Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

Trần Khiêm Hùng

trankhiemhung@yahoo.com
0906334336
 Cơ thể con người, cụ thể là lympho B và lympho T nhận dạng KN bằng cái
gì? Như thế nào?
 Tác nhân gây bệnhvào cơ thể, cơ thể cần loại trừ bằng miễn dịch dịch thể,
miễn dịch tế bào, miễn dịch tự nhiên…
Miễn dịch dịch thể
A. Lympho B:
 Bề mặt mang nhiều BCR (B cell receptor-bản chất giống kháng thể do
tương bào tiết ra), chức năng của BCR là nhận dạng kháng nguyên
 BCR: gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ nối với nhau bằng cầu nối
disulfite( S-S), tạo cấu trúc bền chắc
 BCR có phần FAB(Fragment antigen binding): phần này kết hợp với
KN
 KT gắn với 1 đầu của KN, đầu tiếp xúc của KT gọi là paratop, đầu
tiếp xúc của KN gọi là epitop. Cùng 1 KN này có rất nhiều epitop, các epitop này
có thể giống hoặc khác. BCR gắn lên epitop của KN, tất cả các BCR này đều
giống nhau(gắn trên cùng 1 lympho B) các paratop này giống nhau, gắn đặc
hiệu cùng 1 epitop mà ko cần tb trình diện KN
 Cấu tạo chuỗi nặng : 5 loại (chuỗi µ cấu tạo IgM, chuỗi  cấu tạo
IgE, chuỗi  cấu tạo IgA, chuỗi  cấu tạo IgD, chuỗi  cấu tạo IgG), từ 5 loại này
mà ta có thể biết KT loại gì
 Cấu tạo chuỗi nhẹ: có 2 loại (chuỗi  hoặc chuỗi )
 Kháng thể bề mặt BCR chỉ có 2 loại: IgM hoặc IgD, nhưng sản phẩm
tạo ra có thể là 1 trong 5 loại (đây là điểm khác thứ 1 so với các KT lưu hành
trong máu)
 Điểm khác thứ 2: BCR có thêm cấu trúc xuyên màng để cắm vào bề
mặt lympho B (KT tự do không cần cắm vào bất cứ nơi nào nên không cần cấu
trúc xuyên màng)
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

B. Xử lý KN như thế nào?

 MDDT: KN không được xử lý vì không cần thiết( ngay từ đầu đã nhận
dạng dc KN)

C. TB tăng sinh, hoạt hóa???

 KN vào KN kích thích lympho B ( có BCR nhận dạng được KN
này)( ko phải tất cả các tb lympho B nhận dạng được KN này) 1 lympho B đặc
hiệu với 1 loại KNkích hoạt KN nhờ TCD4 tiết ra cytokine kích thích lympho
B được kích hoạt biến đổi thành tương bào.
 KN này không được xử lý vì: sản phẩm của tương bào là KT, KT tạo
ra để gắn lên bề mặt KN
 Tương bào to hơn lympho B
 Các BCR trên bề mặt mất hết, trong tương bào xuất hiện nhiều bào
quan( lưới nội chất, nhân, ty thể….), bào quan ngày càng tăng, chuẩn bị cho“nhà
máy” sản xuất KT tự do( ko có phần xuyên màng), đầu paratop của KT gắn lên
epitop (KN).

D. Cơ thể loại trừ vật lạ như thế nào?

Cơ chế: KT gắn đặc hiệu với KN mà KN đó kích thích tạo ra nó. KT gắn phần FAB
với KN, đầu FC đưa ra ngoài. 1 số tb, vd như đại thực bào có thụ thể với FC, đại
thực bào tới, gắn vào FC, sau đó nó nuốt phức hợp này.

