9/22/2015 Báo 

cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

Xem bản đầy đủ

Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm
­30% ­30% ­25%

TR NG Đ I H C CỌNG NGHI P

THẨNH PH  H  CHệ MINH
฀ ฀ ฀
VI N CỌNG NGH  SINH H C VẨ TH C PH M Chúng Ta R i Sẽ  n Thôi Nhà Giả Kim

GVHD: BỐI H ­25% ­25%

Chúng Ta R NG QUỂN
i Sẽ  n
Thôi
L P: ĐHTP5 ậ NHịM 5
SVTH: Lê Th  Mỹ Vơn
MSSV: 09078531
­25%

ThƠnh ph  H  Chí Minh, tháng 11 năm 2011
Bên Nhau Trọn Đời ­ Tái
Kẻ Trộm Sách (Tái Bản
1 Bản 2015 (Tặng Kèm
2015)
Poster ) cho những đơn...
BÁO CÁO TH C HẨNH VI SINH
­30% ­25%
TH C PH M
M C L C 
BƠi 1: Thi t b , d ng c  phòng thí nghi m vƠ các ph ng pháp 
ti t trùng vi sinh v t 3
Quốc Gia Khởi Nghiệp
BƠi 2: Ph ng pháp pha ch  môi tr ng nuôi c y vi sinh v t 6
Thiên Đường Nhiệt Đới
Quốc Gia Khởi Nghiệp
BƠi 3: Ph ng pháp nuôi c y vi sinh v t 10 (Sách Tô Màu)

BƠi 4: ph ng pháp quan sát vi sinh v t b ng kính hi n vi quang h c 16

BƠi 5: Ph ng pháp nhu m mƠu vi sinh v t 19
BƠi 6: Ph ng pháp phơn l p vi sinh v t 20
BƠi 10: Kh o sát đặc tính sinh hóa c a vi sinh v t 23
BƠi 13: Đ nh l ng vi sinh v t b ng ph ng pháp đ m tr c ti p 35
BƠi 14: Đ nh l ng tổng vi khu n hi u khí b ng
ph ng pháp đ m khu n l c 37
BƠi 15: Đ nh l ng Coliform b ng ph ng pháp MPN 39
BƠi 19: Ph ng pháp đ nh l ng E.coli trong th c ph m 41
BƠi 20: Ph ng pháp phơn tích Salmonella spp. trong th c ph m 43
BƠi 21: Ph ng pháp phơn tích đ nh l ng Bacillus cereus trong th c ph m 46
BƠi 22: Ph ng pháp phơn tích đ nh l ng Staphilococcus aureus 
trong th c ph m 48
BƠi 24: Ph ng pháp phơn tích Clostridium perfringens trong th c ph m 50
2

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 1/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­30%
BẨI 1: THI T B , D NG C  PHọNG THệ NGHI M VI SINH V T VẨ ­25%

CÁC PH NG PHÁP TI T TRỐNG VI SINH V T

Báo cáo th c t p
1. Trình bƠy yêu c u c a vi c bao gói d ng c  nuôi  y vi sinh v t?
Yêu c u c a vi c bao gói d ng c  nuôi c y vi sinh v t:
Đọc Vị Bất Kỳ Ai ­ Để
­ Ph n gi y bao bên ngoƠi ph i chặt vƠ kín Chúng Ta R i Sẽ  n Thôi Không Bị Lừa Dối Và Lợi
Dụng
­ Bao b ng gi y d u v i d ng c  h p  t
­25% ­25%
­ Bao b ng gi y báo v i d ng c  s y khô khi khử trùng  t.
­ V i các d ng c  nh  pipet, que trang ph i dùng gi y bao kín toƠn b . Có th  dùng h p
nhôm đ  đ ng các d ng c  trên đ  khử trùng.
2. Công d ng vƠ cách sử d ng các d ng c , thi t b  phòng thí nghi m vi sinh
v t?
Khu Vườn Bí Mật
Quốc Gia Khởi Nghiệp
(Coloring Book)
Công d ng vƠ cách sử d ng các d ng c , thi t b  phòng thí nghi m vi sinh
v t: ­30% ­25%
a. N i h p  t (autoclave): 
Thi t b  nƠy c p nhi t b ng h i n c ở áp su t cao, đ c sử d ng đ  h p khử trùng
mô tr ng, m t s  nguyên li u vƠ d ng c  thí nghi m.
b. Kính hi n vi:
Khu Vườn Thời Gian
Công d ng: dùng đ  nghiên c u, quan sát t  bƠo vi sinh v t v  đặc đi m hình thái, Kẻ Trộm Sách (Tái Bản
(Sách Tô Màu Dành Cho
2015)
sinh lỦ nh  vƠo kh  năng phóng đ i c a kính. Người Lớn)

c. Các d ng c  thí nghi m

D ng c  th y tinh có nhi u lo i v i nhi u kích cỡ khác nhau nh  bình tam giác,
ng nghi m, đĩa petri, lam kính, đũa th y tinh, que trang,  ng đong, c c đong, bình
đ nh m cầ
­ Phi n kính (lame): dùng lƠm tiêu b n quan sát hình thái, sinh lỦ t  bƠo vi sinh v t.
­ Lá kính (lamelle): dùng đ  đ y lên v t bôi trên tiêu b n c  đ nh vi sinh v t trong qua
trình nghiên c u.
­ Đĩa petri: dùng đ  nghiên c u các đặc đi m hình thái, đặc đi m nuôi c y vƠ phơn l p
c a t  bƠo vi sinh v t.
­ Que trưi: phơn l p vi sinh v t theo ph ng pháp trưi đĩa.
3
­ Que c y:
+ Que c y đ u tròn: dùng đ  thao tác vi sinh trên đ i t ng đ n bƠo nh  vi khu n, n m
men.
+ Que c y nhón: dùng đ  c y sơu trên môi tr ng r n.
+ Que c y móc: dùng đ  l y khu n ty hay m t đo n t  n m.
­ Micro pipette: sử d ng khi c n hút m t l ng chính xác môi tr ng.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 2/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

4.Trình bƠy ph ng pháp ti t trùng d ng c  vƠ môi tr ng nuôi c y vi sinh v t?

