Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Ingenieria UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA Protocolo de practica de laboratorio Virtual de Bioquimica 201103 - BIOQUIMICA LEONARDO BONILLA RAMIREZ Director MEDELLiN Abril, 2020Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Ingenieria . ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO La presente Guia para implementacién virtual del laboratorio de bioquimica fue disefiada por Bidlogo, Magister y Doctor en Ciencias Biomédicas Leonardo Bonilla Ramirez, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD de Medellin, actualmente se desempefia como tutor de la UNAD. Esta guia utiliza el simulador libre Biomodel desarrollado por el doctor Angel Herrdez de la Universidad de Alcala (UAH) - Espafia que puede ser consultado en la pagina_http://biomodel.uah.es. Las guias fueron aprobadas por la red de curso de bioquimica y la red curricular de fundamentos de quimica para el periodo 16-01 2021. Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar puiblicamente bajo las condiciones siguientes: Y Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor 0 el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo 0 apoyan el uso que hace de su obra). vy No comercial, No puede utilizar esta obra para fines comerciales. ¥ Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra ¥ Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Y Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor ¥ El contenido de este protocolo de laboratorio no menoscaba o restringe los derechos morales del autor. aeray 0 BenenEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Ingenieria 2. INDICE DE CONTENIDO Pag. 3. Caracteristicas generales 5 4. Descripcién de practicas 9 4.1. Practica 1. Determinacion de la concentracién de carbohidratos y proteinas. 9 4.2. Practica 2. Separacién electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa. 16 4.3. Practica 3. Ensayo de Cinética enzimatica: Determinaci6n de la actividad gamma-glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina. 22 4.4, Practica 4. Ensayo de viabilidad celular (actividad metabslica) por reduccién del compuesto MTT. 2eee Basicas, Tecnolo Mirra Riera ye Dasma 3. Caracteristicas generales El componente practico del curso de bioquimica comprende el espacio académico para afianzar y consolidar las competencias adquiridas por el estudiante en el componente de formacién basica de estudiantes de los programas de ingenieria de alimentos y regencia de farmacia. A través del desarrollo de las prdcticas el estudiante aplicard conceptos de la bioquimica, relacionados con biomoléculas, enzimologia y metabolismo celular, tales como estructura, pH, reacciones de oxido- reduccién, cinética e inhibicién enzimdtica y catabolismo celular. De igual manera, el componente practico favorece en los estudiantes el desarrollo de habilidades observacionales, —analiticas. oy experimentales en el drea de la bioquimica. Durante el desarrollo de las prdcticas favorecerd afianzar conceptos y competencias adquiridas en cursos previos como biologia y quimica orgénica, para asi lograr las competencias necesarias en la formacién en ciencias basicas para el éptimo desarrollo de sus programas académicos EI disefio de este protocolo de laboratorio se realizé con el propdsito de complementar y correlacionar los conceptos teéricos con los resultados experimentales del curso de bioquimica de la cadena de Ciencias Basicas de la escuela de Ciencias Basicas tecnologia e ingenieria de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Este protocolo consta de 4 practicas que integran los temas de las tres unidades teméaticas del curso. Los contenidos de las prdcticas fueron seleccionados, teniendo en cuenta el tiempo y las competencias metodolégicas minimas que se esperaria debe alcanzar un estudiante de la Universidad en el campo de la bioquimica.Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Nireeatl Uap Riera ye Dasma Es requisito para los estudiantes en formacién en ingenieria de alimentos y tecnologia en regencia de farmacia. Justificaci6n Propésito: Intencionalidades | Relacionar los procedimientos de laboratorio con los formativas conceptos sobre biomoléculas, enzimologia y metabolismo a través de ensayos experimentales. Objetivo general: Desarrollar en el estudiante la capacidad analitica para relacionar las medidas experimentales del laboratorio de bioquimica, con los conceptos tedricos aprendidos. Meta: Aplicar los conceptos relacionados con la bioquimica en ensayos experimentales simulados y anilisis de resultados experimentales tedricos que evidencien la relacién teoria-practica. Resultado de Aprendizaj Aplicar los conceptos tedricos de la biomoléculas, enzimologia y metabolismo a partir del desarrollo de actividades experimentales con mediacién tecno Pedagogica. Practica 