
modificări osoase radiologice, tulburări de creştere, alterări dentare; nefro-
sau urolitiaza, nefrocalcinoza, poliurie, polidipsie, boli renale cronice;
pancreatita acută, calculi biliari, diaree recurentă; post-operator ȋn caz de
tiroidectomie şi paratiroidectomie, ȋn hiperparatiroidism, boli tiroidiene,
testiculare, ovariene, adrenale; tumori;
Pot să apară reacţii adverse la anumite medicamente: vitamina D, A,
anticonvulsivante, corticosteroizi, tiazide, digitala.
Pregătirea pacientului se realizează astfel:
- à jeun (pe nemȃncate);
- nu se administrează suplimente de calciu cu 8 ÷ 12 ore ȋnainte; nu se
poate face determinarea calcemiei la pacienţi trataţi cu EDTA sau
care au primit substanţe de contrast radiologice.
Recoltarea se face dimineaţa (există variaţii diurne), ȋn clinostatism
(există variaţii de postură, deoarece jumătate din calciu este legat de
proteine; ȋn clinostatism calcemia ca şi proteinemia sunt mai mici decȃt ȋn
ortostatism). La recoltare se va evita staza venoasă cu garoul (produce valori
fals crescute). Dacă folosirea garoului este indispensabilă, proba se va
preleva la mai mult de 1 minut de la restabilirea circulaţiei. La recoltare şi
ulterior, ȋn timpul manipulării probelor, nu se utilizează mănuşi pudrate cu
carbonat de calciu (spălaţi mănuşile ȋn apă curgătoare, fără săpun sau
detergenţi, chiar dacă sunt etichetate “powder free”).
Recoltarea se realizează din sȃnge venos, ȋntr-un recipient de
recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fară gel separator.
După recoltare, se separă serul prin centrifugare cȃt mai repede
posibil (1÷2 ore). Volumul de probă - minim 0,5 mL ser, iar cauzele
posibile de respingere a probei sunt de specimen hemolizat.

3
 Proba este stabilă după separarea serului, astfel serul separat este
stabil: 7 zile la temperature camerei; 3 săptămȃni la 2÷8 °C; 8 luni la -20
°C.
Recomandări pentru determinarea calciului urinar - Se recomandă
determinarea calciului urinar ȋn: hipoparatiroidism, rahitism, osteomalacie,
hipercalcemia hipocalciurică familială (benignă), steatoree, insuficienţă
renală, carcinom metastatic de prostată.
Pregătire pacient – dacă determinarea calciului urinar se face pentru
o boală metabolică, pacientul trebuie să urmeze o dietă săracă ȋn calciu, iar
medicaţia pe bază de calciu trebuie ȋntreruptă cu 1-3 zile ȋnaintea recoltării.
Recoltarea se realizează din urina din 24 ore: la ora 7 dimineaţa
pacientul urinează şi nu reţine această urină, apoi colectează intr-un vas de
plastic toate emisiunile de urină pȃnă la ora 7 dimineaţa ȋn ziua următoare,
inclusiv; se omogenizează urina recoltată; se măsoară ȋntreaga cantitate, se
reţin 100 mL ȋn pahar de plastic de unică folosinţă pentru urină; nu se
folosesc conservanţi; ambele recipiente trebuie sa fie bine ȋnchise cu capac,
ele se păstrează la 2÷8 oC pȃnă ȋn momentul lucrului.
Recipientul de recoltare este un vas de plastic de 2÷3 L şi pahar de
plastic pentru urină (de unică folosinţă), pe care se notează cantitatea totală
de urină din 24 ore. Volumul de probă va fi toată urina din 24 ore, din care
se reţine 100 mL, care necesită o prelucrare ulterioară dupa recoltare prin
acidifiere la pH-ul maxim 3 cu acid clorhidric 6N.
Proba este stabilă 2 zile la temperatura camerei 18÷28 °C, 4 zile la
2÷8 °C şi 3 săptămȃni la -20 °C.

2. Valori critice

Calciu ionic - Valorile de referinţă sunt prezentate ȋn tabelul 1:

Tabelul 1
Valorile de referinţă a concentraţiilor de calciu ionic
Vȃrsta Valori (mg/dL)
≤ 16 ani 4,2-5,2
> 16 ani 3,82-4,82

Valori critice - nivel scăzut < 2 mg/dL; nivel crescut >7 mg/dL.

Calciu seric - Valorile de referinţă sunt prezentate ȋn tabelul 2:

4
 Tabelul 2
Valorile de referinţă a concentraţiilor de calciu ionic
Vȃrsta Valori mg/dL
Copii (0-10 zile) 7,6 -10,4
Copii (10 zile-2 ani) 9,0 – 11,0
Copii (2-12 ani) 8,8 – 10,8
Copii (12-18 ani) 8,4 – 10,2
Adulţi (18-60 ani) 8,6 – 10,0
Adulţi (60-90 ani) 8,8 – 10,2
Adulţi (> 90 ani) 8,2 – 9,6

Valori critice - nivel scăzut < 6 mg/dL; nivel crescut >13 mg/dL.
Limita de detecţie - 0,2 mmol/L (0,8 mg/dL).
Notă: Factor de conversie: mmol/L ⋅ 4 = mg/dL ; mg/dL ⋅ 0,25 = mmol/L.

Calciului urinar

Valori de referinţă - 100 ÷ 320 mg/24h

Limita de detecţie - 0,05 mmol/L (0,2 mg/dL).
Limite şi interferenţe:
- niveluri fals crescute pot să apară dacă urina este obţinută imediat
după mese bogate ȋn calciu, sau după o expunerea excesivă la
lumină.
- niveluri fals scăzute apar cȃnd urina este alcalină.

4. Metoda de analiză

I. Metoda complexonometrică

4.1. Principiul lucrării

Ionii de calciu din proba cu pH 12 … 13 se titrează cu soluţie de
EDTA ȋn prezenţa amestecului indicator murexid-verde de naftol B pȃnă la
virajul culorii roşii ȋn violet.
4.2. Reactivi şi aparatură
- hidroxid de sodiu, soluţie 2 M: ȋntr-un balon cotat de 100 cm3 se
introduce 8,0000 g hidroxid de sodiu, se dizolvă ȋn apă, se aduce la semn cu
apă şi se omogenizează.

5
 Soluţia se păstrează ȋn recipient de masă plastic de capacitate 100
cm sau aproximativ, bine ȋnchis pentru a evita contactul soluţiei cu dioxidul
3

de carbon din aer.

- EDTA soluţie 0,01 M: ȋntr-un balon cotat de 1000 cm3 se dizolvă
3,7226 g sare disodică a acidului etilen-diamino-tetra-acetic
(Complexon III) uscată la 2 h la 80 oC, ȋn circa 900 cm3 de apă, se
aduce la semn cu apă şi se omogenizează.
Soluţia se păstrează ȋn recipient de masă plastic şi se verifică
concentraţia din timp ȋn timp cu 20 cm3 soluţie etalon de calciu
diluată la 50 cm3 cu apă, conform pct. 4.5.

Concentraţia soluţiei de EDTA (c) este dată de formula:

c = (C 1 · V 1 ) / V 2
unde:
C 1 - concentraţia molară a soluţiei de calciu (C = 0,01);
V 1 - volumul soluţiei etalon de calciu folosiţi la titrare , ȋn cm3;
V 2 - volumul soluţiei de EDTA luat ȋn lucru, ȋn cm3.

- Soluţia etalon de calciu 0,01 M: ȋntr-un vas conic de 500 cm3 se

introduce 1,0000 g carbonat de calciu, ţinut ȋn prealabil 2 ore ȋn
etuvă la 105 ± 3 oC şi se adaugă picătură cu picătură acid clorhidric
10% sub agitare, pȃnă cȃnd tot carbonatul s-a dizolvat. Se evită
excesul de acid clorhidric. Se adaugă 200 cm3 apă, se fierbe cȃteva
minute, se răceşte, se adaugă cȃteva picături de roşu de metil şi se
adaugă amoniac soluţie 3 M pȃnă cȃnd soluţia devine portocalie. Se
trece cantitativ soluţia ȋntr-un balon cotat de 1000 cm3, se aduce la
semn cu apă distilată şi se omogenizează.
1 cm3 soluţie etalon de calciu conţine 0,4008 mg (0,01 milimoli)
calciu.
- Amestec indicator: se mojarează 0,20 g verde de naftol B şi 20 g
clorură de sodiu. Se pastrează ȋn vase de culoare brună, bine ȋnchise.
Aparatură - biuretă cu capacitate de 25 cm3 şi intervalul de gradaţie de 0,05
cm3.

6
4.3. Modul de lucru
Ȋntr-un vas conic de 250 cm3 se introduc cu o pipetă 25,0 cm3 probă.
Se adaugă 1 cm3 soluţie de hidroxid de sodiu (pȃnă la pH 12 … 13) şi 0,1 g
amestec indicator. Se agită soluţia şi se titrează imediat, cu soluţie de
EDTA, pȃnă la virajul culorii roşu ȋn violet.
Interferenţe
Ȋn determinarea calciului proba supusă analizei prin metoda
complexonometrică interferă aluminiul, bariul, plumbul, fierul, cobaltul,
cuprul, magneziul, staniul şi zincul.
Ortofosfaţii ȋn concentraţii mai mari de 1 mg/dm3 precipită calciul la
pH-ul de titrare.
Dacă titrarea se efectuează prea ȋncet sau la un conţinut de calciu
mai mare de 100 mg/dm3 precipită carbonatul de calciu.
Interferenţa fierului (ȋn concentraţii de pȃnă la 30 mg/dm3) se
elimină prin adăugarea ȋn probă, inainte de dozare, a 250 mg cianură de
sodiu sau a 1 … 3 cm3 de trietanolamină.
Atenţie! pH-ul probei de analizat trebuie să fie alcalin
Interferenţa cuprului, cobaltului şi zincului poate fi micşorată prin
adăugarea de cianură de sodiu.
Interferenţa aluminiului se reduce prin adăugarea de trietanolamină.
Dacă interferenţele nu pot fi eliminate se utilizează metoda
spectrometrică de absorbţie atomică.

Calcul
Conţinutul de calciu se exprimă ȋn mg/dm3 şi se calculează cu
formula:

Calciu = (1000 · 0,4008 · V 1 · r) / V (mg/dm3)

unde:
0,4008 - cantitatea de calciu, ȋn mg, corespunzătoare la 1 cm3 soluţie EDTA
0,01 M;
V 1 - volumul de soluţie de EDTA folosit la titrare, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul;
V - volumul probei de apă luată pentru determinare, ȋn cm3.

7
II. Metoda spectrometrică de absorbţie atomică
4.1.1. Principiul metodei
Calciul se determină prin spectrometrie de absorbţie atomică ȋn
flacără reducătoare aer-acetilenă, măsurȃnd absorbţia unei probe la care s-a
adăugat clorura de lantan pentru reducerea interferenţelor, la lungimea de
undă de 422,7 nm.

Obiect şi domeniu de aplicare

- Metoda spectrometrică de absorbţie atomică. Metoda se aplică
pentru conţinuturi de calciu de 0,5 … 5 mg/dm3.
Eroarea metodei este de ± 10%.
Metoda se aplică şi ȋn cazul probelor biologice care au un conţinut
pȃnă la 250 mg Ca/dm3, prin diluarea probei pentru ca valorile citite
la aparat să se ȋncadreze ȋn domeniul de liniaritate al curbei de
etalonare.

4.2.1. Reactivi şi aparatură

- acid clorhidric 0,1 M;
- clorură de lantan, soluţie 20 g La/dm3: ȋntr-un balon cotat de 1000
cm3 se dizolvă 23,4500 g oxid de lantan (La 2 O 3 ) ȋn 50 cm3 acid clorhidric d
= 1,19 g/cm3, sub răcire;
Atenţie reacţie violentă!
Se aduce soluţia la semn şi se omogenizează.
-
Soluţia etalon de calciu
a) Soluţia etalon de rezervă: ȋntr-un pahar de laborator de introduce
2,500 g carbraonat de calciu, ţinut ȋn prealabil 2 ore la etuvă la 105 ±
3 oC şi apoi răcit ȋn exsicator pȃnă la temperatura camerei şi se
adaugă picătură cu picătură acid clorhidric 10%, sub agitare, pȃnă
cȃnd tot carbonatul s-a dizolvat. Se evită excesul de acid clorhidric.
Se fierbe cȃteva minute. Soluţia se trece cantitativ ȋntr-un balon cotat
de 1000 cm3, se aduce la semn cu acid clorhidric 10% şi se
omogenizează.
1 cm3 soluţie de etalon de rezervă conţine 1 mg calciu.

8
 b) Soluţia etalon de lucru: ȋntr-un balon cotat de 100 cm3 se
introduce 5 cm3 soluţie etalon de rezervă, se aduce la semn cu apă şi
se omogenizează.
1 cm3 soluţie de etalon de lucru conţine 0,05 mg calciu.