E. Kết quả của đáp ứng miễn dịch

 Nhờ KT gắn vào KNKN dễ bị thực bào hơn so với KN kết hợp với
việc không có KTloại trừ KN nhanh chóng, dễ dàng.
 KN kết hợp với KT nó sẽ hoạt hoá bổ thể( là các protein có trong
máu, nhưng bình thường không được hoạt hóa) theo cách thức: Kn kết hợp với bổ
thể, hoạt hóa theo kiểu dây chuyềnhoạt hóa hàng loạtkết quả: bổ thể sẽ lắng
đọng lên chỗ mà tại đó Kn kết hợp với KT, khi lắng đọng tại đó, sẽ tạo ra lỗ
thủngcần loại trừ
 Hiện tượng opsonin hóa: KT bao xung quanh KNKN không gắn
được vào bất kì thụ thể nào( VD: thụ thể thần kinh)KN bị trung hòa. Hiện
tượng này giúp trung hòa tác động của KN.
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

Miễn dịch tế bào

A. Lympho T : Lympho T gồm T hỗ trợ ( còn gọi làTCD4) và T gây độc ( còn
gọi là TCD8) Bề mặt mang nhiều TCR( T cell receptor)

Nói về MHC:( Major Histocompatibility Complex)- Phức hệ hoà hợp

mô chính( trong miễn dịch tb)
 Bản chất là protein bề mặt tế bào, do gen MHC tạo ra, có 3 loại: MHC
lớp I, MHC lớp II, MHC lớp III( cấu tạo 3 lớp này khác nhau)
 Chức năng: KN nằm trên bề mặt MHC, sau đó trình diện cho 1 tế bào
nào đó. KN (peptid) gắn lên MHC bằng những liên kết hydro (lk H) tương đối
chặt chẽ.
 Chức năng trình diện KN
 MHC lớp II chỉ có ở những tế bào trình diện KN: tb đại thực bào, tb
răng, tb lympho B
 MHC lớp I: có ở hầu hết các tb đa nhân
 Lịch sử MHC: trước đây là HLA (Human Leucocyte Antigen),sau
này phát hiện KN trên bề mặt bạch cầu không chỉ có trên bề mặt bạch cầu mà có ở
khắp nơiđổi tên gọi thành MHC
 Nghiên cứu HLA: ???
 Sau khi ghép nội tạng, phải dùng thuốc ức chế miễn dịch( sử dụng
suốt đời)cơ thể người đó rất yếu, dễ nhiễm trùng

TCR được trình diện KN( KN ngoại sinh) như thế nào?
 2 tế bào tiếp xúc với nhau: 1 bên là tb T hỗ trợ (TH) , 1 bên là tế bào
trình diện KN có các thụ thể ( protein bề mặt)thực hiện chức năng của tế bào
 TH (có CD4 ): chức năng CD4 là gắn kết với phân tử MHC lớp II, nhìn
vào 1 phần của phân tử MHC II
 TH (có TCR ):chức năng TCR là nhìn KN ( KN này phải được trình
diện cùng phân tử MHC II) TCR nhìn cùng 1 lúc 2 phần: peptid( trên bề mặt
MHC II) và MHC II, nếu thiếu 1 trong 2 thì không nhận dạng được
 Peptid từ bên ngoài màng tbvào tb trình diện KN bằng hiện tượng
nhập nội bào ( tùy thuộc kích cỡ KN mà ẩm bào hay thực bào), KN này sẽ được
xử lý thành những mảnh nhỏtrình diện lên màng tb cùng phân tử MHC II
 Chỉ kích thích TH mà ko kích thích lympho T khác
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 TCR( nhìn peptid và MHC II) và CD4( nhìn MHC II) cùng phát tín
hiệu đi vào trong tế bàokích thích tb TH hoạt động
 Tuy nhiên, TCR có phần xuyên màng (phần trong bào tương) ngắn so
với các phần khác, để tín hiệu được truyền sâu vào trong TCR phải kết hợp với
CD3 (CD3 có phần bên trong bào tương dài hơn)giúp truyền tín hiệu, kích thích
từ ngoài vào trong tế bào( cụ thể là nhân tb), lúc đó tb sẽ sản xuất ra 1 số protein
đáp ứng kích thích từ bên ngoài
 CD28, CD45, CD22, B7 cũng là các peptid màng tb nhưng sự liên kết của
những peptid này không đặc hiệu. Vai trò: để cố định, gắn 2 tế bào 1 cách chắc
chắn hơn( do cơ thể luôn di động) và đủ thời gian kích hoạt các thụ thể. Nếu
không có các peptid này thì 2 tb gắn với nhau rất lỏng lẻo, không đủ thời gian tiếp
xúc để kích thích đã bung rakích thích không hiệu quả. Đó là TH được kích hoạt
bởi tb trình diện KN như thế nào