1. Determinacién de la concentracién de “ carbohidratos y proteinas Denominacién de practicas Practica 2. Separaci6n electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa Practica 3. Ensayo de Cinética enzimética: Determinaci6n de la actividad gamma- glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina Practica 4. Ensayo de viabilidad celular (actividad metabélica) por reduccién del compuesto MTT Namero de horas 18Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Nireeatl aeray 0 Ban . la nota de las actividades del laboratorio Porcentaje corresponde al 28% del curso, equivalente a 140 puntos de 500 Totales. Curso Evaluado por proyecto sT__. NO_X_ El desarrollo del laboratorio virtual de bioquimica se realiza de manera individual. Deberd entregar un UNICO informe que contenga todas las précticas de laboratorio en el Aula virtual de componente practico. Este informe deberd contener: Informe o productos a o Portada entregar © Desarrollo de la cada una de las précticas © Conclusiones por cada una de las practicas El informe debera ser entregado 2 dias después de finalizada la Ultima sesién de laboratorio programada. Sistema de Evaluaci6én La evaluacién se llevaré a cabo por medio de las siguientes actividades: 1. El tutor asignado al componente practico virtual evaluard el laboratorio de acuerdo con la presentaci6n del informe de la practica donde deberé dar desarrollo a todas las practicas desarroliadas. La valoracién de la practica se daré con un con una ponderacién de 120 puntos de acuerdo con la Guia y rubrica de evaluacién del componente practico virtual. 2. Desarrollo de la evaluacién en linea para cada practica a través de formularios de Google con un peso de 20 puntos de acuerdo con la Guia y ribrica de evaluacién del componente practico virtual Ribrica de evaluacion La evaluaci6n estard a cargo de los tutores de laboratorio siguiendo la Guia y Rubrica de Evaluacién de la tarea 5 - componente practica y le calificacion serd visible en el OILEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Ingenieria Riera ye Dasma 4. DESCRIPCION DE PRACTICAS 4.1. Practica 1. Determinacién de la concentracién de carbohidratos y proteinas Tipo de practica Presencial Autodirigida Remota Otra Simulada éCual Puntaje de 30 puntos evaluacién Horas de la cinco pra Tematicas de la | Concentracién de carbohidratos y proteinas practica en solucién Intencionalidades | Propésito formativas . : Relacionar las propiedades estructurales y quimicas de los aminodcidos y proteinas, a partir de procedimientos de laboratorio que describen su comportamiento bioquimico. Objetivo general. Determinar concentracién de las biomoléculas Fundamentaci6n Teérica Antes de iniciar el desarrollo de la practica debe visualizar el video que se encuentra a continuacién donde se explican los fundamentos de las técnicas que se realizaran en esta préctica. Video de Espectrofotometria Universidad de Malaga, 2017. Técnicas bésicas en Bioquimica: espectrofotometria [archivo de video] recuperado en https: //www. youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU Pefiaranda L. 2020. Practica # 5: Cuantificacién de proteinas (Archivo de video] recuperado en https://youtu.be/NH7BBGUXgosEscuela de Ciencias fei rele ole en ante debe revisar los fundamentos que incluye el simulador previo al desarrollo de la practica Descripcion de la practica Esta prdctica analizard la concentracién de carbohidratos y proteinas empleando la técnica de espectrofotometria UV-VIS y la interpretacién de espectros Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Computador con conexién a internet Software para utilizar en la practica Simulador en linea Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Espectrofot6metro UV-VIS Virtual [disponible en linea] disponible en http://biomode!.uah.es/lab/abs/ensayo.htm Metodologia Procedimiento. 1. Ingrese al simulador de espectrofotometria UV-VIS en el siguiente enlace i I h y_ deberd observar en su computador el simulador como se muestra en ella figura 4. aa ees A a ie oa Figura 1. Simulador de espectrofotémetro UV-VIS disponible en linea http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm aSeray 0 BenenEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Leer atentamente la pestafia de instrucciones e ingrese a los enlaces compartidos sobre el uso de los equipos de laboratorio (pipetas pasteur, micropipetas y espectrofotémetro) y visualice los videos de los tres temas. Proceder a realizar las tres actividades propuestas en las siguientes pestafias, siguiendo paso a paso las instrucciones dadas por el simulador: Glucosa. Determinacién de la concentracién de glucosa por un método enzimatico colorimétrico Glucemia. Determinacién de la glucemia (concentracién de glucosa en sangre) Lowry. Determinacién de la concentracién de proteinas por un método colorimétrico: método de Lowry 4. Registra las tablas y los datos obtenidos en el desarrollo del experimento. No olvide registrar el nimero del experimento que le corresponde. Este ntimero lo encuentra en el espacio Anélisis de resultados Nota: Recuerde tomar capturas de los datos y espectros en cada fase del proceso en cada actividad. 