Aparatură - spectrometru de absorbţie atomică cu flacără aer-acetilenă

prevăzut cu lampă de catod scobit de calciu
Pregătirea aparatului
Spectrometrul de absorbţie atomică se aduce ȋn stare de funcţionare
conform instrucţiunilor de lucru ale aparatului, la lungimea de undă de
422,7 nm şi linia de bază stabilă.
Pentru stabilizarea temperaturii arzătorului se aspiră apă ȋn flacără,
minim 10 minute ȋnainte de ȋnceperea determinării.

4.3.1. Mod de lucru

Ȋntr-un balon cotat de 50 cm3 soluţie de clorură de lantan, un volum
de probă (V = 1 … 45 cm3), se aduce la semn cu acid clorhidric.
Observaţie: Concentraţia de calciu ȋn proba luată ȋn lucru trebuie să
se ȋncadreze ȋn domeniul de liniaritate al curbei de etalonare (0,5 … 5 mg
Ca/dm3)
Se determină absorbnţa soluţiei din balonul cotat de 50 cm3.
Ȋn paralel cu proba de analizat se pregatesc ȋn mod identic minim
trei probe martor, folosind apă ȋn locul probei de analizat (pentru controlul
reactivilor) şi minim trei probe etalon cu conţinuturi diferite de calciu
(pentru verificarea curbei de etalonare).
Se măsoară absorbanţele probelor martor şi ale probelor etalon.
Ca absorbanţă a probei martor se consideră media aritmetică a
absorbanţelor celor trei probe martor.
Absorbanţa probei martor se scade din valoarea absorbanţei probei
de analizat.
Se citeşte pe curba de etalonare conţinutul de calciu corespunzător
absorbanţei obţinute,
Interferenţe
Ȋn determinarea calciului din apa potabilă prin metoda
spectrometrică de absorbţie atomică interferă ionii fosfat, sulfat, fluorură şi

9
aluminiu. Aceste interferenţe se reduc prin adăugarea de clorură de lantan,
astfel ȋncȃt concentraţia lantanului ȋn proba pentru masurarea absorbanţei să
fie de 0,1 … 1%.
Trasarea curbei de etalonare
Ȋntr-o serie de şase baloane cotate de 50 cm3 se introduce 0; 0,5; 1,0;
2,0; 3,0 şi 5,0 cm3 soluţie etalon de lucru de calciu şi cȃte 5 cm3 soluţie de
clorură de lantan. Se aduce la semn cu acid clorhidric şi se omogenizează.
Soluţiile obţinute conţin: 0; 0,5; 1; 2; 3 şi 5 mg calciu/dm3.
Se măsoară absorbanţele probelor etalon. Din absorbanţele probelor
etalon se scade absorbanţa probei 0 (zero).
Se trasează curba de etalonare ȋnscriind pe abscisă concentraţii de
calciu, ȋn miligrame pe decimetru cub, iar pe ordonată valorile absorbanţelor
corespunzătoare.
Curba de etalonare se verifică la fiecare serie de analize.

Calcul
Conţinutul de calciu se exprimă ȋn miligrame pe decimetru cub şi se
calculează cu formula:

Calciu = (c · V 1 · r) / V [mg/dm3]

unde:
c - conţinutul de calciu citit pe curba de etalonare, ȋn mg/dm3;
V 1 - volumul soluţiei pregatită pentru măsurarea absorbanţei, ȋn cm3; (V 1 =
50 cm3)
V - volumul probei de apă potabilă luat ȋn lucru, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul.

4.1. Interpretarea rezultatelor

Ca ionic - Limite şi interferenţe

Calciul ionic are semnificaţie diagnostică numai dacă distribuţia

fracţiunilor plasmatice ale calciului nu este influenţată de modificări ale pH-
ului. Astfel, acidoza sau o reducere a pH-ului după recoltarea probei

10
determină creşterea calciului ionic datorită activităţii metabolice a celulelor
sanguine (de exemplu, o scădere a pH-ului cu 0,1 determină o creştere a
calciului ionic cu aproximativ 0,2 mg/dL); alcaloza sau creşterea pH-ului
după recoltarea probei determină scăderea calciului ionic datorată eliminării
CO 2 din probă. Calciul ionic prezintă variaţii circadiene semnificative,
creşte după efort fizic şi scade postprandial.

Calciul seric

Pentru ca valorile calciului seric să fie interpretate corect,

ȋntotdeauna trebuie determinate simultan proteinele serice totale şi
albumina, deoarece ȋn ser 0,8 mg de calciu se leagă de 1,0 g de albumină;
pentru corecţie, la valoarea obţinută pentru calciu se adaugă 0,8 mg/dL
pentru fiecare 1,0 g/dL cu care albumina serică scade sub 4,0 g/dL; legarea
de globuline afectează valoarea calciului total doar dacă globulinele sunt ȋn
concentraţie de peste 6 g/dL.

Creşterile se pot datora următoarelor cauze:

- hiperparatiroidism primar;
- tumori maligne: cancer osos metastatic, cancer de plamȃn, sȃn,
tiroida, rinichi, ficat, pancreas, prostata, mielom multiplu, carcinom
scuamocelular pulmonar sau de cap şi gȃt;
- boli granulomatoase (tuberculoza, sarcoidoza), prin exces de 1,25-
dihidroxivitamina D3;
- reacţii adverse la medicamente (intoxicaţie cu vitamina D), diuretice;
- insuficienţă renală cronică;
- alte afecţiuni endocrine: hipertiroidism (la 20 ÷ 40% dintre pacienţi,
de obicei < 14 mg/dL);
- osteoporoza acută (imobilizare la pat a unor pacienţi tineri sau ȋn
boala Paget);
- cauze diverse: hipercalcemia familială hipocalciurică, deshidratarea
cu hiperproteinemie, hipofosfatazia, hipercalcemia idiopatică a
sugarului.

Scăderile se pot datora următoarelor cauze:

- hipoparatiroidism chirurgical, postiradiere, idiopatic, congenital
(sindromul DiGeorge);
- pseudohipocalcemia care reflectă reducerea nivelului albuminei;
- pseudohipoparatiroidism (rezistenţa la acţiunea PTH);
- malabsorbţie de calciu şi vitamina D, boala celiacă, disfuncţii
pancreatice;

11
 - icter obstructiv;
- insuficienţă renală cronică; acidoza tubulară renală;
- pancreatita acută;
- aport redus de calciu, fosfor si vitamina D (inaniţie, malnutriţie,
afecţiuni osoase, ultimul trimestru de sarcină);
- administrarea unor medicamente (chimioterapice anticanceroase,
intoxicaţie cu fluor, antibiotice, diuretice de ansă, anticonvulsivante,
corticosteroizi, calcitonina, transfuzii multiple cu sȃnge citratat,
administrarea ȋn exces de fluide i.v. care scad nivelul albuminei);
- hipomagneziemie;
- tumori cu metastaze osteoblastice (sȃn, prostată, plămȃn, tiroidă);
- sindromul de soc toxic.
Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de medicamente:
- Creşteri: medicamente antiacide (alcaline), androgeni, săruri de
calciu, danazol, dietilstilbestrol (creştere rapidă ȋn 24 ore la pacienţi
cu cancer de sȃn), dihidrotahisterol, administrare cronică de diuretice
(clortalidon, acid etacrinic, furosemid, tiazide), ergocalciferol,
isotretinoin, litiu, progesteron, PTH, tamoxifen, vitamina D,
vitamina A.
- Scăderi: albuterol, alprostadil, aminoglicozide (ex.: gentamicina),
asparaginaza, barbiturice (la bătrȃni), calcitonina, carbamazepin,
carbenoxolona, carboplatin, corticosteroizi; diuretice (efect iniţial):
acetazolamida, acid etacrinic, furosemid; ergocalciferol, estrogeni
(in post-menopauză), fluoruri, gastrina, glucagon, glucoza,
indapamid, insulina, izoniazida, laxative (exces), săruri de magneziu,
meticilina, fenitoin, fosfaţi, plicamicin, soluţii saline (efectul apare ȋn
caz de hipercalcemie), tetraciclina (la gravide), tacrolimus,
tobramicina.

Calciul urinar

Creşterile se pot datora următoarelor cauze:

- hiperparatiroidism (30-80% din cazuri);
- alimentaţie cu un conţinut ridicat de calciu;
- ingestie excesivă de lapte;
- intoxicaţie cu vitamina D;
- sarcoidoza;
- imobilizare prelungită (mai ales la copii);
- mielom multiplu;
- cancer de sȃn sau vezică urinară;
- osteoporoza (primară sau secundară);

12
 - leziuni osteolitice (metastaze de carcinoame, sarcoame);
- boala Paget;
- osteita deformantă;
- acidoza tubulară renală;
- sindrom Fanconi;
- postovariectomie, deficit estrogenic;
- hipercalciurie idiopatică.
Scăderile se pot datora următoarelor cauze:
- hipoparatiroidism, rahitism, osteomalacie;
- deficit de vitamina D;
- sindrom de malabsorbţie;
- nefroza acută, nefrita, insuficienţa renală;
- carcinom metastatic de prostată;
- hipercalcemie hipocalciurica familială.
Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de medicamente:
- Creşteri: acetazolamida, amilorid, amoniu clorid, asparaginaza,
cadmiu, calcitonina, săruri de calciu, colestiramina, corticosteroizi,
corticotropin, diuretice (efect iniţial) ca de exemplu: acid etacrinic,
furosemid, manitol, metolazon, tiazide, triamteren; ergocalciferol,
glucoza, hormon de creştere, mithramicina, nandrolon, clorura de
sodiu, spironolactona, vitamina D.
- Scăderi: bicarbonat; diuretice (efect cronic), de exemplu:
clortalidona, tiazide; estrogeni, litiu, neomicina, contraceptive orale.

Bibliografie

1. Brudasca, M. Cucuianu. Metabolismul calciului, fosforului si

magneziului. In Biochimie clinica. Fundamentare fiziopatologica.
Luminita Plesca-Manea et al. Argonaut, Romania, 3 Ed., 2003, 317-339.
2. Frances Fischbach. Effects of the Drugs on Laboratory Tests. In A
Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 7 Ed., 2004, 1231.
3. Frances Fischbach. Effects of the Most Commonly Used Drugs on
Frequently Ordered Laboratory Tests. In A Manual of Laboratory and

13
 Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009,
1232.
4. Frances Fischbach. Pulmonary Function, ANGs and Electrolyte Studies.
In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 994-997.
5. Frances Fischbach. Urine Studies. In A Manual of Laboratory and
Diagnostic Tests. Lippincott, Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009,
255-257.
6. Jacques Wallach. Analizele de sange. In Interpretarea testelor de
diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001, 61-64.
7. Jacques Wallach. Urina. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura
Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001, 121-124.
8. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate
2015. Ref Type: Catalog.
9. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate
2010. Ref Type: Catalog.
10. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and
Interpretive Guide. Calcium, Ionized, Serum. www.labcorp.com 2010.
Ref Type: Internet Communication.
11. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and
Interpretive Guide. Calcium, Serum. www.labcorp.com 2015. Ref Type:
Internet Communication.
12. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and
Interpretive Guide. Calcium, Urine. www.labcorp.com 2010. Ref Type:
Internet Communication.
13. Lothar Thomas. Bone and Mineral Metabolism. In Clinical Laboratory
Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-
Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed.,
1998, 231-237.

14
 DETERMINAREA FIERULUI DIN FLUIDE
BIOLOGICE (SIDEREMIA) PRIN METODA
SPECTROMETRICĂ CU
1, 10 FENANTROLINĂ

Scopul lucrǎrii
Lucrarea constǎ în determinarea conţinutului total de fier în probe
biologice. Metoda descrisǎ este aplicabilǎ la concentraţii de ioni de fier de
0,2-5,0 mg/dm3, iar prin concentrarea probelor biologice sau diluarea lor
corespunzǎtoare se pot determina cantitǎţi de fier mai mici sau mai mari
decât acest domeniu. Eroarea metodei este de maximum 5%.