Ph ng pháp ti t trùng d ng c  vƠ môi tr ng nuôi c y vi sinh v t:
a. Ph ng pháp lỦ h c:
Nhi t khô:
­ Đ i v i d ng c  c y kim lo i, đôi khi c  th y tinh, ph ng pháp th ng dùng lƠ đ t
tr c ti p trên ng n lửa đèn c n.
­ Đ i v i d ng c  th y tinh có th  gói vƠ s y ở 160
0
C trong 1­2 gi  hoặc 180
0
C trong
30 phút.
Nhi t  m:
­ Ph ng pháp lu c: cho v t khử trùng vƠo n c sôi, nhi t s  th m nhanh vƠo m u v t
lƠm cho protein đông k t, d n đ n gi t ch t vi sinh v t. Ch  di t t  bƠo sinh d ỡng,
bƠo tử v n còn.
­ Ph ng pháp Pasteur: ch  di t vi khu n gơy b nh, không di t bƠo tử vƠ vi khu n ho i
sinh. Ph ng pháp nƠy th ng dùng ở nhi t đ  70­75
0
C trong th i gian 10­15 phút.
­ Ph ng pháp Tyndall: đun cách th y nhi u l n ở nhi t đ  70­80
0
C, m i l n 30­60
phút vƠ liên ti p trong ba ngƠy li n.
­ Ph ng pháp h i n c bưo hòa ở áp su t cao: dùng autoclave. Th ng dùng ở nhi t
đ  121
0
C trong 15­30 phút.
Di t trùng b c x :
­ Tia tử ngo i hay UV: ch  sát trùng b  mặt, không xuyên sơu vƠo m u v t.
­ Tia ơm c c dùng trong ti t trùng d ng c  gi i ph u, thu c, th c ph m. V t khử trùng
ph i bao gói kính.
Di t trung b ng cách l c:
4
­ D ng c  l c th ng lƠ nh ng mƠng x p b ng s , aminate, cellulose,ầ có kích th c
l  l c từ 0,2­0,45μm, th ng dùng đ  l c nh ng v t ph m l ng không khử trùng b ng
nhi t đ c.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 3/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­ Đ i v i khử trùng không khí thì thi t b  khử trùng lƠ m t máy l c khí có trang b

mƠng l c hay h p ph  vi khu n.
b. Ph ng pháp hóa h c.
­ Ch  sát khu n ngoƠi da: xƠ phòng, c n, iode, ph m mƠu.
­ Ch t di t khu n vƠ t y u : phenol, formol, h p ch t clorầ
5
BẨI 2: CÁCH PHA CH  CÁC LO I MỌI TR NG
I. TR  L I CỂU H I
1. Trình bƠy khái ni m môi tr ng vƠ phơn lo i môi tr ng nuôi c y vi sinh
v t
• Khái ni m môi tr ng dinh d ỡng
Môi tr ng dinh d ỡng lƠ h n h p các ch t dinh d ỡng vƠ các ch t nƠy có
nhi m v  duy trì th  oxy hóa khử, áp su t th m th u c a t  bƠo vƠ s  ổn đ nh c a pH
trong môi tr ng. trong đó các ch t dinh d ỡng lƠ nh ng h p ch t tham gia vƠo quá
trình trao đổi ch t n i bƠo.
• Phơn lo i môi tr ng dinh d ỡng
o Theo ngu n g c
Môi tr ng t  nhiên: có thƠnh ph n lƠ các s n ph m t  nhiên nh : tr ng, s a,
khoai tơy, d ch chi t n m men, đ ng, cám.
Môi tr ng tổng h p: ch a các ch t hóa h c mƠ thƠnh ph n c a chúng đ c
xác đ nh vƠ đ nh l ng m t cách c  th  vƠ chính xác. Ví d  nh : Czapeck, Hansen,
EMB
Môi tr ng bán tổng h p: ch a c  các ch t hóa h c l n các s n ph m t  nhiên,
ví d  nh : PGA, giá đ u đ ng
o Theo tr ng thái v t lỦ
Môi tr ng l ng: thƠnh ph n môi tr ng nƠy không ch a agar vƠ th ng đ c
sử d ng đ  nghiên c u quá trình tổng h p c a vi sinh v t.
Môi tr ng đặc: c  1000ml môi tr ng có 15 ậ 20 Agar
Môi tr ng bán l ng: ch a kho ng 0,3 ậ 0,7% agar
o Theo công d ng
6
Môi tr ng phơn l p
Môi tr ng tăng sinh
Môi tr ng nuôi gi  gi ng: nghèo dinh d ỡng
Môi tr ng thử nghi m sinh hóa
2. Trình bƠy qui trình pha ch  môi tr ng nuôi c y vi sinh v t
Bao g m các b c sau:

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 4/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