5. Responder los interrogantes que encuentra en cada actividad en los items Anélisis de resultados. Consignar su respuesta en el informe de la practica Evaluacién de la Practica Una vez desarrollada la practica deberd ingresar al siguiente enlace registrar sus datos y responder las preguntas https://forms.ale/eGNMN1nSKZNMr6d89Escuela de Ciencias fei rele ole en eraurearer ‘ica 2. Separaci6n electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa. Tipo de pr ica Presencial Autodirigida Remota Otra Simulada éCual Puntaje de 30 puntos evaluacién Horas de la Cuatro practica Tematicas de la|Propiedades quimicas y estructurales de practica aminodcidos y proteinas Intencionalidades _ Propésito formativas Relacionar las propiedades estructurales y quimicas de los aminodcidos y proteinas, a partir de procedimientos de laboratorio que describen su comportamiento bioquimico. Objetivo general. Analizar el efecto de la fuerza idnica sobre proteinas en solubilidad acuosa. Fundamentaci6n Teérica La electroforesis es una técnica que permite separar sustancias cargadas por influencia de un campo eléctrico externo. La separacién electroforética se basa en la diferente velocidad de migracién que experimentan en un campo eléctrico las distintas particulas largadas eléctricamente. La velocidad de migracién depende principalmente de la densidad de carga y de la intensidad del campo eléctrico aplicado. Debido a la naturaleza anfolitica, !a carga eléctrica de las proteinas se modifica con el pH del medio, definigndose entonces como punto isoeléctrico (pl), al pH en el cual la molécula no tiene carga eléctrica neta y entonces no migraré en un campo eléctrico. Si el pH se encuentra por debajo de la pl, predominan las cargas positivas y a la inversa a un pH superior al pI. aeray 0 BenenEscuela de Ciencias Basicas, Tecnolo Mirra aSeray 0 Benen écnica, la muestra estd obligada a desplazarse sobre un soporte sdlido de papel, celulosa o gel. La pequefia cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas 0 bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucién estabilizada con un medio que sirve de soporte. La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolucién tampén, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampén. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucién tampén y en los que se hallan colocados los electrodos. Se conectan los electrodos a una fuente de tension continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigracién de una molécula depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensién y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...). El revelado se realiza empleando los mismos métodos que los utilizados en cromatografia sobre papel, mediante la accién de los colorantes adecuados. La electroforesis y la cromatografia en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras que la electroforesis separa las moléculas fundamentalmente en funcién de su carga, la cromatografia lo hace en base a una amplia gama de caracteristicas (ejemplos, solubilidad en la cromatografia de reparto, polaridad en la de adsorcién, carga en la de intercambio iénico, etc.). La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacion de sustancias de bajo peso molecular como aminodcidos y péptidos. La difusién que se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de “alto voltaje”. El revelador para localizar las sustancias seria la ninhidrina en el caso de péptidos y aminoacidos. Las electroforesis en papel también pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son quimicamente mas homogéneas yEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e eraurater 3 -ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez tefiidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometria. Es muy util en los laboratorios clinicos por su facil manipulacién y su rapido desarrollo. La principal aplicacién es la separacién de proteinas del suero, conociéndose el resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan mediante este tipo de electroforesis son la albumina y las globulinas a1, a2, B y y. El acetato de celulosa se utiliza también para separar lipoproteinas. El resultado obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas 8, pre-B y y. El tampén més usado es el veronal, a pH 8,6. La separacién se realiza de forma andloga a la de proteinas y se produce en unos 30 minutos. Las lipoproteinas, una vez separadas, se localizan tifiéndolas con colorantes que se unen a la fracci6n lipidica, como “Negro Sudén” o “Ciba 7B Fat Red”. Electroforesis andlogas a las de proteinas y lipoproteinas, utilizando como soporte el acetato de celulosa, se han aplicado también para la separacién de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatinquinasa. Descrip: n de la practica En esta practica se va a estudiar el efecto de la fuerza iénica sobre las propiedades quimicas y estructurales de las proteinas Mediante elanilisis de la separacién de proteinas por métodos electroforéticos y el analisis de densitogramas. Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Computador con acceso a internet Software a utilizar en la practica Simulador en linea Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Simulador de electroforesis de proteinas sobre acetato de celulosa [disponible en linea] disponible en http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_aplicar_muestras. htm Metodologia Procedimiento. 1. Ingrese al simulador de espectrofotometria UV-VIS en el siguiente enlace Riera ye DasmaEscuela de Ciencias sicas, Tecnologia e. htm y deberd observar en su computador el simulador como se muestra en el la figura 1. ce [Steen am =e) bnoe Figura 2. Simulador de electroforesis de proteinas sobre acetato de celulosa disponible en linea http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH _aplicar_muestras.htm 2. Leer atentamente las instrucciones 3. Proceder a realizar el experimento con las dos de las tres muestras (M1, M2 y M3) 4. Registra las grdficas obtenidas en el desarrollo del experimento. No olvide registrar el ntimero del experimento que le corresponde. 5. Ingrese al enlace “en esta pagina” que se encuentra en el item “Fundamento”, esto lo llevara a otra parte del simulador que observa en la figura 3. El enlace directo a este segundo simulador es http://biomodel,uah.es/lab/acetato/LDH.htmEscuela de Ciencias cf Ucetedole fe Were amon thee — H = Ch C= Figura 2. Simulador de electroforesis de proteinas sobre acetato de celulosa disponible en linea http: //biomodel.uah.es/lab/acetato/LOH. htm. 6. Utilizando los perfiles normales compare la separacién de las proteinas en la tira de acetato de celulosa y los densitogramas para encontrar el tejido al cual corresponden cada una de las muestras M1, M2 0 M3 de su experimento. Evaluacién de la Practica Una vez desarrolle la practica ingrese al siguiente enlace registrar sus datos y responder las preguntas ‘hittps://forms.gle/SqaNShpi8RSwGNHKc8 aeray 0 BanoEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e eraurater aeray 0 Benen rica 3. Ensayo de Cinética enzimatica: Determinacién de la actividad gamma-glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina Tipo de practica Presencial| [Autodirigida | [Remota | Otra ‘Simulada’ eCual Puntaje de 30 evaluacién Horas de la Cinco practica Tematicas de la Actividad enzimética - Cinética enzimatica - practica Km Intencionalidades — Propésito formativas Relacionar los conceptos basicos de enzimas y actividad enzimatica a partir de procedimientos de laboratorio que describen el comportamiento bioquimico de las enzimas. Relacionar actividad enzimatica_ con parémetros fisicos de velocidad y tiempo Fundamentacién Teérica La cinética enzimatica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, Estos estudios proporcionan informacién directa acerca del mecanismo de la reaccién catalitica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacci6n catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones éptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccién observada es la velocidad maxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicién de los productos o la desaparicion de los reactivos.Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e eraurcarer seguir la velocidad de aparicién de producto (0 de desapari del sustrato) en funcién del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccién, o simplemente, la cinética de la reaccién. A medida que la reaccién trenscurre, la velocidad de acumulacién del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccién (Figura de la derecha). Para evitar esta complicacién se procede a medir la velocidad inicial de la reaccién (vo). La velocidad inicial de la reacci6n es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de vo se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Ademas, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccién inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequefia que la reaccién inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Para estudiar la cinética enzimdtica se mide el efecto de la concentracién inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccién, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos vo frente a [S]o obtenemos una grafica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]o es pequefia, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracién