DAFTAR HALAMAN JUDUL KATA PENGANTAR TATA TERTIB LABORATORIUM DAFTAR ISI PENDAHULUAN Unit 1. Sterilisasi Unit 2. Media Unit 3. Teknik Biakan dan Pengamatan Morfologi Bakteri Unit 4. Uji Biokimia Unit 5. Pewamaan sederhana Unit 6, Pewamaan Negatif Unit 8. Pewamaan Tahan Asam (BTA) Unit 9. Pewarnaan Kapsul Unit 10. Pewamaan Spora Penuntun Praktikum Bakteriologi I|_ATA PENGANTAR Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkat dan rahmat-Nya sehingga buku penuntun Bakteriologi I ini dapat terselesaikan sesuai dengan waktu yang telah ditentukan. Buku Penuntun praktikum Bakteriologi I ini disusun dengan harapan dapat membantu para mahasiswa untuk lebih mudah mempelajari bakteri, dan sebagai pedoman dalam melaksanakan praktikum bakteriologi I. Penuntun praktikum ini dilengkapi tcori dasar yang relatif sederhana yang mudah dipahami, Percobaan-percobaan yang disajikan di dalam penuntun disesuaikan dengan kondisi peralatan laboratorium. Penulis menyadari masih ada kekurangan dalam penyusunan ‘buku petunjuk praktikum bakteriologi ini. Segala macam kritikan yang membangun dan saran dari semua pihak akan dihargai dan diterima dengan lapang hati. Akhimya, semoga penulisan penuntun ini dapat bermanfaat bagi segenap pemakaianya. Makassar, Maret 2019 Penyusun Penuntun Praktikum Bakteriologi I| - f |TATA TERTIB PRAKTIKUM. 1. Praktikan wajib hadir 15 menit sebelum praktikum dimulai 2. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium — sebelum memasukilaboratorium dan dilepas di luar laboratorium. 3. Tas dan perlengkapan lain yang tidak diperlukan harap diletakkan di tempat yangtelah di sediakan. 4. Praktikanberambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa schingga tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal- hal yang tidak diinginkan, 5. Praktikan wajib mengikuti pretest yang diadakan pada setiap awal praktikum. 6. Praktikan tidak diperkenankan merokok, makan dan minum di dalam laboratorium, serta HP harap disilent. 7. Praktikan dilarang meninggalkan ruangan, kecuali seizin asisten atau dosen penanggung jawab. 8. Praktikan bertanggungjawab atas segala kerusakan alat akibat kelalaian praktikan. 9. Scbelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan. 10. Penggunaan semua alat dan bahan harus sesuai dengan prosedur. 11. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijarsesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat. 12, Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dan jika perlu dengan desinfektan. Penuntun Praktikum Bakteriologi I| m>|UNITI STERILISASI Teori Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan untuk membebaskan ‘lat, barang atau bahan dari mikroorganisme hidup termasuk bakteri dan sporanya dari alat atau bahan yang steril.Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secaramekanik, fisik dan kimiawi. 1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yangberpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikrobatertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahanyang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibioti 2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. a. Pemanasan = Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secaralangsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. ~ Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180C selama 2 jam. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer,tabung reaksi yg telah ditutup kapas, dll. - Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yangmengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidakterjadi dehidrasi. Misalnya produk minuman. - Uap air panas bertekanan: sterilisasi dengan menggunalkan autoklaf kira-kira suhu 121°C selama 15-30 menit, Sterilisasi ini cocok untuk alat-alat yang terbuata dari kaca, alat bedah dan media dil,b. Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnyauntuk —membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior SafetyCabinet dengan disinari lampu UV 3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antaralain alkohol. Tujuan Untuk mengetahui teknik sterilisasi dan melakukan kerja secara aseptis Alat dan Bahan = Aquadest + Tabung reaksi - Ose = Otoklaf = Spirtus = Cawan petri - Pipet tetes - oven - Kapas - Air - Almonium foil Cara Ker; 1. Sterilisasi dengan menggunakan otoklaf a. Sebelum melakukan sterilisasi, mengecek dahulu banyaknya air dalam otoklaf. Jika kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambahakan air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentulnya kerak dan karat b. Tutup rapat labu erlenmeyer dengan kapas dan aluminium foil kemudian masukkan ke dalam otoklaf €. Tutup otoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir otoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. Penuntun Praktikum Bakteriologi Id. Nyalakan otoklaf, kemud " in atur timer dengan wakt n pimval 15 menit pada suhu 12 ©. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun sehingga sama dengan tckanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjukkan ke angka nol). Setelah beberapa menit, kemudian klep pengaman dibuka dan dikeluarkan isi otoklaf dengan hati-hati 2. Sterilisasi kering menggunakan oven a, Sebelum sterilisasi dilakukan, alat-alat lab yang akan digunakan harus kita lindungi dengan membungkus dengan kertas koran. b. Dilakukan sterilisasi selama 2 jam dengan suhu 160°C-180°C. c. Setelah proses sterilisasi selesai, diamkan oven selama beberapa menit hingga suhu turun dan mencapai suhu kamar. 3. Sterilisasi dengan menggunakan bunsen a. Siapakan bunsen kemudian nyalakan b. Sterilisasi alat-alat yang terbuat dari platina atau nikrom seperti ose dengan api bunsen hingga pijar. Penuntun Praktikum Baktertoiog!!| ssUNIT IL MEDIA Teori Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat- makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.—- Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul keeil yang dirakit untuk menyusunkomponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur_ mumi dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. Menurut wujudnya dikenal 3 macam media yaitu media cair, padat dan semi padat. Media cair dibuat dalam tabung atau botolmisalnya air pepton alkalis, nutien broth, brain heart infusion broth dsb. Media padat dibuat di dalam cawan petri atau tabuny yang dimiringkan misalnya nutrien agar, TSI Agar, Mac Conkey Agar, dll sedangkan media setengah padat dibuat di dalam tabung atau botol kecil yang ditegakkan misalnya SIM, MIO dsb. Menurut sifatnya dikenal beberapa jenis media yaitu: 1. Media Transport Media yang digunakan untuk mengirim kli spesimen dari suatu tempat ke laboratorium. Di dalam media ini bakteri yang ada di dalam spesimen tidak mati dan tidak berkembang biak. Contoh Carry & Blair, Amies dan Stuart 2. Enrenchiment media Media yang digunakan untuk memperbanyak atau menummbuhkan bakteri menjadi lebih banyak. Ada yang bersifat umum dan ada yang bersifat khusus. Contoh yang bersifat umum: Nutrient Agar, Nutrient broth, Brain Heart Infusion Agar, Brain Heart Infusion broth, Blood Agar dsb.3. Media Selektif uk memilih koloni satu jenis bakteri dari Media yang digunak: koloni-koloni yang lain. Ada yang bersifat umu dan ada yang bersifat khusus. Contoh yang bersifat unum Blood Agar plate (untuk gram negatif dan gram positif), Mac Conkey Agar (untuk gram negatif batang). Contoh yang bersifat khusus TCBS Agar plate, SS Agar plate, Mannitol Salt Agar plate 4. Universal Media Media yang dapat ditumbuhi oleh hampir semua jenis bakteri. Misalnya Blood Agar, Trytose Soy Broth, BHI broth dsb. Tujuan Untuk mengetahui pembuatan media pertumbuhan bakteri Alat dan Bahan - Aquadest = Tabung reaksi - Ose - Otoklaf = Spirtus - Cawan petri = Pipet tetes - Oven - Kapas - Aquadest Cara Kerja 1. Siapkan labu erlenmeyer berukuran 250 ml dan timbang bahan media NA, MIO, BHIB atau Lactosa Broth dan larutkan kedalam aquadest. 2. Panaskan bahan hingga | Penyesuain pH dilakukan dengan menambahkan NaOH | N. padat dimasukkan ke dalam tabung farut dan ukur pH cairan dalam labu. 3. Untuk media cair atau semi steril, kemudian tabung ditutup dengan kapas dan diberi label 4. Sterilkan tabung dalam otoklaf suhu 121°C selama 15 menit. a Penuntun Praktikum Bakteriologi I| a |Penuntun Praktikum Bakteriologi I EzPenuntun Praktikum Bakteriologi I|| Keterangan | Sebelum sterilisasi- Warma Konsistensi: 2. Sesudah sterilisasi Warna: Media: Keterangan a, Sebelum sterilisasi Wama: Konsistensi: b. Sesudah sterilisasi Wara: Konsistensi: Penuntun Praktikum Bakteriotog! Il EaMedia: | Keteranean ] a, Sebelum st Warna b, Sesudah sterilisasi | Warna: Konsistensi: Media : Keterangan 1. Sebelum sietilisasi Warna: Konsistensi: 2. Sesudah sterili — Waray Konsistensi: Penuntun Praktikum Bakteriolog! 