SOOUSCINTIRCA TE 28 Le imine J0DOus.. iss: 15 3823 INDICE REVEMCY TRINH EATINDES 1219 PERIODIC & PARIONED Caracteristicas fisicoquimicas de la saliva de pardtida y actividad antimicrsblana-antioxidante de Ia peroxidasa salival en escolarcs con gingivitis Physicachemieal characteristics and antimicrobial-antiosidant activity salivary peroxidase of parotid saliva in scholar children with gingivitis Pérez D, Mariela, Villalobos G, Angela Depurtamento de Ciencias Mertotimcionales. Facultad dc Odontologia. Universidad de Carabobo midperez1@uc.cdu. ve ecile VRS 201L Aceptade: 050501 Resumen La saliva cs um fluido bipoténico, con una excrecién totul de 1 -1,8 Lidia, pero on condiciones de estimulacién glandular se inerementa a 0,3-0,4 ml min, represeatada prineipalmente (50%) por Ja saliva de Ja glindutz parétida. La saliva contieng electrlitos y macromoléculas como peroxidssa salivel, cnzima con propiedades antimiccobianas y antioxidantes. Lin este estudio se determinaron las caracteristions Fsivoquimicas de la saliva de perdtida cstimulada (flujo salivel, pI[, capacicad amorriguadora) y ta actividad de Is peroxidava salival en escolares con gingivitis, La mucstra cscavo conformada por 16 nitios con gingivitis, entre 9 y 1d alos de edad, del sexo femmenino masculine. El diagnéstico de la enformedad gingival se realiz6 segin indice gingival (Loc-Silness), placa gingival (Silness-Lec) y sangramienty (Ainamo- Bay). Se determing Ta actividad de fs peroxidesa salival (espectrofotometria), fuga: salival, pl, concentracién de bicarbonate (HCO,) y prateinas. FL promaho del flujo salival ice 0,7540,31 mL/minigland y volumen total 45=1,8mL; pH 8,3 - 0,7; HCO,: 61,134 21,84mM y proteinss: 100 a 200mg/il. en el 87% de Los nilios, Todos ellos presextaroa placa deutobacicriana_y gingivitis. La potoxicasa salival mostré mayor actividad enzimatica ca eondigiones LinM H,0,, oHI7 (25, 36-38°C). Los resultados de este esrudio mostraron que la actividad de Ti pezexidasa salival y la capacidad amortiguedora, no resularon aiectadas en los escolares que presentaron placa dentobacteriana y gingivitis, Palabras clave: saliva estimuleda, saliva parétida, peroxidase salival, flujo salival. Summary. Physicochemical characteristics and antimicrobial-antiovidant setivity salivary peroaidase of parotid saliva in scholar children with gingivitis. Salivs is a hypotonic fluid, the whole salivary flow exerotion is a 1-1,5 Liday, but in conditions of glandular stimulation increases to 0.3-0.4 mLimin, represented mainly (50%) by saliva the parotid gland. Saliva comains electrolytes and macromolecules such as salivary peroxidase, enzyme with antimicrobial and antioxidant properties, In this study, it was determined the physicochemical chametcristics of stimulated parotid saliva (salivary flow, pl, buffering capacity) and salivary peroxidase (spectrophotometry) in scholars with gingivitis. The saraple was constituted by 16 children with gingivitis, between 9 and 1d years old, female and male, The diagnosis of giagival disease was determined by gingival index (Loe-Silness), gingival plaque (Silness-1 oe) and bleeding (Ainamo-Ray), Salivary peroxidase was determined (spectophotomciry), salivary flow, pEL, [LCO,| and proteins, The results showed that the mean salivary flow was 0.75 0.31 ml./ min/ gland and total volume 4.5 + 1.8 mil, pl 8.3+0.7, JHCO,}: 61.13 + 21.84 mM, ard proteins 100-200me/aL. in 87% of children, All the children had dental plaque and gingivitis. The salivary peroxidase showed activity in conditions LmM. 1BoD Ouse, <2 Lease ah HO, pHT (25, 36-38°C). These evsults showed (hal the activity of salivary peroxidase and the buffer capacity were not affected in children with ental plaque and gingivitis. Key words: stimulated sativa, parotid saliva, salivary peroxidase, salivary Now. Introduceiin Lasaliva humana presenta mis de 309 proteinas ue contribuyen a mantener ke homeostasis denatco ge la cavided oral, Dentro de este proteoma salival Tumano, se ha aisledo Ta peroxidasa salival, de #0,3 kDa con un punto isoeléctrico 8.89, ia cual ¢s una enzima coa actividad antimnicrobiana- antioxidants.’ Se deriva tanto de los dines de lus glindulas salivales, como de lox Teucocites que atravieszn el epitelio del surco gingival, sicndo le del origen acinar la que muestra mayer actividad antimicrobiana-anticxidante,"* La peroxidasa salival es una hemoproteiaa con sitios de union para cl caleio-* tiene como sustratos in vivo el idn tigcianate (SCN) y peroxide de hidrgeno (H.O,); su producto a pH neutro es el ign hipotiocianats (SCN), § y a pH baj el hipotiocianata cido (HOSCNL), el cual este en equilibrio dcido-hase con e] OSCN-. Ambas inoléculas, inhiben enzimas como la hexoquinasa, gliceraldchido-3 fosfalo. deshidrogenasa otras enzimas de la glicélisis microbiana; asi como, también inhibe el sistema de transporte de azticares y aminodcidos. tales como, lisina y dcido gluidmico; ademis, altera ¢l gradiente electroquimico de la pared bacteriana.2* Debido a su carga idnica, el HOSCN- puede penetra la membrana microbiana mucho mas rapido que cl OSCN-, por lo tanto, el efecto antimicrobiano os mis cficaz a pli bajo. Ademés, Ja actividad antimierobiana-antioxidante del sistema peroxidasa salival es proporeional a Is concentraciéa del OSCN y es mds efeetivo en saliva obtenida en condieién de reposo, que en saliva de glindula estirnulada, debido a que el pil de esia Gltima, es mas alealino y su flujo presenta una disminuciiin inmediata de tos niveles det ion OSCN,, principalmeme durante la expectaraciém. Le presencia del tiocianato y del HO, tienen un origen glandular endégeno, ya que las ghindulas 16 solivales sanas estén desprovistas de bacteria leucocites.” La placa demobacteriana tiene un predou de polisacdtidos extracelulares ecomo glucan fructanos y pecscnta una estructura que dismin In pormesbilidad hacia el exterior de metaboli como los icidos formades por los microoganiss de la placa," y disminuye la difusion dindn hacia el micrior de la piaca. por del tivcianat cuzimas como la peroxidasasalival, no permitic que su funcién desintoxicante y antirvicrebi sen efectiva Ademés cn Ja placa dentobacteriana, pu estar disminuida Ia funciéa ancimicrobiana la peroxidase salival debido a la presencia protecsas do origen miicrobicno, que pue afeotar la actividad catalitica de Ja enzima produceién del hipotiocianato’ hipctiocs Acidos" par lo tanto, en el presente estndic + determing la actividad de fa peroxidssa sali y las caracteristicas fisicoquimicas de te s2 obtenida de la glindula pardtida estimalad: nifios escolares con gingivitis. Materiales y métodos Esta investigacién es de tipo descriptiva, poblacién fue 82 nifios en edad escolar (4 ios) que asisticron al rea de Cidontopediat de la Facultad de Odontologia de ta Universi de Carabobo, desde febrero a junio del 2006. muestra estuve conlormada por 16 escolarss ( nifias y 8 nifios). Previamente, se realie5 una pricba piloto 1Wescolares, cn una muestra de saliva de pard estimulada, con un nivel de confianza 0,99, ¢ que sc mostré verianza del Muje salival 0,078 min‘glindula, Para Ia seleccién de los sujetos se consider les siguientes riterios de exclusion: ri con tratamlentos odontoligicos de ortop. ylo ortedoncia, que recibian —tratumie farmacolégicos y‘o presentaban patolovias eventualmente podrian afectar [a lisiologia las glandlutas salivales, tales como enfermeds infecciosas y/o sistémicas, traumatismos)Los criterios de inetusién fueron: nifios en cdad escolar con gingivitis y erupeidn de has unidades dentarias 15, 16, 17, 25, 26 y 27, dedido a su proxitnidad anatomica con ¢l conducto excreior de Ja parétida (éste contribuye 50%, en condicisn dc estimulacién, al fyjo de saliva total). Bara Jos fines de estudio, la muestra se clasific segiin grupo etario: de 9a 10 afos, 11a 12 anos y 13-4 14 anos de cdad. La investigecién se apegi a las Normas de la Comisién de Bioética y Bioseguridad del Ministerio del Peder Popular para Ciencia, Tecnologia ¢ Industries Intermedias por lo cual se empleo el consentimicato informade exerito que fue firmada por los padres o representantes de los aides que purticiperon cx la presente Investigacion.” Recoleccion de muestra de saliva, Se catetetiz6 el condueto excretor ¥ posteriormente se estimulo la secrcciGn de la glandula, von dcido citrice cada 30 seguados