1. Generalităţi
Cantitatea totală de fier din organism diferă ȋn funcţie de vȃrstă şi
sex. Nou-născuţii la termen au ~75 mg Fe/kgc provenit ȋn principal de la
mamă ȋn timpul trimestrului al treilea de sarcină. Depozitele de fier scad ȋn
timpul perioadei de creştere. După adolescenţă nevoia de fier scade, bărbaţii
prezentȃnd o creştere graduală a depozitelor de fier pe parcursul vieţii (au un
minim de 50 mg Fe/kgc). Ȋn schimb, femeile prezintă o pierdere continuă de
fier pȃnă la menopauză (au ~35 mg Fe/kgc); după menopauză femeile
acumulează fier, ȋntr-un mod liniar, ajungȃnd la un nivel asemanător
bărbaţilor.
Cea mai mare parte a fierului din organism se gaseşte ȋn compuşii
hem, ȋn special hemoglobina şi mioglobina. O cantitate foarte mică este
conţinută ȋn enzimele care utilizează fierul ȋn schimbul de electroni:
peroxidaze, catalaze şi ribonucleotid reductaze. Cea mai mare parte a
fierului non-hemic este depozitat sub formă de feritină sau hemosiderina ȋn
macrofage şi hepatocite. Numai o fracţiune foarte mică (~0,1%) circulă ȋn
plasmă sub formă de Fe3+ legată de o proteină de transport – transferina.
Fierul este absorbit din intestinul subţire proximal sub formă de fier
hemic şi fier feros (Fe2+), absorbţia sa fiind influenţată de aciditatea gastrică,
factori potenţiatori şi inhibitori alimentari. Absorbţia se realizează prin
intermediul unor proteine transportoare şi cu ajutorul unor enzime:
ferireductaza, care converteşte Fe3+ din alimente ȋn Fe2+ pentru transferul ȋn
celulele mucoasei intestinale, şi o ferioxidază (hefaestina), care converteşte

1
Fe2+ ȋn Fe3+ la nivelul membranei bazolaterale, pentru transferul plasmatic.
Deoarece organismul uman nu posedă un mecanism fiziologic de
eliminare a excesului de fier, absorbţia acestuia este foarte bine controlată,
elementul cheie fiind hepcidina cu rol reglator negativ asupra fierului
plasmatic, avȃnd ca efect scăderea eliberării de fier din enterocit şi din
celulele sistemului reticulo-endotelial. Sinteza de hepcidină este stimulată
de inflamaţie sau atunci cȃnd depozitele de fier ale organismului sunt
saturate. Hipoxia ca şi creşterea necesarului de fier pentru eritropoeza inhibă
sinteza hepatică a hepcidinei. Afectarea mecanismului reglator al hepcidinei
- respectiv a moleculelor semnal ce intervin ȋn stimularea sau inhibarea
sintezei acesteia – are rol ȋn patogeneza unor afecţiuni datorate tulburărilor
metabolismului fierului (anemia feriprivă, hemocromatoza ereditară,
ȋncarcarea cu fier din eritropoieza ineficientă, anemia asociată cu infecţii şi
inflamaţii, anemia din boli cronice).
Excreţia de fier are loc prin pierderile celulare la nivel
gastrointestinal, cutanat, urinar şi pierderile menstruale la femeie. Cea mai
mare parte a fierului funcţional din organism provine din reutilizarea fierului
deja existent provenit din eritrocitele senescente distruse la nivelul
sistemului reticuloendotelial, ȋn principal din splină.

2. Recoltare
Recomandări pentru determinarea sideremiei se realizează ȋn
principal ȋn:
- diagnosticul diferenţial al anemiilor;
- evaluarea anemiei feriprive, talasemiei, anemiei sideroblastice;
- diagnosticul supraȋncărcării cu fier şi hemocromatozei;
- diagnosticul intoxicaţiei cu fier.
Pregătirea pacientului se realizează astfel:
- dimineaţa (cȃnd valorile sideremiei sunt cele mai mari);
- ȋnaintea administrării de preparate de fier/transfuzii de sȃnge;
- dacă pacientul a fost transfuzat, determinarea sideremiei se face
după 4 zile.
Recoltarea se realizează din sȃnge venos, ȋntr-un recipient de
recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fară gel separator. După
recoltare, se separă serul prin centrifugare cȃt mai repede posibil (1÷2 ore).
Volumul de probă - minim 0,5 mL ser, iar cauzele posibile de respingere a
probei sunt de specimen hemolizat.

2
 Proba este stabilă după separarea serului, astfel serul separat este
stabil: 7 zile la 15÷25 °C; 3 săptămȃni la 2÷8 °C; cȃţiva ani la temperturi de
(-15)÷(-25) °C.

3. Valori critice
Tabelul
Valorile de referinţă a concentraţiilor de fier
Varsta Valori (mg/dL)
Barbati Femei
<1 luna 32 - 112 29 - 127
1-12 luni 27 - 109 25 - 126
1-3 ani 29 - 91 25 - 101
4-6 ani 25 - 115 28 - 93
7-9 ani 27 - 96 30 - 104
10-12 ani 28 - 112 32 - 104
13-15 ani 26 - 110 30 - 109
16-18 ani 27 - 138 33 - 102
>18 ani 59 - 158 37 -145

Notă: Factori de conversie: µmol/L⋅5,59 = µg/dL; µg/dL⋅0,179 = µmol/L.

4. Metoda de analiză

4.1. Principiul lucrării

Se adaugă la proba de analizat o soluţie de 1,10-fenantrolină și se
măsoară absorbanța complexului colorat în roșu oranj la lungimea de undă
de 510 nm.
Pentru dozarea fierului total şi a fierului total dizolvat este necesară
adăugarea de clorhidrat de hidroxilamină pentru a reduce fierul (III) la fier
(II). Dacă sunt prezenţi compuşi nedizolvaţi ai fierului, ca oxizi sau
complecşi de fier este necesară pretratarea probelor. Pentru solubilizarea
acestor compuşi (a se vedea 4.3.1.2).
Complexul fier (II)-1,10-fenantrolină este stabil ȋn intervalul de pH
2,5...9, iar intensitatea coloraţiei lui este proporţională cu cantitatea de fier
(II) prezentă. Relaţia dintre concentraţie şi absorbanţă este liniară pȃnă la
concentraţii de 5 mg Fe/L. Absorbanţa maximă se situează ȋn jurul a 510 nm
[coeficientul de absorbţie molară este de 11⋅10-3 L/(mol·cm)].

4.2. Reactivi şi aparatură

- Acid sulfuric ρ = 1,84 g/mol;

3
- Acid sulfuric, soluţie C(1/2 H 2 SO 4 ) aprox. 4,5 mol/L. Se adaugă treptat
şi agitȃnd energic, 1 volul de acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) la 3 volume
de apă, răcind tot timpul;
- Acid azotic, concentrat ρ = 1,40 g/mL;
- Acid clorhidric soluţie ρ = 1,12 g/mL, C HCI aprox. 7,7 mol/L;
- Tampon acetat - Se dizolvă 40 g acetat de amoniu (CH 3 COONH 4 ) ȋn
apă, se adaugă 50 mL acid acetic glacial (CH 3 COOH) (ρ = 1,06 g/mL) şi
se completează la 100 mL cu apă;
- Clorhidrat de hidroxilamina, soluţie 100 g/L. Se dizolvă 10 g clorhidrat
de hidroxilamină (ClH 4 NO) în apă şi se completează la 100 mL cu apă.
Această soluţie este stabilă o saptămȃnă;
- 1,10-Fenantrolină soluție. Se dizolvă 0,5 g clorură de 1,10-fenantrolină
monohidrat (C 12 H 9 ClN⋅H 2 O) şi se completează la 100 mL cu apă. Ca o
alternativă, se dizolvă 0,42 g 1,10-fenantrolina monohidrat (C 12 H 9 ClN⋅
H 2 O) ȋn 100 mL apă care conţine 2 picături de soluţie de acid clorhidric
(ρ = 1,12 g/mL). Soluţia este stabilă o săptămȃnă dacă se păstrează la
întuneric;
- Peroxidisulfat de potasiu, soluţie 40 g/L. Se dizolvă 4 g peroxidisulfat de
potasiu (K 2 S 2 O 8 ) în apă şi se completează la 100 mL. Această soluție
este stabilă mai multe săptamâni dacă este păstrată la temperatura
ambiantă într-o sticlă brună;
- Fier, soluție mamă corespunzătoare la 0,10 g Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 50 g fir de fier (puritate 99,99 %). Se adaugă 20 mL
apă, 5 mL sotuţie de acid clorhidric (4,5 mol/L) și se încălzește ușor
pentru a se dizolva. Se răcește și se completează la semn, cu apă. 1 mL
soluţie conține 0,10 mg fier. Această soluție este stabilă cel puțin o lună
dacă este păstrată într-un flacon de sticlă sau de material plastic. Pot fi de
asemenea folosite alte soluții standard de fier comercializate;
- Fier, soluție etalon I, corespunzător la 20 mg Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 100 mL soluție mamă și se completează cu apă până
la semn. Se prepară în ziua folosirii;
- Fier, soluție etalon II, corespunzător la 1 mg Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 5 mL soluţie etalon și se completează cu apă la semn.
Se prepară în ziua utilizării;

Aparatură - Înaintea folosirii, toată sticlăria și flacoanele de prelevare

trebuie să fie spălate cu acid clorhidric (ρ = 1,12 g/mL) și apoi clătite cu
apă.
- Spectrometru, cu prismă sau cu rețea, adecvat pentru măsurări la 510 nm;

4
- Cuve fotometrice, cu drumul optic de cel puţin 10 mm, corespunzătoare
domeniului de absorbanță a probei;
- Filtru de membrană cu dimensiunile porilor mai mici de 0,45 μm;
- Vas pentru oxigen (vas Winkler) cu capacitatea de 100 mL.

4.3. Modul de lucru

4.3.1. Fier total

4.3.1.1 Determinare directă

Se iau pentru analiză 50 mL probă acidulată: imediat dupa prelevare,
se acidulează proba la pH=1. În general pentru 100 mL probă este suficient
1 mL acid sulfuric concentrat (ρ = 1,84 g/mol). Dacă este necesar, se
ajustează pH-ul adăugând acid sulfuric concentrat (4,5 mol/L) și ținând
seama în calcul, de volumul adăugat.
Dacă proba conține fier nedizolvat, oxizi de fier sau complecși de
fier, se transvazează proba de analizat într-un flacon de 100 mL și se face
următoarea pretratare.
Oxidare - Se adaugă 5 mL soluţie de peroxidisulfat de potasiu și se
fierbe ușor timp de 40 min, asigurându-se că volumul să nu scadă sub 20
mL. Se răcește și se transvazează într-un balon cotat de 50 mL și se aduce la
semn cu apă.
NOTA – Amestecul poate fi de asemenea pus ȋn autoclavă într-un balon de
100 mL cu dop, timp de 30 min, apoi răcit și diluat la 100 mL. În calculul
rezultatelor se ţine seama de această diluție, înmulțind rezultatul cu 2.
Dacă după oxidare soluția este tulbure, se filtrează imediat pe filtru
de membrană într-un balon cotat. Se spală filtrul cu o cantitate mică de apă,
adaugând apele de spălare la filtrat și completând cu apă până la semn.
Reducerea la fier (II) - Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă
de 100 mL se adaugă 1 mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită
energic. Se adaugă 2 mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprins între
3,5 și 5,5, de preferat 4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

5
4.3.1.2 Fier total după mineralizare
Într-un balon cotat de 100 mL se introduc 50 mL probă acidulată
(imediat dupa prelevare, se acidulează proba la pH=1. În general pentru 100
mL probă este suficient 1 mL acid sulfuric concentrat (ρ = 1,84 g/mol).
Dacă este necesar, se ajustează pH-ul adăugând acid sulfuric concentrat (4,5
mol/L) și ținând seama în calcul, de volumul adăugat, se adaugă 5 mL acid
azotic, 10 mL acid clorhidric și se încălzește amestecul la (70…80 °C) până
la dizolvarea completă. După circa 30 min se adaugă 2 mL acid sulfuric (ρ =
1,84 g/mol) și se ține pe o sursă de căldură până la apariția vaporilor albi
denși de anhidridă sulfurică. Se recomandă evitarea evaporării până la sec.
Se răcește la temperatura ambiantă, se adaugă 20 mL apă, transvazând
cantitativ într-un baton cotat de 50 mL şi se completează la semn.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL se adaugă 1
mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită energic. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprin între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 minut, apoi se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

4.3.2. Determinarea fierului dizolvat

Se ia o proba de apă de analizat de 50 mL (imediat după prelevare şi
se filtrează proba. Se acidulează filtratul la pH=1 (ȋn general este suficient 1
mL acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) pentru 100 mL probă) și se trece într-un
balon cotat de 100 mL.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL se adaugă 1
mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită energic. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprins între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

4.3.3. Determinarea fierului (II)

Într-un balon cotat de 100 mL se introduc 50 ml probă. Se introduce
1 mL acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) într-un vas pentru oxigen cu capacitatea

6
de 100 mL şi se umple exact cu proba de apă. Se evită orice contact inutil cu
aerul.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprin între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Atenţie! Fără adăugare de hidroxilamină.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Se evită pe cât posibil contactul cu aerul.
Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu un spectrometru la 510
nm, utilizând apă în cuva de referință.

Preparare soluțiilor etalon

Se prepară o serie de soluții etalon de fier care să acopere o gamă de
concentrații corespunzând concentrației presupuse a fierului din probe, prin
măsurarea cu precizie a unor volume din soluția etalon I sau etalon II într-o
serie de baloane cotate de 50 mL. Se adaugă în fiecare balon 0,5 mL soluţie
de acid sulfuric (4,5 mol/L) și se completează volumul cu apă.
Se tratează apoi seria de soluții etalon în mod similar cu soluțiile de
probe, urmând modul de lucru indicat pentru fiecare formă de fier de
determinat.
Proba martor - Se prepară o soluție pentru proba martor, urmând
întocmai modul de lucru indicat pentru probe, dar folosind 50 mL apă ȋn
locul a 50 mL probă de analizat.