• Chu n b  d ng c

• Cơn hóa ch t
• Ph i ch  t o môi tr ng nuôi c y
• Đi u ch nh đ  pH c a môi tr ng
• Phơn ph i môi tr ng vƠo d ng c
• Khử trùng môi tr ng
• LƠm th ch nghiên, th ch đ ng, đổ th ch vƠo đĩa petri
• Ki n tra đ  vô trùng vƠ b o qu n
3. Yêu c u c a môi tr ng trong đĩa petri,  ng nghi m th ch nghiêng vƠ th ch
đ ng
• LƠm th ch nghiêng: 
C n ti n hƠnh ngay sau khi khử trùng môi tr ng vƠ môi tr ng ch a đông
đặc.
­ Đặt  ng nghi m có môi tr ng lên giá đặt nghiêng vƠ không đ c
đ  môi tr ng ch m vƠo nút bông.
­ Đ  yên cho đ n khi môi tr ng đông đặc. Yêu c u mặt th ch ph i thẳng,
nhẵn vƠ liên t c
• LƠm th ch đ ng:
­ Đặt các  ng nghi m có môi tr ng lƠ th ch đ ng vƠo giá, đ  yên cho môi
tr ng đông đặc
• Đổ môi tr ng vƠo đĩa petri: 
­ ToƠn b  quá trình đổ th ch vƠo đĩa petri đ c th c hi n trong t  c y vô
trùng vƠ g m các thao tác sau:
o Mở bao gi y gói các đĩa petri
o M t tay c m d ng c  ch a môi tr ng
7
o Tay còn l i mở nút bông vƠ h  mi ng bình trên ng n lửa đ n c n.
o Mở hé n p đĩa petri. Nghiêng bình vƠ rót môi tr ng vƠo đĩa petri.
o Đ y n p đĩa l i, xoay tròn đĩa đ  môi tr ng đ c phơn ph i đ u bên trong đĩa.
o Đ  yên cho môi tr ng đông đặc.
o L t ng c đĩa l i vƠ b o qu n.
4. Gi i thích t i sao không phơn ph i môi tr ng vƠo đĩa petri tr c khi khử
trùng
Vì s  lƠm nhi m các vi sinh v t không mong mu n, có th  nhi m m t s  t p
ch t vì v y sau quá trình nuôi c y khó có th  xác đ nh đ c k t qu . Có th  tránh đ c
h i n c ti p xúc vƠo môi tr ng nuôi c y vƠ vì sau khi c y ph i đ  yên môi tr ng
đ  c ng môi tr ng

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 5/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

5. Đĩa petri ch a môi tr ng tr c khi c y vi sinh v t nên úp hay ngửa? T i 

sao?
Nên đ  ngửa bởi vì lƠm kín khu v c nuôi c y, tránh lơy nhi m các vi sinh v t 
khác vƠ cũng tránh ti p xúc v i h i n c.
6. ụ nghĩa c a vi c pha ch  môi tr ng?
Chúng ta ph i pha ch  môi tr ng cho vi sinh v t vì môi tr ng dinh d ỡng lƠ h n 
h p g m các ch t dinh d ỡng vƠ các ch t có nhi m v  duy trì th  oxy hóa­ khử, áp 
su t th m th u c a t  bƠo vƠ s  ổn đ nh đ  pH c a môi tr ng đ  vi sinh v t có th  
sinh tr ởng vƠ phát tri n m t cách t i  u nh t có th .
LƠm môi tr ng đ  th c hi n vi c phơn l p, nhơn gi ng, gi  gi ng vi sinh v t, đ ng
th i đ  nuôi c y vƠ nghiên c u các đặc đi m sinh h c c a chúng
7. Yêu c u c a m t môi tr ng dinh d ỡng nuôi c y?
Yêu c u c a môi tr ng dinh d ỡng: có đ  ch t dinh d ỡng c n thi t, có đ  pH
phù h p. có đ  nh t nh t đ nh, không ch a các y u t  đ c h i, hoƠn toƠn vô trùng, 
đ m b o s  phát tri n ổn đ nh c a vi sinh v t.
8. Nêu Ủ nghĩa c a các thƠnh ph n trong môi tr ng nuôi c y?
8
Peptone chi t xu t cao th t bò dùng lƠm ngu n cacbon, năng l ng vƠ nit . Cao
th t bò ch a các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit h u c , vitamin vƠ m t s  ch t 
khoáng. Cao n m men lƠ ngu n phong phú các vitamin nhóm B cũng nh  ngu n nit  
vƠ cacbon.
9. Có bao nhiêu lo i peptone?
Có 3 lo i peptone
o Từ đ ng v t: chi t xu t từ th t, cao th t bò, d ch thuỷ phơn m t ph n c a th t bò,
cazêin,ầ dùng lƠm ngu n cacbon, năng l ng vƠ nit . Cao th t bò ch a các 
axit amin, peptit, nuclêôtit, axit h u c , vitamin vƠ m t s  ch t khoáng.
o Từ th c v t: chi t xu t từ đ u nƠnh,ầ.
o N m men: cao n m men, Cao n m men lƠ ngu n phong phú các vitamin nhóm 
B cũng nh  ngu n nit  vƠ cacbon).
10. C  ch  lƠm trong n c c a lòng tr ng tr ng
Cách lƠm trong n c b ng lòng tr ng tr ng: lòng tr ng tr ng: n c t  l  1:1→ 
đánh tan nổi b t → cho vƠo 1 lít môi tr ng → đun sôi kho ng 5 phút → đ  ngu i 
→ l ng cặn →l c.
C  ch : các protein trong lòng tr ng tr ng nh  albumin, ovalbumin d i tác đ ng
c a s  khu y tr n vƠ gia nhi t b  bi n tính không thu n ngh ch, các liên k t trong
protein đ c kéo dưn lƠm l  ra nhi u nhóm ch c → hình thƠnh l c hút tĩnh đi n v i
các ion, b i b n có trong n c → sau khi l ng, l c n c trong h n. 