durante scis mimatos de recoleceién Las muestras se distribuyeron en alicuotas de 1 mL. y se congelaron a (-20'C} durante une semana, ‘como ticnpo maximo, para el precesamivato de las mismas. Sialomemriay caracteristicas fisicoquimicas de Ja saliva de parétida estimutada, Se determine <1 volumen total ebtenide y el lujo salival expresadi en mlminiglindula oa seis minutos, Se mid pil (pHmetro Ecoscan Eo-PH510). La capacidad amortiguadora, se chiuvo mediante fa titulacion de {a saliva de pardtida estimulada con acide lactice 0,1, eruplcando el anaranjado de metilo (pH 3.1- 4,4) como indieador colorimétrice, La determinacidn de Ja conceniracion de las Proieinas wiales fue por cspectrofotometria a 493nm (Speclronic 20} con el métdo Bradford ‘con comassie brillant blue G-250.!8 Actividad de ta perexidasa suilvel, Sc verified a través del meicdo espectefotemetrico utifizando ¢! guayacol (Shaclau) como sustrato onidable." Las condiciones de la reaveién fueron Jas siguicates: buffer fosfato 11,1 M pH 7: (fosfato de sedio monobasico, fosfato de sodio dibasic), guayacel 30mM y H,O, lM. La oxidacién del guayacol fue monitoreada a 470 nm (Speetronic 20) durante dos minutes con lecturas cada L292 Ja Digewbe 2 20 segundos a una temperatura 25 °C. Los experimentos se realizaron por triplicado y la actividad de [a enzims se expresd en unidades de absorbancia por mninuto, Pare determinar In actividad de 1a peroxidasa, se realizaron ensayes en las mismas condiciones idnicas y de temperatura, variando solo le concentracion del sustrao H,0, (mM, 2mM. SmM, 10m). En otres ensayos, so analizé cl efoto del pH sobre {a actividad de Is cazima manteniende las condiciones de coticentracion de sustratos ¥ temperatura. variandy sclo el pH (3, 5, Ty 9) del buffer fosfato, Se considers ademés, el efecto de la temperatura sobre 1a actividad catgliviea de la enzima, pot lo que se realizaron ensayos varigndo solo la temperatura (25°C, 36°C, 37°C y 38°C), en las condiciones idnicas y de concemracion de sustrato inicialmente sefialadas, Dingnéstico de gingivitis en escolares. Se realizé una evaluaciéu clinica odontologica utilivande espejo bucal y sonda pericdontal, A todos los sujetos, se exdaninaron las encias del primar y segundo premolar superior y det primer y segundo moler superior (UID 15, UD 16, UD 17. UD 25, UD 26 y UD 27), segin indicadores de inflamacion gingival, el indice gingival propuesto por Loe-Silness, indice de sangramieato GBI (gingival blcoding index- Ainamo-Ray) y el indicador de placa deatal de Silness-Loo, Para el andlisis de los datos se utilize ot programa esladisiico SPSS version 159 y se realizaton estadisticos deseriptivos. Resultados Caracteristicas fisicoquimicas de ta saliva de pardtida estimulada FI flujo salival exhibié un rango (0,5-1,18 mlLémin/glandula) con un promedio de 0.75 4 0.31 mLimin’gland. La fluctuacitin del_yolumen total obtenide con cstimulacion fue de 2a mL, preseniando uy promedio del volumen total de 4,5 1,8 mL. Qovous..... wa1. a Diins 20 @ovous...... Los valores de pH oscilaron entre 7 y 9 con um promodio de 8,3 + 0.7. Ningin escolar presento pH de saliva de pandtida estimulada inferior a 6 (datos no mostados en tabla) El sistema tulfer estudiado fue el dcido carbénica’ bicarbonato en fimeién dela eoncentracién de bicarbonato. En 87% de los paciemtes estudiades se observaron concentracioncs de bicarbenato comprendidos entre 30y 89. mM, cor un valor promedio de 61.13 1 21,84 (retultados no mostrados). Ja coneentracion de proteinas tolales cvidenciaron valores entre 109 y 200 mydL en 87% de los casos (resultados no mostrados). Solo el grupo etarin de IL a £2 afios (n: 11), presenlo valores de proteinas totales entre 100 me‘dl. y 250mg‘dL, mientras que 75% de las nihas, cifras entre 125 mg/dl y 250 mgidL. Peroxidase salival o sialapcroxidusa. La actividad do [a envima so detennind monitereando Ia oxidacién del guayaco! mediante 2) incromento de la absorbancia (A...) por minute, Tus ensayos mostraron que la concentracién de sustrato (H,O. ) influyé sobre la cinética envimnatica vor una actividad méscima 0.2720,018A,,, ‘min a fa concentraciéa de 17,0, de tmM (Fig 1)" a Figura 1 fet deb