INSTITUTO DEL MAR DEL PERU en, Resolucion Directoral DE-2)0-2010 Callao2S noviembre de 2010 VISTO: Decreto Supremo N* 007-2004-PRODUCE Aprueban Norma Sanitaria de Moluscos Bivalvos Vivos del 24 de marzo de 2004. CONSIDERANDO: Que, conforme al Articulo 142° de la Norma Sanitaria para las Actividades Pesqueras y Acuicolas aprobadas por Decreto Supremo N° 040-2001-PE, los requerimientos y condiciones para la recoleccién y extraccién para el comercio de ‘moluscos bivalvos vivos, gasterdpodos equinodermos y tunicados de medios naturales 0 de Ia acuicultura deben ser establecidos en normas especificas que apruebe el Ministerio de ia Produccion; Que, el aprovechamiento racional de los moluscos bivalvos vivos requiere una normatioa sanitaria diferenciada de aquella aplicada a los productos pesqueros de consumo humano por presentar riesgos para la salud diferentes a los detectados por los pescados; Que, el Articulo 2°, Numeral 7 del Decreto Supremo N° 007-2004-PRODUCE se aprueba la Norma Sanitaria de Moluscos Bivalvos Vivos, de fecha 24 de marzo de 2004, establecen las condiciones y requisitos de seguridad saniiaria y de calidad que deben reunir los moluscos bivalvos destinados directamente al comercio 0 a su Procesamiento para consumo humano, incluyendo requerimientos para las areas de extraccién o recoleccién y para las concesiones acuicolas; Que, de acuerdo al Articulo 7° Inciso d). del precitado Decreto Supremo, se dispone que el IMARPE, como institucién integrante en la gestién de la citada Norma participa también en acciones dirigidas a lograr el propdsito de la misma, supervisando periddicamente a los laboratorios autorizados, los protocolos de muestreo, metodologias y resultados, como procedimientos de verificac én de fitoplancton potencialmente téxico; S ESQue, mediante Resolucién Ministerial N° 172-2010-PRODULCE se creé la Comisién Sectorial de Naturaleza Temtporal, la que estuvo integrada por representantes del IMARPE teniendo como funcién principal formular el Plan Nacional de Alertas Tempranas para Floraciones de Algas Nocivas, de acuerdo a los criterios técnicos y metodolégicos contenidos en el Plan de Trabajo que serd aprobado por la Comisién dentro de los treinta (30) dias hébiles contados desde su instalacién, con el objeto de contar con una herramienta de prevencién sobre el desarrollo, acumulacién y persistencia de microalgas nocioas en los moluscos bivalvos que se manifiestan como intoxicaciones en los seres iumanos; Que, para cumplir con la funcién antes indicada es necesario contar con manuales de procedimientos institucionales autorizados, como es el Manual de Procedimientos para el Muestreo y Ensayo Semicuantitative y Cuantitativo del Fitoplancion Potencialmente Téxico, el mismo que sera de soporte para los laboratorios que realizan ensayos de fitoplancton y asi mejorar la calidad de sus resultados analiticos; Que, para dicho fin se ha elaborado el presente Manual que establece los requisitos generales a aplicarse durante el muestreo y ensayos del fitoplancton te tixico, estimacin de Ia abundancia relativa, concentracién y taxondmica, incluyendo los pasos previos de colecta, conseroacién y ‘almacenamiento de las muestras, asi como la metodologia de Uterméhl 1958; Con la visacién de ta Direccién Cientifica, de Ia Oficina de Asesoria Juridica y de la Oficina Planificacién y Presupuesto; SE RESUELVE: Articulo Primero .- Aprobar el Manual de Procedimientos para el Muestreo y Ensayo Semicuantitativo y Cuantitativo del Fitoplancton Potencialmente Téxico, el mismo que forma parte de la presente resolucién directoral y servird como documento base para los laboratorios de IMARPE y particulares que realizan ensayos de fitoplancton. Articulo Segundo.- Disponer la publicacion de la presente Resolucin Directoral y del ‘Manual de Procedimientos para el Muestreo y Ensayo Semicuantitation y Cuantitativo del Fitoplancton Potencialmente Téxico, en el Portal Institucional del Instituto del Mar del Peni (IMARPE).7 Ng MANUAL PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO ay | Semcuantirarivo y cuaNTiTATVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO Esicn 01 Version: 09 Fecha’ 2010 setiembre Pagina 1 de 22 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO SETIEMBRE 2010 LIMA - PERU [| —-Wonibre yapaiiios Fiima_| [Fecha meal Bowie Svectee “Panui | DE stherbre 2010 Jefe del hrea - Revise per Meyda | A ayfes} Mlanbee 20 | Director de \ Investigaciones ure Coe va eo 4 16 oad 20 pL fae sees ®) 97 Dianne a RENE9 as ae ws MANUAL | escent ——__ - Vers: 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Fech# 2010 setembre SZ SEMIGUANTITATIVO Y GUANTITATIVO DEL | P#! FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO INDICE PG. INDICE 222 4. INTRODUCCION 422 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACION 422 3. RESPONSABILIDADES 4.22 4, TERMINOS Y DEFINICIONES 4-22 5. TOMA DE MUESTRAS 6-22 5.1 MATERIAL, EQUIPOS Y ACCESORIOS PARA MUESTREO DE FITOPLANCTON 6-22 5.1.1 MUESTRAS COLECTADAS CON RED 6-22 5.1.4.1 MATERIALES 6-22 5.1.1.2 EQUIPOS Y ACCESORIOS 6-22 5.1.2 MUESTRAS DE AGUA 6-22 5.1.2.1 MATERIALES 6-22 a) COLECTA CON BOTELLA NISKIN 6-22 b) COLECTA CON MANGUERA 7-22 5.1.2.2 EQUIPOS Y ACCESORIOS 7-22 5.2 AGENTES DE FIJACION/PRESERVACION 7-22 5.3 PROCEDIMIENTOS DE TOMA DE MUESTRA 8-22 5.3.1 ENSAYO SEMICUANTITATIVO 8-22 a) EN COLUMNA DE AGUA 8-22 b) EN ORILLA DE PLAYA 8-22 5.3.2, ENSAYO CUANTITATIVO 9-22 a) BOTELLA NISKIN 9-22 b) MANGUERA 9.22 5.4 ETIQUETADO DE LAS MUESTRAS 10-22 5.5 ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA PROBLEMA 10-22 6. ENSAYOS DE FITOPLANCTON EN EL LABORATORIO 10-22 6.1 ENSAYO SEMICUANTITATIVO: OBSERVACION PRELIMINAR 10-22 6.1.1 PROCEDIMIENTO DE LA OBSERVACION PRELIMINAR 10-22 6.2 ENSAYO CUANTITATIVO: CONTEO CON MICROSCOPIO INVERTIDO (UTERMOHL) 11-22 a) NUMERO DE CAMPOS SELECCIONADOS ALEATORIAMENTE — 11-22 ‘\ b) CAMARA COMPLETA 11-22 Hs 2) c) CONTEO DE TRANSECTOS 12-22 ) PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO CUANTITATIVO 12-22 .2.1.1 CAMPOS Y ORGANISMOS ALGALES A CONTAR 12:22 6.2.1.2 LECTURA DE LAS MUESTRAS 12-22 6.3 PRECISION - 13-22 6.4 LIMITE DE DETECCION CUANTITATIVO 13-22 6.5 TIEMPOS DE ENTREGA DE RESULTADOS 14-22 7. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS 14-22 7.1 REPETIBILIDAD 14-22 7.2 REPRODUCIBILIDAD 14-22 b. INCERTIDUMBRE DE LA MEDIDA (DE LOS CONTEOS) 14-22 8.1 INCERTIDUMBRE SEMICUANTITATIVA 14-22 ‘Prohibida le repreduccin total 0 parcial de este documento sin proviaautorizacin del Director CientiicoEdicion 01 a MANUAL |__ediew |_————__———_—_— Version, 0 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | feos 2010 setembre sr SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL. | P# FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO 8.2 INCERTIDUMBRE CUANTITATIVA 15-22 9. FORMATOS 15-22 9.1 USO INTERNO- 15-22 9.2 USO EXTERNO 15-22 10. BIBLIOGRAFIA 15-22 ANEXOS 18-22 ASPECTOS A CONSIDERAR 18-22 + MUESTREO 18-22 + ANALISIS . 18-22 + _FIJACION /PRESERVACION 18-22 FICHAS PARA ENSAYOS 19-22 * USO INTERNO: F1: FICHA DE ENSAYO SEMICUANTITATIVO DE FITOPLANCTON — 19-22 F2: FICHA DE ENSAYO CUANTITATIVO DE FITOPLANCTON 20-22 * USO EXTERNO: F LAB-FM-01-1 FICHA DE ENSAYO SEMICUANTITATIVO 21-22 F LAB-FM-01-2 FICHA DE ENSAYO CUANTITATIVO 22-22 Profibia e reproduccién teal 0 parcial de este documento sin previa autorzacién del Diector Clenico( a ar a ae sr. MANUAL, Edicion or __| Version, 09 PROGEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Fhe. 2010 setmre Sey | Semicuantianive y GuaNTiTarivo BEL | FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO 4. INTRODUCCION En concordancia con la Norma Sanitaria de Moluscos Bivalvos (DS N° 07-2004- PRODUCE) se ha elaborado el procedimiento para el muestreo y ensayo semicuantitativo y cuantitativo de! fitoplancton potenciaimente toxico. Este procedimiento sera de ayuda para que los laboratorios que realizan analisis de fitoplancton mejoren la calidad de sus resultados analiticos, teniendo como objetivo establecer los requisitos generales durante el muestreo y andlisis del fitoplancton Potencialmente téxico, en la estimacién de la abundancia telativa, concentracién celular y composicién taxondmica, incluyendo los pasos previos de conservacién y almacenamiento de las muestras. 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACION Este procedimiento se basa en técnicas de colecta con red estandar de fitoplancton de 10 um, botella Niskin y manguera, asi como la técnica de sedimentacién tal y como la definio Utermohl (1958). Se describe un procedimiento general para ia estimacién de la abundancia relativa, concentracién celular y composicién taxonémica det fitoplancton de agua de mar. Asi mismo se describe la metodologia utilizando la microscopia de luz invertida y cémaras de sedimentacién, incluyendo los pasos previos de toma de muestra, conservacién, preservacién y almacenamiento de las muestras. 3. RESPONSABILIDADES Responsable de muestreo Responsable del ensayo: analista Jefe de Laboratorio o Supervisor 4. TERMINOS Y DEFINICIONES En la elaboracién del listado que se da a continuacién se consulté publicaciones internacionales tales como la Norma Espafiola UNE-EN 15204 (2007), JCGM (2008), manual | Para el propésito de este documento, son de aplicacién los siguientes términos y definiciones: entre otros, que van a facilitar la comprension de los términos utilizados en este + Campo de recuento de! microscopio: Area delimitada (por ejemplo, un para el recuento. CD cuadrado 0 una reticula) de! campo de vision del microscopio, que se utlliza + Condiciones de repetibilidad: Situacién en la que se obtienen resultados de ensayos 0 de medicién independientes, sobre materiales de ensayo 0 de medicién idénticos, en la misma instalacién de ensayo o de medida, realizados por el mismo operador utilizando el mismo equipo y dentro de un intervalo de tiempo corto. ® Prohibits a epreduccisn fetal o parcial de este documento sn previa auorzacién de! Diractr CercarT ina if y Version: 00 | PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO v ENSAYO | Foo 210sstenbe Sr SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL |" FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO + Condiciones de reproducibilidad: Circunstancias en las que se obtienen resultados de ensayos 0 de medicién independientes, utllizando el mismo método, sobre materiales de ensayo o de medicién idénticos, en diferentes instalaciones de ensayo 0 de medicién, realizados por distintos operadores. + Conservacién: Proceso que protege las sustancias organicas de su degradacion, + Especie: Unidad/conjunto de una 0 mas células algales encontradas durante el analisis de fitoplancton, que constituyen una unidad discreta (susceptible de sedimentar de forma independiente) con respecto a otras particulas de la muestra, + Exactitud: Grado de acuerdo entre un resultado de ensayo o un resultado de medicion y el valor real (esto no se da en la parte biolégica). Es importante tener en cuenta que la exactitud de un instrumento de medicién sélo puede conocerse y cuantificarse con materiales de referencia. + FijadoriPreservante: Compuesto quimico que permite proteccién