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 6/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

9
BẨI 3: PH NG PHÁP NUỌI C Y VI SINH V T
PHỂN L P SINH V T
I. Nguyên t c
1. M c đích c a vi c nuôi c y
­ Phát hi n s  có mặt c a vi sinh v t trong các nguyên li u v t ph m c n nghiên c u.
­ Ti n hƠnh vi c phơn gi ng các vi sinh v t m t cách nhanh chóng.
­ B o t n các gi ng vi sinh v t thu n khi t.
­ Nghiên c u các đặc tính sinh h c vƠ s  phát tri n từng lo i c a vi sinh v t.
2. Nguyên t c nuôi c y vi sinh v t
M i thao tác nuôi c y đ u ph i th c hi n trong đi u ki n vô trùng đ  tránh t p 
nhi m các vi sinh v t không mong mu n từ môi tr ng ngoƠi.
Môi tr ng vƠ d ng c  nuôi c y đ u ph i khử trùng tri t đ . Duy trì t t các đi u 
ki n nuôi c y đ  vi sinh v t phát tri n thu n l i.
II. D ng c , môi tr ng vƠ hóa ch t
III. Ti n hƠnh thí nghi m
1. Ph ng pháp c y truy n th ch (môi tr ng th ch).
1.1. C y truy n trên th ch đĩa
Có th  c y trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:
* Dùng que c y đ u tròn vƠ th c hi n theo trình t  sau:
­ Đ  đĩa pêtri lên bƠn.
­ Dùng que c y l y canh tr ng vi sinh v t theo th  t  vƠ yêu c u ở
ph ng pháp chung.
­ Tay trái hé mở n p đĩa pêtri vừa đ  đ  cho que c y vƠo.
­ Nhẹ nhƠng vƠ nhanh chóng l t que c y lên mặt th ch theo m t
trong các ki u sau:
+ Theo hình ch  chi trên toƠn b  mặt th ch (hình 3.3a)
+ Theo nh ng đ ng song song (hình 3.3b)
+ Theo 4 hình ch  chi 4 góc (hình 3.3c)
Hình 3.1 Các ki u c y
trên th ch đĩa
10
Hình 3.2: Cách dƠn vi sinh v t lên b  mặt môi tr ng
A ậ que g t B ậ dƠn b ng que g t; C: S  sinh tr ởng c a VSV sau khi dƠn đ u 
b ng que g t; D : S  sinh tr ởng c a VSV sau khi dƠn b ng que c y
1.2. Ph ng pháp c y trên th ch nghiêng
­ Ph ng pháp nƠy dùng đ  c y truy n các vi sinh v t hi u khí.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 7/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­ Sử d ng que c y đ u tròn ti n hƠnh các thao tác theo đúng trình t  nói trên

­ Th c hi n vi c c y gi ng vƠo  ng th ch nghiêng b ng các thao tác ti p
theo:
+ HoƠ gi ng ở đ u que c y vƠo gi t n c ở đáy  ng nghi m.
+ Nhẹ nhƠng l t que c y trên mặt th ch theo các ki u (hình 3.1)
­ Hình ch  chi
­ Hình vòng xo n
­ Hình v ch ngang song song
d
Hình 3.2: M t s  ki u c y trên  ng th ch nghiêng
1.3. Ph ng pháp c y trên th ch đ ng: c y sinh v t k  khí
• Sử d ng que c y hình kim
• Sau khi l y gi ng vi sinh v t, dùng que c y nƠy đơm sơu vƠo ph n kh i th ch hình tr .
• Đơm sát đáy  ng nghi m vƠ đơm thƠnh 3 đ ng: 1 đ ng chính gi a, 2 đ ng sát 
thƠnh  ng tuỳ yêu c u.
• Đ ng c y ph i thẳng, nhẹ nhƠng đ  không gơy n t, vỡ môi tr ng
IV. Tr  l i cơu h i.
1. Các ph ng pháp gieo c y vi sinh v t
11
­ C y truyên vi sinh v t trên môi tr ng l ng: c y truy n b ng pipette Pasteur, c y 
truy n b ng que c y vòng.
­ C y truy n trên môi tr ng l ng: c y truy n trên  ng truy n th ch nghiêng, trên  ng 
nghi m th ch đ ng, c y truy n trên th ch đĩa.
2. Các ph ng pháp gi   ng vi sinh v t
a. Ph ng pháp c y truy n đ nh kỳ trên môi tr ng m i
u đi m: ph ng pháp nƠy đ n gi n, d  lƠm, th i gian b o qu n không lơu.
Nh c đi m: t n môi tr ng, công s c vƠ th i gian. D  b  t p nhi m vƠ d  d n đ n
m t ch ng gi ng g c. M t hay nh m l n nhưn hi u gi a các ch ng trong quá trình b o
qu n. Ph i nghiên c u vƠ theo dõi th i gian c y truy n thích h p cho các ch ng b o 
qu n. Gi ng g c có th  b  m t do sai sót khi dùng môi tr ng c y truy n không thích 
h p. Ch ng vi sinh v t đ  b  thay đổi các đặc tính sinh h c do đ t bi n xu t hi n sau 
m i lƠn c y truy n.
b. Ph ng pháp gi  gi ng trên môi tr ng th ch có l p d u khoáng
u đi m: đ n gi n nh ng hi u qu  cao nh  kh  năng lƠm ch m quá trình bi n 
d ỡng vƠ hô h p nên vi sinh v t phát tri n ch m l i. Môi tr ng không b  m t n c vƠ
khô.
c. Ph ng pháp gi  gi ng trên đ t, cát, h tầ

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 8/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