Trasarea curbei de etalonare

Pentru fiecare serie de soluţii etalon se stabilește o curbă de
etalonare înscriind pe abscisă concentrația fierului în miligrame la litru, iar
pe ordonată absorbanțele soluțiilor etalon corespunzătoare.
O curbă de etalonare se stabilește pentru fiecare formă de fier, pentru
fiecare tip de aparat și pentru fiecare drum optic al cuvelor.
De exemplu, din soluţia etalon de lucru pentru fier se mǎsoarǎ cu o
biuretǎ: 0; 2; 5; 7; 10; 15; 20; 30; 40 şi 50 cm3 soluţie etalon de lucru. Se
aduce la 100 cm3 cu apǎ bidistilatǎ. Apoi se prepară proba zero constituind
proba martor (sau proba de referinţă). Soluţiile finale din baloanele cotate
conţin urmǎtoarele cantitǎţi de ioni de fier 1; 0.02; 0.05; 0.07; 0.10; 0.15;
0.20; 0.30; 0.40; 0.50 mg Fe2+.

Calcul

7
 Fier (Fe2+) = (c · V 1 · r) / V (mg/dm3)

unde:
c - conţinutul de fier citit pe curba de etalonare, ȋn mg/dm3;
V 1 - volumul soluţiei pregatită pentru măsurarea absorbanţei, ȋn cm3;
V - volumul probei luat ȋn lucru, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul.

4.4. Interpretarea rezultatelor

După efectuarea calculelor, se vor interpreta rezultatele conform
limitelor maxime admisibile şi se vor ȋncadra ȋn valori normale, critice sau
letale.
Valorile critice se ȋncadrează ȋn intervalul: 280-2550 µg/dL sau 50-
456 µmol/L la copii cu intoxicaţie acută cu fier.
Valorile letale se ȋnregistrează la valori: >1800 µg/dL sau >322
µmol/L.
Creşterile se pot datora următoarelor cauze:
- talasemie;
- anemii;
- hemocromatoza idiopatică;
- intoxicaţie acută cu fier (la copii);
- necroza hepatică severă (hepatite virale acute; poate atinge
>1000 µg/dL) şi unele hepatopatii cronice.
Scăderile se pot datora următoarelor cauze:
- anemia feriprivă: dietă deficitară;
- absorbţie scazută de fier: aclorhidrie, gastrectomie, boala
celiacă, by-pass duodenal;
- pierdere cronică de sȃnge;
- nevoi crescute de fier: sarcină, lactaţie, perioada de creştere;
- anemia din bolile cronice (boli inflamatorii, infecţii cronice,
boli renale etc.);
- sindromul nefrotic (pierderea urinară a proteinei de legare a
fierului).
Simptome ale intoxicaţiei cu fier includ: vărsături, diaree, şoc,
letargie, comă.
Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de:
- Factori fiziologici:

8
 - Creşteri ȋn perioada premenstruală;
- Scăderi ȋn timpul menstruaţiei.
- Medicamente:
- Creşteri: acid acetilsalicilic, cefotaxim, cloramfenicol,
cisplatin, contraceptive orale, fier dextran (se produc creşteri
care se menţin mai multe săptămȃni, uneori >1000µg/dL);
meticilina, metimazol, metotrexat, multivitamine care conţin
fier, pirazinamida.
- Scăderi: alopurinol, aspirina, colestiramina, corticotropin,
cortizon, metformin, pirazinamida.

Bibliografie

1. Andrews N. Iron Deficiency and Related Disorders. In Wintrobe’s

Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 11 Ed.,
2004; 980-1004.
2. Frances Fischbach. Blood Studies: Hematology and Coagulation. In A
Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 8 Ed., 2009; 99-101.
3. Frances Fischbach. Effects of Drugs on Laboratory Tests. In A Manual
of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins,
USA, 8 Ed., 2009; 1244.
4. Ivana De Domenico, Diane M.Ward, Jerry Kaplan. Hepcidin regulation:
ironing aut the details. In J. Clin. Invest. 117(7):1775-1758 (2007).
5. Jacques Wallach. Afectiuni hematologice. In Interpretarea testelor de
diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001; 451-452.
6. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate.
2010. Ref Type: Catalog.
7. Lothar Thomas. Iron. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and
Assessment of Clinical laboratory Results. TH-Books
Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998; 273-
275.
8. Paul R.Finley, Harold J.Grady, Eugene S.Olsowka et al. Chemistry. In
Laboratory Test Handbook. David S. Jacobs, Wayne R. DeMott, Paul R.
Finley et al., LEXI-COMP.Inc., USA, 3 Ed., 1994.

9
1. DETERMINAREA MAGNEZIULUI DIN
FLUIDE BIOLOGICE

Scopul lucrǎrii
Se urmăreşte determinarea magneziului din fluide biologice aplicȃnd
trei metode şi anume: Metoda complexonometrică, Metoda spectrometrică
de absorbţie atomică şi Metoda colorimetrică. Metodele se aplicabilă pentru
conţinuturi de magneziu de maximum 12 mg Mg2+/L. Sensibilitatea metodei
este de 0,5 mg Mg2+/L.

1. Generalităţi
Magneziul este un cation cu localizare predominant intracelulară
care, deşi se gaseşte ȋn proporţie mică ȋn organism (0,05% din greutatea
totală a corpului), prezintă o mare importanţă din punct de vedere structural
şi funcţional. Aproximativ 70% din cantitatea totală de magneziu a corpului
uman (cca. 14 g) se află ȋn compoziţia oaselor ȋmpreună cu Ca şi P, iar
restul este distribuit in ţesuturile moi (ȋn special muşchii scheletici) şi ȋn
diverse fluide.
Nivelul seric de Mg2+ nu reflectă cu acurateţe nivelul total
de Mg al corpului, deoarece numai 1% din Mg2+ total al organismului
2+

uman se află în lichidul extracelular.

În plasmă Mg2+ se găseşte în proporţie de 65 % sub formă de ioni
liberi, restul de 35% este legat de proteine. Ionul Mg2+ îndeplineşte
numeroase funcţii în organism deoarece este necesar pentru utilizarea ATP
(adenozintrifosfat) ca sursă principală de energie pentru organism, iar
prezenţa acestui electrolit este indispensabil în aproape toate procesele
metabolice.
Ȋn afară de rolul său de constituent al oaselor şi al unor ţesuturi moi,
Mg ȋndeplineşte numeroase roluri funcţionale printre care şi acela de
2+

activator al unor enzime (peste 300 enzime, implicate ȋn metabolismul

carbohidraţilor, sinteza proteinelor şi acizilor nucleici).
Alături de sodiu, potasiu şi calciu ionic, Mg2+ reglementează de
asemenea excitabilitatea neuromusculară și mecanismul de coagulare. Din
această cauză este importantă monitorizarea nivelului magneziului la
bolnavii cardiaci.
Ionii de Mg2+ joacă un rol important în menţinerea nivelului
intracelular al calciului, influenţeză absorbţia intestinală şi metabolismul
calciului.
Acţiunile calciului şi magneziului sunt strȃns legate ȋntre ele,
deficitul unuia dintre aceste elemente influenţȃnd semnificativ metabolismul
celuilalt (magneziul este necesar atȃt pentru absorbţia intestinală cȃt şi
pentru metabolismul calciului).
O deficienţă a Mg2+ generează mobilizarea calciului din oase, fiind
posibilă apariţia de calcificări anormale la nivelul aortei şi rinichiului. De
aceea este recomandat să se ia ȋn considerare nivelul calciului cȃnd se
evaluează nivelul magneziului. De aceea adesea hipocalcemia se tratează
prin administrarea de săruri de magneziu. În celulele
musculare Mg2+ acţionează ca antagonist de calciu.
Ionii de Mg2+ se absoarb în intestinul subţire şi sunt eliminaţi în
urină şi materii fecale, astfel homeostazia lui este reglată de absorbţia
intestinală şi de excreţia renală. De aceea niveluri anormale de magneziu
sunt întâlnite cel mai frecvent la pacienţii care suferă de boli care pot cauza
excreţia excesivă sau insuficientă a Mg2+ de către rinichi sau absorbţia
insuficientă la nivel intestinal.
Din punct de vedere clinic, deficitul de magneziu determină afecţiuni
neuromusculare (slăbiciune musculară, tremor, tetanie şi convulsii), iar la
nivelul cordului poate genera aritmii.
Necesarul de magneziu zilnic este cuprins între 300÷350 mg. Surse
bogate în magneziu sunt: cerealele, fasolea, soia, merele, banane, carnea,
diferite organe (ficat, rinichi, splină). Hipomagneziemia interferă cu efectele
hormonilor paratiroidieni cu aparitia hipocalcemiei. Simptomele de
deficienţă apar atunci cand nivelul Mg2+scade sub 0,50 mmol/L
Manifestările clinice ale hipomagneziemiei severe sunt: slăbiciune şi
crampe musculare, parestezii, tetanie, tremor, modificări EKG, reflex
osteotendinos hiperactiv, dezorientare şi confuzie.
Cea mai frecventă cauză a hipermagneziemiei este insuficienţa
renală. Simptomele creşterii nivelului Mg2+ seric sunt letargia, greaţa,
vărsăturile, paralizia, ataxia, ameţelile, confuzia. Un nivel critic crescut
cuprins între 10-15 mg/dL duce la deprimarea stării de conştienţă,
modificări EKG, paralizia mușchilor respiratori.
La nivelul de 30 mg/dL se instalează blocul atrioventricular total, iar
între 34÷40 mg/dL stopul cardiac. Principiile terapeutice sunt:
antagonizarea Mg2+ cu calciul, îndepărtarea Mg2+ din ser și eliminarea
surselor de aport alimentar. Tratamentul de elecţie este însă dializa.

2
2. Recoltare

Magneziu urinar
Recomandări pentru determinarea magneziului urinar se realizează
ȋn principal ȋn:
- investigarea statusului electrolitic; stabilirea cauzei unui nivel
seric anormal de magneziu;
- investigarea nefrolitiazei.
Recoltarea se realizează din urina din 24 ore: la ora 7 dimineaţa
pacientul urinează şi nu reţine această urină, apoi colectează ȋntr-un vas de
plastic toate emisiunile de urină pȃnă la ora 7 dimineaţa ȋn ziua următoare,
inclusiv; se omogenizează urina recoltată; se măsoară ȋntreaga cantitate, se
reţin 100 mL ȋn pahar de plastic de unică folosinţă pentru urină; nu se
folosesc conservanţi; ambele recipiente trebuie sa fie bine ȋnchise cu capac,
ele se păstrează la 2÷8 oC pȃnă ȋn momentul lucrului.
Recipientul de recoltare este un vas de plastic de 2÷3 L şi pahar de
plastic pentru urină (de unică folosinţă), pe care se notează cantitatea totală
de urină din 24 ore. Volumul de probă va fi toată urina din 24 ore, din care
se reţine 100 mL, care necesită o prelucrare ulterioară după recoltare prin
acidifiere la pH 3÷4 cu acid clorhidric 6 N.
Proba este stabilă 2 zile la temperatura camerei, 7 zile la 4÷8 °C, un
an la -20 °C.
Notă: Sunt inacceptabile probele care vin ȋn contact cu orice fel de
metal.

Magneziu seric
Recomandări pentru determinarea magneziului seric se realizează ȋn
principal ȋn:
- evaluarea funcţiei renale;
- iritabilitate neuromusculară;
- apariţia unei hipocalcemii neexplicate;
- diverse afecţiuni cardiace (insuficienţă cardiacă, hipertrofie
ventriculară stȃnga);
- tratament digitalic;
- monitorizarea pacienţilor care primesc tratament cu tiazide,
diuretice de ansă, aminoglicozide, ciclosporina şi alte
medicamente nefrotoxice;
- sindroame de malabsorbţie, abstinenţă de la alcool, nutriţie
parenterală.
Pregătirea pacientului se realizează astfel:

3
 - à jeun (pe nemȃncate, cel puţin 4 ore);
Recoltarea se face dimineaţa din sȃnge venos, ȋntr-un recipient de
recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fară gel separator, cu
următoarele recomandări:
- recoltarea se va efectua ȋn poziţie culcată, deoarece ȋn ortostatism
nivelul magneziului seric creşte cu 4%;
- se va evita staza venoasă cu garoul;
- nu se vor folosi mănuşi pudrate cu talc (conţin stearat de magneziu;
se spală mănuşile cu jet de apă, fară săpun sau detergenţi).
După recoltare, se separă serul prin centrifugare cȃt mai repede posibil (1÷2
ore). Se analizează imediat; dacă acest lucru nu este posibil, se stochează
serul la temperaturi cuprinse ȋntre 2÷8 °C sau se congelează (-18 °C).
Serul separat este stabil 2 zile la temperatura camerei; 7 zile la 4-8
°C; o lună la -20 °C.
Volumul de probă - minim 1 mL ser, iar cauzele posibile de
respingere a probei sunt de specimen hemolizat.