TCR được trình diện KN( KN nội sinh) như thế nào?
 Khi TCD8 tiếp xúc với tb đích (target cell)( tb mục tiêu bị bệnh cần phải
tiêu diệt). Tế bào đích này là KN nội sinh(KN được tạo ra từ bên trong nhân)
trình diện MHC I bên trong tế bào, sẽ được xử lý, trình diện lên màng tb cùng
MHC Inhận dạng bởi TCR.
 TCR nhìn MHC I và peptid lạ, TCD8 nhìn MHC I, kích hoạt T gây độc,
sau đó biến đổi thành T sát thủtiêu diệt tb đích (nhiễm bệnh)
 Tuy nhiên, TCR có phần xuyên màng (phần trong bào tương) ngắn so
với các phần khác, để tín hiệu được truyền sâu vào trong TCR phải kết hợp với
CD3 (CD3 có phần bên trong bào tương dài hơn)giúp truyền tín hiệu, kích thích
từ ngoài vào trong tế bào( cụ thể là nhân tb), lúc đó tb sẽ sản xuất ra 1 số protein
đáp ứng kích thích từ bên ngoài
 Các thụ thể không đặc hiệu trên tb T gây độc và tb đích giúp 2 tb dính
lại chắc chắn với nhau
 TCR gây độc nhận diện đặc hiệu MHC I

Câu hỏi đặt ra: TCR và CD8 có gắn được với MHC II hay không?
Có vì :
 Trong tb có nhân bình thường luôn có MHC I, vì nó là tb trình diện
KN( tb răng, tb lympho B, tb đại thực bào) nên có thêm MHC II.
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 Tế bào T hỗ trợ hay T gây độc đều có khả năng bị bệnh. Bất kể tb đích
nào có hay không có MHC II, nhưng có MHC I là T sát thủ đến giết.
 Tế bào T gây độc cũng giết tb T gây độc khác (nếu tb này bị bệnh)

B. Xử lý KN như thế nào?

 MDTB: KN được xử lý trước khi nhận dạng bởi tb lympho TCD4,TCD8.
Quá trình xử lý này được thực hiện bởi tb trình diện KN-MHC II( KN ngoại
sinh), hay trình diện MHC I( KN nội sinh)
 Con đường đi của KN nội sinh khác KN ngoại sinh
 KN ngoại sinh: KN lạvào tb trình diện KN( = hiện tượng nhập nội
bào hay thực bào)biến thành thể thực bào, rồi phối hợp với thể tiêu bào( chứa
men)hợp lại tạo thành thể hòa màng (thể fusion)cắt KN thành những mảnh
nhỏ( xử lý KN). MHC II được tạo ra và đưa đến đây, peptid sẽ gắn lên MHC
IItrình diện lên màng tb
 KN nội sinh: KN được tạo ra từ bên trong tb (nhân), cũng là tb của cơ
thể( vd: tb nhiễm VR hay tb ung thư), tổng hợp ra mRNA của KN lạ đóđưa ra
ngoài bào tươngtổng hợp protein lạ. MHC I cũng hình thành mạng lưới bào
tương, sau đó peptid sẽ gắn lên MHC I, phức hợp này được đưa ra ngoài màng
tbđược nhận dạng bởi tb đích tương ứng của nó

C. TB tăng sinh, hoạt hóa???

 KN vào gặp tế bào T
 T gây độc: tiếp xúc KN, KN này được trình diện bằng phân tử MHC I.
T gây độc nhận diện MHC I và KN trình diện lên tb đích, TCD4 không tiêu diệt tb
nào, nhưng nó tiết ra cytokine kích hoạt quá trình biến T gây độcT sát thủ. Bào
tương cũng mang nhiều bào quan khác nhaucũng là 1 “nhà máy sản xuất vũ khí”
 T hỗ trợ: khi nhận dạng được KN, KN này phải được trình diện bởi
MHC II, trên MHC II mang peptid và trình diện bởi tb trình diện KN. Sau khi
nhận dạng được, TH được kích hoạt sau đó nó biến đổi thành TH được hoạt
hóatiết ra cytokine
 Cytokin còn giúp đỡ các miễn dịch tự nhiêncytokin có vai trò điều
hòa, điều phối miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào, và cả miễn dịch tự nhiên. Nếu
ko có cytokinđáp ứng miễn dịch sẽ bị rối loạn.
 Cytokin là 1 chất do tb tiết ra, bản chất là peptid, nhưng không phải là
nội tiết tố. Các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ, khi được tb tiết ra, đi vào gian
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

bào gắn vào 1 tb nào đó, trên tb đó có thụ thể của cytokine đógiúp tb đó thực
hiện chức năng, tùy thuộc thụ thể:
 Thụ thể nằm trên tb đã tiết cytokine: cytokine tiết ra, tác dụng lên
chính tb đó hiện tượng tự tiết
 Thụ thể nằm trên tb lân cận của tb tiết cytokinehiện tượng cận tiết
 Cả 2 đều có nồng độ tiết ra rất thấp