1 matudul : | ‘Zakis Bakri, S.SLM.Kes 1DN, 091 $098 901 lari/Tanggal : >, PEMBAHASAN Penuntun Praktikum Bakteriolog! I| | i |Penuntun Praktikum Bakteriolog! I|UNIT IN TEKNIK BIAKAN DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI Teori 'solasi_mikroorganisme adalah_memisahkan mikroba yang berasal dan lingkungan dan menumbuhkannya sebagai kultur mum! dalam suatu- media. Proses pemindahan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang berhubungan dengan medium dan pekerjaan harus benar-benar steril, hal ini untuk menghindari kontaminasi dengan mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam praktikum akan dipelajari 3. cara isolasi untuk memperoleh biakan murni yaitu: 1. Cara goresan Cara ini menguntungkan jika ditinjau dari sudut waktu, tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dengan latihan.Penggoresan yang sempuma akan menghasilkan koloni yang terpisah. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah ada beberapa teknik yang digunakan yaitu goresan T (cawan petri dibagi menjadi 3 menyerupai huruf T), goresan kudran (cawan petri dibagi menjadi 4), radian dan sinambung. 2. Cara Agar Tuang Isolasi menggunakan media agar yang sedang mencair (suhu 45-50°C) dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme schingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung. 3. Cara Agar Sebar Isolasi menggunakan media pada, dimana setelah suspensi atau bahan yang mikroba ‘Penuntun Praktikem Baxeeriotogt! =Jempeng agar, lalu disebarkan atau diratakan dengan menggunakan batany bengkok (stick) yung terbuat dari gelas. Pengamatan Morfol Pengamatan morfologi mikroba merupakan tindakan pertama suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya kali jikaingin mempelaj untuk tujuanidentifikasi. Setelah mendapatkan kultur mumi maka binkan yang diinginkanditumbubkan ke berbagai bentuk media untuk dikenaliciri koloninya. Ciri koloniyang diamati berupa ukuran, pigmentasi, bentuk tepi, elevasi dan pertumbuhanpada media cair. ‘Tujuan Mengetahui teknik biakan bakteri dan mempelajari morfologi bakteri pada media agar nutrisi padat Alat dan Bahan - Media -Batang kaca penabur bentuk L + Erlenmeyer -Spirtus = Neraca -cawan petri = Tabungreaksi ose - Kapas -Hot plate Cara Kerja 1. Cara Goresan = tuang media NA yang sudah steril 4 15 ml ke dalam cawan petri dan tunggu hingga memadat. Ambil 1 ose biakan bakteri dan lakukan goresan T, sinambung dan kuadran - Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C dengan posisi cawan terbalik. 2. Cara Taburan + dibuat suspensi biakan dengan mengambil 1 ose biakan bakteri kemudian dimasukkan kedalam tabung berisi aquadest steril 9 ml setelah itu homogenkan, a Penuntun Praktikum Bakteriologi I| EiAmbil | ml suspensi biakan dari tabung reaksi dan masukkan ke dalam tabung reaksi pertama (10"), setelah itu homogenkan. Ambil 1 ml suspensi biakan dari tabung reaksi pertama dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua (107), elah itu homogenkan. = Ambil | ml suspensi biakan dari tabung reaksi kedua dan masukkan ke dalam tabung reaksi ketiga (10°, setelah itu homoeenkan. = Ambil 1 ml suspensi biakan dari tabung reaksi ketiga (10°), setelah itu di masukkan ke dalam cawan petri. = tuang media NA steril + 15 ml kedalam cawan petri dan goyangkan secara melingkar ke kanan dan ke kiri agar koloni terpisah. - Biarkan medium memadat dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C denean posisi cawan terbalik. 3. Cara Sebaran = dibuat suspensi biakan dengan mengambil 1 ose biakan bakteri kemudian dimasukkan kedalam tabung berisi aquadest 9 ml setelah itu homogenkan. ~ Ambil 1 ml suspensi biakan dari tabung reaksi dan masukkan ke dalam tabune reaksi pertama (10°, setelah itu homogenkan. - Ambil 1 ml suspensi biakan dari tabung reaksi pertama dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua (107). setelah itu homogenkan. = Ambil 1 ml suspensi biakan dari tabung reaksi kedua dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua (10°), setelah itu homogenkan. = Ambil 0.1 ml suspensi biakan dari tabune reaksi ketiga (107). setelah itu masukkan ke dalam cawan petri yang berisi media NA dan ratakan dengan batang gelas bengkok. Biarkan suspensi meresap dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C denean posisi cawan terbalik. |. Isolasi pada Media Padat di Dalam Tabung Bentuk Miring Dengan nce yang sndah steril dan diamhil kolani bakteri Penuntun Praktikum Bakteriologi I| ElTutup tabung media dibuka dengan menjepit menggunakan jari helingking kanan, Mulut tabung dibakar dengan nyala api. = Ose yang sudah berisi koloni bakteri igoreskan zig-zag pada permukaan media. - Mulut tabung dibakar kembali dan ditutup dengan kapas + Ose dibakar lagi hingga steril 5. Isolasi pada Media Semi Solid di Dalam Tabung - Dengan ose yang sudah steril dan dingin, diambil koloni bakteri - Tutup tabung media dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking kanan, Mulut tabung dibakar dengan nyala api. = Ose yang sudah berisi koloni bakteri ditusukkan tegak lurus di permukaan bagian tengah sampai dasar tabung media. - Mulut tabung dibakar kembali dan ditutup dengan kapas = Ose dibakar lagi hingga steril. 