frente a la desintegracién de algunas estructuras morfologicas de los organismos, + Fitoplancton: Es la parte vegetal del plancton, son organismos de vida libre, en suspension, principalmente fotosintéticos de los sistemas acuaticos y constituyen el primer esiabén de la cadena tréfica de los océanos. + Incertidumbre: Parémetro asociado al resultado del recuento que caracteriza la dispersion de los valores que podrian ser razonablemente atribuidos al mesurando. La incertidumbre da una idea de la calidad del resultado ya que muestra un intervalo alrededor del valor estimado dentro del cual se encuentra el valor considerado verdadero, + Muestra: Organismo 0 conjunto de organismos tomados como representantes de una poblacién o de su ambiente. Las muestras son seleccionadas al azar sin tener en cuenta su calidad. + Muestra problema: Denominacién dada a aquella muestra que contenga ‘organismos de dudosa determinacién asi también aquella muestra en donde los organismos téxicos son abundantes. + Plancton: Proviene de una palabra griega que significa vagar, flotar, e incluye a dos grupos el fitoplancton y zooplancton. Muchas de las especies del plancton son de dimensiones microscépicas y de un comportamiento pasivo como es el caso del fitoplancton. + Precision: Grado de acuerdo entre los resultados de ensayos/mediciones independientes, obtenidos en condiciones controladas. + Repetibilidad: Precision bajo condiciones de repetibilidad. Es un pardmetro que evaltia la precision del resultado de las mediciones y tiene en cuenta al analista, ‘Protibida la reproduccién total o parclal de este documento sin previa autorzacion de Owector Cente[ some | an T 3 MANUAL |__edicsn on _ J verter 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Fete: 20/0sgtemre crab de 22 SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO + Reproducibilidad: Precision bajo condiciones de reproducibilidad. Evalda la precision del resultado de las mediciones y tiene en cuenta el método. 5. TOMA DE MUESTRAS: 5.1 MATERIAL, EQUIPOS Y ACCESORIOS PARA MUESTREO DE FITOPLANCTON, 5.1.1. MUESTRAS COLECTADAS CON RED 5.1.1.1 MATERIALES + Red estandar de fitoplancton con malia de 10 micrémetros + Termémetro de superficie de mercurio (Hg) calibrado, con escala de 1/10°C y de -2 a 35°C y protector de PVC + Frasco (colector) de vidrio o plastico de 200 ml transparente de boca ancha ‘con tapa rosca Formalina al 20% (pH entre 8 y 9) Lugol acético Etiquetas de papel canson Balde de 10L Pita de céfamo 5.1.1.2 EQUIPOS Y ACCESORIOS + Microscopio estereoscopio ‘Aumento de 8X a 6,3X, Ocular de 10X/22 Cuerpo de aumento 0 zoom paralelo o galileo de 6.3% + Microscopio compuesto ‘Oculares de 10X , 12,5X 6 15X Objetivos de 4X, 10x (20X), 40X y 100X ‘Ocular micrométrico y lamina patron 5:2 MUESTRAS DE AGUA 1.2.1 MATERIALES a) COLECTA CON BOTELLA NISKIN Botella Niskin de PVC con una capacidad de 5 L y mensajero de bronce Termémetro de inversion de Mercurio (Hg) calibrado, con escala de 1/10°C y de -2.a 35°C Termémetro de superficie de Mercurio (Hg) calibrado, con escala de 1/10°C y de -2 a 35°C y protector de PVC Frascos de 80 6 100 mL de color ambar, de vidrio, con tapa rosca Frascos de 30 mL boca ancha, de plastico Formalina al 20% (pH entre 8 y 9) Lugol-acético O® Prohibid a reproduccion tte parcial de este documento sn previa autozacién dol Director CincoEatcion Ot ik, & Se MANUAL PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO ar SEMICUANTITATIVO ¥ CUANTITATIVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO, Version: 09 Fecha 2010 setiembre Pagina 7 do22 + Esparadrapo para etiquetar frascos b) COLECTA CON MANGUERA + Una manguera transparente de plastico, cuyas especificaciones técnicas son las siguientes: = Didmetro externo de 2,8 om y de 2.3 cm de didmetro interno y longitud de 20 m como maximo. ~ _ Dividida en secciones de 5 m, de acuerdo a los estratos o profundidad a la que se quiere hacer el muestreo. Adicionalmente en el estrato superior, se debe considerar una longitud mayor que correspondera a la distancia del bote y la superficie del agua - Cada seccién consta de llaves de compuerta que facilitan el acople entre ellas a través de una unién de rosca, permitiendo independencia de cada tramo y su facil separaci6n. - En la parte terminal de la manguera se acopla un lastre de aproximadamente 2 kg para darle estabilidad. Formalina al 20% (pH entre 8 y 8) Lugol-acético Esparadrapo para etiquetar frascos Recipientes de pléstico de 2 a 5 | de boca ancha Frascos de 80 6 100 mL de color émbar, de vidrio con tapa rosca 5.1.2.2 EQUIPOS Y ACCESORIOS + Microscopio invertido Objetivos de 10X, 20X y 40X (Objetivos PLAN). El objetivo de 40X con contraste de fases Oculares iguales 0 mayores a 12,5X Kit de contraste de fases Reglila ocular micrométrica Platina mecdnica con botones de mando para lectura transversal y longitudinal (%Y), vernier y nomio (lectura 0,1. mm) Reglilla WHIPPLE (para delimitar campos de conteo) + Microscopio compuesto (caracteristicas similares al item 5.1.1.2) + Camaras de sedimentacién con cilindros 0 columnas de 25 6 50 mL 5.2 AGENTES DE FIJACION /PRESERVACION. + Formalina: Para preparar esta solucién se necesita: - Un litro de formaldehido P.A. (al 37%, estabilizado con metanol al 10%, grado de acidez (HCOOH) no mayor de 0,025%) - Un litro de agua destilada - 1,2.g de carbonato de sodio hidrogenado P.A. (NaHCO;), para neutralizar la solucion ‘Se mezcla y homogeniza todos estos elementos hasta obtener una solucién sin residuos sdlidos. Se usa cintas indicadoras del pH en la solucién final para verificar su