D. Cơ thể loại trừ vật lạ như thế nào???

Cơ chế:khi TCD8 biến thành T sát thủphá tbtb bệnh bị tiêu diệt
E. Kết quả của đáp ứng miễn dịch:
 TH tiết ra 1 số cytokine giúp hoạt hóa lympho B thành tương bào, biến
lympho T gây độc thành T sát thủ
 Lympho TCTL: ly giải tb nhiễm VK,tb ung thư
 Lympho TDTH: 1 dạng dưới nhóm của lympho TCD4
 Miễn dịch thu được rất đặc hiệu. Tuy nhiên, tính đặc hiệu này cũng là
1 trở ngại trong 1 số trường hợp bệnh lý. Vd: khi nhiễm HIV, đột biến quá nhiều,
miễn dịch thu được tạo ra nhưng không hiệu quả, vì HIV đã thay đổi hình
tháiđôi khi miễn dịch tự nhiên có thể thay thế miễn dịch thu được. 1 trường hơp
đột biến không có lympho TCD8 trong cơ thể nhưng vẫn sống bình thường khỏe
mạnh( vì tuy không có T sát thủ tiêu diệt những KN lạ nhưng có những cái khác
thay thế)

Thuyết chọn dòng

 Lượng tb tăng lên 1 cách khủng khiếp. Hemantoric là tỉ lệ huyết
cầu/huyết tương=40-45%/60-55%. Với tỉ lệ này, máu có thể chảy dễ dàng trong
mạch máu. Nếu máu có tỷ lệ huyết cầu quá nhiềumáu không chảy được. Khi cơ
thể tiếp xúc với KN lạ, antigen 2 xuất hiện, cơ thể sẽ chọn dòng. Lúc đầu cơ thể
có nhiều dòng khác nhau, mức độ số lượng tế bào nhu nhau, nhưng khi tiếp xúc
với KN lạ, cơ thể chỉ cho những dòng nào đã tiếp xúc với KN phát triển gia tăng
số lượng tb KT chống lại KN số 2(đây là thuyết chọn dòng)
 Cả lympho B và lympho T đều có thuyết chọn dòng. Cơ thể tiếp xúc
KN, cơ thể sẽ tạo ra các tb thực hiện tùy theo tb đáp ứng MDDT hay MDTB mà
chúng ta có những dạng tương ứng.
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

1. Kỹ thuật kết tủa trong thạch: (precipitate reactions in gels)

1.1. Nguyên lý:
 Đảm bảo rằng khi có hiện tương KN kết hợp với KT thì thấy đường kết tủa
 Để có phản ứng xảy ra, chúng ta cần phải có 1 số điều kiện sau:
 Kháng nguyên: thuộc loại KN hòa tan, vd: tb tạo ra  phetoprotein. Phản
ứng xảy ra trong môi trường thạch (nồng độ 2-3%). Khi mới cho agar vào, môi
trường đục, chưa tan. Sau khi đun sôi, dd trong suốt, agar tan hoàn toàn, cho vào
khuôn( xác định được diện tích, chiều dày), để nguội thạch đông cứngcho
KN,KT vào, chúng khuếch tán và gặp nhau. Agar khi hòa tan tạo thành lưới, giam
bên trong là môi trường nước. Nếu KN không hòa tan(khối lượng lớn) không
qua lưới được
 Kháng thể: đa giá( mạng lưới), chính mạng lưới này giúp ta thấy được
đường kết tủa. KT không đa giá sẽ không tạo mạng lưới
 Tỉ lệ KN-KT tương ứng nhau và KN-KT đặc hiệu lẫn nhau.Thí nghiệm với
11 ống nghiệm: cho vào 11 ống này cùng 1 thể tích KT như nhau, cho KN tương
ứng vào( nồng độ khác nhau,tăng dần đến ống 11). Để 1 khoảng thời gian cho
chúng kết hợp lại với nhauđem li tâm (phức hợp KN-KT nặng nên lắng xuống
đáy, dịch nổi là nước, KT tự do, KN tự do. Sau đó cân phức KN-KT lần lượt 11
ống vẽ đồ thị. Khi KN kết hợp với KT trong thạchtạo đường kết tủa(nồng độ
cao nhất, không tìm thấy Kn và KT thừa),nghĩa là KN và KT phải kết hợp với
nhau hoàn toàn, càng nhiều kết tủatạo mạng lướicàng dễ thấy. Tỷ lệ KN-KT
tương ứng để kết hợp tạo thành mạng lưới tối đa. Vị trí khác vẫn có KN kết hợp
KT nhưng không chắc sẽ có đường kết tủasẽ có KN,KT dư thừa. VD: KT quá
nhiều, KN cho vào ít hoặc ngược lạichỉ tạo những đốm nhỏ
 PP này mang tính chất định tính, bán định lượng( định lượng trong 1 khoảng
xác định)