u đi m: d  b o qu n các ch ng bƠo tử ti m sinh, th i gian b o qu n có th  kéo 
dƠi đ n 1 năm.
Nh c đi m: khử trùng môi tr ng tr c
d. Ph ng pháp l nh đông
u đi m: nhanh, thu n l i cho vi c b o qu n m t s  l ng l n m u. vi sinh v t 
đ c b o qu n từ 10­20 năm, ti t ki m công s cvƠ sai sót nhưn mác, t p nhi m.
Nh c đi m: giá thƠnh thi t b , đ  ổn đ nh c a các ch ng vi sinh v t b o qu n theo
các đ t b o qu n lƠ khác nhau. Tr c khi đem ra sử d ng ph i đ c ho t hoá trên môi
tr ng thích h p m t s  l n đ  đ m b o ph c h i các đặc tính sinh h c c a ch ng vi 
sinh v t.
e. Ph ng pháp b o qu n l nh sơu
12
u đi m: thích h p cho nhi u đ i t ng vi sinh v t khác nhau nh  n m men, vi 
khu n, n m m c, v ut, t o vƠ các dòng t  bƠo đ ng v t. th i gian b o qu n lơu.
Nh c đi m: đ u t  kinh phí cho thi t b , đi n quá cao, r i ro cháy nổ, không thích
h p cho các ch ng vi sinh v t hay dùng đ n th ng xuyên.
3. Trình bƠy nguyên t c vƠ m c đích c a quá trình phơn l p.
­ Nguyên t c: tách r i các t  bƠo vi sinh v t, nuôi c y các t  bƠo trong môi tr ng dinh 
d ỡng đ  t o khu n l c riêng r .
­ M c đích: phơn tách các ch ng vi sinh v t trong môi tr ng t  nhiên vƠ cô l p chúng 
nh m ch n l a gi ng vi sinh v t thu n khi t cho nh ng m c đích khác nhau.
4. Mu n phơn l p n m men, n m m c, vi khu n thì ngu n m u c n ch n lƠ gì?
Tr  l i:
­ Phơn l p vi khu n: ngu n m u lƠ c  khô c t nh .
­ N m m c: ngu n m u lƠ c m ngu i, xôi lƠm m c t ng, bánh mì đ  khô
­ N m men: ngu n m u lƠ b  mặt trái cơy, d ch ép nh  táo, lê hoặc trong r u n p, bia, 
n c mía.
5. So sánh s  gi ng vƠ khác nhau c a cách phơn l p vi sinh v t hi u khí vƠ k  khí.
Tr  l i:
­ Gi ng nhau: nh m phơn tách các ch ng vi sinh v t trong môi tr ng t  nhiên vƠ cô 
l p chúng nh m ch n l a nh ng gi ng vi sinh v t thu n khi t.Khác nhau:
Phơn l p vi sinh v t hi u khí Phơn l p vi sinh v t k  khí
­ Hút d ch m u đư pha loưng cho 
vao dĩa petri có môi tr ng thích 
h p.
­ Dùng que g t th y tinh phơn ph i
d ch m u tr i đ u kh p mặt th ch.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 9/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­ Ti p t c dùng que g t m u cho 

đ u kh p mặt th ch đĩa th  2 r i 
đĩa th  3.
­    m ở nhi t đ  thích h p sau 
m t th i gian nh t đ nh ta s  nh n 
đ c các khu n l c riêng r  từ các 
đĩa th  2, 3 
­ Dùng môi tr ng đặc trong  ng nghi m đem 
ch ng cách th y đ  lo i b  không khí.
­ Đ  ngu i môi tr ng còn 45­50
o
C
­ Hút d ch nghiên c u cho vƠo  ng môi tr ng, đ y 
nút l i, l c tròn quanh tr c  ng nghi m.
­ Rút nhanh, đ y nhanh tránh cho  ng nghi m có 
không khí.
­ Dùng parafin hƠn kín ph n ti p xúc gi a 2 đĩa 
petri vƠ   ở nhi t đ  thích h p
­ Sau khi vi sinh v t phát tri n, ch n các khu n l c 
riêng r  trong môi tr ng, dùng que c y c t c  kh i 
môi tr ng r i c y vƠo môi tr ng l ng thích h p.
6. T i sao khi đi cơn hoá ch t ch  c n 2­3 ng i?
Do d ng c  trong phòng hoá ch t có h n, đi cơn hoá ch t c n 2­3 ng i đư đ m 
b o v  th i gian,hi u qu  lƠm vi c
13
BẨI 4: PH NG PHÁP QUAN SÁT KệNH HI N VI B NG KệNH
HI N VI QUANG H C
1. Trình bƠy c u t o vƠ nguyên t c ho t đ ng c a kính hi n vi quang h c
a. C u t o
Kính hi n vi quang h c g m có hai ph n:
­ H  th ng c  h c: giá kính g m có chơn kính, thơn kính, tr  đỡ vƠ xoay th  kính, ổ g n 
vƠ xoay v t kính, bán kính, thanh tr t di chuy n tiêu b n,  c di chuy n thanh tr t, 
kẹp gi  tiêu b n,  c di chuy n t  quang kính,  c đi u ch nh thô s  c p,  c đi u ch nh 
th  c p (vi c p).
­ H  th ng quang h c g m: th  kính, v t kính, t  quang kính, mƠng ch n sáng, ngu n 
chi u sáng (đèn đi n chi u sáng hoặc kính chi u sáng). NgoƠi ra, ở kính dùng ngu n 
chi u sáng lƠ đèn đi n thì có thêm b  ph n cung c p đi n nh  phích c m, dơy đi n, 

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 10/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

c u chì, m ch đi n (trong chơn kính) vƠ nút đi u ch nh c ng đ  chi u sáng.

