Bài 2: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có thông số sau (5đ):

Chiều dài cột : 150 mm

Tốc độ dòng : 0,8ml/phút
Thể tích pha động (Vm): 1,8 ml
Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,752 ml
Sau khi cho qua cột, hỗn hợp curcuminoid, thu được sắc ký đồ (như file đính kèm) với dữ
liệu như sau :
Thời gian lưu của cấu tử không bị lưu giữ bởi cột (tM) : 1,5 phút
Hỗn hợp curcuminoid thu được gồm 3 thành phần chính: BDMC (Bis-
Demethoxycurcumin), DMC (demethoxy curcumin) và curcumin I.
Phương trình đường chuẩn của curcumin I : y = 47100,08231x + 25,29503 (với x là nồng
độ của curcumin I (mg/ml), y là diện tích peak (mAU.s))
1. Phương pháp sắc ký được sử dụng là phương pháp pha thuận hay pha đảo ? Vì
sao?
2. Thứ tự các chất (3 thành phần chính của curcuminoid) lần lượt xuất hiện trong kết
quả phân tích ?
3. Cách thức pha mẫu và chuẩn bị mẫu ?
4. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi peak, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn của N và chiều
cao đĩa lý thuyết của cột.
5. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.
6. Độ phân giải Rs và độ chọn lọc α đối với hai cấu tử DMC (demethoxy curcumin)
và curcumin I.
7. Dựa trên phương trình đường chuẩn, tính toán giá trị nồng độ của curcumin I.
Bài làm

Câu 1: Phương pháp sắc ký được sử dụng là phương pháp pha đảo. Bởi vì:
Ta thấy, hỗn hợp thu được là hỗn hợp curcuminoid thu được gồm 3 thành phần chính:
BDMC (Bis-Demethoxycurcumin), DMC (demethoxy curcumin) và curcumin I. Cả 3
thành phần trong hỗn hợp trên là những chất phân cực, vì vậy dung môi muốn hoà tan
được mẫu trên phải phân cực. Về nguyên tắc, dung môi không được tương tác với pha
tĩnh (cột) và phải có bản chất khác với pha tĩnh. Do đó dung môi là chất phân cực thì pha
tĩnh là không phân cực. Suy ra phương pháp sắc ký sử dụng pha động là phân cực, pha
tĩnh là không phân cực nên là phương pháp sắc ký pha đảo.

Curcumin I

Demethoxy curcumin (DMC)

Bis-Demethoxycurcumin (BDMC)

Câu 2: Thứ tự các chất lần lượt xuất hiện trong kết quả phân tích là

Bởi vì là phương pháp sắc ký pha đảo nên pha tĩnh là chất không phân cực và nó có xu
hướng tương tác với những chất ít phân cực nhất và những chất phân cực hơn sẽ đi ra
ngoài. Trong đó BDMC là cấu tử phân cực nhất, ít tương tác với pha tĩnh nhất nên ra
trước, tiếp theo là DMC và cuối cùng là Curcumin I ít phân cực nhất (vì trong phân tử có
nhóm -OCH3 tạo hiệu ứng +C vào vòng làm cho nhóm –OH ít phân cực).

Vì vậy, chất đầu tiên xuất hiện là (Bis-

Demethoxycurcumin (BDMC).
Kế đến là (Demethoxy curcumin (DMC)).

Cuối cùng là: (Curcumin I)

Kết luận: Thứ tự các chất lần lượt xuất hiện trong kết quả phân tích là: BDMC  DMC
 Curcumin I.

Câu 3: Cách thức pha mẫu và chuẩn bị mẫu

3.1. Cách thức pha mẫu và chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu thực nghiệm: Cân m(g) mẫu thử. Chuyển phần mẫu thử vào bình định mức
10ml. Định mức bằng acetonitrile, lắc đều. Đánh siêu âm khoảng 5 phút. Pha loãng mẫu
20 lần. Lọc qua giấy lọc. Dung dịch sao khi lọc được tiêm vào máy.

Hệ thống sắc ký và thiết bị đo đạc

Một hệ thống Varian® ProStar HPLC được sử dụng để phân tích, bao gồm hai máy bơm
(Mô-đun phân phối dung môi, model 210), một máy dò quang phổ PDA ProStar 330 UV-
vis (đặt ở 425 nm), một bộ lấy mẫu tự động ProStar 410 (thể tích tiêm mẫu , 20 μL). Cột
C18 pha đảo Luna (kích thước hạt là 250 mm x 4.6 mm, cỡ hạt 5 μm). Pha động là hỗn
hợp 50:50 (v/v) của axetonitril và axit axetic 2% trong nước với tốc độ dòng chảy là 1.2
mL/min.