neutralidad Se filtra el preparado para evitar sedimentacién de las sales Profibia a reproduce total parcial de este documento sn preva autenzacién del Director CieniiooSP ee MANUAL [Giese a ye _ PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO Sz? SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL r FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO Pagina 8 de 22 + Lugol acético: Se requiere de 20 g de loduro de potasio (KI) y 10 g de Yodo (2): Estos compuestos se diluyen en 200 mL de agua destilada y 20 g de acido acético. Esta solucién se oxida répidamente por accién del aire y luz, por ello, debe conservarse en botellas de color ambar y en la oscuridad 5.3 PROCEDIMIENTOS DE TOMA DE MUESTRA 5.3.1 ENSAYO SEMICUANTITATIVO a) EN COLUMNA DE AGUA + Localizar la estacién de muestreo, mediante un GPS (geoposicionador) + Introducir la red en forma vertical hasta una profundidad aproximada a 50 cm del fondo, teniendo cuidado que no forme alguna burbuja de aire. + Mantenerla unos segundos en el punto de muestreo y empezar el izado a una velocidad de 1m.s”. Esta operacién se repite como minimo tres veces en el ‘mismo lugar. + Con la red en cubierta se procede a trasvasar el fitrado obtenido en el frasco 0 recipiente colector a otro de igual o mayor capacidad, teniendo en cuenta ‘otular dicho recipiente con la informacion indicada en anexos. Para su preservacién se agrega 10 mL de formalina al 20%. Posterior a la operacién anterior se homogeniza convenientemente la muestra Lavar la red con agua de mar y prepararla para la siguiente estacion. Al conciuir el monitoreo y ya en el laboratorio, se lava la red con agua dulce dejandola secar a temperatura ambiente. b) EN ORILLA DE PLAYA + Localizar la estacién de muestreo. + Dos personas deben ingresar al mar con un balde de 10 L y una red (10m), hasta una distancia prudente a la que puedan trabajar + Se espera que la ola reviente y al cabo de algunos segundos en el punto de muestreo se procede a colectar la muestra. + Se colecta un total de 50 L de agua de mar, los cuales son filtrados en la red, + Siel contenido tuviese arena, sedimento 0 material particulado en abundancia, ~X-/ se espera unos minutos hasta que sedimente y se procede al filtrado. El tiempo de sedimentacién de la arena esta en funcién de la temperatura de! mar, por [o que se debe dejar que la arena sedimente entre 1 y 2 minutos, + Se procede a trasvasar el filtrado obtenido en el frasco o recipiente colector a ‘otro de igual o mayor capacidad, teniendo en cuenta rotuiar dicho recipiente con la informacién necesaria, + Para su preservacién se agrega 10 mL de formalina al 20%, procediéndose a homogenizar convenientemente la muestra + Lavarla red con agua de mar y prepararla para la siguiente estaci6n, + Al concluir el monitoreo y ya en el laboratorio, se lava la red con agua dulce dejéndola secar a temperatura ambiente. Prohibie a reproduccion total 0 parcial de este documento sin preva autoizacion del Director ContiicoMANUAL, Esicign 01 ——— Veesén:00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Fech® 2010 setiembre SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL : FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO. 5.3.2. ENSAYO CUANTITATIVO a) BOTELLA NISKIN (APHA, 2005) + Bajar la botella Niskin a dos 0 tres niveles (media agua y fondo) segin la profundidad de la estacién, llegando hasta 1m del fondo teniendo como sefial Jos marcajes de profundidad de la linea madre. + Esperar por lo menos 1 minuto para su estabilizacién y enviar el mensajero, se procedera a izar la botella a la superficie y/o cubierta de la embarcacién. + Se registran los datos de temperatura que indica el termémetro de inversion de la botella Niskin a la profundidad establecida + El orden para la obtencién de la muestra de agua una vez en la embarcacién @ la siguiente: oxigeno, nutrientes, salinidad, pH y muestras para fitoplancton. + De la botelia Niskin se toma una submuestra en frascos de 80 6 100 mL, para ello se abre el tap6n de respiracion y la vaivula de escape de la botella Niskin a la cual se le ha acoplado una manguera (puede ser: de jebe, latex, silicona 0 PVC) en la parte inferior del muestreador, la cual se introduce dentro del frasco para obtener la muestra. + Sie! frasco es de 80 mL, agregar 2 mL de formalina (20%) a la muestra (un buen indicador de ta concentracién suficiente de formalina es el olor, el cual delata su presencia ala sola exposicién del olfato) + La preservacién también se puede hacer con solucién de lugol-acético. Se utiliza entre 0,5 y 1,0 mL de lugol para 80 mL de muestra. + Rotular cada frasco con la informacién necesaria + Elremanente de la muestra colectada en la botella Niskin es devuelto al mar. b) MANGUERA (LINDAHL, 1986) + Acondicionar la longitud de la manguera conforme a lo establecido en el item 5.1.2.1. b). + Debe establecerse en los primeros 5 m el drea libre de muestreo, esto se refiere a la Separaci6n entre la superficie del mar y la altura de la embarcacién © punto de ejecucién del muestreo. + La toma de la muestra con manguera en estaciones donde las profundidades son menores a 7,5 m debe hacerse en un estrato integrado de 0 - 7 m. + Cerciorarse del buen funcionamiento de las llaves (apertura y clerre) de la manguera y el facil enrosque y desenrosque de las secciones. + Bajar el muestreador guardando la verticalidad de éste, asegurandose que las llaves estén abiertas. + Bajar la manguera a una velocidad tal que el llenado de ésta sea uniforme y sin turbulencia (1ms") + Cuando se esta a la profundidad requerida, se cierra la llave