6. Isolasi pada Media Cair di Dalam Tabung jambil koloni bakteri = Tutup tabung media dibuka dengan menjepit menggunakan jari = Dengan ose yang sudah steril dan dingin, kelingking kanan. Mulut tabung dibakar dengan nyala api. = Ose yang sudah berisi koloni bakteri digores pada dinding bagian dalammedia. = Mulut tabung dibakar kembali dan ditutup dengan kapas - Ose dibakar lagi hingga steril. a Penuntun Praktikum Bakteriolog! I| EiTepi koloni dilihat dari atas Bulat Tidak teratur ——berbenang ——Serupa akar Permukaan koloni dilihat dari samping ust Serupa akar Tidak terotur esting -—=—_wberbenang timbul membutit Timbuldatar rata —— cembung __Timbul,tepl_——_Serupa cbse vawan——-‘Tumbuh dalam medium Bentuk koloni pada agar miring Serupa —serupa 7 feme SETUP2 ak bet Menebrberdu—_Seropa m8 tar Penuntun Praktikum Bakteriologi I|Perumbuhan bakteri pada media cair y | AS f \ | } 4 af \l Servps —Serupa Sepa Serupa oy Sera bertoriel—seropa wasn eden Ga Pertumbuhan Bakteri pada Media Cair Terdapat ‘sdieon ‘ncn es — Derr bere - —_ Tahuttatit aerob mikreaerofilik anserob anaerob Gambar 1. Bentuk koloni bakteri Penuntun Praktikum Bakteriologiti =AALATA ELABKANG —_ Penuntun Praktikum Bakterlologi I|B, TINJAUAN PUSTAKA a SS Penuntun Praktikum Bakteriologi I aZAMATAN [Motades Katona “| Bentuk | Permukaan: | Tepi. | | | | Warna: | Metode: Keterangan 1, Bentuk: 3. Tepi: 2. Permukaan: | ‘Penuntun Praktikem Bakterioiogiti =Moatade: Keteranaan | | | Bentuk, Permukaan: | Tepi Warna: | Metode: | | | | Keterangan | Bentuk: Permukaan: i Tepi:| Motado | Kote Bentuk: Permukaan Tepi. ' Warna: Keterangan Bentuk: Permukaan: ceriotost! AE Penuntun Praktikum BakJudul t | ” gal: | Zahle Babe SSuMAKO | Hari/Tanggal NIDN, 091 £098 901 D. PEMBAHASAN | Penuntun Praktikum Bakteriologi I)= SSN Penuntun Praktikum Bakteriolog! I| a > |UNIT IV UJI BIOKIMIA Teori Uji yang dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri adalah Uji Wi Indol, Methyl Red, Voges Proskauer dan Citra, serta beberapa uji biokima lainnya, yaitu Urea, katan dari Sukrosa, Glukosa, Luktosit, Maltosa, dan Manitol. Dari suspensi bukleri yang dibuat di uji__lengkap, masing-masing — diinokulasikan menggunakan jarum ose ke dalam tiga tabung masing-masing berisi media yang berbeda. 1, UJI KIA/USIA Ujl_ TSIA bertujuan untuk melihat kemampuan_bakteri metermentasi dekstrosa, sukrosa dan laktosa_ serta_ kempuan memproduksi hydrogen sulfida. Perubahan pH karena adanya fermentasi yang menyebabkan terjadinya wama kuning, dengan adanya indicator phenol red. 2. Uji Indol (MIO/SIM) Media Mio (Moniliti, Indol, Ornitin) atau media SIM (Sulfit, Indol, Motiliti) digunakan untuk mengetahui reaksi terhadap omitin, dapat juga digunakan untuk mengetahui adanya pergerakan bakteri yang diperiksa, serta kemampunaanya menghasilkan indol. 3. Ujisitrat Uji sitrat bertujuan untuk mengetahui penggunaan sitrat sebagai sumber karbon dan energi. Bila bakteri mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, schingga menyebabkan peningkatan pil dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. ee Eel Penuntun Praktikum Bakteriologi I 2.2)4, Uji Urea Uji urea bertujuan untuk mengetahui bakten’ yang memiliki enzim urease. Bakteri tertentu dapat menghidrolisis urea dan membentuk amonia dengan menimbulkan wama merah karena indikator phenol red. ‘Terbentuknya amonia menyebabkan nilai pH menjadi alkali sehingga jika ujt urea teryadi warna merah muda pada media berarti tes positif. §. UjiMRVP Uji VP bertujuan untuk mendetcksi adanya acethyl methyl carbinol yang diprodukst oleh bakten tertentu dalam pembenthan VP. Adanya bekteri tertentu: yang, dapat memproduksi acethyl methyl carbinol dapat diketahui dengan penambahan reagen voges proskauer (reagen VP). Sedangkan Uji MR bertujuan untuk menentukan adanya termentast asam campuran. Beberapa bakter: memtermentas! glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhan menjadi 5,0 atau lebih rendah, Penambah indikator pH “methyl red” dapat menunjukan adanya perubahan pH menjadi asam. 6. Uji Fermentasi karbohidarat ‘Uji termentasi karbohidrat (giukosa, sukrosa, laktosa dan mannitol) bertujuan untuk mengetahui jenis bakteri yang memfermentasikan jenis karbohidrat tertentu. Vembenihan gula-gula yang digunakan adalah