b. Nguyên t c ho t đ ng
14
V t kính lƠ h  th ng quang h c ph c t p g m m t s  th u kính, tr c ti p phóng đ i
m u v t. Các th u kính s p x p theo th  t , th u kính nh  ngoƠi cùng h ng vƠo tiêu
b n có đ  phóng đ i l n nh t. Đ  phóng đ i c a kính ph  thu c vƠo tiêu c , t c bán
kính cong c a th u kính. Th u kính cƠng cong, tiêu c  cƠng ng n thì kh  năng phóng
đ i cƠng l n.
Có hai lo i v t kính
• V t kính khô đ  phóng đ i nh  nh  x4,x10,x15,x40.
• V t kính d u có đ  phóng đ i l n nh  x90,x100.
Th  kính cũng có đ  phóng đ i ph c t p, g m hai th u kính, m t h ng v  phía
m t ng i xem, m t h ng v  v t kính. Th  kính phóng đ i m t l n n a  nh do v t
kính thu vƠo, lƠm  nh to lên, xem rõ h n.
Đ  phóng đ i c a kính = Đ  phóng đ i c a v t kính x đ  phóng đ i c a th  kính.
Ví d : Đ  phóng đ i c a v t kính x100, đ  phóng đ i c a th  kính x10. Nh  v y đ
phóng đ i c a kính : 100x10=1000 l n.
Năng su t phơn ly c a kính quan tr ng h n đ  phóng đ i, vƠ lƠ tiêu chu n chính đ
ch n kính hi n vi.
2. Có bao nhiêu lo i kính hi n vi? Đặc đi m c a từng lo i?
Có 5 lo i kính hi n vi.
­ Kính hi n vi vi n đen
Ánh sáng th ng chi u từ d i lên, qua rìa c a t  quang n n đen, chi u h t vƠo
xung quanh tiêu b n, nh ng tia sáng nƠy b  tiêu b n lƠm khúc x  r i đ a vƠo v t kính.
Tiêu b n đ c soi sáng r c trên n n đen, gi ng nh  trong phòng t i có m t tia sáng
chi u vƠo, giúp ta th y rõ từng h t b i trong không khí b  tia sáng chi u vƠo. Ch c
năng: quan sát hình thái vƠ đặc tính c a m t s  vi khu n mƠ kính hi n vi th ng khó
quan sát.
15
­ Kính hi n vi đổi pha
Ánh sáng th ng b  đổi pha vƠ biên đ  dao đ ng bởi c u trúc đặc bi t c a t  quang
kính, v t kính vƠ th  kính. Ch c năng: dùng quan sát rõ nét các c u trúc nh  nh  tiên
mao, các l p mƠng.
­ Kính hi n vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngo i chi u vƠo các tiêu b n đư nhu m mƠu b ng các ch t huỳnh
quang. Trong t  bƠo, các c u trúc khác nhau s  phát quang v i mƠu s c khác nhau.
Ch c năng: quan sát vƠ phơn bi t các c u trúc khác nhau trong t  bƠo vi sinh v t.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 11/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­ Kính hi n vi đi n tử

Chùm tia đi n tử b c sóng r t ng n, năng su t phơn li r t l n nên đ  phơn gi i
cao, giúp phơn bi t hai đi m r t g n nhau. Ch c năng: quan sát v ut, c u trúc phơn tử
c a t  bƠo.
­ Kính hi n vi quang h c
Dùng b c sóng 500 nm ậ 560 nm trong chùm ánh sáng th ng đ  t o năng su t
phơn li l n giúp phơn bi t hai đi m cách nhau kho ng 0.2 µm trở lên. H  th ng phóng
to c a kính hi n vi quang h c g m hai b  ph n: v t kính vƠ th  kính. M i b  ph n lƠ
m t h  th ng th u kính h i t  ph c t p. Ch c năng c a kính hi n vi quang h c lƠ dùng
đ  quan sát t  bƠo vi sinh v t, kí sinh trùng, t  bƠo đ ng v t, th c v t.
3. T i sao khi quan sát ở v t kính 100 ph i cho 1 gi t d u soi kính?
Do chi t su t ánh sáng c a không khí nh  h n thuỷ tinh, nên tia sáng khi đi qua
tiêu b n thuỷ tinh s  b  khúc x  m t ph n. Ph n phía ngoƠi cu  tia sáng do b  khúc x
nên không đi vƠo đ c v t kính. V t kính có đ  phóng đ i cƠng l n thì đ ng kính
c a th u kính cƠng nh , l ng tia sáng đi vƠo v t kính r t ít nên không nhìn rõ  nh.
Đ  h n ch  nh c đi m nƠy ta dùng d u soi kính có chi t su t ánh sáng g n b ng
thuỷ tinh. Thuỷ tinh vƠ d u soi đ c xem lƠ m t môi tr ng đ ng nh t. ánh sáng đi
qua không b  khúc x  nên t p trung đ y đ  vƠo v t kính, giúp xem rõ  nh.
16
BẨI 5. PH NG PHÁP NHU M MẨU VI SINH V T
Báo cáo th c t p
1. Sau khi nhu m, vi khu n Gram d ng có mƠu xanh đen hay tím, Gram ơm
có mƠu đ  vƠng hay đ  tía. Gi i thích nguyên nhơn?
Sau khi nhu m Gram, vi khu n Gram d ng s  có mƠu xanh đen hay tím, còn vi
khu n Gram ơm có mƠu đ  vang (nhu m safranin O) hay đ  tía (Fuchsin Ziehl). Sở dĩ
có mƠu nh  v y lƠ do vi khu n Gram d ng vƠ vi khu n Gram ơm có s  khác bi t v
thƠnh ph n hóa sinh c a thƠnh t  bƠo vi khu n. ThƠnh t  bƠo vi khu n Gram d ng thì
có nhi u peptidoglycan (ph c ch t protein­đ ng) vƠ các peptidoglycan nƠy đ c liên
k t chặt ch  v i nhau từ đó có th  giúp cho t  bƠo kháng l i ch t t y mƠu nên sau khi
rửa b ng c n thì crystal violet không b  rửa trôi vƠ v n gi  đ c mƠu tím, sau đó
nhu m bổ sung b ng dung d ch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nh ng không có s
thay đổi mƠu nhi u. ThƠnh t  bƠo vi khu n Gram ơm có thƠnh ph n lipid ở n ng đ
cao cho nên chúng có th  hòa tan trong ch t khử mƠu (aceton, alcohol,ầ) vƠ b  rửa
trôi cùng v i crystal violet (mƠu tím), sau khi nh  dung d ch t y mƠu, ta nhu m them
b ng dung d ch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc nƠy vi khu n Gram ơm có mƠu đ
vƠng hay đ  tía.
17

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 12/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