superior y se procede a izarla + Sucesivamente, conforme se va izando el muestreador, también se van cerrando las llaves de las subsiguientes secciones. + Con la manguera en cubierta, se procede a trasvasar el contenido de cada seccién en recipientes (2 a 5 L), previamente rotulados, tal es asi que a cada recipiente le corresponde una seccién; asi a la seccién de 0 - 5 m, le corresponde el recipiente 0 - 5 m y asi sucesivamente. ‘Prohibida la repreduccion total o parcial de este documento sin preva autorizacion del Director ClentiicoMANUAL Ein 01 verte: 0 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | FA! 20sstambro SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL = FITOPLANGTON POTENCIALMENTE TOXICO + De cada recipiente se toma una submuestra, previa homogenizacién y se procede a fiarla con las soluciones de lugol acético 0 formalina, segun pautas dadas en el item 5.2 + Posterior al paso anterior se vuelve a homogenizar la muestra, + Rotular cada recipiente con la informacién necesaria del punto de muestreo. 5.4 ETIQUETADO DE LAS MUESTRAS. ‘Todas las muestras y preparaciones deben estar convenientemente etiquetadas de forma que se identfique un cédigo de la muestra, de la estacién, fecha de colecta, preservante utilizado y persona o entidad a cargo de la colecta. El cédigo de la muestra servira de enlace en la base de datos, Es importante indicar el tipo de muestra, el método y la profundidad de colecta, Se debe utlizar un rotulador resistente al agua. 5.5 ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA PROBLEMA Se almacenarén muestras problema (semicuantitativo y/o cuantitativo) por un tiempo no menor a 2 afios, en condiciones controladas de luz y temperatura, preservadas con tuna solucién que conserve por un tiempo prolongado a los organismos. El lapso de almacenamiento de estas muestras servira como respaldo ante cualquier eventualidad que se presente, 6. ENSAYOS DE FITOPLANCTON EN EL LABORATORIO 6.1 ENSAYO SEMICUANTITATIVO: OBSERVACION PRELIMINAR (METODOLOGIA IMARPE) El objetivo principal de este andlisis es proporcionar una visién general de la composicién de fitoplancton antes de realizar el andlisis cuantitativo detallado. Este estudio preliminar ayuda a determinar la estrategia de conteo y también a la identificacién posterior de la muestra preservada, En este ensayo puede aparecer informacién adicional relevante, como el estado y circunstancias de la muestra (por ejemplo, puede ser de utilidad realizar una anotacién sobre el tamafio de una colonia en la muestra fresca, si las colonias se desintegran en el proceso de conservacién, etc.) 6.1.1 PROCEDIMIENTO DE LA OBSERVACION PRELIMINAR + De la muestra homogenizada, se toma una submuestra de 3 ml, aproximadamente 40 gotas con pipeta Pasteur y se coloca en una placa petri Se lleva al microscopio estereoscopio para su lectura e identificacion con un aumento de 6,3X. Este proceso se repite 3 veces para llegar a determinar a la totalidad de las especies presentes. Se anotan todas las especies identificadas elaborando un listado de acuerdo a la escala de la abundancia relativa 4; Muy abundante (mayor de 20 cel) 3:Abundante (entre 11 y 20 cel/c) Pri f rpreduccé fa « parcel de este documento sin provi aurizactn del Drector CecaSs eae & \ MANUAL Eaciin ot je -— — Version: 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Feels 2010selembre a, SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL yenaice FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO 2: Escaso (entre 4 y 10 cele) 4: Presente (entre 1 y 3 cel) 0: Ausente cel ‘élulas por campo NOTA: Estas equivalencias estan en proceso de validacién. + Las especies de dificil determinacién se separan para un previo tratamiento de limpieza, separaci6n de placas, coloracién u otro método, para ser observadas en el microscopio compuesto. El aumento empleado es de 40X 6 100X. + Se reportan los resultados en el formato: “Ensayo semicuantitativo de fitoplancton” (ver anexo), en el cual se registra la ocurrencia y abundancia relativa de las especies potenciaimente toxicas y de las especies acompariantes. 6.2 ENSAYO CUANTITATIVO: CONTEO CON MICROSCOPIO INVERTIDO. (UTERMOHL) Se recomienda realizar una visualizacién previa de la muestra, antes de iniciar el conteo, para tener una vision general de la comunidad fitoplancténica, previo a elegir la estrategia de conteo. Hay tres alternativas de conteo con las cémaras de sedimentacién a) NUMERO DE CAMPOS SELECCIONADOS ALEATORIAMENTE + Se utiliza un reticulo de Whipple que se coloca en el ocular del microscopio. Este reticulo es un disco de vidrio que tiene impreso un cuadrado reticulado de 10x10, dividido en 100 partes iguales. Este elemento permite delimitar el area de recuento yy asi llevar la cuenta del ntimero de campos contados. Dado que esta area puede diferir de un microscopio a otro y dependiendo también del aumento empleado, se debe calibrar cuidadosamente cada microscopio. + Los campos pueden seleccionarse por el analista de un modo aleatorio (cuya aleatoriedad puede verificarse durante la validacién del protocolo) o utilizando una platina electrénica con un controlador incorporado. b) CAMARA COMPLETA + Es apropiado para densidades bajas de fitoplancton (0 en la deteccién de especies raras), 0 para el recuento de especies grandes cuya distribucién en la cémara no puede ser aleatoria + El conteo se realiza desplazando la cémara de arriba-abajo e izquierda-derecha y viceversa. + Se utiliza una reticula en el ocular que contenga 2 lineas paralelas horizontales que delimitan el transecto, preferiblemente con