corcenmacien de FO, ube perdu La cinética de la enzima en presenvia de 1mM de H,O,y on funcisn del pli presents maxima actividad 0,25.0,014,,, ‘min a pIL 7 fisiologico, mostrando disminucién ce ta actividad a valores: superionss o inferiores de pH 7 (ig 2) ‘a — _ eee’ oom 0 @ Hs Im 1S ewer Piquca 2 Bact del pH sabre a ceria peda sale Asimismo, el compertamiento cotati Ta potoxidasa salival on presencia de variac de temperatura (25, 36, 37 y 38°C) a Im H.O,y pH 7, mantuvo su actividad cata sin embargo, la maxima actividad se obse 25°C 0.25-0 014... min y on ue range me actividad 0,205 0.018- 0,{740,011 Ag los 36-38°C (Fig 3), ona i Fore i” + en i oa 43 a ee Tigra 3, Feet La erpertseob asc pers Evatuaciin de la condivién gingival y de ta dentobacteriana en tos escolutes: Tinbe evidensia de placa dentobeet ep todos los pacicates; sin embargo, se ot mayor prevalencia de placa escasa (66.6%) grupo eturio de 13a 14 aiios. Elindice gingival revelé que todos los ese presentaron inflamacion gingival, de | moderada, mostrande una mayor provalem inflamaciin moderada (62, 5% sin embarg solo se presenté en cl grupo de 13 y 14 ai‘cwacterticasfisicoquiminas de la setacteparotda yaw ritmorebean-anexidanie Sela peroxide saval em SSCo1Fe Rita eee eded (reyultades no mostrados), El promedio del indice de sangramiento de Jas unidacics dentarias 15, 16, 17 y 25, 25, 27 fhe 7,69 = 4.94 margencs sangrantes ¥ 81,3% de los escolares presentaron margenes sangranics entre | a 12. Discusion La saliva es un fuido hipoténico, cuyo promedio diario de exereciin varia cae | ¥ 1,5 litros; ée éstos, el flujo de Ja saliva tolal en condiciones de no cstimulacién glandular os 0,3 a 04 mLimin;® la cuota diaria do Ja glinduls fparétida no estimulads es aproximadamente al 30%, perosu contribucion seinerementa hasta 50% Ge la excrecidn total de saliva ea condiciones de estimulacién glardular'* Hiraba y col, reportaron gue la secrecisn de saliva estimulada procedente de la pardtida puede llegar hasia 62% de la saliva total, sehlande gue existen variaciones en ol flujo salival de la glandula parétida izquierda con respecto a In dereca.”” Fn Ja presente investigaciin, Los escolares evidenciaron un flujo salivel de parstida on condiciones de estimulacién glandular entre 0,5 y 1,18mLiminigland, resultado similar al teportado por Gandara y coL'* Kalk y col, en un estudio realizado cn jovencs sanos mostro un promedio de flujo salival, ubicado dentro del rango observado en esta investigaciin.” Heft y col, en una investigneidn en adulios de diferenics edades, reporteron valcres de flujo salival que oscilaron entre 0,63 y 0.8ml/min/gland, por To cual se puede inforir, que la edad no debe ser una variable determinanle en el flujo salival de la glandula parotida? in embargo, se han seftalado cifras de thnjo salival inforiores a los mostredas, en gléndula parétida estimulada, de 0,374 mLimin/giand, diferencia quc puede ser atribuida a que el promedio que sz obtuvo en dicha investigacién fue obtenide a partir del pool de muesiras de saliva de todos los pacientes." Es importante senalar, ‘gue las veriaciones e6 el flujo salivel se afectan por Factores, tanta fisiologicos como patoldgicos, Jas cuales de forma reversible o irreversible iaciden en la secrecién salival, tales como son cl grado de hicrataciin, la posicién del cuespo, la exposiciin a la luz, ch métode de cstimulacién, tamato de la glandula y el consumo de deogas. Estas fluctuaciones, se han estublecido inter ¢ intraindividual, con moditicaciones hasta el 50%, dependienda del ritmo citcardiano;"~ sin embargo, on el grupo de estudio no se observe variaciones importantes cor respecte a la reportada cn pacientes sanes. La saliva presenta valores de plT que oscilan entre 6.7 y 7.5. * Pero en condiciones de estimulacién alcanza un pil de 7,5 a8; * es decir que la saliva de pardtida estimntada increments el pH a medida que aumenta Ta tast de flujo salival:® tal como se demostré en la presente Investigacion. El pH ligeramento alcalino dcterminado, se alribaye a la disminucion de reabsorcién del bicarborato, durante su paso pot Jos canales exeretores de Ta glindula (intercalares y cstriados), debido