Meth od s

L ign ocellu los ic feed s tock , en zymes an d yeas t

Wheat s traw w as purchas ed from a farm located in the northeas t of The
N etherlands . The w heat s traw was air- dried (89.5% dry matter by w eight) and
ground to pas s through a 4-mm s creen. The chemical compos ition of the
wheat s traw w as determined by us ing a modified TA P P I Tcm-249 tes t method
as des cribed els ew here  : glucan 33.3%; xylan 19.8%; arabinan 2.2%; rhamnan
0.3%; mannan 1.1%; lignin 21.8%; uronic acids 2.5%; and extract ives 10.7%.
The commerc ial enzyme cocktail GC 220 (G enencor- D anis co, Roches ter, NY ,
US ) contained cellulas e (filter paper units ), cellobi as e and xylanas e activit ies
of 116, 215 and 677 U /ml, res pectively  , w ith a s pecific gravity of 1.2 g/ml.
The ethanol fermentation w as performed w ith the w ild-type bakers ' yeas t
(K onings gis t, DS M , The N etherlands ). Chemicals , unles s indicated otherw is e,
w ere purchas ed from M erck (D arms tadt, G ermany).
A lk alin e p retreatmen t and w as h in g p roced u re
The alkalin e pretreatm ent of air- dried wheat s traw w as performed in a 215-
liter heated ves s el. A bout 22.5 kg ground w heat s traw (approximately 20.1
liters per kilogram of dry matter) w as mois tened w ith 40 liters of w ater and
placed in the vess el. S ubs equently, 2019 g of lime w as dis s olved in 145 liters
of w ater and added to the ves s el and the res ulting s us pens ion w as then heated
to 80–85°C under continuous mixing by a s tirrer. After 8 hours of incubation
(80–85°C), the ves s el was thermally is olated and throughout the follow ing 16
hours of incubation, the temperature of the w heat s traw sus pens ion decreas ed
to 66° C. A fter a total of 24 hours of incubation, the LTWS w as trans ferred to
a drainage ves s el and dew atered through tw o s ieves (pore s izes 3 mm and 0.3
mm, res pective ly) by gravitation. The solid fraction w as returned, together
w ith 215 liters of fres h hot w ater (55 to 60°C), into the drainage ves s el,
continuous ly mixed for 30 minutes , and dew atered us ing the s ame approach
outlined above. The w as hing/dew atering procedure w as repeated five times .
The pH of the pulp w as adjus ted to pH 6.5 w ith a 25% (by volume) s ulfuric
acid (H 2 S O 4 ) solution. F inally, the pulp w as dew atered once more to a dry-
matter content (105°C, 16 hours ) of approximate ly 35% and s tored at 4° C .
F or the determina tion of the ins oluble s olid content, the s amples w ere
centrifuged for 5 minutes at 3000 rpm, s upernatant w as removed and the
remaining pellet w as w as hed by re-s us pens ion w ith w ater. The s equence of
w as hing and centrifugat ion w as repeated three times follow ed by drying the
pellet overnight at 105°C.

S imu ltan eous s acch arification an d fermen tation

The S S F of LTWS w as carried out in a 100-liter fermenter (A pplikon,
S chiedam, The Netherlands ) w ith a pH and temperature control (Biocontroller
AD I 1020). The reactor w as filled w ith 35 liters of tap w ater. The follow ing
s alts w ere added to the w ater: ammoniu m s ulfate ((NH 4 ) 2 S O 4 ), 425 g;
monopotas s ium phos phate (K H 2 PO 4 ), 255 g; and magnes ium s ulfate
(M g 2 S O 4 .7H 2 O ), 42.5 g. The pH w as adjus ted and maintained at 5.0 w ith a 2
M H 2 S O 4   s olution and a 20% (w eight to volume) Ca(O H ) 2   s us pens ion. The
proces s s tarted w ith a prehydrolys is phas e (I) of 8 hours at 37°C and an
agitation rate varying betw een 450 rpm and 700 rpm. During this phas e, 48.42
kg of w as hed LTWS (w ith a dry-matter content of approximately 35%) and
1105 ml G C 220 w ere added manually. The rate of subs trate addition
depended on the vis cos ity of the LTWS s us pens ion in the reactor. After
prehydrolys is , the follow ing components w ere added to the LTWS : trace
element solution, 85 ml; vitamin solution, 85 ml; fatty acid s olution, 106.25
ml; anti- foam A cepol 77 (Emerald F oam Control), 42.5 ml; antibiot ics
penicillin and s teptomycin (S igma- A ldrich), 212.5 ml; s econd dos age of
enzyme preparation G C 220, 787 ml; and fres h w et previous ly   .bakers ' yeas t
(K onings gis t, DS M , The N etherlands ), 1071 g (around 353 g dry yeas t, 4.2 g
dry yeas t/liter fermentation broth), all according to the methods des cribed
previous ly  . The SS F phas e (II) w as initiat ed by the addition of yeas t cells
and the reactor w as clos ed in order to analyze CO 2   production (U ras 10E,
H artmann & Braunn). A nitrogen gas flow betw een 5 and 40 liters /minut e w as
added to the fermenter functioning as a carrier gas of the produced CO 2 . As
CO 2   is produced in equimolar amounts w ith ethanol from glucos e by bakers '
yeas t, meas urements of CO 2   production rates can be us ed to es timate the
production rate of ethanol. S amples w ere taken throughout the experiment,
treated and analyzed for the compos ition of monomeric s ugars , organic acids ,
glycerol and ethanol by high- press ure liquid chromatography methods as
des cribed previous ly  . The s oluble oligomer ic s ugars and ins oluble polymeric
sugars w ere determined as des cribed
R ecovery of eth an ol an d q u ality as s es s men t
After completion of the S S F proces s , the fermentat ion broth in the fermenter
w as heated up to 83°C. N itrogen gas (15 liters /m inute) functioned as a carrier
gas of evaporated ethanol. The ethanol w as condens ed by a cold fall spiral
(length 270 cm, diamet er 2 mm), which w as cooled by w ater at 4°C. The
dis tillate fraction of condens ed ethanol/w ater mixture w as collec ted in a
bottle cooled w ith melting ice w ater.