una tercera linea vertical que las. cruce. Las células algales que se encuentren entre las lineas del transecto, son contabilizadas a medida que atraviesan la linea vertical. Prohiede Ie reproduccicn total parcial de esto documento sin previa autorzacion del Dkector GientificsMANUAL Eden 01 | sep PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | feels 2010 satemive SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL 7 FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO + Aquellos organismos que estén cruzando {a linea superior del transecto, se inciuyen en el recuento, pero no aquellos que se encuentren por Ia linea inferior, ya que se contaran al realizar el siguiente transecto (o viceversa). ¢) CONTEO DE TRANSECTOS. Se emplea el mismo reticulo utilizado para el recuento de camara completa, teniendo cuidado en asegurarse (mediante validacion) la existencia de una distribucién aleatoria de los organismos sedimentados y de que no existe “efectos de borde” (mayor nimero de algas sedimentadas hacia la periferia). 6.2.1 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO CUANTITATIVO + Se homogeniza la muestra (con movimientos rotatorios verticales y horizontales, cuidando de no destruir cadenas o colonias). Estos movimientos se realizan por lo menos durante 1 a3 minutos. Se vierte el contenido en columnas o cilindros de sedimentacién de 25 6 50 mL, para luego tapar en la parte superior, evitando la formacion de burbujas de aire. + Eluso de los cilindros de sedimentacién de 25 y/o 50 ml estara en funcién de las caracteristicas de cada area de estudio. + Eltiempo de sedimentacién de las muestras va a estar en funcién de la altura de la columna (cm) a usar. El tiempo que se usa es de 3 horas por cada centimetro de la columna, asi se tiene que el cilindro de SOmL tiene un tiempo de sedimentacién de 24 horas y el cilindro de 25mL es de 12 horas. + No se recomienda el uso de columnas de 100 mL, debido a la adherencia de pianctontes a ias paredes, asi como la formacién de corrientes de convecci6n, impidiendo la sedimentacién. + Transcurrido el tiempo de sedimentacién, se eliminara el agua de la columna a través de un orificio que posee ia platina. La columna es deslizada hacia el extremo donde esta el orificio utilizando una lamina cuadrada de vidrio. + Lamuestra contenida en la cémara de sedimentacion debe estar libre de burbujas, evitandose el incremento de la temperatura en el ambiente de ensayo. Se recomienda mantener condiciones controladas de temperatura en zonas calidas. + Se procede a la lectura de la cémara utiizando un microscopio invertido. 6.2.4.4 CAMPOS Y ORGANISMOS ALGALES A CONTAR El numero de campos u objetos algales que constituyen el recuento puede decidirse de acuerdo al nivel de precision requerido, dado que la precision depende del niimero de objetos algales/campos. La precisién (0) de un recuento puede expresarse como error estandar, como proporcién de la media o mediante los intervalos de confianza del 95% en toro a la media. En la mayoria de los recuentos de rutina, se deberia preestablecer la precision. 6.2.1.2 LECTURA DE LAS MUESTRAS. importancia fundamental de la aplicacién de este procedimionto, jantificar (cel. L") el fitoplancton potencialmente toxico. La determinacién se realiza utilizando las claves respectivas. determinar y ‘rohibida le reproduccién total o parcial de este documento sn preva autoizacin de! Director Cieniticaaah & s | MANUAL |___esicien ot {$I erin: 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Feet 210 sturtre Se? | Semcununstvoy cuavntatvo pee YS | Ps FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO + La lectura de especies se efectia mediante observacién directa con microscopio invertido a 160X, 200X 6 400X de aumento. + Las células menores de 50 ym y las mas abundantes, son contadas en un area determinada con un aumento de 400X. + Las células mayores de 50 ym son contadas en la mitad del area de la camara con un aumento de 200X 6 160X. + Se completa el conteo celular leyendo toda la camara para registrar aquellos organismos que no se determinaron en la mitad contada, paralelamente se realiza el conteo de las especies potencialmente toxicas. = El conteo en una diagonal o area determinada, se hard siempre y cuando estas ‘especies sean abundantes (mayor a 15 cel/campo). + Al realizar los calculos se debe considerar: si el volumen es de 50 mL, los organismos contados al aumento de 400X, son muttiplicados por 50 y luego por 20. Si el conteo es en toda la base se multiplica por 20, mientras que aquellos ‘organismos contados en la media base se multiplican por 40, + Se reportan los resultados en el formato de “Ensayo cuantitativo de fitoplancton” (ver anexo), indicando las especies téxicas y su densidad por especie. Los resultados son expresados en N° cel." 6.3 PRECISION La precisién es normalmente expresada a un nivel de significancia de! 95% como una proporcién de la media. En muchos estudios se ha decidido que contando 50 unidades de las especies dominantes, al 95% de significancia, da una precision de 28%, la cual es suficiente. Aumentando la precision en 20% 6 10% se necesitaria un aumento dramatico en las unidades contadas a 100 y 400 respectivamente. La precision se da por la siguiente ecuacién: 00 IN" cel. contadas Esta claro que no es posible contar 50 unidades de todas las especies presentes en una muestra. Algunas especies no pueden ser abundantes y disminuiran la precision global. Para mantener una precision aceptable para la muestra entera, debe contarse Un total de por lo menos 500 unidades (KARLSON et