3. Valori critice
Valorile de referinţă sunt prezentate ȋn tabelul 1:
Tabelul 1
Valorile de referinţă a concentraţiilor de magneziu
Vârstă Valori (mg/dL)
Nou-născut 1,5-2,2
5 luni – 6 ani 1,7-2,3
6-12 ani 1,7-2,1
12-20 ani 1,7-2,2
Adult (2-60 ani) 1,6-2,6
6-90 ani 1,6-2,4
>90 ani 1,7-2,3

Valori critice - nivel scăzut < 1 mg/dL; nivel crescut > 4,7 mg/dL
Limita de detecţie - 0,10 mmol/L (0,243 mg/dL), pentru magneziu seric.
Limita de detecţie - 0,03 mmol/L (0,07 mg/dL), pentru magneziu urinar.
Notă: Factor de conversie: mmol/L ⋅ 2,43 = mg/dL; mEq/L ⋅ 0,5 = mmol/L;
mEq/L ⋅ 1,2 = mg/dL.

4. Metoda de analiză

4
I. Metoda complexonometrică

4.1. Principiul lucrării

Ionii de magneziu din proba cu pH 12 … 13 se titrează cu soluţie de
EDTA ȋn prezenţa amestecului indicator negru eriocrom T pȃnă la virajul
culorii roşu ȋn albastru.
4.2. Reactivi şi aparatură
- soluţie tampon NH 3 /NH 4 Cl.0
Soluţia se păstrează ȋn recipient de masă sticlă de capacitate 100 cm3
sau aproximativ, bine ȋnchis pentru a evita contactul soluţiei cu oxigenul din
aer.
- EDTA soluţie 0,01 M: ȋntr-un balon cotat de 1000 cm3 se dizolvă
3,7226 g sare disodică a acidului etilen-diamino-tetra-acetic
(Complexon III) uscată la 2 h la 80 oC, ȋn circa 900 cm3 de apă, se
aduce la semn cu apă şi se omogenizează.
Soluţia se păstrează ȋn recipient de masă plastic şi se verifică
concentraţia din timp ȋn timp cu 20 cm3 soluţie etalon de magneziu
diluată la 50 cm3 cu apă, conform pct. 4.2.2 b).

Concentraţia soluţiei de EDTA (c) este dată de formula:

c = (C 1 · V 1 ) / V 2
unde:
C 1 - concentraţia molară a soluţiei de magneziu (C = 0,01);
V 1 - volumul soluţiei etalon de magneziu folosiţi la titrare, ȋn cm3;
V 2 - volumul soluţiei de EDTA luat ȋn lucru, ȋn cm3.

- indicator: negru eriocrom T; se păstrează ȋn vase de culoare brună,

bine ȋnchise.
Aparatură - biuretă cu capacitate de 25 cm3 şi intervalul de gradaţie de 0,05
cm3.

4.3. Modul de lucru

Ȋntr-un vas conic de 250 cm3 se introduc cu o pipetă 25,0 cm3 probă.
Se adaugă 1 cm3 soluţie tampon NH 3 /NH 4 Cl (pȃnă la pH 12 … 13) şi 0,1 g

5
amestec indicator. Se agită soluţia şi se titrează imediat, cu soluţie de
EDTA, pȃnă la virajul culorii roşu ȋn albastru.
Interferenţe
Ȋn determinarea magneziului proba supusă analizei prin metoda
complexonometrică interferă aluminiul, bariul, plumbul, fierul, cobaltul,
cuprul, calciul, staniul şi zincul.
Interferenţa fierului (ȋn concentraţii de pȃnă la 30 mg/dm3) se
elimină prin adăugarea ȋn probă, ȋnainte de dozare, a 250 mg cianură de
sodiu sau a 1 … 3 cm3 de trietanolamină.
Atenţie! pH-ul probei de analizat trebuie să fie alcalin
Interferenţa fierului (ȋn concentraţii de pȃnă la 30 mg/L) se elimină
prin adăugarea ȋn probă, inainte de dozare, a 250 mg cianură de sodiu sau a
1 … 3 cm3 de trietanolamină.
Interferenţa cuprului, cobaltului şi zincului poate fi micşorată prin
adăugarea de cianură de sodiu.
Interferenţa aluminiului se reduce prin adăugarea de trietanolamină.
Dacă interferenţele nu pot fi eliminate se utilizează metoda
spectrometrică de absorbţie atomică.

Calcul
Conţinutul de magneziu se exprimă ȋn mg/L şi se calculează cu
formula:

Magneziu = (1000 · 0,2431 · V 1 · r) / V (mg/L)

unde:
0,2431 - cantitatea de magneziu, ȋn mg, corespunzătoare la 1 cm3 soluţie
EDTA 0,01 M;
V 1 - volumul de soluţie de EDTA folosit la titrare, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul;
V - volumul probei de apă luată pentru determinare, ȋn cm3.

II. Metoda colorimetrică

4.1.2. Principiul lucrării

6
 Magneziul formează cu galbenul de titan ȋn mediul alcalin şi ȋn
prezenţa unui coloid protector, un lac de culoare portocaliu-roşie.
Intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de magneziu din
probă şi se determină colorimetric la lungimea de undă de 545 nm.

4.2.2. Reactivi şi aparatură

Reactivii utilizaţi la determinare vor fi calitate p.a. sau de calitate
echivalentă, iar apa distilată, sau de puritate echivalentă.
- Clorhidrat de hidroxilamină, soluţie 5%;
- Clorură de calciu, soluţie: 0,3 g carbonat de calciu (CaCO 3 ) se
introduc ȋntr-un balon cotat de 100 cm3 şi se adaugă, cu picătura,
acid clorhidric 10% pȃnă la completa dizolvare a carbonatului.
Se completează apoi cu apă pȃnă la semn;
- Coloid protector soluţie: 1g amidon se dizolvă ȋn 5 cm3 apă rece
apoi se toarnă ȋncet şi amestecȃnd ȋn 70 cm3 apă la fierbere; se
răceşte, se adaugă 2,5 cm3 glicerină şi se aduce la 100 cm3 cu
apă;
- Galben de titan (C 28 H 19 O 6 N 5 S 4 Na 2 ) soluţie 0,05%;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 2 N;
- Soluţii etalon:
a) Soluţie etalon A: 8,1128 g sulfat de magneziu
(MgSO 4 ·7H 2 O) se introduce ȋntr-un balon cotat de 1000 cm3
şi se aduc cu apă pȃnă la semn.
1 cm3 soluţie etalon A conţine 0,8 mg Mg2+.
b) Soluţie etalon B: 2,5 cm3 soluţie etalon A se introduc ȋntr-un
balon cotat de 100 cm3 şi se completează cu apă pȃnă la
semn.
1 cm3 soluţie etalon B conţine 0,02 mg Mg2+;
- Trietanolamină, soluţie 10%.
4.3.2. Modul de lucru
Ȋntr-un balon cotat de 25 cm3 se introduc 10 cm3 apă de analizat, apoi
reactivii ȋn ordinea şi ȋn cantităţiile care urmează:
- 1 cm3 soluţie de clorură de calciu;
- 1 cm3 soluţie de clorhidrat de hidroxilamină;
- 1 cm3 soluţie de trietanolamină;

7
 - 2 cm3 soluţie de coloid protector;
- 5 cm3 soluţie de galben de titan;
- 5 cm3 soluţie de hidroxid de sodiu.
Se agită soluţia şi se lasă 15 minute pentru dezvoltarea culorii.
Intensitatea culorii soluţiei se măsoară la un spectrofotometru, ȋntr-o
cuvă cu grosimea stratului de 1 cm, la 545 nm, faţă de o probă martor
pregătită ȋn acelaşi mod, ȋnsă cu apă distilată ȋn locul probei de apă de
analizat.

Valoarea obţinută pentru extincţie se citeşte pe curba de etalonare şi se află

concentraţia de magneziu, ȋn mg.

Observaţie: Ȋn cazul ȋn care apa de analizat conţine peste 10 mg Mg2+/L, se

ia ȋn lucru un volum mai mic de 10 cm3 şi se completează cu apă distilată
pȃnă la 10 cm3.

Trasarea curbei de etalonare

Ȋn şase baloane cotate de cȃte 25 cm3, se introduc reactivii ȋn
ordinea şi cantităţile indicate ȋn tabelul de mai jos:

Soluţie etalon B, cm3 0 0,5 1 2 4 6

Apă distilată, cm3 10 9,5 9 8 6 4
Soluţie de CaCl 2 , cm3 1 1 1 1 1 1
Soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, cm3 1 1 1 1 1 1
Soluţie de trietanolamină, cm3 1 1 1 1 1 1
Soluţie de coloid protector, cm3 2 2 2 2 2 2
Soluţie de galben de titan, cm3 5 5 5 5 5 5
Soluţie de NaOH, cm3 5 5 5 5 5 5
Conţinut de Mg, mg 0 0,01 0,02 0,04 0,08 0,12

Ȋn continuare, se procedează ca la analizarea unei probe.

Se colorimetrează soluţiile faţă de soluţia zero care constituie soluţia
de referinţă, iar valorile obţinute se ȋnscriu pe o curbă ce reprezintă variaţia
extincţiei ȋn funcţie de concentraţia de magneziu, ȋn mg.

8
Calcul

Magneziu (Mg2+) = (c/V)·100 (mg Mg2+/L)

unde:
c - conţinutul de magneziu ȋn soluţia colorimetrică, citit pe curba de
etalonare, ȋn mg;
V - volumul de probă luat ȋn lucru, ȋn cm3.

III. Metoda spectrometrică de absorbţie atomică

4.1.3. Principiul lucrării

Magneziul se determină prin spectrometrie de absorbţie atomică ȋn flacără

reducătoare aer-acetilenă, măsurȃnd absorbţia unei probe la lungimea de
undă de 545 nm.

4.2.3. Reactivi şi aparatură

Reactivii utilizaţi la determinare vor fi de calitate p.a. sau de calitate
echivalentă, iar apa distilată, sau de puritate echivalentă.
- Acid azotic, soluţie 0,2%;
- Soluţii etalon:
c) Soluţie etalon A: 8,1128 g sulfat de magneziu
(MgSO 4 ·7H 2 O) se introduce ȋntr-un balon cotat de 1000 cm3
şi se aduc cu soluţie de acid azotic 0,2 % pȃnă la semn.
1 cm3 soluţie etalon A conţine 0,8 mg Mg2+.
d) Soluţie etalon B: 2,5 cm3 soluţie etalon A se introduc ȋntr-un
balon cotat de 100 cm3 şi se completează cu apă pȃnă la
semn.
1 cm3 soluţie etalon B conţine 0,02 mg Mg2+.

4.3.3. Modul de lucru

Ȋntr-un balon cotat de 25 cm3 se introduc 10 cm3 probă biologică, apoi acid
azotic până la semn.

9
 Valoarea obţinută pentru extincţie se citeşte pe curba de etalonare şi se află
concentraţia de magneziu, ȋn mg.

Observaţie: Ȋn cazul ȋn care proba biologică conţine peste 10 mg

Mg2+/dm3, se ia ȋn lucru un volum mai mic de 10 cm3 şi se completează cu
apă distilată pȃnă la 10 cm3.

Trasarea curbei de etalonare

Ȋn şase baloane cotate de cȃte 25 cm3, se introduc cantităţile indicate
ȋn tabelul de mai jos şi se completează până la semn cu soluţie de acid azotic
0,2%.

Soluţie etalon B, cm3 0 0,5 1 2 4 6

Conţinut de Mg, mg 0 0,01 0,02 0,04 0,08 0,12

Se măsoară absorbanţele probelor etalon. Din absorbanţele probelor

etalon se scade absorbanţa probei 0 (zero).
Se trasează curba de etalonare ȋnscriind pe abscisă concentraţii de
magneziu, ȋn miligrame pe litru, iar pe ordonată valorile absorbanţelor
corespunzătoare.
Curba de etalonare se verifică la fiecare serie de analize.

Calcul
Magneziu = (c · V 1 · r) / V (mg/L)

unde:
c - conţinutul de magneziu citit pe curba de etalonare, ȋn mg/dm3;
V 1 - volumul soluţiei pregatită pentru măsurarea absorbanţei, ȋn cm3; (V 1 =
25 cm3)
V- volumul probei luat ȋn lucru, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul.

4.4. Interpretarea rezultatelor

10
Magneziu seric
Limitele care detremină semne ale creşterii nivelului magneziului seric sunt:
- deprimarea activitatii neuromusculare, hipotensiune arterială (> 4÷6
mg/dL);
- deprimarea SNC (> 6÷8 mg/dL);
- greaţă, vărsături, flash-uri cutanate (> 6 mg/dL);
- hiporeflexie, somnolenţă (> 8mg/dL);
- comă (12÷17 mg/dL);
- modificări ECG (>10 mg/dL);
- bloc atrioventricular complet (30 mg/dL);
- stop cardiac (34÷40 mg/dL).

Valori crescute ale magneziului seric se pot datora următoarelor cauze:

- insuficienţă renală (acută şi cronică);
- stări de deshidratare
- hipotiroidism
- lupus eritematos
- mielom multiplu
- cauze iatrogene: antiacide cu magneziu, clisme cu magneziu, abuz
de laxative sau purgative, magneziu administrat ȋn eclampsie sau ȋn
caz de travaliu; intoxicaţie cu carbonat de litiu, salicilaţi, ingestia
accidentală a unor cantităţi mari de apă de mare.
- insuficienţă renală;
- deshidratare;
- comă diabetică ȋnainte de instituirea tratamentului;
- hipotiroidism.

