A.

Treatment: 7 plates
1. Normal ( big plates or 2-3 100mm discs) 2. UVB 144mJ 3. H2O2 ( big plates or 2-3
100mm discs) ( 4 . 5. 6. 7. ) Sample treatment
B. Nhuộm

After 24 h irradiation:

1. Rửa cells 2 lần với cold PBS. Collect cell bằng TE 0.05%. Centrifuge 1000 rpm/3’
2. Resuspend cells bằng 1X binding buffer, đếm cell để pha về 1 mL dịch chứa cell với nồng độ
1x106
3.
3.1. Mẫu UVB và mẫu từ 4-7, lấy 100 uL + 5uL FITC + 5 uL PI
3.2. Ống Normal và H2O2: làm 4 tubes: unstain, + only 5uL FITC, + only 5uL PI, và + cả 2 stain
4. Vortex và ủ tối ở nhiệt độ phòng trong 15’
5. Thêm 400 uL 1X binding buffer vào mỗi tube, đo trong vòng 1 tiếng
C. Đo
1. Tạo trước 4 plots, 1: FCS SSC, 2: SSC vs FITC, 3: SCC vs PI, 4: FITC vs PI.
Kèm histogram là cái nhìn được peak 1 cho FITC, 1 cho PI.

Chạy unlimited, dừng khi thấy xác định đc mục đích.

2. Chạy normal unstain (unlimited), sau đó chọn cell population gate
3. Chạy uvb và h2o2 control unstained xác định lại ví dụ P1, chỉnh lại gate P1 ở 3 plots 2,3,4
4. Chạy H2O2 control FITC only, chỉnh dấu cộng chia plot4 để setting quadrant
5. Chạy H2O2 control PI only, chỉnh dấu cộng chia plot 4 lại theo PI +
6. Chạy H2O2 control FITC+PI kiểm tra xem có đúng ở vị trí của nó k?

Set 10000-15000 events theo lượng cells có.

7. Chạy lại từ normal unstained với double stained uvb, h202 controls
8. Chạy mẫu 4 mẫu
9. Chạy kiểm tra lại 3 stained của normal.

10. Chạy normal stain FITC only (limited 10,000 events)

11. Chạy PI stain only (limited 10,000 events)
12. So sánh H2O2 với Normal (vị trí các population để setting quadrant
13. Đo mẫu