al. 2010). Precision (%) = 6.4 LIMITE DE DETECCION CUANTITATIVO, EI limite de deteccién es una caracteristica de funcionamiento importante en los estudios de fitoplancton. Para un taxén determinado (asumiendo una distribucin aleatoria), el limite de deteccién puede determinarse mediante estadistica de Poisson, conforme a: ‘An (4) - frees / V “Seonndos) Maen = Profibia la reproduccién total o parcial de este documento sin previa autorzacién del Dwector Cleniicowy MANUAL |__ eaicienos Version: 00 | | PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | ft=r8 2012sstentre SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO Donde: a = nivel de significacién Naot = limite de deteccién fotal ‘ntimero total de campos microscépicos en la cémara feontados numero de campos contados volumen de la submuestra en la camara 6.5 TIEMPO DE ENTREGA DE RESULTADOS. Las Entidades de Apoyo deben emitir al SANIPES los resultados correspondientes a los ensayos de fitoplancton via electronica. Los tiempos de entrega de los resultados seran de 12 horas para el ensayo semicuantitativo y 48 horas para el ensayo cuantitativo. Este tiempo sera considerado a partir de la recepcién de la muestra por los laboratorios. 7. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS El control de la calidad de resultados se hace para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos y las calibraciones de los equipos utiizados. Los datos resultantes deben ser registrados en forma tal que se puedan detectar las tendencias y cuando sea posible, aplicar técnicas estadisticas para la revisién de los resultados, Dicho seguimiento debe ser planificado, revisado y puede incluir los elementos siguientes: 7.4 REPETIBILIDAD La repetibilidad evaléa a un analista mediante el recuento de varias submuestras (camaras de recuento) procedentes de la misma muestra 7.2 REPRODUCIBILIDAD La reproducibilidad interlaboratorios evalia mediante el conteo de un conjunto representative de muestras bajo diferentes condiciones similares y realizadas por distintos analistas. También puede realizarse entre todas las sedes de una misma institucién, 8. INCERTIDUMBRE DE LA MEDIDA (DE LOS CONTEOS) 8.1 INCERTIDUMBRE SEMICUANTITATIVA Se refiere a la identificacién errénea y/o a la no determinacién de los taxones. Puede expresarse como una declaracion general basada en las comparaciones interlaboratorios e intralaboratorio. Esta declaracién se podria expresar como un rcentaje maximo de identificaciones erréneas. Prohlbida a reproduccién total 0 parcial de este documento sn previa autorizacién del Director Cientifcowee | & 2 MANUAL. Edicion 01 j= ~ Version: 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | Fests 2010 setembe a? 'SEMICUANTITATIVO ¥ CUANTITATIVO DEL io a FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO 8.2 INCERTIDUMBRE CUANTITATIVA La incertidumbre cuantitativa depende de la abundancia de cada tax6n en la muestra, la que aumentara al disminuir su abundancia. Se consideraré la suma de la reproducibilidad intralaboratorio més la desviacién estandar, respecto al valor verdadero, Ala actualidad_no se dispone de informacién sobre materiales de referencia para este tipo de andlisis, por lo que para encontrar esta incertidumbre se puede hallar un valor de incertidumbre relativa, el que puede deducirse en los ensayos interlaboratorios (cuando se disponga de ellos). 9, FORMATOS Los resultados de los ensayos deben estar registrades en formatos adecuados, considerandose dos tipos (ver Anexos) 9.4 USO INTERNO + Formato F1: para los resultados de los andlisis semicuantitativos de fitoplancton, * Formato F2: para los resultados de los analisis cuantitativos de fitoplancton, 9.2 USO EXTERNO + F LAB ~ FM- 01-1: para los resultados de los andlisis semicuantitativos de fitoplancton, + F LAB — FM- 01-2: para los resultados de los andlisis cuantitativos de fitoplancton indicando las especies toxigénicas registradas y la densidad por especie (cel.L"), j 10. BIBLIOGRAFIA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA). 2005. Standard Methods for the ‘examination of water & wastewater, 21" Edition APHA. Part. 10200 B, 2.a. pp. 10-3 a 10-5; Part 10200 E, pp. 10-12 a 10-13; Part 10200 F: 10-13 a 10-17 pp. BALECH E. 1988. Los dinoflagelados del Atlantico Sudoccidental. Public. Espec. Inst. Espafiol de Oceanog, Espafia. 310 pp. (ONFEDERACION HIDROGRAFICA DEL EBRO. 2005. Metodologia para el establecimiento del Estado Ecolégico segtin la Directiva MARCO del Agua. Protocolos de muestreo y anélisis para fitoplancton. Ministerio del Medio Ambiente Confederacién Hidrogréfica del Ebro. Comisaria de aguas. Zaragoza. 37 pp. Probie a reprediccibn total parcial de este documento sin previa aterzeciin del Drsctor CentiicoSi we MANUAL |___esicionor | — Yeni: 90 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO ¥ ENSAYO | Feet 2210 eterore ey Scmicuanrirativo y CUANTITATWVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO Cure E1943. 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FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO SOURNIA A. 1967. Le genre Cerativm (Peridinien Planctonique) dans le Canal de Mozambique. Contribution a une revision mondiale. Vie et Milieu. 18 (2*-A): 375- 580 pp. STEIDINGER K, TANGEN K. 1996. Dinoflagellates. In: Tomas C. (ed.). Identifying Marine Diatoms and Dinoflagellates. Academic Press, Inc. San Diego. 387-570pp. SUNDSTROM B. 1986. The Marine diatom genus Rhizosolenia. A new approach to the taxonomy. Doctoral Thesis. Lund, Sweden: 196 pp. THRONOSEN J. 1993. The Planktonic Marine Flagellates. In Tomas C. (Ed.). Marine Phytoplankton a guide to naked flagellates and coccolithophorids, Cap. 2 Academic Press, Inc. San Diego. 