2. N u không nhu m bổ sung thu c thử safranin hoặc fuchsin, vi khu n

Gram ơm có mƠu gì? T i sao?
N u không nhu m bổ sung thu c thử safranin hoặc fuchsin, vi khu n Gram ơm s
không có mƠu. Bởi vì ở giai đo n t y mƠu b ng c n đư rửa trôi crystal violet (có mƠu
tím) nên sau giai đo n t y mƠu vi khu n Gram ơm đư b  m t mƠu c a crystal violet
đ c nhu m ở tr c đó. Hoặc tr ng h p vi khu n Gram ơm s  có mƠu tím cũng có
th  ở giai đo n t y rửa, ta không t y mƠu cho đ n khi gi t dung d ch cu i cùng ch y ra
kh i phi n kính lƠ không mƠu.
BẨI 6. PH NG PHÁP PHỂN L P VI SINH V T
1. Trình bƠy nguyên t c vƠ ph ng pháp phơn l p vi khu n thu n khi t?
Nguyên t c:
­ Gieo c y vi khu n đư pha loưng trên môi tr ng dinh d ỡng đặc tr ng (2% th ch hay
còn g i lƠ agar).
­ Nuôi d ỡng trong đi u ki n thích h p cho m c các khu n l c tách bi t nhau.
­ C y tách từ khu n l c m c tách bi t sang  ng môi tr ng dinh d ỡng th ch nghiêng
đ  thu nh n ch ng vi khu n thu n khi t.
Ph ng pháp phơn l p vi khu n thu n khi t:
1.1. Ph ng pháp t o khu n l c đ n các vi sinh v t hi u khí:
Có nhi u kỹ thu t ria khác nhau đ  th c hi n h p ria vƠ t o khu n l c đ n. M t s
kỹ thu t ria th ng dùng: kỹ thu t ria ch  T , kỹ thu t ria b n góc ,kỹ thu t ria tia ,kỹ
thu t ria liên t c
Thao tác kỹ thu t t o khu n l c đ n đ c th c hi n nh  sau:
18
a. Kỹ thu t h p ria:
­ Dùng que c y vòng thao tác vô trùng thu gi ng.
­ Ria các đ ng trên đĩa pêtri ch a môi tr ng thích h p (ria ch  T vƠ ria b n góc). Sau
m i đ ng ria, đ t khử trùng đ u que c y vƠ lƠm ngu i tr c khith c hi n đ ng ria
ti p theo.
­ Bao gói đĩa pêtri,   ở nhi t đ  vƠ th i gian thích h p trong t   m.
b. Kỹ thu t h p tr i:
­ Dùng pipetman vƠ đ u típ vô trùng, thao tác vô trùng chuy n 0,1 ml d ch ch a gi ng
vi sinh v t lên b  mặt môi tr ng trong đĩa pêtri.
­ Nhúng đ u thanh g t (que tr i) thuỷ tinh vƠo c n 70
0
, h  qua ng n lửa đ  khử trùng.
Đ  đ u thanh g t ngu i trong không gian vô trùng c a ng n lửa.
­ Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhƠng thanh g t lên b  mặt th ch c a đĩa petri.

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 13/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

­ Dùng đ u thanh g t xoay, tr i đ u d ch gi ng lên b  mặt th ch. Trong khi tr i, th c
hi n xoay đĩa m t vƠi l n, m i l n kho ng 1/2 chu vi đĩa t o đi u ki n cho thanh g t
tr i d ch gi ng đ u kh p b  mặt môi tr ng.
­ Rút thanh g t kh i đĩa, đ y đĩa, gói vƠ   ở nhi t đ  vƠ th i gian thích h p trong t   m.
c. Kỹ thu t h p đổ:
­ Dùng pipetman vƠ đ u típ vô trùng, thao tác vô trùng chuy n 1 m d ch ch a gi ng vi
sinh v t lên b  mặt môi tr ng trong đĩa pêtri.
­ Đổ kho ng 15 ­ 20 ml môi tr ng đư đun ch y vƠ đ  ngu  đ n 45 ­ 55
0
C vƠo đĩa petri
đư c y m u.
­ Xoay nhẹ đia petri cùng chi u vƠ ng c chi u kim đ ng h  vƠi l n đ  dung d ch gi ng
đ c tr n đ u trong môi tr ng c y.
­ Đ y n p đĩa pêtri, đ  đông t  nhiên.
19
1.2. Ph ng pháp t o khu n l c đ n các vi sinh v t hi u khí:
­ Dùng môi tr ng đặc trong  ng nghi m đem ch ng cách thuỷ đ  lo i b  không khí
trong môi tr ng.
­ Đ  ngu i môi tr ng còn 45 ­ 50
0
C.
­ Hút 0,1 ml d ch nghiên c u cho vƠo  ng môi tr ng, đ y nút l i, l c tròn quanh tr c
ng nghi m.
­ Rót nhanh môi tr ng ở  ng nghi m vƠo n p d i c a đĩa pêtri vƠ đ y th t nhanh n p
trên l i, sao cho gi a mặt n p vƠ môi tr ng không còn không khí.
­ Dùng parafin hƠn kín ph n ti p xúc gi a 2 n p c a đĩa petri vƠ   ở nhi t đ  thích h p.
­ Sau khi vi sinh v t phát tri n, ch n các khu n l c riêng r  trong kh i môi tr ng, dùng
que c y c t c  kh i môi tr ng r i c y vƠo môi tr ng l ng thích h p.
2. Nguyên t c c a vi c nuôi tích lũy?
Nguyên t c c a vi c nuôi tích lũy: tr ng h p s  vi khu n có trong m u ít thì
ph i nuôi tích lũy b ng cách   m u, bổ sung ch t dinh d ỡng vƠ các đi u ki n lỦ hóa
c n thi t hoặc bổ sung các ch t  c ch  sinh tr ởng c a các vi sinh v t đi kèm. 
3. Th  nƠo lƠ chu n vi khu n thu n khi t (ch ng s ch)?
Chu n vi khu n thu n khi t (hay còn g i lƠ ch ng s ch) đ c hi u lƠ th  h  con,
cháu, dòng có ngu n g c từ m t t  bƠo riêng lẻ. Các ch ng vi sinh v t đ c thu nh n
từ khu n l c phơn l p l n đ u ch a ch c đư thu n khi t vì m t khu n l c có th  đ c
hình thƠnh bởi m t hoặc nhi u t  bƠo, bƠo tử, vì th  ph i lƠm s ch nhi u l n m i thu

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 14/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

đ c ch ng vi sinh v t thu n khi t.