de sustrato, y por tanto, la reaccién es de primer orden. A altas [S]o, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]o. En este punto, a reaccién es de orden cero y la velocidad es maxima (Vmax). Video de cinética enzimatica. Visualice el siguiente video donde se explica los fundamentos de la de cinética enzimatica Garcia Jerez A. 2018. Cinética Enzimatica [Archivo de video] recuperado en _https://www.youtube.com/watch?v=sLrhI9mgHD¢ Descripcién de la practica En esta prdctica se va a estudiar la cinética enzimatica mediante la actividad de la enzima gamma-glutamiltranspeptidasa evidenciado en las variaciones de la absorbancia en el tiempo Recursos para utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Computador con conexién a internet Software a utilizar en la practica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la practica aSeray 0 BenenEscuela de Ciencias ve icas, Tecnologia e Wiador en linea: Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Espectrofotémetro UV-VIS virtual [disponible en linea] recuperado en http://biomodel.uah.es/lab/abs/cinetica.htm Metodologia 1. Ingrese al simulador de espectrofotometria UV-VIS en el siguiente enlace i I it y deberd observar en su computador el simulador como se muestra en ella figura 4. Figura 1. Simulador de espectrofotémetro UV-VIS disponible en linea ht 2. Leer atentamente la pestafia de instrucciones, en esta se explica el funcionamiento del simulador 3. Proceder a realizar la actividad propuesta en la siguiente pestafia, siguiendo paso a paso las instrucciones dadas por el simulador: gammaGT. Determinacién de la actividad gamma- glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina 4. Registra las tablas y los datos obtenidos en el desarrollo del experimento. No olvide registrar el numero del experimento que le corresponde. Este nimero lo encuentra en el espacio Anélisis de resultadosEscuela de Ciencias fei rele ole en Ingenieria 5. Responder los interrogantes que encuentra en cada actividad en los items Anélisis de resultados. Consignar su respuesta en el informe de la practica en el formato sugerido. Evaluaci6n de la Practica Una vez desarrolle la practica ingrese al siguiente enlace, registrar sus datos y responder las preguntas https: //forms.gle/cQSfua8VNRawJvv17Escuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e eraurcarer Riera ye Dasma Practica 4. Ensayo de viabilidad celular (actividad metabélica) por reduccién del compuesto MTT Tipo de practica |[Presencial| | Autodirigida |_| Remota Otra ‘Simulada éCual Puntaje de 30 puntos evaluacién Horas de la cuatro practica Tematicas dela | Metabolismo - ciclo de Krebs -fosforilacion practica oxidativa. Propésito Relacionar los conceptos basicos de enzimas y actividad enzimatica a partir de procedimientos de laboratorio que describen el comportamiento bioquimico de las enzimas. Objetivo general. Relacionar el proceso de digestién con la actividad enzimatica. Fundamentaci6n Teorica Un catalizador es una sustancia que aumenta la velocidad de una reaccién quimica, sin sufrir ningun cambio al final de la misma. Casi todas las reacciones quimicas que ocurren en los seres vivos son catalizadas por proteinas especializadas llamadas enzimas. La sustancia sobre la que actua una enzima se llama sustrato. La enzima se une al sustrato formando un complejo enzima-sustrato que al final se disocia en enzima y producto. La enzima libre queda asi en capacidad de unirse a otras moléculas del sustrato y generar més producto, hasta que se agote la disponibilidad del sustrato o se presenten efectos reguladores que inhiban la actividad catalitica de la enzima.Escuela de Ciencias | Basicas, Tecnologia e ene eee ja son proteinas de peso molecular elevado (mas de 10 K daltons). Su estructura tridimensional esté determinada por la secuencia de aminodcidos que caracteriza a cada una. En su estructura contienen un pequefio espacio llamado sitio activo, catalitico o sitio isostérico, al que se une una regién especifica del sustrato, por medio de un acoplamiento muy especifico semejante al de una llave con su cerradura. Esto explica una de las caracteristicas de las enzimas: una alta especificidad por su sustrato. Por ejemplo, la enzima SACARASA actua solo sobre SACAROSA y no lo puede hacer sobre otros disacaridos parecidos. La actividad enzimatica puede verse afectada por cualquier factor fisico o quimico que altere su estructura tridimensional. Generalmente, las condiciones éptimas se encuentran entre limites estrechos de temperatura, pH, concentracién salina, etc. A medida que las condiciones se alejan del punto dptimo, la actividad de la enzima empieza a decrecer y en condiciones extremas, puede perder su estructura tridimensional y se dice que la enzima es desnaturalizada La NADH deshidrogenasa, NADH: ubiquinona oxidorreductasa o complejo I es un gran complejo