7-145 pp. THRONOSEN J. 1978. Preservation and storage. En: A. Sournia (Ed.) Phytoplankton manual. UNESCO, Paris:69-74. UNE-EN 15204, 2007. Calidad del Agua Guia para el recuento de fitoplancton por microscopia invertida (técnica Uterméhi). Asociacién Espafiola de Normalizacién y Certificacién (AENOR). 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MANUAL ain 01 Vestn 00 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | fc 2010 selene ar SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO, ANEXOS ASPECTOS A CONSIDERAR MUESTREO + Contar con una ficha de datos de campo en donde se registre la siguiente informacién: zona, area, estacion y/o punto de muestreo; fecha y hora de muestreo {inicio y término); profundidad de muestreo; tipo de muestra (semicuantitativa o cuantitativa); equipo empleado; nombre del responsable; parémetros ambientales (temperatura superficial y de fondo, oxigeno, pH y salinidad) + Verificar las condiciones de la red y del frasco colector, ambos deben estar bien asegurados. Se recomienda que la unién del frasco colector con la red sea mediante un sistema de rosca hermético. Si no fuera asi, amarrar con un hilo resistente (pita de cafiamo) la union de la tela eldstica o lona con el frasco. + Considerar que el lastre que va unido a la red debe estar a una altura determinada (aproximadamente 50 cm) del fondo, cuidando de no crear turbulencia que haga dificil el muestreo, + Evitar que la red esté en contacto con grasas y/o aceite (si se ensuciara con éstos, hay que lavarla con agua tibia y detergente). + Los pequerios agujeros en la malla nytal pueden ser reparados temporalmente con cemento liquido, parafina, cera de abeja, etc. y los grandes deben ser parchados ‘con un pedazo de la misma malla e hilo fino. + Se recomienda que el horario de muestreo esté en funcién de horas de luz, de preferencia por la mafiana o tarde. ANALISIS Dependiendo de la dificil determinacion de las especies halladas en las muestras, éstas_seran tratadas adecuadamente, esto es: tratamiento previo de limpieza, separacién de placas, coloracién u otro método que facilite su observacién e identificacién FIJACION / PRESERVACION Comprobar cada cierto periodo de tiempo el grado de foto-oxidacion de lugol y de ser necesario afiadir mas conservante si éste fuese el caso. Las muestras con este reactivo deben guardarse protegidas de la luz y en lugares frescos. @ Prohibida ta epreduccién total 0 parcial de este documento sin previa autorzacién del Director CentiicoRae me MANUAL Edicion 01 Vers 00 & PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | f8cha: 2010 setiembre SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL Page nsiee 2a) FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO, FICHAS PARA ENSAYOS USO INTERNO F1: FICHA DE ENSAYO SEMICUANTITATIVO DE FITOPLANCTON LABORATORIO QUE REALIZA EL ENSAYO Monitoreo: Fecha muestreo: Estacion: Hora de Inicio: Cédigo de muestra: Hora de Término: Latitud: Profundidad: Longitud TSM (°C) Abertura de malla: Fecha de analisis: Metodo de anal Observaciones: RESULTADOS Fitoplancton % ‘Taxa/Grupo/ Especie ‘Abundancia relativa Diatomeas Pseudo-nitzschia cf. delicalissima Pseudo-nitzschia pungens Dinoflagelados ‘Alexandrium minutum Dinophysis acuminata Dinophysis caudata Dinophysis tripos Dinophysis rotundata Lingulodinium polyedrum Prorocentrum cf. baitioum Prorocentrum minimum Prorocentrum lima Protoperidinium crassipes | Protoperidinium depressum Firma del Analista y/o Supervisor Prohieida a reproduccién total 0 parcial de esta documento sin previa auorizacién del Dector ClenticoMANUAL Edicion 01 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO. ey | Semicuanriranivo y CUANTITATNO DEL FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO_ Version: 00, Fecha: 2010 setiembre Pagina 20 de-22 LABORATORIO QUE REALIZA EL ENSAYO F2: FICHA DE ENSAYO CUANTITATIVO DE FITOPLANCTON Monitoreo: Fecha muestreo: Estacion: Hora de Inicio: ‘Cédigo de muestra: Profundidad Latitud: TSM 0 TEM (°C) Longitud! Vol. Sedimentado: Método de anaiisis: Fecha de analisis: ‘Observaciones: RESULTADOS Taxa/Grupo/ Especie Ne de células contadas | Densidad | Porcentaje Total | (cel.L") Diatomeas Pseudo-nitzschia ch delicatissima Pseudo-nitzschia pungens TOTAL DIATOMEAS Dinoflagelados ‘Alexandrium minutum Dinophysis acuminata Dinophysis caudate Dinophysis tripos Dinophysis rotundata Lingulodinium polyedrum Prorocentrum cf. baiticum Prorocentrum minimum Prorocentrum lima Protoperidinium crassipes Protoperidinium depressum, TOTAL DINOFLAGELADOS: TOTAL DE FITOPLANCTON (cel.L") Firma del Analista yo Supervisor ‘rohit a reproduccion foal 0 parcial de este documonto sin proviaautori2acén de! Director Cientiicaws MANUAL Eaconat Vern 0 PROCEDIMIENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | festa sisson wey SEMICUANTITATIVO Y CUANTITATIVO DEL " FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO USO EXTERNO: F LAB-FM-01-1 FICHA DE ENSAYO SEMICUANTITATIVO, Beds aes ree Oa De ENSUE Praha a ercdvecon ttl parca de este document sin revi autoreecon detect Girtscion ot Ves c0 PROCEDIMENTOS PARA EL MUESTREO Y ENSAYO | 5m 20 nena eZ MN soncunnrarvoy cuantranivo ost FITOPLANCTON POTENCIALMENTE TOXICO F LAB-FM-O1-2 FICHA DE ENSAYO CUANTITATIVO Cao - @ ee ER RECRT aT terest Ta monezourmna em Ta | oye oa Socetate te RAT ines herrea Fam Ean esaraooe Peace = rar Tene Er aa ia | i El i El rohit a produc ttl parc ete cocumants sn provi atrzann det Decor Ceo