1.2. Khuếch tán miễn dịch vòng (single radial immunodffusion/ manci
method)( khuyếch tán miễn dịch đơn)
 Môi trường agarđun sôiđể nguộitạo thành thạchkhoét 1 giếng nhỏ,
lấy thạch ra, cho KN vào, nồng độ KN ở giếng cao nhất, sau đó khuếch tán ra
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

xung quanh sau 1 thời gian hình thành đường kết tủa. Đường kết tủa trong
thạch(không trong suốt, hơi đục )kết luận có phản ứng xảy ra.
 Kháng thể (kháng huyết thanh )được hòa tan vào thạch đun lỏng ở nhiệt độ
700C , trộn đều ( vì nếu cho vào lúc sôi, bản chất KT là protein, KT sẽ biến tính,
không thể cho vào lúc nguội vì thạch đã đông).
 Hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt
trên mặt phẳng ngang. Sau khi thạch đôngđục các lỗ tròn trên thạch và cho KN
cần đoKN sẽ khuyếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa
KT(kháng huyết thanh) xung quanhTự KN và KT sẽ khuếch tán tìm chỗ tương
đồng. Bởi vì nồng độ KT (kháng huyết thanh trong thạch) cố định KN trong lỗ
khuyếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỷ lệ thích hợp với nồng độ KT
trong thạch thì một vòng kết tủa sẽ hình thành.
 Nếu tăng nồng độ KN: sau 1 thời gian, tại gần giếng, nồng độ KN vẫn cao
hơn vị trí tương đồng ban đầuvị trí tương đồng mới càng đi xa giếng. Nếu giảm
nồng độ KN: sau 1 thời gian, tại gần giếng, nồng độ KN vẫn thấp hơn vị trí tương
đồng ban đầuvị trí tương đồng mới sẽ gần giếng.
 Ứng dụng kỹ thuật này để định lượng, định tính KN
 Có thể dùng pp này để xác định được nồng độ chất thử. Sự tương quan giữa
nồng độ KN cho vào với đường kính kết tủa là phương trình tuyến tính. VD:Trên
1 thạch lớn đã có KT, khoét 6 giếng(1,2,3,u1,u2,u3)( giếng 1,2,3 cho những nồng
độ KN khác nhau mà đã biết trước nồng độxác định được đường kết tủa nối
lại thành đường biểu diễn tuyến tính. Khi biết được đường kính u2 đo được
nồng độ giếng u2( xem hình)
 Đây là cơ sở để định lượng KN,( nếu là KT thì làm ngược lại)
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

Hình: Đường chuẩn dùng trong định lượng protein đặc hiệu(KN) bằng
khuyếch tán đơn
Lỗ 1-3 chứa nồng độ, chuẩn đã biết của loại protein(KN) muốn đo. Trên trục tọa
độ là đường chuẩn đã được vẽ. QC =  quality control, kiểm tra chất lượng.