cair ynag mengandung satu jenis karbohidrat (kadar 1%) dengan indikator phenol red. Jika, terjadi fermentasi, medium terlihat berwama kuning karena perubahan pH menjadi asam Mengetahui pembuatan media TSIA, MRVP, MIO, SITRAT. UREA, GLUKOSA, LAKTOSA, SUKROSA, MALIOSA Alat dan Bahan Aanadest + Tahung reaksi ay Penuntun Praktikum Bakteriolog! I| — aOse + Otoklaf apintus = Cawan pein Pipet tetes - Oven Aupas = Aquauest Media TSIA, MRVP, MIO, SITRAT. UREA, GLUKOSA, LARIUSA, SUNKUDSA, MAL TUS, Cara Kerja Siapkan labu erlenmeyer berukuran 250 ml dan timbang masing- macine media INIA. MIC MEV. Sitrat. Urea Ginkasa, laktosa Sukrosa, Mannitoldan larutkan ke dalam aquadest. . Panaskan behan hingga larut dan ukur pH cairan dalam labu. Penyesuain pH dilakukan dengan menambahkan NaOH | N. . Media dibagi ke dalam beberapa tabung steri] setelah itu tabung ditutup dengan kanas dan diheri label |. Sterilkan tabune dalam otoklaf suhu 121°C selama 15 menit .. Media TSIA, Urea dan Sitrat diletakkan pada kemiringan 30-45°C dan agar tidak boleh np tabung . Media MIO, MRVP, Glukosa, Laktosa, Sukrosa, dan Maltosa disusun ke dalam rak tabung dan dibiarkan secara tegak. ‘PenuntenPrakdkem Bakeeriotegtti—=st«sdMEawane ps ee mee et me en et ee ee ee ee ee ee ee eeDOTINTATIAN DICT AL « = sos sieAunpiotenst. | Warna: Konsistensi: Konsistensi: Pencimtin Rosteettecren Metrenstntast #! Keterangan Sesudah sterilisasi b, Sesudah sterilisasi— Fungsi: Keterangan a, Sebelum sterilisast T Whaenas b. Sesudah sterilisasi ' i vrai. I | Kunpisicusi. Fungsi: Keterangan 1 t i { a, Sebelum sterilisasi b, Sesudah sterilisasi veut. i | Konsisieusi.Fungsi: Keterangan a, Sebelum sterilisasi i Vinmes b. Sesudah sterilisasi i i i wana: i i Konsisiensi: i l | J i i Fungsi: Keterangan i i i i i i a. Sebelum sterilisasi i Ttamne i b. Sesudah sterilisasi | i vain, i | Konsisteusi. iangen a. Sebclum stertlisast i Warna: Wwarna. j Kuusisiensi. Keterangan a. Sebelum sterilisasi i Warne: \ b, Sesudah sterilisasi I Wailia, | Kunsisicnsi.Media : Mannitol | Fungsi: Keterangan a. Sebelum sterilisasi Wama: Konsistensi b. Sesudah sterilisasi Warna: Konsistensi: Tener rey eewil | | i lari/Tanggal ; | “ | i i ' | PEMBAHASAN | it =. Sa eS ee ee ee ee ee ee oe Ponuntun Praktitium Baktertotocs 2! ais OO ESUNIT V PEWARNAAN SEDERHANA Teori Mikroorganisme dapat dilihat dengan mikroorganisme biasa tanpa diwarmai vakni denva cara-cara khusus. Cara tersebut misalnva dengan cara tetes gantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lainnva, Tetani neneamatan vane demikian (tanna newaraan) lebih sulit dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan seksama, Hal ini karena umumnya sel mikroorganisme bersifat transparan atau semi transparan. Sel bakteri danat teramati dengan ielas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa. pewamaan. sel bakteri sulit terlihat. Pewamaan bertujuan untuk memperjelas selbakteri dengan menempelkan zat wama ke vermukaan sel bakteri. Zat warnadapat meneabsorbsi dan membiaskan cahaya, schingga kontras sel bakteri dengansekelilingnya ditinekatkan.Zat wama vane diounakan bersifat asam atau basa. Pada zat wama basa, bagian yang berperan dalam memberikan wama disebut kromofor dan memounvai muatan vositif. Sebaliknya vada zat wama ‘asam bagian yangberperan memberikan zat warna memiliki muatan nevatif. Zat wama basa lebihbanyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan padapermukaan sel. Contoh zat wama basa antara Iain Crvstal Violet. Methvlene Blue.Safranin, Base Fuchsin. Malachite Green dil. Sedangkan zat wama asam antaralain Eosin, Congo Red di, Pewarnaan sederhana atau pewarnaan tungeal adalah salah satu cara pewamaan yang hanya mengeunakan satu macam zat wamna, akni untuk meningkatkan kontras antara Tujuan dari pewarnaan mikroorvanisme denvan sekelilinonva dan untuk) melihat hentuk Penuntun Praktikum Bakteriologi I|ukuran dan penataan mikroorganisme. Zat warna yang digunakan adalah metilan blue, gentian violet (Kristal violet), karbon fuksin, safranin, hiiau malakit, dan lain-lain.. Kadang-kadane digunakan zat wara negative untuk pewamaan sederhana, misalnya nigrosin dan h kongo. Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object bakteri wlass vane vudian difiksa: yang terlalupadat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh Kkesulitan saat mencari bakteri denean mikroskor. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada anatara sel ke! mengamati ciri morfologi bakteri Alst dan Bahan 1. Mikroskop = Tissue 2. Biakan bakteri ~ Aauadest 3. Larutan (Methylen blue, Safranin, Crystal violet) 4. Gelas obyek 5. Spirtus 6. Ose Cara Kerja 1. Bersihkan object glass denean kanas atau iika verlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass. 2. Bila menceunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan denganpipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum, Janganlupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, makabiakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saia kemudiandiberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. “Ponuntun Praktikam Baxteriotogtti sl2. Keringkan ulasan tersebut sambil difiksasi an api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali). 4. Setelah benar-benar kering dan tersebar selaniutnve div denganpewara (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal u kurane lebih 30 detik. mtu violet 5. Cat dibuang, dicuei dengan air mengalir sampai bersih, 6. Kerinekan dengan tissue dan lihat di bawah mikroskon obiectif perbesaran 100 x. Gambar 2. Prosedur newamgan Sederhana a Penuntun Praktikum Bakteriologi I| EaA. LATAR BELAKANGC. HASIL PENGAMATAN Gambar Keterangan we Perbesaran: Paraf Dosen NIDN. 091 5098 901 PEMBAHASAN ‘Penuntun Prakikem Baxtertoiogst| stsUNIT VI PEWARNAAN NEGATIF Teori Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat_warna tidak akan melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel mewarnai s tampak transparan dengan latar belakang hitam, Pewarnaan negative menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak jelas terpisah diantara medan yang gelap karena pewama yang diberikan tidak menembus sel mikroba.Teknik pewamaan ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Tinta yang dipakai dalam pewamaan negatif adalah nigrosin. Berhasil tidaknya metode ini tergantung: a) kaca obyek harus betul- betul bersih, b) jumlah nigrosin yang digunakan menentukan keberhasilan pewamaan, dan c) campuran mikroorganisme harus digesekkan di atas kaca obyek, bukan sekedar didorong. Tujuan Mengamati morfologi. mikroorganisme yang sulit diwamai oleh pewarnaan sederhana. Alat dan Bahan - Mikroskop - larutan nigrosin -Ose - Gelas obyek -Biakan bakteri ——- Aquadest -Rak pewarna Cara Kerja 1. Buat suspensi dari biakan bakteri dengan NaCl fisiologis pada salah satu ujung dari kaca benda pertama. Penuntun Praktikum Bakteriologi2. Letakkan satu tetes tinta cina didekat suspensi bakteri tadi, lalu pelan-pelan campur baik-baik susupensi bakteri tersebut dengan tinta cina 3. Letakkan kaca benda kedua dengan kemiringan 45° di didepan campuran tadi, Jalu tarik ke belakang sampai campuran tinta merata pada ujung kaca benda I, Segera dorong kaca benda I ke arah depan dengan rata dan cepat 4, Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri S. Barkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api, Gambar 3. Prosedur Pewarnaan Negatif Penuntun Praktikem Baxteriotogiti tsGambar 4, Bentuk dan Penataan Bakteri Penuntun Praktikem Baxeertotog!| =A. LATAR BELAKANG Penuntun Praktikum Bakteriotogit| saPenuntun Praktikum Bakteriologi |C. HASIL PENGAMATAN Gambar Keterangan Perbesaran: iTanggal : i 'EMBAHASAN eee Penuntun Praktikum Bakteriologi I a— Penuntun Praktikum Bakteriologi !|UNIT VII PEWARNAAN GRAM Teori Pewarmaan gram adalah pewaraan diferensial yang sangat berguna dan paling banyakdigunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atautipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemakpada membran sel bakteri, Jenis bakteri berdasarkan pewaraan gram dibagimenjadi dua yaitu gram positif dan pram negatif. Bakteri gram positif memilikidinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Pada pewamaan gram zat wama yang sering digunakan adalahkristal violet, Iugol, larutan pemucat dan air fuchsin. Fungsi zat warna pada pewamaan gram adalah sebagai berikut: 1. Kristal violet Memberikan warna ungu pada bakteri gram positif karena disebabkan kompleks zat wama Kristal Violet dengan dinding sel bakteri. 2. Larutan lugol 7. Meningkatkan afinitas pengikatan zat wama Kristal Violet oleh bakteri schingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. 8. Setelah penambahan lugol, zat wamna Kristal violet lebih jelas terlihat 9. Setelah penambahan lugol zat warna Kristal violet lebih sulit dilarutkan 10. Tanpa penambahan lugol, zat wama Kri sewakti penambahan larutan pemucat, sehingga bakteri gram Positif tidak akan berwarna ungu. Penuntun Praktikum Bakteriologi I istal violet akan larut3. Larutan Pemucat Rakteri pram positif tetap berwama ungu karena kompleks pers enyawaan Kristal violet-lugol tetap terikat pada dinding sel Bakteri gram negative berwarna pucat atau tidak berwarna karena larutan pemucat melarutkan fipida dan menyebabkan_ pori-pori dinding sel membesar, sehingza meningkatkan daya_larut persenyawaan Kristal violet-lugol. 