Valori scăzute ale magneziului seric se pot datora următoarelor cauze:

- afecţiuni renale;
- afecţiuni gastrointestinale: malabsorbţie, pierdere anormală a
fluidelor gastrointestinale (boală Crohn, colită ulcerativă cronică,
carcinom de colon, vărsături, aspiraţie gastrică prelungită);
- administrări prelungite de diuretice şi antibiotice;
- tulburări de nutriţie (administrare prelungită de lichide fără conţinut
de magneziu; alcoolism cronic şi ciroză alcoolică (hepatică),
alimentaţie săracă în proteine şi calorii, înfometare);
- tulburări endocrine (hipertiroidism, hipoparatiroidism, diabet
zaharat);
- tulburări metabolice (lactaţie excesivă, tratamentul cu insulină a
comei diabetice, ultimul trimestru de sarcină)

11
 - alte cauze: pancreatită acută şi cronică, toxemia de sarcină sau
eclampsia, tumori osoase, transfuzia de sânge citratată, arsuri severe,
transpiraţie excesivă, hipotermie,deficienţă de fosfaţi, hipercalcemie;
- afecţiuni digestive: malabsorbţie sau pierderi exagerate de lichide pe
cale digestivă.

Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de medicamente:

- Creşteri: antiacide alcaline, amilorid, aminoglicozide, aspirina
(tratament prelungit), calcitriol, cefotaxim, felodipina, litiu,
medroxiprogesteron, progesteron, săruri de magneziu, tacrolimus,
triamteren.
- Scadări: albuterol, amfotericina B, azatioprina, cisplatin,
ciclosporina, contraceptive orale, digoxin, diuretice (acid etacrinic,
furosemid, tiazide), doxorubicin, gentamicina, haloperidol, gluconat
de calciu, neomicina, insulină (doze mari ȋn coma diabetică), laxative
(abuz cronic), pamidronat, pentamidina, prednisolon, tacrolimus,
teofilina, tobramicin, zalcitabin.

Magneziu urinar
Limite şi interferenţe:
- scăderea magneziului urinar sugerează deficit de magneziu, iar
dacă pierderea este de cauză renală, magneziul urinar este
crescut;
- alcoolemia ridicată determină creşterea magneziului urinar.
Prezenţa sȃngelui ȋn urină creşte magneziul urinar.

Creşterile se pot datora următoarelor cauze:

- sindrom Bartter;
- boli renale cu pierderi excesive de magneziu (glomerulonefrita
cronică, pielonefrita cronică, acidoza tubulară renală, faza
diuretică a necrozei tubulare acute, diureza postobstructivă);
- hiperaldosteronism;
- pacienţii cu transplant renal sub tratament imunosupresor.

Scăderile se pot datora următoarelor cauze:

- malabsorbţie;
- alcoolism cronic (malnutriţie);
- tratament parenteral ȋndelungat;
- insuficienţă renală cronică;
- hipoparatiroidism;

12
 - boala Addison.
Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de medicamente:
- Creşteri: acetazolamida, amfotericina B, calcitonina, cisplatin,
ciclosporina A, corticosteroizi, diuretice tiazidice, gentamicina,
hidroxid de magneziu, litiu, triamteren.
- Scăderi: amilorid, contraceptive orale, extract de paratiroidă,
gluconat de calciu, interferon alfa-2a.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Effects of the Drugs on Laboratory Tests. In A

Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 1246.
2. Frances Fischbach. Pulmonary Function, ANGs and Electrolyte
Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott
Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 1001-1003.
3. Jacques Wallach. Analizele de sange. In Interpretarea testelor de
diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed. 2001, 91-93.
4. Jacques Wallach. Valori critice. In Interpretarea testelor de
diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001, 44-
46.
5. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate
2015. Ref Type: Catalog.
6. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and
Interpretive Guide. Magnesium, Serum. www.labcorp.com . 2010.
Ref Type: Internet Communication.
7. Lothar Thomas. Trace Elements. In Clinical Laboratory Diagnostics-
Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books
Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998;
339-340.

13
 DETERMINAREA CLORURILOR SI A CLORULUI REZIDUAL
DIN SUCUL GASTIRC

Generalităţi

Sucul gastric este secretat de stomac, fiind compus din apa, acid clorhidric, pepsina
(enzima), mucus si minerale. El contribuie la digestia alimentelor din stomac, in special a acelora
care contin proteine: carne, lapte, oua. In mod normal sucul gastric este acid. In gastrita cronica, in
unele anemii, in tumorile stomacului, aciditatea gastrica este scazuta sau chiar lipseste.
Scaderea aciditatii gastrice se intalneste si la unele persoane sanatoase, mai ales dupa
varsta de 60 ani, dupa un stres care poate opri secretia gastrica etc. Un suc gastric cu aciditate
scazuta nu mai are capacitatea de a digera suficient alimentele care contin proteine. Acestea trecand
nedigerate in intestin produc o serie de tulburari digestive (enterocolita).
Cresterea aciditatii gastrice (hiperaciditate) care se intalneste in gastritele acute, in ulcerul
gastroduodenal precum si la persoanele sanatoase, dupa o alimentatie care excita secretia acida a
stomacului (condimente, alcool, cafea) sau dupa tutun.
Clorul este principalul anion al lichidelor extracelulare. Clorul este bine reprezentat si in alte
fluide ale organismului: suc gastric, pancreatic si intestinal, sudoare. Clorul este responsabil,
impreuna cu sodiul, de volumul lichidului extracelular si de osmolaritatea plasmatica. Clorul
mentine integritatea celulara prin influenta sa asupra presiunii osmotice si a echilibrului acido-
bazic. Ionul de clor urmeaza sodiul in deplasarile sale aproape pasiv, in scopul mentinerii
neutralitatii electrice, fiind supus influentelor exercitate de mecanismele neuroumorale responsabile
de homeostazia volumului. Astfel comportamentul concentratiei clorului plasmatic este in general
paralel cu cel al sodiului.
De asemenea, clorul contribuie la economisirea bicarbonatului in tubul distal renal. Prezenta
unei cantitati reduse de clor in fluidul tubular distal determina corectarea dezechilibrului indus de
reabsorbtia activa de Na+ exclusiv prin secretie de H+, ceea ce impune o intensificare a disocierii
H 2 CO 3 in H+ si HCO 3 -, cu trecerea anionului bicarbonat in sange intr-o proportie sporita si aparitia
alcalozei. La polul opus alcalozei hipocloremice se situeaza acidoza hipercloremica, in care o
cantitate crescuta de clor la nivelul tubului distal freneaza reabsorbtia de bicarbonat si secretia de
H+. Clorul si bicarbonatul au tendinta de a actiona invers in cadrul coloanei anionilor serici,
variatiile lor proportionale si succesive tinzand sa compenseze modificarile electrice antrenate de
variatia izolata, in plus sau in minus, a unuia dintre cei doi ioni.
Exista doua tipuri de alcaloza metabolica hipocloremica:
 tipul sensibil la clor, care poate fi corectat prin administrarea de clor, apare in asociere cu
varsaturile si administrarea de diuretice, ca urmare a pierderii de ioni de H+ si Cl―, cat si la
pacientii cu adenoame viloase, ca urmare a pierderii de clor prin scaun;
 tipul rezistent la clor, necorectabil prin administrarea de clor, intalnit la pacientii cu
hiperaldosteronism primar sau secundar, ca si la cei cu sindrom Bartter; excretia clorului
urinar este echivalenta cu aportul5.
Recomandari pentru determinarea clorului seric – investigarea echilibrului hidro-
electrolitic si acido-bazic in anumite conditii patologice: insuficienta suprarenaliana,
mucoviscidoza, sindroame diareice si varsaturi, diabet zaharat, hiperparatiroidism, abuzuri de
medicamente.
In conditii de urgenta este cel mai putin important electrolit, dar este in mod special
important in corectarea alcalozei hipopotasemice.
 Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial; se va evita recoltarea din bratul
prin care pacientul a primit recent o transfuzie.
 Specimen recoltat – sange venos.

1
  Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator.
 Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare intr-un interval de 2
ore.
 Volum proba – minim 0.5 mL ser.
 Cauze de respingere a probei – specimen hemolizat.
 Stabilitate proba – serul pastrat in tuburi inchise ermetic este stabil: 7 zile la temperatura
camerei; 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C.
Valori de referinta

Varsta Valori (mmol/L)

Prematur 97-122
1zi-4 saptamani 95-116
1- 12 luni 93-112
Copii >1an 96-111
Adulti <= 65 ani 98-106
Adulti >65 ani 94-110

Factor de conversie: mmol/L = mEq/L.

Limita de detectie – 1.5 mmol/L.
Valori critice – nivel scazut: <70 mmol/L; nivel crescut: >120 mmol/L

Recoltare

Pentru aprecierea gradului de aciditate se dozeaza acidul clorhidric din sucul gastric. Sucul
gastric se recolteaza dimineata cu un tub subtire de cauciuc care se inchide de catre bolnav pana
ajunge in stomac (tubaj gastric).
Bolnavul nu trebuie sa inghita saliva caci se amesteca cu sucul gastric iar daca are o proteza
dentara mobila trebuie sa o scoata (pericol de inecare). De asemenea, inainte de recoltare nu se vor
consuma alimente, bauturi, nu se vor lua medicamente si nu se va fuma.
Pentru a se produce o secretie gastrica mai mare i se da persoanei respective sa bea o solutie
slaba de alcool sau i se injecteaza o fiola de histamina. Sucul gastric se extrage cu o seringa si se
analizeaza.

METODA ARGENTOMETRICĂ

1.1. Determinarea clourilor

Principiul metodei
Clorurile în soluţie adusă la pH=8.3 sunt precipitate prin titrare cu soluţie de azotat de argint
în prezenţa cromatului de potasiu ca indicator. Punctul final al titrării este dat de apariţia
precipitatului galben-cărămiziu de cromat de argint.

Reactivi
Reactivii folosiţi trebuie să fie de calitate chimic pur (c.p.) sau de calitate echivalentă.
Pentru prepararea soluţiilor de reactvi şi diluarea probelor se va folosi apă bidistilată în
aparat complet din sticlă.
• Fenolftaleină, soluţie alcoolică 1%;
• Acid sulfuric 0.2N;

2
 • Hidroxid de sodiu, soluţie 0.2N;
• Cromat de potasiu: 50g cromat de potasiu se dizolvă în puţină apă bidistilată şi apoi se
adaugă soluţie de azotat de argint până la formarea unui precipitat roşu, slab. Soluţia se
lasă să se decnateze timp de 12 ore şi apoi se filtrează. Filtratul se diluează la 1000 cm3
cu apă bidistilată.
• Azotat de argint, soluţie 0.0282N: se cântăresc 4.7905g±0.0002g azotat de argint în
prealabil mojarat şi uscat la 40°C şi se dizolvă apa bidistilată; soluţia obţinută se
diluează cu apă bidistilată la 1000cm3, într-un balon cotat. Factorul soluţiei se determină
faţă de soluţia de clorură de sodiu 0.0282N. Soluţia se păstrează într-o sticlă brună cu
dop rodat.
• Clorură de sodiu, soluţie 0.0282N: câteva grame de clorură de sodiu se mojarează şi apoi
se usucă 2 ore la circa 105°C; 1.6481g±0.0002g clorură de sodiu uscată se dizolvă şi
apoi se aduce la 1000 cm3 cu apă bidistilată, într-un balon cotat. 1cm3 soluţie de clorură
de sodiu 0.0282N conţine 1mg Cl-.

Modul de lucru
Într-un vas Erlenmayer de 250cm3 se introduc 100cm3 de solutie de analizat. Se adaugă 2
sau 3 picături de soluţie de fenolftaleină şi se aduce la punctul de viraj al indicatorului cu acid
sulfuric sau cu hidroxid de sodiu. După aceea se adaugă 1cm3 soluţie de cromat de potasiu şi
agitând continuu se titrează cu soluţie de azotat de argint până la apariţia culorii galbene-cărămizii.
În paralel, se efectuează o probă martor, folosind aceleaşi cantităţi de reactivi ca la probă,
însă cu apă bidistilată în locul solutiei de analizat.
În cazul când proba titrată are un conţinut de cloruri mai mare de 20mg Cl- se repetă
determinarea de mai sus luând un volum mai mic de probă, care se diluează corespunzător cu apă
bidistilată.

Prelucrarea rezultatelor

35.453 ⋅ N ⋅ (V − V1 ) ⋅ V3
( )
Cloruri Cl − =
V2 ⋅ V4
[
⋅ 1000 mg/dm 3 ]
în care:
35.453 – cantitatea de cloruri (Cl-), în mg, corespunzătoare la 1 cm3 soluţie de azotat de
argint, N;
N – normalitatea soluţiei de azotat de argint folosită la titrare,
V – volumul soluţiei de azot de argint folosit la titrarea probei de suc gastirc, în cm3;
V 1 – volumul soluţiei de azotat de argint folosit la titrarea probei martor, în cm3;
V 2 – volumul iniţial al probei de solutie luat pentru determinare în cm3;
V 3 – volumul probei de apă eventual diluată, în cm3;
V 4 – volumul părţii alicote din proba de proba eventual diluată, în cm3.
Deoarece 1cm3 soluţie de azotat de argint 0.0282N corespunde la 1mgCl- în cazul când factorul
soluţiei este 1,0000 formula de calcul este următoarea:

( ) (VV− V⋅ V) ⋅ V
Cloruri Cl − = 1 3
⋅ 1000 [mg/dm ]
3

2 4

METODA CU METILORANJ

3
1.2. Determinarea clorului rezidual

Lucrarea urmăreşte stabilirea metodelor de determinare a clorului residual din sucul gastric.