multi enzimatico que cataliza la transferencia de electrones del NADH a la coenzima Q en la cadena respiratoria. Es el mayor complejo de la cadena respiratoria; en los mamiferos consta de 45 cadenas polipeptidicas, de las cuales, siete estan codificadas por el genoma mitocondrial. Contiene FMN como grupo prostético y 8 ctimulos hierro-azufre. Su estructura tiene forma de "L" con un gran dominio en la membrana (con alrededor de 60 hélices transmembrana) y un dominio periférico hidréfilo donde se produce la reduccién del NADH. Constituye el punto de entrada a la cadena de transporte electrénico en las bacterias y en la membrana interna de las mitocondrias de las células eucariota. La transferencia electrénica se inicia mediante la oxidacién del NADH ya que sus dos electrones son transferidos simulténeamente a un FMN unido no covalentemente a la enzima, y desde alli, a través de una serie de clusters Fe-S (transportadores de electrones capaces de aceptar un electrén por ciclo) al aceptor final, la coenzima Q (ubiquinona, transportador electrénico liposoluble) 0 a aceptores artificiales como ferrocianuro o rutenio (III) hexaamina. Simulténeamente al transporte electrénico, el complejo 1 bombea protones a través de la membrana, contribuyendo asi a la generacién de un gradiente electroquimico. La estequiometria aceptada para elEscuela de Ciencias fei rele ole en Ingenieria Boribeo de protones es 2H+/e-.3 4 Este proceso produce el 40% del gradiente transmembrana generado en la oxidacién del NADH por la cadena respiratoria mitocondrial.5 Recientemente se demostr que en ciertos procariotas el complejo transloca cationes Na+ en lugar de protones y que de este modo se genera una fuerza sodio-motriz en lugar de protén-motriz, Descripcién de la practica En esta seccién se estudiarén la actividad metabélica relacionada a un ensayo de citotoxicidad con peréxido de hidrégeno determinando la viabilidad de las células por un método colorimétrico. Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) ‘Computador con conexién a internet Software a utilizar en la practica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la practica Simulador en linea: Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Ensayo del MTT para viabilidad metabdlica [disponible en linea] recuperado en http://biomodel,uah.es/lab/citotox/inicio.htm Metodologia Procedimiento 1. Ingrese al simulador de Ensayo del MTT para viabilidad metabdlica en el siguiente enlace hi iomodel.uah.es/lab/citotox/inicio.htm y debera observar en su computador el simulador como se muestra en ella figura 5. aSeray 0 BenenEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e eraureater i eee OSS Figura 5. Simulador de Ensayo del MTT para viabilidad metabdlica disponible en linea http://biomodel.uah.es/lab/citotox/inicio. htm 2. Prepare las disoluciones de perdxido de hidrogeno de acuerdo como se indica en la primera parte del experimento 3. Registre los valores y verifique la preparacién, incluya esta informacion en el informe. 4. ingrese al enlace “fundamento” y alli encontrara la informacién relacionada al método colorimétrico empleado en el experimento. 5. Realice la segunda parte del ensayo siguiendo los 10 pasos mencionados en el simulador. 6. A partir de la gréfica determine la concentracién a la cual el 50% de las células ya no presentan actividad metabdlica 7. Registre todos las capturas y datos en el informe de la practica. Evaluacién de la Practica Una vez desarrollada la practica ingresar al siguiente enlace, registrar sus datos y responder las preguntas tty fforms.gle/LML3cSNB17STrQWDA aera 0 BatonEscuela de Ciencias Basicas, Tecnologia e Ingenieria Referentes Universidad de Malaga, 2017. Técnicas basicas en Bioquimica: espectrofotometria [archivo de video) recuperado en ‘ 2v=fXiP. Pefiaranda L. 2020. Practica # 5: Cuantificacién de proteinas [Archivo de video] recuperado en https://youtu.be/NH7BBGUXqos Miller D.D. 2001. Quimica de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Ensayo del MTT para viabilidad metabdlica [disponible en linea] recuperado en http://biomodel.uah.es/lab/citotox/inicio.htm Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Espectrofotémetro UV-VIS virtual [disponible en linea] recuperado en http://biomodel.uah.es/lab/abs/cinetica.htm Herréez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Simulador de electroforesis de proteinas sobre acetato de celulosa [disponible en linea] disponible en http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH aplicar_muestras.htm Garcia Jerez A. 2018. Cinética Enzimatica [Archivo de video] recuperado en _hi //www.youtube.com/watch?v=sLrhI9mgHDi Herrdez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Espectrofot6metro UV-VIS Virtual [disponible en linea] disponible en http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm aeray 0 Benen