20
BẨI 10: CÁC PH N  NG SINH HịA
1. Ph n  ng t o indol
M c đích: Phát hi n các VSV có kh  năng sinh indol ฀ các VSV có h  emzym
tryptophanase
S  đ :
21
K t qu , d ng tính (mƠu
h ng) vƠ ơm tính (mƠu vƠng)
Thu c
thử
Kovac’s
37
o
C
24h
Ch ng 
Vi Sinh V t
Môi Tr ng: NB vƠ Tripton
Ểm tính
37oC / 24h
Ch ng 
Vi Sinh V t
Môi Tr ng
D ng tính
Ểm tính
C  ch  phép thử: Vi sinh v t ti t enzyme tryptophannase chuy n hóa tryptophan trong
môi tr ng thƠnh Indol. Indol s  k t h p v i para­dimethylaminbenzaldehyd trong
thu c thử kovac’s t o thƠnh ph c ch t có mƠu h ng cánh sen.
ụ nghĩa: 
• Phép thử cho bi t các ch ng lo i vi sinh v t có kh  năng ti t enzyme
tryptophannase, giúp ta đ nh danh đ c m t s  ch ng lo i vi sinh v t.
฀ LƠ ph n  ng giúp phơn bi t
◦ E. coli (+) v i Klebsiella (­)
◦ Proteus mirabilis (­) v i Proteus khác (+)
◦ Bacillus alvei (+) v i Bacillus khác (­)ầ

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 15/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

฀ Đ i ch ng (+) Proteus rettgeri

(­) Serratia marcescens
22
Môi tr ng MR­VP
Ch ng vi sinh v t
K t qu , mƠu đ  (D ng tính), mƠu vƠng: (ơm tính)
Ch ng 
Vi Sinh V t
Môi Tr ng
2­4 ngƠy
D ng tính Ểm tính
2. Ph n  ng MR (methyl red)
฀ M c đích: xác đ nh vi sinh v t s n xu t vƠ duy trì các acid b n trong quá trình 
lên men glucose.
C  ch :
฀ C  sở sinh hóa:
◦ Ch t ch  th  pH: methyl red
◦ MR (+) ậ cƠng kéo dƠi th i gian nuôi c y ậ môi tr ng cƠng acid
◦ MR (­) ậ cƠng kéo dƠi th i gian nuôi c y ậ các ch t có tính acid b  
chuy n hóa ậ môi tr ng d n trung tính
23
24h,
37
o
C
Methyl
Red
D i 4,4 5,0 ậ 5,8 Trên 6,0
Môi tr ng MR­VP
Ch ng vi sinh v t
24h, 37oC
KOH 10% (NaOH 40%)
K t qu ,mƠu đ  h ng (D ng tính), không đổi mƠu (ơm tính)
­naphthol
Ểm tính D ng tính
฀ Th i gian   2 ậ 5 ngƠy ở 37
o

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 16/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

C
C  ch : m t s  vi sinh v t có kh  năng chuy n hóa Glucose qua quá trình đ ng 
phơn t o thƠnh acid pyruvic, r i từ Acid pyruvic chuy n hóa thƠnh acetyl coenzyme 
A, đi qua chu trình Kreps t o ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid 
malic, a cid oxalicầ hoặc từ Acid pyruvic chuy n tr c ti p thƠnh các acid lactic, acid 
fomic,ầ
Trong môi tr ng MR­VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đ m phosphat) giúp ổn 
đ nh PH, khi có mặt các acid h u c  m nh s  t n công vƠ phá vỡ th  PH ổn đ nh lƠm 
cho PH gi m m nh, PH<4.3, V i s  có mặt c a thu c thử MR (Methyl Red) s  lƠm 
môi tr ng chuy n sang mƠu đ  (Ph n  ng d ng tính)
ụ nghĩa: Đ nh danh m t s  vi sinh v t có kh  năng chuy n hóa Glucose (th ng lƠ 
gram ­).
3. Ph n  ng VP
M c đích: Phát hi n vsv t o s n ph m trung tính (acetoin) trong quá trình lên men 
glucose. 
24
Quy trình hóa h c:
ụ nghĩa: Đ nh danh vi sinh v t t o s n ph m trung tính (acetoin) trong quá trình
lên men glucose, th ng lƠ gram (­)
4. Thử nghi m Citrate
M c đích: Xác đ nh kh  năng vi sinh v t sử d ng ngu n citrat nh  lƠ ngu n 
cacbon duy nh t.
฀ C  sở sinh hóa: 
◦ VSV sử d ng citrate, sinh ra CO
2
lƠm ki m hóa MT
◦ VSV sử d ng mu i ammonium lƠ ngu n đ m duy nh t t o ra NH
3
lƠm 
ki m hóa MT
25
Tài liệu liên quan
Báo cáo M t s  gi i pháp thúc đ y tiêu th  s n ph m.doc
TH C HẨNH VI SINH  NG D NG
Th c t p vi Sinh th c ph m
TƠi li u BƠi gi ng: Th c hƠnh vi sinh  ng d ng docx
BÁO CÁO TH C HẨNH VI SINH Đ I C NG

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 17/18
9/22/2015 Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm ­ Tài liệu text

báo cáo th c hƠnh vi sinh
Báo cáo " V  hƠnh vi ph m t i tổ ch c sử d ng trái phép ch t ma tuỦ" docx
bƠi gi ng th c hƠnh vi sinh  ng d ng
Báo cáo th c hƠnh vi sinh môi tr ng
THUC HANH VI SINH

Generate time = 0.10384798049927 s. Memory usage = 2.09 MB

http://text.123doc.org/document/2355081­bao­cao­thuc­hanh­vi­sinh­thuc­pham.htm 18/18