Professional Documents
Culture Documents
Teknik Rekayasa Genetika Compress
Teknik Rekayasa Genetika Compress
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens
DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena
mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup.
Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen
atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens
DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun
berbagai bidang terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.
Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang)
seperti PCR
ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan
menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
JATMIKO EKO WITOYO 125100601111006 Kelas K
TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan
dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA
cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi
akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi
dengan gugus 5′-fosfat dNTP berikutnya membentuk ikatan phosfodiester.
1) Metode Sanger
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975,
yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-
masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan
hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan
adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan
pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan
basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang
paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang
digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang
dilabel melainkan dNTP.
Gambar 4. Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda
Dye-Terminators Sequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas
menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda
untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing
dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis
saja. Sangat simple dan cepat.
Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya
digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan
untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism),
analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya.
Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini –
meskipun kini tergolong “lambat” setelah ditemukannya high-throughput sequencing–
akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak
heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua
kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.
Hibridisasi probe pada sebuah fragmen DNA tertentu pada filter membran
menunjukkan bahwa inifragmen mengandung urutan DNA yang melengkapi probe .
Langkah transfer DNA dari gel elektroforesis untuk izin membran mudah mengikat
berlabel hibridisasi probe untuk DNA ukuran - difraksinasi . Southern blot dilakukan
dengan pembatasan DNA genomik enzim - dicerna dapat digunakan untuk menentukan
jumlah urutan ( misalnya , gen salinan ) dalam genom . Sebuah probe yang hybridizes
hanya untuk segmen DNA tunggal yang belum dipotong oleh enzim pembatasan akan
menghasilkan pita tunggal pada blot Southern , sedangkan beberapa band kemungkinan
akan diamati ketika probe hybridizes beberapa urutan yang sangat mirip (misalnya , orang-
JATMIKO EKO WITOYO 125100601111006 Kelas K
TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI
orang yang mungkin hasil duplikasi urutan ) . Modifikasi kondisi hibridisasi ( yaitu ,
meningkatkan suhu hibridisasi atau menurunkan konsentrasi garam ) dapat digunakan
untuk meningkatkan spesifisitas dan mengurangi hibridisasi probe ke urutan yang kurang
dari 100 % sama .
4. Jelaskan prinsip kerja northern blot!
Teknik Northern Blot digunakan untuk mempelajari ekspresi gen dengan deteksi
RNA ( atau mRNA yang terisolasi) dalam sampel . Dengan Northern Blot adalah
memungkinkan untuk mengamati kontrol selular atas struktur dan fungsi dengan
menentukan tingkat ekspresi gen tertentu selama diferensiasi , morfogenesis , serta
kondisi tidak normal atau sakit . Teknik ini dikembangkan pada tahun 1977 oleh James
Alwine , David Kemp dan George Stark di Stanford University. Nothern Blot mengambil
nama dari kesamaannya dengan teknik blotting pertama, Southern blot . Perbedaan utama
kedua teknik adalah bahwa pada Northern Blot yang dianalisa adalah RNA , bukan DNA
Prosedur blotting dimulai dengan ekstraksi RNA total dari sampel jaringan homogen .
mRNA kemudian dapat diisolasi menggunakan oligo kromatografi selulosa ( dT ).
Sampel RNA kemudian dipisahkan oleh gel elektroforesis . Sebuah membran nilon
dengan muatan positif yang paling efektif untuk digunakan dalam Northern Blot karena
asam nukleat bermuatan negatif memiliki afinitas yang tinggi bagi mereka . penyangga
yang digunakan untuk mentransfer blotting biasanya mengandung formamida karena
menurunkan anil pada suhu interaksi probe- RNA untuk mencegah degradasi RNA oleh
suhu tinggi . Setelah RNA telah ditransfer ke membran itu bergerak melalui ikatan
kovalen ke membran dengan bantuan sinar UV atau panas . Setelah probe telah diberi
label , maka hibridisasi RNA pada membran . Membran dicuci untuk memastikan bahwa
probe telah terikat. Sinyal hybrid kemudian dideteksi oleh film X - ray dan dapat diukur
dengan densitometri.