1.3. Khuếch tán miễn dịch kép(double immunodffusion/ ouchterlony

method)- Ứng dụng định tính KN.
 Protein trong máu tích điện +, hay -, hay ko tích điện. Khi đặt vào điện
trường, protein tích điện + chạy tới cực -, protein tích điện – chạy tới cực +.
 Tương tự khuếch tán miễn dịch vòng, nhưng trên thạch khoét 2 giếng: 1
giếng KN, 1 giếng KT(kháng huyết thanh của người). KN,KT khuếch tán theo
mọi hướng, sau đó hình thành rất nhiều đường kết tủa đan xen nhau,những đường
này nằm khoảng giữa 2 giếng. Vì lý do đó, ta cần điện di tách rời các protein này
ra, tùy theo kích cỡ, sự tích điện của nó, tách rời các đường kết tủa.
 Bất kì thử nghiệm nào cũng có độ nhạy, nồng độ KN phải ở 1 mức tối thiểu
nào đó mới phát hiện được KT. Ta chọn 1 giá trị pH thích hợp đảm bảo KT đi về
cực -, KN đi về cực +. Khi đưa vào điện trường, độ nhạy của KN tăng lên rất
nhiều.
 KT ko đổi, nếu nồng độ KN tăng hay giảm thì có những đường khác nhau.
 Ứng dụng: giúp xđ tính đồng nhất của KN. VD: xác định phetoprotein đã
tinh chế hay chưa
Đổ thạch lên lam, khoét 3 giếng
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 TH1: giếng dưới chứa KT chống A, giếng trái chứa KN

A(phetoprotein chưa biết đã tinh chế hay chưa),bên phải chứa KN A
(phetoprotein đã chắc chắn là tinh chế ).Nếu KQ cho ra 1 vạch hình mũ ôpu
kết tủa của KN từ giếng trái và phải với KT là như nhau phetoprotein ở giếng
trái là tinh chế
 TH2: giếng dưới chứa KT chống A và KT chống B, giếng trái chứa
KN A.Giếng phải chứa KN BKQ cho 2 vạch chéopu kết tủa của KN từ 2
giếng với KT là khác nhauko thể xác định dc tính đồng nhất của KN giếng
trái phetoprotein ở giếng trái là ko tinh chế
 TH3: giếng dưới chứa KT chống A và KT chống B, giếng trái chứa
KN A và KN B.Giếng phải chứa KN BKQ cho 1 đường mũ ô và 1 đường phụ
khácpu kết tủa của KN từ 2 giếng với KT là đồng nhất nhưng ko biết đồng nhất
về KN A hay KN B phetoprotein ở giếng trái là tinh chế 1 phần
 TN: Tinh chế  phetoprotein trong cuống rốn trẻ mới sinh( do cuống rốn có
nhiều protein). Xác định tính đồng nhất của KN.  phetoprotein là 1 protein tạo ra
trong giai đoạn phôi thai của đứa bé, sau khi ra đời chất này sẽ giảm, từ từ mất đi,
và ko còn trong cơ thể trưởng thành. Nếu tìm thấy  phetoprotein trong máu nghĩa
là có thể bị ung thư gan

1.4. Điện di miễn dịch

1.4.1. Điện di 1 phức hợp protein (immunoelectrophoresis of an antigen
mixture)
Đào 1 cái rãnh trên thạch, khoét lấy thạch, đổ KT vào, KT khuếch tán tự do, KN
cũng khuếch tán tạo nên đường kết tủa. VD: Bình thường tại vị trí đó là albumin,
nếu ko có đường tủa, ta kết luận là bệnh nhân ko sx albumin.
1.4.2. Điện di hỏa tiễn(rocket electrophoresis)
Nguyên lý: giống kĩ thuật khuếch tán miễn dịch vòng (đơn). Vd: có 5 mẫu KN,
mẫu 1,2,3,4 là chuẩn (đối chứng), mẫu 5 là mẫu cần xác định. Dùng để định lượng
Độ chính xác và độ nhạy cao hơn khuyếch tán đơn. Protein khảo sát được
cho chạy trong một điện trường vào trong gel chứa KT tương ứng (Hình).
Ta thấy có sự tương quan tuyến tính giữa chiều cao của cột tủa với nồng độ
của kháng nguyên.
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

Hình: Sơ đồ minh họa hình ảnh điện di miễn dịch hỏa tiễn.