a un aumento de la velocidad de excrccién del flujo salival (condicién de estimulacién}; ademas, es Importante sefalar sk. partieipacién como ion del sistema amortiguador Scidojbase de las glémdulas solivales. Ea este sentido, el valor promedio observado del HCO, en el grupo de estudio, fue muy superior a fos reportados pot Turmer ¥ col y Pruitt ¥ col Listo se debe a que durenté la estimelueion glandular se incrementa ¢} flujo salival e inclusive cl pH aumenta, E] otto sistema amortiguador importante de ia saliva, oblenida por estirmulacion glandular es representado por las protefnas. Fn este estadio. Jos escclares mostraron resultados similares al seportado por Kal y cok: sin smbargo, se han reportados valores de protcina totales de saliva de parotida en jévenes sanos de 60mgidL.,” aunque egle sistema amortiguador de la saliva ha sido poco documentade, Es importante seftalar que la capacidad amortiguadora de la saliva de pordtida, cu condiciones de estimulacién no se encuentra alterada; asi mismo, los valores de pH estan deatro del rango que favorece fa actividad catalitica de Je peroxidusa silival para la produccién del nipotiocianarc. Laactivided de la peroxidasa salival se estucio en fureidn de la concentracion de sustrato HO, DH y temperature, En celacion a las diferentes concentraciones de HO, utilizadas, se evideacio que Ia cazima presents una maxima actividad catalitica la concentracidn de sustrato de LO, DoD Sevres 9@opous...... ImM, aumentaedo la velocidad de formacién del producto de la reaccién desarrollada cxperimentalmente (guayacol + 1,0, > tetraguayacol + HO). A partir de concentractones superiares a ImM, la velocidad de Te reacciéa decrecid cotablemente, resultado el HO, un {actor limitanie en la velocidad de esta reaccién Aunque se ba reportado que la asa de formacion del tetraguayacol, se incrementa a concentraciones por encima de HO, 0,1 mM? En cuanto 2 laactivided delaenvima peroxidase selival expresada ca funcidn del pll, se observ, gue la enzima, prosenté actividad maxima a pH 7 fisiologicn y mantuvo su actividad inciusive hasta piT9, sin embargo, se he mostrado que el pH éptima de actividad de la peroxidasa esta on un tango de 6,3-72* Los efeetos del pH en las reacciones cnzimaticas, se basan ea cl hecho de que ciccws grupos fimcionales criticos de la enzima, del susirato © del complejo exzims. sustrale st asocian o disocian con los protores: Fl pH éptimo de la peroxidase salival depende de los grupos donadores de electiones, cs decir de su. comportamiento como decide.” La actividad de una enzima bajo condiciones de pH. por encima o por debajo de su pH optima se altera, detsido a que las ceadcnas Iaterales de eminodvides pueden acwar como acidas © camo dases débiles, los cuales desarrollan funciones criticas en cl sitie activo de ln envima, afeotande el estado de ionizacion, miontres que on otras zonas de la proteina, algunas cadenas laterals ionizadas pueden jugar un papel eseticial en fas interaceiones que mantiene la estructura proteica. Finalmente, la actividad de la peroxidasa salival mostré estabilidad cn su actividad catalitiea a temporaturas 25, 36-38°C, aunque su maxima actividad observada en los ensayos fue 2 25°C, lo eual corresponds a Ia interaecion enzima-sustrale artificial que se empieé en el presente estudio (guayacel). Conclusion Jos resultados de esta investigacion evidencian aque las caracteristicas fisiecquimicas de la saliva de pardtida estimulada en esta muestra, son similares a las reportadas en indivicuos sanes: y Ia actividad de is peroxidasa salival ye mantuvo a en condiciones ImM HO, pll 7, por lo 5 posible que en los pacientes que confor: Ta muestra, los productos. metabélicos microorgunismes presentcs cu la plac gjercieron influencia importante scbre la acti catlitica de la peroxidase, Al Fondo de Investigacion de Ta Facutt Odontologia de la Universidad de Carabobo financié La presente investigacidn y al Dr. Mora, profesor de le Facultad de Gdontolo; la Universidad de Carabobo por su partici en la recolceei6n de le macste. Referencias 1, HuS, Xie ¥, Ramachandran P, Ogorzalel Y, Loo J, Wong D. 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