Prin clor rezidual se întelege:

• Clorul rezidual liber, sub formă de clor elementar (Cl 2 ), acid hipocloros (HOCl) sau
hipoclorit (ClO-);
• Clorul rezidual legat sub formă de cloramine sau dicloramine;
• Clorul rezidual total, format din clorul rezidual liber şi clorul rezidual legat.

Determinarea clorului rezidual se poate face prin două metode:

1) Metoda cu ortolidină-arsenit,
2) Metoda cu metiloranj
În caz de litigiu se va folosi metoda cu ortolidină-arsenit. Sensibilitatea ambelor metode este de
0.01 mg Cl 2 /dm3. La efectuarea analizei se vor folosi reactivi de calitate p.a. sau de calitate
echivalentă şi apă bidistilată în mediu alcalin.

Principiul metodei

În mediu acid, metiloranjul este decolorat de către clorul rezidual. Decolorarea este
proporţională cu conţinutul de clor rezidual şi se apreciază colorimetric. Determinarea se efectuează
la temperatura de 20°C.
Reactivi

• Acid sulfuric d=1.84, diluat 1+3

• Bromura de potasiu, soluţie 1%;
• Metioranj, soluţii
a) Soluţie A: 0.46g metiloranj se introduc într-un balon cotat de 1000cm3 şi se completează
până la aemn cu apă.
1cm3 soluţie A corespunde la 0.1mgCl 2
b) Soluţie B: 100cm3 soluţie A de metiloranj se aduc într-un balon cotat de 1000cm3 şi se
completează până la semn cu apă.
1cm3 soluţie B corespunde la 0.1mgCl 2

Modul de lucru

100 cm3 apă de analizat se introduc într-un vas Erlenmeyer de 200 cm3. Se adaugă 0.5cm3
acid sulfuric şi se titrează cu soluţie B de metiloranj, picătură cu picătură, până la virarea culorii în
roz, care persistă 2 minute.
Volumul soluţiei de metiloranj utilizat la titrare, în cm3, se notează cu V 1 .
În continuare, în vasul Erlenmeyer se adaugă 0.5 cm3 soluţie de bromură de potasiu. În cazul
când soluţia se decolorează, aceasta se titrează cu soluţie de metiloranj până la o nouă apariţie a
culorii roz, care persistă timp de 2 minute.
Volumul soluţiei de metioranj utilizat la această titrare, în cm3, se notează cu V 2 .
În paralel cu proba de analizat se va efectua în mod identic o probă martor cu apă bidistilată
în locul probei de apă; în cazul unui consum de soluţie de metiloranj se va ţine seama de acest lucru
în calcul, scăzându-se volumul soluţiei de metiloranj consumat din volumele V 1 şi V 2 .

Calcul

4
 Conţinutul de clor rezidual liber, clor rezidual legat şi clor rezidual total, în mg Cl 2 /dm3, se
calculează cu ajutorul formulelor:
Clor rezidual liber = 1
V ⋅ 0.01
V
[
⋅1000 mg/dm 3 ]
Clor rezidual legat = 2
V ⋅ 0.01
V
[
⋅1000 mg/dm 3 ]
Clor rezidual total = 1
V ⋅ 0.01
V
V ⋅ 0.01
⋅1000 + 2
V
[
⋅1000 mg/dm 3 ]
în care:
V 1 – volumul soluţiei B de metiloranj, utilizat la prima titrare, în cm3;
V 2 – volumul soluţiei B de metiloranj, utilizat la a doua titrare, în cm3
0.01 – cantitatea de clor (Cl 2 ), în mg, corespunzătoare la 1cm3 soluţie B de metiloranj,
V – volumul probei luată în analiză, în cm3.

Aciditatea sucului gastric se exprima in grame de acid clorhidric la litru (g HCl ‰) sau in
ml hidroxid de sodiu normal pe 10 (ml NaOH N: 10). Acidul din stomac poate fi in stare libera sau
legat de alte substante.

Interpretarea rezultatelor

Stările associate cu creșterea concentrației de Cl- sunt asociate cu:

- Deshidratare;
- Hiperventilație cronică cu acidoză respiratorie;
- Acidoză metabolică cu diaree prelungită;
- Hiperparatiroidism;
- Acidoză tubulară renală;
- Diabet insipid;
- Intoxicație cu salicilații;
- Administrare de clorură de amoniu;
- Traumatism cranio-cerebral cu afectare hipotalamică;
- Eclampsie;
- Ureterosigmoidostomie.
O scădere a concentrației de clor poate fi provocată de:
- Intoxicație cu apă;
- Vărsături incoercibile sau aspirație gastrică cu alcaloză hipocloremică
hipopotasemică;
- Diuretice;
- Hiperaldosteronism;
- Sindrom Cushing;
- Tumori producătoare de ACTH – în prezența alcalozei metabolice;
- Sindrom lapte-alcaline;
- Sindrom Bartter;
- Arsuri;
- Insuficiență cardiacă congestivă;
- Sindromul secreției inadectave de ADH;
- Boala Addison;

5
 - Nefrite cu pierdere de sare;
- Alcaloza metabolică;
- Hipercapnie cronică datorată insuficienței respiratorii;
- Porfirie acută intermitentă.

Limite și interferențe

Administrările i.v. excesive de soluții saline determină creșteri ale clorului seric.

Medicamente

Creșteri: acetazolamida, acetilcisteina, aspirina, cannabis, carbamazepin, cefotaxim,

colestiramina, corticosteroizi, ciclosporina, diazoxid, etretinat, hidroclorotiazidă, litiu, metildopa,
metiltestosteron, neostigmin, răsini schimbătoare de ioni, săruri de clor, triamteren.
Scăderi: acid ascorbic, allopurinol, amilorid, bicarbonat, bumetanid, cefotaxim,
clorpropamida, corticosteroizi, etretinat, furosemid, hidroclorotiazid, laxative, manitol, triamteren,
trimetoprim.

6
METODA ARGENTOMETRICĂ
 METODA CU METILORANJ

Proba
Martor
 DETERMINAREA POTENŢIOMETRICĂ A
pH-ULUI DIN SOLUŢII SIMULATE DE
FLUID INTESTINAL

Scopul lucrǎrii este de a prezenta aplicaţiile metodei potenţiometrice în

determinări directe de pH, utilizând electrodul cu membrană de sticlă ca electrod
indicator al ionilor hidroniu.

1. Generalităţi
Organismul uman ȋşi păstrează pH-ul in jurul valorii generale de
7,35÷7,45, iar abaterea de la aceşti indici anunţă instalarea unor afecţiuni. Ȋn
cazul ȋn care pH-ul sȃngelui scade cu mult sub 6,8 sau peste 7,8, celulele
ȋncetează să mai funcţioneze, iar pacientul ȋşi pierde funcţiile vitale. Un pH
ideal al sȃngelui este de 7,4, aşadar este mai alcalin decȃt acid.
Pe de alta parte, pH-ul tractului digestiv uman variază destul de mult.
Cel al salivei este cuprins de regulă ȋntre 6,5 şi 7,5. La nivelul orificiului
stomacal, pH-ul scade la valorile de 4,0÷6,5, fiind mai acid pentru faza de
predigestie.
Apoi, secreţia de acid clorhidric şi pepsina reduce nivelul pH-ului
pȃnă la valorile de 1,5÷4,0. După aceea alimentele sunt amestecate cu
sucurile gastrice şi intră ȋn intestinul subţire, unde pH-ul se schimbă la
7,0÷8,5. Ȋn acest punct, are loc absorbţia de nutrienţi şi eliminarea
reziduurilor prin colon (al cărui pH este de 4,0÷7,0).
Pentru a digera mâncarea și a omorî bacteriile și virusurile introduse
odată cu aceasta, interiorul stomacului nostru are un pH acid. În interiorul
stomacului pH-ul se menține în jurul valorii de 4. Când consumăm alimente
sau bem apă, pH-ul din interiorul stomacului crește. În acest moment,
mecanismele de tip feedback din stomac sesizează această schimbare și
comandă celulelor din pereții stomacului să secrete acid gastric pentru a
reduce valoarea pH-ului înapoi la 4, și astfel pH-ul stomacului redevine
acid.
Ingredientele din celulele stomacului care ajută la producția de acid
clorhidric (HCl) sunt dioxidul de carbon (CO 2 ), apa (H 2 O) și clorura de
sodiu (NaCl) sau clorura de potasiu (KCl).
Reacțiile chimice care au loc sunt:
NaCl + H 2 O + CO 2 → HCl + NaHCO 3
sau
 KCl + H 2 O + CO 2 → HCl + KHCO 3
După cum se observă, din procesul de fabricare a acidului
clorhidric rezultă și două produse secundare și anume bicarbonatul de
sodiu (NaHCO 3 ) și bicarbonatul de potasiu (KHCO 3 ) care intră la rândul lor
în circulația sanguină. Aceşti bicarbonaţi sunt tampoanele alcaline care
neutralizează excesul de acid din sânge, ele dizolvă și transformă reziduurile
acide solide în formă lichidă. Prin neutralizarea reziduurilor acide solide se
eliberează mai mult dioxid de carbon, care este transportat la plămâni. Pe
măsură ce organismul îmbătrânește, aceste tampoane alcaline se diminuează
și astfel apare fenomenul de acidoză.
Acidoza este fenomenul natural ce apare pe măsură ce în corpul
nostru se acumulează tot mai multe reziduuri acide. Atunci când pH-ului
stomacului devine mai mare de 4, stomacul știe ce să facă ca să îl scadă, şi
produce acid. Totuși, dacă pH-ul scade sub 4, indiferent de cauze, stomacul
nu mai are ce să facă și are nevoie de ajutor din exterior. În acest caz, acidul
clorhidric nu mai este produs de pereții stomacului, deci nu se mai
adaugă tampoane alcaline circulației sanguine.
Încă un exemplu în care un organ produce acid pentru a putea
produce alcalinitate este pancreasul. După ce mâncarea este digerată în
stomac, ajunge în intestinul subțire, iar în acest moment mâncarea este atât
de acidă încât ar putea găuri peretele intestinului. Pancreasul, pentru a evita
această problemă produce o secreție alcalină (sucul pancreatic). Acest suc
pancreatic este bicarbonat de sodiu, care se combină cu mâncarea acidă ce
ajunge în intestin din stomac. Conform ecuației chimice de mai sus, pentru a
se produce bicarbonat (alcalin), pancreasul este nevoit să producă acid
clorhidric, care este eliberat în circulația sanguină.
De exemplu, după o masă copioasă, apare o stare de somnolență – nu
în timpul mesei sau când mâncarea este digerată în stomac, ci atunci când
mâncarea digerată iese din stomac în intestinul subțire. Atunci este timpul
când acidul clorhidric intră în sânge. Acidul clorhidric este principalul
element al antihistaminazei, astfel apare starea de somnolență.
Produsele alcaline sau acide generate de organism trebuie să aibă o
proporție egală și opusă, deci nu există un câștig net. Echilibrul alcalin/acid
general al organismului poate fi modificat prin aport exterior de alimente și
apă.

Principiul de funcţionare a electrodului de sticlă

Electrodul cu membrană de sticlă funcţionează pe baza echilibrului
proceselor de schimb ionic stabilite la interfaţa membrană/soluţie.
Electrodul cu membrană de sticlă a fost primul (şi mult timp, singurul)

2
electrod cu membrană, fiind adoptat în practica de laborator după 1930, şi
denumit pe scurt "electrod de sticlă".
Membrana de sticlă este higroscopică. Hidratarea se realizează prin
menţinerea timp îndelungat (1÷2 zile) a membranei în contact cu o soluţie
apoasă slab acidă, rezultând astfel pe suprafaţa membranei un strat
superficial puternic hidratat. Simultan, o parte din ionii de sodiu din stratul
superficial vor fi substituiţi cu ioni de hidrogen, proveniţi din soluţie, printr-
un proces de schimb ionic:
-SiO-)Na+ St + H+ Sol ⇄ -SiO-)H+ St + Na+ Sol (1a )
Constanta de echilibru a acestui proces este atât de mare încât practic
suprafaţa membranei de sticlă constă dintr-un gel de acid silicic. Grosimea
acestui strat este de ordinul 10-4 mm. În interiorul membranei structura
sticlei nu se modifică în urma contactului cu soluţia.
Atunci când membrana de sticlă se imersează într-o soluţie, la
nivelul celor două interfeţe membrană/soluţie au loc procese de schimb
ionic, care pot fi exprimate prin echilibrele:
-SiO-)H+ St + X- Sol ⇄ -SiO-) St + H+ Sol + X- Sol (1b)
Procesul de mai sus determină apariţia unui exces de grupări
anionice pe fiecare faţă a membranei, deci a unor sarcini negative.
Cantitatea de electricitate astfel acumulată depinde de concentraţia ionilor
de hidrogen în soluţie. Cu cât aceasta este mai mică, cu atât va fi mai mare
numărul de grupări negative în stratul superficial al membranei.

