Bioquímica 1 – Diplomatura en Ciencia y Tecnología – Universidad Nacional de Quilmes

Trabajo de laboratorio:
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford

Objetivos
Generar una curva de calibración y estimar la concentración proteica
de una muestra incógnita.

Introducción
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es
una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de
purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la
actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Con esta práctica se pretende

Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe
en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la
forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es
sensible (1-25 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren
están los detergentes y las soluciones básicas.

Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue
G-250 con 10 ml de fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar
en la oscuridad.

Procedimiento
Añadir 950 µl del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras
problema preparadas como se indica en la Tabla. Dejar a temperatura
ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es
estable 1 hora.

• Curva de calibración

Muestra 1 (blanco) 2 3 4 5 6
µg BSA en muestra 0 5 10 15 20 25
µl BSA (0.5 µg/µl) 0 10 20 30 40 50
µl agua 50 40 30 20 10 0
Reactivo de Bradford 950 950 950 950 950 950
Absorbancia a 595 nm

• Incógnitas
Muestra M M(1/5)
µg BSA en muestra ? ?
µl de M 50 10
µl agua 0 40
Reactivo de Bradford 950 950
Absorbancia a 595 nm
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Análisis de resultados

1. Graficar la absorbancia obtenida en función de los µg de BSA en

la muestra patrón y obtener la recta de regresión.
2. Utilizar la ecuación de la curva de calibración para calcular la
cantidad de proteína que hay en la muestra incógnita M1 y M1/5.
3. Expresar la concentración de proteínas de la solución incógnita
M en mg/ml.

Absorbancia a 280 nm

Objetivo: Estimar el Ε para BSA.

La Ley de Lambert y Beer dice que la absorbancia es proporcional a la

distancia que recorre el haz de luz a través de la muestra
multiplicado por la concentración (solución diluida) de la muestra. La
constante de proporcionalidad es Ε (Epsilon).

Procedimiento: Realizar al menos 5 mediciones de Abs280 de soluciones

de BSA de concentración conocida a partir de la solución stock (0.5
mg/ml). Graficar Abs280 versus concentración de BSA y estimar Ε.

Bibliografía

Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:
248-254.