Câu 4:

Quan sát 3 sắc ký đồ trong phiếu kết quả nhận thấy: trên sắc ký đồ tại bước sóng 422nm
các peak của các hợp chất chính trong hỗn hợp curcuminoid có độ hấp thụ cực đại và ít
peak nhiễu hơn so với 2 sắc ký đồ còn lại. Do đó, sử dụng sắc ký đồ số 2 để tính toán kết
quả.

Nhận định về vị trí của các peak như sau:

RetTime – tR [min] Width – W [min] Ý nghĩa

1 1.542 tM 0.3467 WM Cấu tử không bị lưu giữ bởi cột.

2 3.398 (nhiễu) 0.5076 (nhiễu) (nhiễu)

3 4.301 tR1 0.1738 Wb1 Demethoxycurcumin (BDMC)

4 4.762 tR2 0.1287 Wb2 Demethoxy curcumin (DMC)

5 5.296 tR3 0.1375 Wb3 Curcumin I

Công thức tính số đĩa lý thuyết:

( ) ( )
tR 2 t 2

N=16 × =5,54 × R
W W1
2

Trong đó,

N: Số đĩa lý thuyết biểu kiến.

tR: thời gian lưu

W: chiều rộng của pic ở đáy pic

W1/2: chiều rộng của pic đo tại nửa chiều cao

Công thức tính độ lệch chuẩn

√
n
2 ∑ ( x i−x )2
i=1
s=
n−1

Công thức tính chiều cao đĩa lý thuyết của cột

L 150
H= =
N N

Thực hiện các phép tính thu được bảng kết quả sau:

RetTime – tR [min] Width – W [min] N ( x i−x )

1 1.542 0.3467 316.505 -10978.113

2 3.398 0.5076 717.007 -10577.611

3 4.301 0.1738 9798.494 -1496.124

4 4.762 0.1287 21904.920 10610.302

5 5.296 0.1375 23736.164 12441.546

N trung bình 11294.618

Như vậy:

 Số đĩa lý thuyết trung bình của cột: N=11294.618

 Độ lệch chuẩn của N:

√
2 2 2 2 2
(−10978.113 ) + (−10577.611 ) + (−1496.124 ) + ( 10610.302 ) + ( 12441.456 )
2
¿ =11202.832
5−1

150
 Chiều cao đĩa lý thuyết của cột H= 11294.618 =0.013 [mm]

Câu 5: Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.

Công thức tính:

Hệ số chứa (Capacity factor k’)

' t ❑R −t M
k=
tM

hay

' V R−V M
k=
VM

Hệ số phân bố (Partition coefficient K)

' Vs
k =K ×
VM

Với VS = 0.752 ml; VM = 1.8 ml

Thực hiện các phép tính thu được bảng kết quả sau:

Cấu tử RetTime – tR [min] tM [min] k' K

Demethoxycurcumin (BDMC) 4.301 1.542 1.789 4.282

Demethoxy curcumin (DMC) 4.762 1.542 2.088 4.998

Curcumin I 5.296 1.542 2.435 5.828

Câu 6: Độ phân giải Rs và độ chọn lọc α đối với hai cấu tử DMC (demethoxy curcumin)
và curcumin I.

Công thức tính:

Độ phân giải (Rs)

2× ( t r 1−t r 2 )
R S=
W b 1 +W b 2

Độ chọn lọc 
'
k2
¿ '
k1
Từ phiếu kết quả thu được bảng kết quả sau:

Thời gian lưu của Demethoxy curcumin (DMC) là t r 2=4.762

Thời gian lưu của Curcumin I là t r 3=5.296

Bề rộng đáy peak của Demethoxy curcumin (DMC) là W b 2 =0.1287

Bề rộng đáy peak của Curcumin I là W b 3 =0.1375

Độ phân giải Rs

2× ( t r 3−t r 2 ) 2× (5.296−4.762 )
R S= = =4.012
W b 3 +W b 2 0.1287+0.1375

Hệ số chứa của Demethoxy curcumin (DMC) là k ' 2=2.088

Hệ số chứa của Curcumin I là k ' 3=2.435

Độ chọn lọc:

k '3 2.435
¿ = =1.166
k '
2
2.088

Câu 7: Từ phương trình đường chuẩn của curcumin I:

y=47100,08231 x +25,29503

Trong đó: x là nồng độ của curcumin I (mg/ml)

y là diện tích peak (mAU.s)

Đối với mẫu đang xét: Tại RT: 5.296 có diện tích peak y = 10988.500

y−25,29503 10988,5−25,29503
x= = =0,233
47100,08231 47100,08231

Như vậy, nồng độ của curcumin I là x = 0.233 (mg/ml)