Măsurarea pH-ului cu ajutorul pH-metrului

Măsurarea pH-ului unei soluţii, utilizând ca electrod indicator
electrodul cu membrană de sticlă, se realizează cu ajutorul instrumentelor
numite pH-metre. Aceste instrumente sunt milivoltmetre de mare precizie
(precizie de cel puţin ± 0,001 V), a căror scală este gradată în unităţi de pH,
ca urmare a corelaţiei liniare dintre pH şi T.E.M. a celulei:

pH indicat = a + bε cel (1)

a şi b sunt parametri reglabili ai pH-metrului.
Funcţia de etalonare a electrodului cu membrană de sticlă este de
tipul , ε cel = k + SpH , şi se rescrie în forma:

pH proba = a' +b' ε cel (2)

în care a’ = -k / S şi b’ = 1/ S sunt parametrii celulei cu electrod de sticlă.

3
 Etalonarea pH-metrului presupune reglarea mărimilor a şi b astfel
încât să fie îndeplinite condiţiile: a = a’ şi b = b’. În acest scop se utilizează
două soluţii standard de pH.
Prima soluţie standard se alege astfel încât pH-ul său să fie cât mai
apropiat de pH-ul soluţiei interne a electrodului de sticlă. Se reglează
parametrul a până când valoarea indicată de instrument este pH-ul soluţiei
standard (reglaj de asimetrie).
Corectarea parametrului b se face în raport cu o a doua soluţie
standard de pH (reglaj de pantă).
După etalonare se poate efectua determinarea rapidă şi precisă a pH-
ului unui mare număr de probe făra a fi necesară recalibrarea frecventă a
pH-metrului. Totuşi, datorită modificării lente în timp a unor parametri, cum
ar fi potenţialul de asimetrie, este recomandabil să se verifice zilnic
instrumentul cu ajutorul unor soluţii etalon şi să se repete, la nevoie,
etalonarea.

2. Recoltare
Determinările de pH se efectuează din diferite probe biologice
recoltate. O probă biologică = fluide biologice (sânge, urină, LCR (lichid
cerebro-spinal), lichid amniotic, aspirate), colectate evitând riscul
contaminării.
De asemenea, se poate măsura pH-ul patului lacrimal de la sprafață
ochiului. Acesta trebuie să fie în jurul valorii 5,5. O scădere a pH-ului
patului lacrimal duce la cataractă. Cataracta este rașchetarea suprafeței
corneei de către aciditatea patului lacrimal. Valoarea pH-ului stomacal se
determină mai rar, ȋntrucât necesită realizarea unei biopsi, iar aciditatea
crescută a lichidului stomacal afectează peretele stomacal putând fi ușor
depistată la ecografia abdominală. În cazul unor intervenții chirurgicale se
mai poate face determinare de pH în timpul intervenției pentru a se strabili
anumite măsuri care ar trebui luate.
Metodele de recoltare sunt ȋmpărţite ȋn tehnici de intubaţie şi metode
fără tub.
Determinarea pH- ului din urină:
Aportul de lichide în timpul recoltării trebuie să fie normal (cu
excepţia cazurilor când medicul curant face recomandări specifice în acest
sens). În unele cazuri se recomandă întreruperea medicaţiei care poate
induce interferenţe, cu cel puţin 12 ore (de preferat 48÷72 ore) înaintea
începerii recoltării. Unele alimente pot influenţa anumiţi compuşi chimici,

4
astfel că uneori, la sfatul medicului, pacientul trebuie să ţină o anumită dietă
înaintea acestei analize.
Cu alte cuvinte, timp de trei zile ȋnainte de practicarea analizei, se
evită ingerarea de aspirină ȋn doze mari, sau alte antiinflamatoare: vitamina
C (pot să rezulte fals pozitive), preparate din fier administrat oral, carne
roşie, pui, peşte, precum şi alte fructe şi legume ca: hrean, castraveţi,
conopidă.
Determinarea pH- ului sanguin se poate face prin două metode;
- direct, utilizind probe de sȃnge analizate la pH- metru;
- indirect, prin ecuaţia Henderson - Hasselbach
Testarea nivelului propriu de pH al organismului se poate realiza ȋn
mod regulat, folosind o hȃrtie de turnesol ȋn salivă sau urină, la prima oră a
dimineţii, fără să fi consumat ȋnainte mȃncare sau apă.

3. Valori critice
Abaterea pH-ului de la valorile normale ale acestui indicator anunţă
instalarea unor afecţiuni. Ȋn cazul ȋn care pH-ul sȃngelui scade cu mult sub
6,8 sau peste 7,8, celulele ȋncetează să mai funcţioneze, iar pacientul ȋşi
pierde funcţiile vitale. Un pH ideal al sȃngelui este de 7,4, aşadar este mai
alcalin decȃt acid.

Valori normale :
pH arterial = 7, 35÷7, 45
pH venos = 7, 31÷7, 41

Pe de alta parte, pH-ul tractului digestiv uman variază destul de

mult. Cel al salivei este cuprins de regulă ȋntre 6,5 şi 7,5. La nivelul
orificiului stomacal, pH-ul scade la valorile de 4,0÷6,5, fiind mai acid
pentru faza de predigestie.

4. Metoda de analiză

4.1. Principiul lucrării

Metodele potenţiometrice de analiză sunt metode electrochimice
bazate pe determinarea tensiunii electromotoare a unei celule electrochimice
(T.E.M.) în condiţii de echilibru, adică la o valoare practic nulă a curentului
electric prin celulă.
Determinarea potenţiometrică a pH-ului presupune utilizarea unor
electrozi indicatori ai concentraţiei ionilor de hidroniu (senzori de pH).

5
Aceşti senzori se caracterizeză prin faptul că în anumite condiţii prezintă un
potenţial de electrod care se corelează liniar cu pH-ul soluţiei cu care se află
în contact. Printre senzorii potenţiometrici pentru determinarea pH-ului se
numără: electrodul cu membrană de sticlă; electrodul de hidrogen;
electrodul de chinhidronă; electrodul de stibiu.
Principiul metodei este de a prezenta aplicaţiile metodei
potenţiometrice în determinări directe de pH, utilizând electrodul cu
membrană de sticlă ca electrod indicator al ionilor hidroniu.

4.2. Reactivi şi aparatură

- KH 2 PO 4
- NaOH 0,2M
- soluţie simulată de fluid intestinal
- sucuri acide, ceaiuri din comerţ
- pH metru
- hȃrtie indicatoare de pH

4.3. Modul de lucru

1. Se pregătesc cele două soluţii standard de pH necesare pentru calibrarea
pH-metrului.
Se dizolvă 6,8 g KH 2 PO 4 ȋn 250 mL apă distilată şi apoi se adaugă 190
mL NaOH 0,2 M. Se omogenizează amestecul şi se mai adaugă 400 mL
apă distilată, se ajustează pH-ul soluţiei rezultate cu NaOH 0,2 M pȃna
la pH 7,4 ± 0,1. La final soluţia se aduce la semn la balon cotat de 1000
mL, (soluţie simulată de fluid intestinal).
Se poate prepara şi a doua soluţie standard de pH 4± 0,1 corespunzătoare
pH-ului din stomac.
2. Electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă se spală cu apă distilată,
evitând atingerea membranei de sticlă cu vârful pisetei. Se usucă prin
tamponare cu hârtia de filtru şi se introduc în paharul care conţine primul
standard de pH.
ATENŢIE! Se solicită atenţie deosebită în manevrarea electrozilor!
Electrozii nu se răstoarnă şi nu se deplasează de la masa de lucru!

6
3. După stabilizarea indicaţiei pH-metrului se ajustează valoarea indicată la
valoarea de pH corespunzătoare altui standard utilizat.
4. Pentru determinarea pH-ului unei probe necunoscute electrozii se spală
cu apă distilată, se usucă prin tamponare cu hârtia de filtru şi se introduc
în paharul care conţine proba.
5. După stabilizarea indicaţiei se citeşte valoarea pH-ului afişată pe ecranul
pH-metrului.
În Tabelul 1 sunt indicate o serie de substanţe standard de pH şi
concentraţiile molale (M) ale soluţiilor ce trebuie preparate în mod riguros,
astfel ca pH-ul acestora să aibă valoarea indicată în tabel.
Tabelul 1
Standarde de pH, conform NIST
(National Institute of Standards and Technology)
Nr. crt. Substanţa Concentraţia, M pH S la 25°C
(mol solut/ kg H 2 O)
1 Tartrat acid de potasiu sol. saturată 3,557
(C 4 H 5 O 6 K)
2 Citrat biacid de potasiu 0,05 3,776
(C 6 H 7 O 7 K)
3 Ftalat acid de potasiu 0,05 4,008
(C 8 H 5 O 4 K)
4 KH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 0,025 + 0,025 6,865
5 KH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 0,008695 +0,03043 7,413
6 Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O 0,01 9,180
7 NaHCO 3 /Na 2 CO 3 0,025 + 0,025 10,012

O atenţie specială trebuie acordată temperaturii de lucru. Este indicat

ca temperatura probei să fie egală cu cea a soluţiilor etalon. În plus, trebuie
să se ţină seama de faptul că pH-ul unei soluţii standard este uşor dependent
de temperatură, abaterile fiind tabelate în lucrări de specialitate. Dacă există
diferenţe mari între temperatura probei şi cea a soluţiilor standard, se poate
recurge la corecţii, efectuate cu ajutorul unor reglaje speciale, cu care este
prevăzut pH-metrul.

4.4. Interpretarea rezultatelor

Ȋn general, pH-ul este scăzut ȋn acidemii prin creşterea producţiei de
acid şi este crescut ȋn alkalemii prin pierderi exagerate de acid.
Dioxidul de carbon (CO 2 ) este un compus acid, iar ionul bicarbonat
(𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻3−) este o bază. Ȋn interpretarea dezechilibrelor acido-bazice se va

7
urmări evoluţia acestor parametri. Modificarea ȋn acelaşi sens cu echilibrul
acido-bazic arată cauza primară a dezechilibrului, iar modificări de sens
opus arată tendinţa de compensare a acestuia.
Primul pas este analizarea pH-ului şi stabilirea normalităţii sau
sensului devierii acestuia (alcaloză sau acidoză sau valoare normală).
Valoarea normală a pH-ului nu înseamnă neapărat absenţa unui dezechilibru
acido-bazic. pH-ul este direct proporţional cu ionii 𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻− 3 (creşterea
anormală a bicarbonatului determină creşterea pH-ului) şi invers
proporţional cu CO 2 (creşterea anormală a CO 2 determină scăderea pH-
ului).
Dezechilibrele care apar la nivelul pH-ului organismului pot conduce la
dezvoltarea mai multor probleme de sănătate, printre care se numără:
- tulburările hormonale;
- afecţiunile cardiovasculare;
- pierderea sau acumularea excesivă ȋn greutate;
- boli ale vezicii urinare şi ale rinichilor;
- imunodeficienţa;
- accelerarea proceselor oxidative ale radicalilor liberi;
- slăbiciunea sistemelor structurale (oase fragile, fracturi de şold sau
disconfort articular);
- disfuncţionalităţi hepatice;
- lipsa de energie;
- digestie ȋncetinită şi constipaţie;
- dezvoltarea infecţiilor fungice;
- dezvoltarea tumorilor;
Alimentele alcaline echilibreaza pH-ul organismului, contribuie la
pierderea ȋn greutate şi la prevenirea multor afecţiuni specifice vieţii
moderne (artrita, diabetul etc.).
Exemple de alimente acide, neutre şi alcaline:
Alimente acide: apa carbonatată, băuturi acidulate şi energizante,
popcorn, crema de brȃnză, lapte bătut, produse de patiserie, paste, carne de
porc, bere, vin, ceai negru, castraveţi muraţi, ciocolata, nuci prăjite, oţet,
dulciuri, cafea, sucuri de fructe, fistic, carne de vit, pȃine albă, grȃu, ouă,
peşte, fasole gătită, lapte de soia, nuca de cocos, orez brun, cacao, ovăz, orz,
ficat, stridii, somon etc.
Alimente neutre: apa plată, apa minerală necarbonatată;
Alimente alcaline: mere, migdale, roşii, porumb, ciuperci, măsline,
piersici, ardei roşu, ridichii, ananas, cireşe, caise, căpşuni, banane, avocado,
ceai verde, salata verde, ţelina, mazăre, cartofi dulci, vinete, fasole verde,
afine, pere, struguri, kiwi, pepene galben, mandarine, curmale, mango,

8
papaya, spanac, broccoli, varza de Bruxelles, conopida, morcovi, castraveţi,
lămȃie, alge, sparanghel, varza Kale, ceapa etc.