Độ cao của cung tủa tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Tủa có thể nhìn thấy rõ
sau khi nhuộm. Các nồng độ chuẩn được dùng để vẽ đường chuẩn, từ đó tính được
các nồng độ chưa biết dựa vào chiều cao x đo được

2. Kỹ thuật ngưng kết( agglutination reaction)

2.1. Nguyên lý:
 Tương tự như trong nguyên lý của kỹ thuật kết tủa, nhưng có 1 điểm khác
biệt ở kỹ thuật này là: KN thuộc loại KN không hòa tan như hồng cầu, bạch
cầu ,VK…
 Thậm chí, người ta có thể biến đổi KN hòa tan thành KN không hòa tan
bằng cách dùng những giá đỡ như hạt latex( hạt nhựa, không hòa tan), hồng cầu,
bạch cầu, VK…
 KN,KT ko tự tìm vị trí tương đồng, hiện tượng tương đồng này do ta tạo
ra( nồng độ KN, KT phải tương đồng nhau)
 Kỹ thuật này dùng định tính, bán định lượng, chuẩn độ KT bằng cách pha
loãng huyết thanh
 Thí nghiệm với giếng ELISA:
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 Với 3 dãy giếng elisa: dùng giếng đáy chữ U( có điểm thấp nhất), ko
sử dụng đáy bằng( mọi điểm đều thấp nhất)
 Dãy A(12 giếng): cho KN gắn lên mặt hồng cầu vào các giếng với
nồng độ không đổi.VD: nhỏ 1 giọt máu vào
 Dãy B(12 giếng): cho KN gắn lên mặt hồng cầu vào các giếng với
nồng độ không đổi. VD: nhỏ 1 giọt máu vào
 Dãy C(12 giếng): dãy đối chứng( mẫu trắng), cho KN gắn lên mặt
hồng cầu vào các giếng với nồng độ không đổi. VD: nhỏ 1 giọt máu vào
 Sau đó cho KT (KT từ máu bệnh nhân( huyết thanh), máu này có thể
có KT hoặc ko có KT). Tỉ lệ máu được pha loãng với các nồng độ khác nhau:
1/10,1/20,1/40,1/80…cho vào lần lượt 12 giếng của dãy A( máu bệnh nhân A),
dãy B( máu bệnh nhân B). Máu pha loãng bằng nước muối sinh lý -pha loãng
huyết thanh( KT). Dãy C ko cho KT vào
 Trộn đều KN,KT, sau 1-2 giờ, nếu:
 Ko tạo mạng lướilắng xuống đáy( sử dụng đáy chữ U, đáy
bằng lắng đều ko phân biệt dc)
 Tạo mạng lưới: có sự kết hợp KN trên hồng cầu với KT từ máu
bệnh nhânmáu bệnh nhân có KT chống KN trên hồng cầu đó
 Tại chỗ nồng độ KT cao nhất (giếng 1): mẫu A ko có hiện
tượng ngưng kết, mẫu B có hiện tượng ngưng kết vì: mẫu A không có hiện tượng
tương đồng( hoặc KT quá nhiều, hoặc KN quá nhiều)cần pha loãng. Vì nồng
độ KN như nhau cả 2 dãy A và Bnồng độ KT dãy A cao hơn dãy B
 Tại chỗ có nồng độ KT trung bình: mẫu A có hiện tượng ngưng
kết( tạo mạng lưới), mẫu B ko ngưng kết vì: lúc tại nồng độ này, mẫu B ko có KT
(quá loãng)
 Cả 12 giếng của dãy C: KN trên mặt hồng cầu đều lắng xuống,
ko ngưng kết do ko có KT