4. Air fuchsin Pada bakteri gram negative, penambahan air fuchsin menyebabkan sel bakteri berwarna merah, karena persenyawaan kompleks Kristal violet-lugol larut dan dinding sel kemudian mengikat zat warna kedua. Tujuan Untuk mengetahui prosedur pewarnaan gram dan memahami reaksi- reaksi kimiawi yang terlibat Alat dan Bahan -Mikroskop = Aquadest -Ose + Biakan bakteri -Tissue - Bak pewama -Larutan (Kristal violet, Lugol, Safranin, Alkohol, Air fuchsin) Cara Kerja a. Buat preparat ulas, kemudian fiksasi di atas api. b. Teteskan kristal violet sebagaipewara utama pada kedua preparat, usahakan semua ulasan terwamai dantunggu selama + | menit. cc. Cuci dengan aquades mengalir d. Teteskan mordant (/ugol.s iodine) Jalu tunggu + 1 menit e. Cuci dengan aquadest mengalir 5 " f. Cuci dengan akuades mengalir Beri larutan pemucat (ethanol 96%! i setetes hingga etanol yang jatuh berwama aseton) setetes demi i terlalu banyak (overdecolorize) iemih. Jangan sampai & Cuci dengan akuades mengalir a ee Penuntun Praktikum Bakter!h. Teteskan counterstain (safranin) dan tunggu selama + 45 detik i. Cuci dengan akuades mengalir j. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di si ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara, Gambar 5 . Prosedur Pewarnaan Gram Penuntun Praktikum Bakteri etLATAR BE! —_—_—_ Penuntun Praktikum Bakteriolog! I |me OEE ES Penuntun Praktikum Bakteriologi I|C. HASIL PENGAMATAN Rete angen, | | Zakin Bakri, S.Si,M.Ket wri Tangy : | l NIDN, 091 5098 901 , PEMBAHASAN Penuntun Praktikum Bakteriologi I|Penuntun Praktikum Bakteriologi !|PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM Teori Fewamaan 7ient neetsen aaaian pewamaan anerensiat any membedakan kelompok Mycobacterium dan bakteri_lainnya Pewamaan ini disebut tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuei dengan asam alcohol. Bakteri tahan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya padabakteri yang tidak tahan asam, larutan pemucat akan melarutkan karbol fuksin denzan cepat sehingga sel bakteri tidak berwama. Setelah penambahan zat warna kedua hakteri tidak tahan asam henwama hint Bakteri Mycobacterium memiliki dinding sel yang mengaadung Tinid Kandunean lipid ini saneat tineei menvebahkan sel hakteri sulit diwamai, karena zat wama tidak dapat menembus lapisan lipid. Jadi ketika diwamai dengan karbol fuksin warna ini tidnk mudah dilunturkan oleh pemucat, oleh karena itu digunakan pemasan schingga zal warna dapat merusak ke dalam sel bakteri vane diliouti oleh lipida. Tujuan Untuk mempelajan cara melakukan prosedur pewamaan tahan asam dengan cara Zieh! Neelson dan memahami dasar-dasar kimiawi reaksi tahan asam. Alat dan Bahan -Mikroskop _- Kaca obyck “Use - Bak pewama -Aquadest Tarntan (karhal fichsin alenhol dan metilon bler\ -Biakan bakteri ‘Penuntun Prakdkam Bakeertorogiti =Cara Kerja 1. Bersinkan apyect glass dengan tissue 2. Buat preparat ulas dari biakan, kemudian fiksasi 3. Sediaan yang sudah difiksasi, digenangi dengan larutan fuchsin kemudian lewatkan nyala api spirtus di bawah sediaan, sampai keluar uap tetapi jangan sampai mendidih atau kering, 4, Setalah preparat dingin, sisa larutan fuchsin dibuang dan kaca preparat dicuci dengan air mengalir. 5 Tambahkan acam alenhol selama 20 detik dan cuci dengan air 6. Wamai dengan metilen blue selama 1 menit dan cuci dan air menealir 7. Keringkan dun amati dibawah mikroskop dengan perbesaran ahieltif 40x dan 100 Penuntun Praktikum Bakteriologi I|fo ( Buat sediaan, genangi dengan air tuchsin danpanaskan preparat selanva § monit erhinewn terlihat uap. Jangan biarkan preparat mengering Cuci dengan asam alcohol Cirek dengan aie notte menghilangkan pemucatan 5 deangais nett ‘Cuct aengan air mengatir blue selama I menit ¥ Keringkan dengan kertas saring/tissue Gambar 6. Prosedur Pewaraan Ziehl Neelsen Fungsi zat warna pada pewarnaan Ziehl-Neelsen: i. Natu fucinsis Memberikan warna merah pada bakteri tahan asam 2. Laratan nemueat (meneandune asam dan alenhaly Memucatkan zat warna pertama, pada bakteri tahan asam tidak danat dilunturkan sehingea hakteri tetan herwarna mera Sebaliknya pada bakteri tidak tahan asam, larutan pemucat akan ‘“Penuntun Praktikum Bakeeriotogit| sdmelarutkan karbol fuchsin dengan cepat, schingpa bakteri tidak herwarnn 3. Metilen blue Metilen bine zat wamna kedun tidak akan menvehahkan re warna merah pada bakteri tahan asam, Sedangkan bakteri tidak tohan asam metilen Nie akan ditkat oleh sel hakteri vane tidak berwarna schingga berwara biru, ‘Penuntun Praktikem Baxteriotogiti stsA. LATAR BELAKANG ee ee Penuntun Praktikum Bakteriolog! !