SARS COV-2 TE YÖNELİK CRISPR TABANLI TANI ARAÇLARININ GELİŞTİRİLMESİ

Nükleik asitlerin hızlı tespiti, klinik teşhis ve biyoteknolojide çok önemlidir (14). Kellner ve ark. yakın
zamanda, istenen DNA veya RNA dizilerinin spesifik olarak tanınması için nükleik asit ön
amplifikasyonunu CRISPR-Cas enzimolojisiyle birleştiren CRISPR tabanlı bir tanı aracı tasarladı.
Spesifik yüksek hassasiyetli enzimatik raportör kilid açma (specific high-sensitivity enzymatic reporter
unlockingSHERLOCK) olarak adlandırılır ve klinik olarak uygulanabilir örneklerden RNA veya DNA'nın
duyarlı tanımlanmasına izin verir (15, 16). CRISPR temelli başka bir tanı aracı, viral enfeksiyonların
saptanması için hızlı (∼30 dk), düşük maliyetli ve doğru CRISPR-Cas12 tabanlı lateral akış testi olan
DNA endonükleaz hedefli CRISPR trans reporterdir (The DNA endonuclease-targeted CRISPR trans
reporter/ DETECTR).

SHERLOCK ve DETECTR tanı araçları, geleneksel PCR tabanlı yöntemlerle karşılaştırılabilir duyarlılık ve
özgüllük ile karakterize edilir, ancak karmaşık ekipman gerektirmez ve çok düşük maliyete sahiptir.
CRISPR-Cas'ın moleküler tanıya dahil edilmesi, küresel tanı platformunun profilini yeniden
şekillendirebilir (16, 17).

İlk teknolojiler, tip II CRISPR-Cas sistemlerinin (41) kanonik Cas9 proteinini veya onun modifiye
edilmiş nükleolitik olarak boş veya ölü Cas9 (dCas9) proteinini (42) kullandı. Cas12 ve Cas13'ün
protein kollateral aktivitesinin keşfi, CRISPR tabanlı moleküler tanılama geliştirmeye yönelik büyük bir
adımdı (17, 43). Cas13, hedefe bağlı rastgele RNaz aktivitesi sergilemektedir bu da RNA
moleküllerinin trans bölünmesine yol açarak onları nükleik asit saptama uygulamaları için faydalı
kılmaktadır.

2017 yılında Jennifer Doudna'nın grubu (17), DNA endonükleaz hedefli CRISPR trans reporter
(DETECTR) adlı CRISPR-Cas tanı aracını sundu. Bu yöntem, Cas12a tarafından hedef RNA'nın
tanınmasından sonra aktive olan Cas12a proteininin kollateral aktivitesine bağlıdır. Yazarlar,
Lachnospiraceae bakteri suşu ND2006'dan (LbCas12a) elde edilen Cas12a proteininin, spesifik
olmayan tamamlayıcı aktivite sergilediğini ve hedef RNA'yı tanıdıktan sonra tüm bitişik rna
moleküllerini bozduğunu gösterdiler. Cas12a proteini ve hedef crRNA ile reaksiyon, tek sarmallı DNA
raportörleri (problar) tarafından tamamlanır ve daha sonra biyolojik numune ile karıştırılırsa, Cas12a
tarafından patojenik nükleik asitlerin crRNA'ya bağlı olarak tanınması, DNA problarını yok eden
kollateral aktiviteyi açar. DNA probları, habercinin bir ucunun bir florofora ve diğer ucunun bir
quencher bağlı olduğu geleneksel TaqMan problarına benzer şekilde tasarlanmıştır. DNA problarının
bozulması, floroforları serbest bırakır ve bir florimetre tarafından tespit edilen kararlı ve güçlü
floresan sinyali ile sonuçlanır. DETECTR, insan papilloma virüsünü (HPV) saptamak ve HPV'nin en pro-
onkojenik türleri olan HPV16 ile HPV18'i ayırt etmek için kullanılmıştır (48). DETECTR, ham DNA
ekstraktlarında, geçici olarak PCR ile belirlenen 25 vakanın 25'inde HPV16'yı ve 25 vakanın 23'ünde
HPV18'i tanımlamıştır. Dikkat çekici bir şekilde, tüm DETECTR analizinin tamamlanması sadece 1 saat
sürer (17).

2018 yılında Zhang ve ark. CRISPR-Cas tip VI sistemine dayalı bir teşhis aracı olan SHERLOCK'u sundu
(15, 16, 46). SHERLOCK, DETECTR ile aynı ilkelere dayanmaktadır, ancak Leptotrichia wadei'den Cas13
nükleaz aktivitesine bağlıdır. Cas13, Cas12a gibi DNA'yı değil, sadece RNA'yı özel olarak tanır ve
parçalar. Hedef RNA fragmanları, Cas13 protein, crRNA ve floresan RNA probları ile karıştırılır.
Örnekte hedef moleküller mevcutsa, Cas13 onları crRNA aracılığıyla tanır ve ayrım gözetmeksizin
floresan RNA problarını (teminat aktivitesi ile) bölerek florofor ve söndürücü arasındaki etkileşimi
bozar. Floresan sinyalinin varlığı ve yoğunluğu, biyolojik numunedeki hedef miktarını gösterir.
SHERLOCK'un DNA'da Zika virüsü, dang virüsü, çeşitli patojenik bakteriler ve tek nükleotid
polimorfizmlerini (SNP'ler) attomolar hassasiyetle saptadığını göstermiştir (46). İlk SHERLOCK
sisteminin büyük bir dezavantajı, niceliksel değil niteliksel olmasıydı; ancak bir yıl sonra araştırmacılar
SHERLOCKv2 (45) adlı ikinci sistemi sundular. SHERLOCKv2, Cas13a'yı, sinyal güçlendirme için efektör
sinyalini Cas13a ile birleştirebilen, destekleyici bir tip III CRISPR efektör nükleazı (49, 50) olan Csm6 ile
birleştirerek hassasiyette 3.5 kat artış sağladı.

CRISPR CAS9 İLE İLİŞKİLİ BİTİRİLEN ÇALIŞMALAR

In vitro correction of HBB V6G mutation in lymphocyte cells of sickle cell anemia patients using the
CRISPR / Cas9 genomic editing technique. (Done)

Application of CRISPR / Cas9 system against HER2 amplification in breast invasive ductal carcinoma
(Done)

Not: Değerli Hocam destekleriniz için çok teşekkür ederiz. Gayretleriniz bizide caseretlendiriyor.
Otoromlarda sunduğumuz şeyler mutlak şeyler değil. Sizin bizim adımıza da en iyi kararı vereceğinize
inanıyoruz. Oturumlarda sunduklarımız sadece bir öneri niteliğinde. İlgileniğimiz teknolojiler entegre
olabilecek teknolojiler niteliğide taşıyor. Aslında biz öncelikle yeni moleküler teknolojiler ile
ilgilenmeye CRISPR ile başladık. Dünya da ilk in vitro CRISPR çalışması 2012 yılında yapıldı. Biz 2015
yılında bu yönde Türkiyede ilk olabilecek çalışmaları yaptık Fakat daha sonra birlikte çalıştığımız
öğrencileri Hoca yetersizliğinde dolayı Doktoraya (doktora için bölümde belli sayıda Hoca
istendiğinden dolayı) devam ettiremediğimiz için ötesini getiremedik. Daha sonraki süreçte Covid-19
ile birlikte de ilgilenmemiz sınırlı kaldı. Hocam başta dediğim gibi sizin takdirleriniz bizim için her
zaman önemli.