2.2. Kỹ thuật ngưng kết trực tiếp

 Tìm KN gắn lên hồng cầu
 KT tự nhiên: trong cơ thể ko có KN, vẫn có KT chống KN đó
 KT miễn dịch: khi có KN xâm nhập, cơ thể tạo ra KT chống lại nó
 Câu hỏi: truyền đúng nhóm máu A,B,O vẫn sinh ra miễn dịch chống
lại, vì sao???
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 Vì: Bên cạnh nhóm máu ABO, cơ thể vẫn còn có những nhóm máu
phụ khácmáu truyền vào là KN lạ, cần phải phù hợp với nhóm máu phụ. Khắc
phục bằng cách thiếu gì truyền đó, ko nhất thiết là truyền máu
 Đối với những KN đã bị KT bao phủ thì khi cho KT vào nữa nó sẽ ko
tạo hiện tượng ngưng kết, như vậy để phát hiện dc KN, người ta sẽ cho KKT vào.
KKT sẽ liên kết với KT tạo hiện tượng ngưng kết.
2.3. Kỹ thuật ngưng kết gián tiếp
 Tìm KT tự do
 Đối với những KN chưa có KT bao phủ thì người ta sẽ cho KT tương
ứng vào trước, sau đó sẽ cho KKT vào để nó tạo ngưng kết với những KT đã bao
phủ KN. Kỹ thuật này phát hiện KN bằng KKT thông qua KT nên dc gọi là gián
tiếp
3. ELISA( enzyme linked immunosorben assay)
3.1. Nguyên lý:
Dùng để định lượng KN hoặc KT. Trong thử nghiệm luôn có thang chuẩn đi
kèm
Có nhiều loại men khác nhau:peroxydase…
Có nhiều loại cơ chất khác nhau thích hợp cho mỗi loại men
Do vậy kết quả phản ứng có nhiều màu sắc khác nhau và được phát hiện ở
những bước sóng khác nhau( đo OD xác định cường độ màu). Mật độ tương
quan giữa độ màu và OD tuân theo định luật tuyến tính.

3.2. Thử nghiệm ELISA gián tiếp ( indirect elisa)

 Cho KN phủ lên 1 bề mặt nào đó của giếng ELISA. Rửa để loại
những KN tự do
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 Cho KT đặc hiệu với KN cần tìm vào. Ủ. Nếu KT nghi ngờ là KT đặc
hiệu cho KN này thì KT sẽ gắn lên KN. Rửa để loại trừ những KT tự do.
 Cho KT thứ 2 có mang enzyme vào, KT này sẽ gắn lên KT thứ nhất.
Rửa để loại những KT tự do
 Cho cơ chất vào, cơ chất sẽ nhờ enzyme của KT thứ 2 xúc tác pu tạo
màu
 Dựa vào phức màu này so với thang chuẩn đã dựng ta sẽ định lượng
 KT hoặc KN càng ít thì độ đậm càng ít và ngược lại
3.3. Thử nghiệm bánh mì cặp chả (sandwich ELISA)
(KN bị kẹp giữa 2 KT)
 Cho KT phủ lên 1 bề mặt giếng. Rửa để loại KT tự do
 Cho KN vào ủ, nếu KN nghi ngờ là KN đặc hiệu cho KT này thì sẽ
gắn lên đó. Rửa để loại KN tự do.
 Cho tiếp KT đặc hiệu thứ 2 có mang enzyme vào gắn lên KN. Rửa để
loại trừ KT tự do
 Cho cơ chất vào, cơ chất sẽ nhờ enzyme của KT thứ 2 xúc tác phản
ứng tạo màu
 Dựa vào phức màu này so với thang chuẩn đã dựng, ta định lượng KN
 Cường độ màu OD tỉ lệ thuận với lượng KT hoặc KN

Elisa sandwich KN
3.4. Thử nghiệm cạnh tranh (competitive ELISA)
Hàn Hồng Nguyên- SH08A1

 Trộn KN và KT lại với nhau. Như vậy, sẽ có những KT gắn với KN

đặc hiệu với KT đó, và có những KT ko gắn dc gọi là KT tự do
 Cho hỗn hợp này vào giếng ELISA đã có sẵn KN của nhà sx, sau đó
ủ. Các KT tự do sẽ gắn với KN của nhà sx. Rửa để loại trừ những KT đã mang
KN ban đầu và những KT ko gắn với KN nào.
 Cho KT thứ 2 có mang enzyme vào, KT này sẽ gắn lên KT thứ 1 ( là
KT đang gắn với Kn của nhà sx). Rửa để loại những kháng nguyên tự do.
 Cho cơ chất vào, cơ chất sẽ nhờ enzyme của KT thứ 2 xúc tác phản
ứng tạo màu
 Dựa vào phức màu này so với thang chuẩn đã dựng, ta định lượng KN
 Lượng KN cần tìm ban đầu càng nhiều  phức màu càng nhạt( vì
lượng KN ban đầu càng nhiềulượng KT đặc hiệu gắn với nó càng nhiều
lượng KT tự do càng ítlượng KT tự do càng ít sẽ gắn lên KN của nhà sx càng
ítKT 2 mang enzyme gắn lên nó cũng ít phức màu càng nhạt)
 Lưu ý: không phải lúc nào cường độ màu OD cũng tỉ lệ thuận với
lượng KN ta muốn tìm