| iB, TINJAUAN PUSTAKA L Penuntun Praktikum Bakteriolog} !|C.HASIL PENGAMATAN EMBAHASAN Penuntun Praktikum Bakteriolog! I mm? |‘Penuntua Praktixam Baxeeriotogtt!UNIT IX PEWARNAANSPORA Teori Spora pada bakter merupagan struktur yang tanan panas dan tahan terhadap kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk ‘mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri tersebut. Contoh bakteri pembentuk spora adalah Bacillus, Clostridium, dan lain- Jain. Tujuan dilakukannya pewamaan spora adalah untuk membedakan spora dengan sel vegetatif. schin a pembedaannya tampak jelas. Spora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpapewamaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sanget refraktil. Namun jika dengan pewamaan sederhana, spora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan. sel vegetatif’ berwama), schingga diperlukan teknik pewamaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewamaan endospora dengan metode Schaeffer- Fulton. Tujuan Untuk mengetahui cara pewamaan spora pada bakteri dengan cara Wirtz Conclin Alat dan Bahan -Mikroskop - Bak pewama -Kaca obyek - Ose -Bak pewama - Aquadest -Larutan pewama (hijau malakhit 5 % dalam air, safranin 0,5 % dalam air) Cara Kerja ‘Penuntun Praktikem Bakerton! sdBuat preparat ulas dari biakan yang disediakan dan tutup dengan kertas saring, 2. Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas caring kemudian letakan di atas air yang mendidih Riarkan $ menit dan dijaga jangan sampai kering. Jika bagian Pinggir mulai ireen mongering, tambublan api Matachin 3. Setelah dingin, bilas object glass denganaquades mengalir 4. Tetesi dengan safranin dan diamkan selama + 48 detik 5. Cuci dengan aquadest, keringkan dan periksa dengan mikroskop Gambar 7, Prosedur Pewarnaan Spora - Penuntun Praktikum Bakteriolog! IGambar 8. Tipe Spora dan Contohnya _____+§___—_—_ |g Penuntun Praktikum Bakteriolog! 1!A. LATAR BELAKANG Penuntun Praktikum Bakteriolog!B. TINJAUAN PUSTAKA —— Penuntun Praktikum Bakteriologi I| =C. HASIL PENGAMATAN Keterangan Perbesaran: Paraf Dosen NIDN, 091 $098 901Se —ent(‘(ité«daR Penuntun Praktikum Bak’UNIT X PEWARNAAN KAPSUL TEORI Kapsul merupakan lapisan yang melekat di luar dinding sel Yang terdiri dari polisakarida atau polipeptida dengan tebak sekitar 1-2 hm. Kapsul berfungsi sebagai cadangan makanan, melekatkan diri Pada permukaan, melindungi bakteri terhadap sel fagositosis (baik dalam tubuh hospes maupun di alam bebas).. Tanpa pewamaan, kapsul bakteri sangat sulit diamati dengan mikroskop cahaya biasa karena tidak berwama dan mempunyai indeks bias yang rendah.Karen kapsul bersifat non ionik, maka pewarnaanya tidak dapat dilakukan dengan prosedur pewamaan sederhana biasa. Tujuan Untuk mengetahui cara pewarnaan kapsul dengan cara Burry Gins Alat dan Bahan Ose - Biakan bakteri -Kaca obyek bersih - Tinta cina -Bak pewama ~ Air Fuchsin -Mikroskop Cara Kerja: 1. Buat suspensi tebal dari biakan bakteri dengan NaCI fisiologis pada salah satu ujung dari kaca benda pertama. 2. Letakkan satu tetes tinta cina didekat suspensi bakteri tadi, lalu pelan-pelan campur baik-baik susupensi bakteri tersebut dengan tinta cina, Penuntun Praktikum Bakeeriologit| = AL3. Letakkan kacabenda kedua dengan kemiringan 45° di didepan campuran tadi, lalu tarik ke belakanys sampai campuran tanta merata pada ujung kaca benda I, Segera dorony kaca benda I ke arah depan dengan rata dan cepat 4. Keringkan preparat di atas api dan fiksasi dengan melewathannya 3 kali pada nyala api S$. Tambahkan carbol fuchsin 1/10 selama | menit 6. Buang sisa cat dan keringkan. 7. Amati di bawah mikroskop pembesaran 10 * 100, perhatikan dan gambarkan morfologi bakteri dan latar belakang yang saudara lihat sy = ni Buatlah suspensi biakan | Letakkan satu tetes Letakkan kaca obyek kedua larutan tinta ci dengan kemiringan 45° Wamai dengan karbol | Cuci dengan air mengalir fuchsin Keringkan dengan kertas saringytissue Gambar 9. Prosedur Pewarnaan kapsul ‘Penuntun Prakdkem Baxeertotogt|A. LATAR BELAKANG Penuntun Praktikum Bakeerfotog! Il eeB, TINJAUAN PUSTAKA ‘Penuntun Frakelxam paxeertolons© NGAMATAN Gambar ] Keterangan | Perbesaran: dudul Hari/Tanggal : NIDN. 091 $098 901 D. PEMBAHASAN “ Penuntun Praktikum Bakteriologi I