F urther upgrading of the ethanol content w as performed in a s econd

dis tillat ion s tep, w hich was carried out in a batch dis tillat ion unit w ith a 3-
liter boiler volume. A n O lders haw -type dis tillat ion column containing 28
theoretica l s tages w as us ed. The boiler w as filled w ith 2 to 2.5 liters of the
ethanol/w ater mixture obtained in the firs t dis till ation s tep. H ence, s everal
dis tillat ion runs w ere required to produce sufficient material. D is till ate
fractions of approximately 20 g w ere collected s eparately and analyzed on
ethanol content. D uring the firs t phas e of the dis tillat ion, the reflux ratio w as
kept at 2. A fter receiving the firs t 100 g, the reflux ratio w as increas ed to 3.
This w as done to ens ure the required ethanol content of the dis tillate (during
a batch dis tillat ion the mos t volatile component is continuous ly depleted from
the liquid in the boiler). A ll dis tillate fractions were analyzed for their
ethanol content by gas liquid chromatography us ing a flame ionization
detector (G LC-F ID ). The final dis tilla te s ample (all combined dis tilla te
fractions w ith s ufficient ethanol content) w as analyzed for w ater content
(K arl F is cher titrat ion, A S TM D 1364), acidity (acid- bas e titration, AS TM D
1613), anion content (chloride, sulphate, nitrate and carbonate meas ured by
ion exchange chromatography (ICE)) and organic components other than
ethanol (gas liquid chromatography- mas s s pectrometry (G LC- MS )).

S olid /liq u id sep aration of d is tillation res id u e

After the dis tillation s tep, the dis tillation res idue w as s eparated by
centrifugation (H eine Zentrifuge, type D M -K-Z 2237-2V 2, 1977), res ulting in
a liquid fraction and a fraction containing mainly solid particles . The feeding
rate of the dis tilla tion res idue w as around 6 liters /minu te w ith an agitation
rate of 3500 rpm.

D etermin ation of th e q u ality of th e solid fraction for comb u s tion

The s olid fraction w as as s es s ed as a fuel for combus tion. It w as analyzed

us ing s tandard methods for the chemic al analys is of biomas s fuels according
to the Dutch N EN N TA 8200 s eries . The res ults w ere us ed to calculate
fluidized bed combus tion agglomera tion and fouling indicators . Suitable
convers ion technology w as s elected us ing in- hous e expertis e and data from
the litera ture .Combus tion experiments were performed in a bench- s cale
experimenta l F BC (feed rate approximate ly 0.15 kg/hour) . The reactor had a
diameter of 7 cm (bottom) and 11 cm (top) and a height of 110 cm and was
made of 253 MA . A ir w as us ed to fluidize the s and bed. The FBC w as
operated at a temperature of approximately 850°C and 5% to 6% oxygen by
volume in the dry flue gas . To prevent heat los s es , the s et- up was electri cal ly
externally heated by tracing elements . The solid fraction w as thermally dried
before combus tion (approximate ly 3% mois ture by w eight) and milled (2 mm
s ieve diamet er). The fuel w as trans ported into the reactor by a s crew feeder.
During combus tion of the fermenta tion res idues , the fly as h w as entrained
w ith the flue gas and collec ted by S oxhlet filters (200°C). The flue gas w as
analyzed online for: N O x, O2, CO 2 and S O 2, and off-line (w et chemica l) for
SO 2 and H Cl. A depos ition probe, cooled w ith w ater, w as placed into the flue
gas to s imulate boiling tubes in a boiler. A fter finis hing the experiment, the
probe w as carefully removed and vis ually ins pected.
 Метод ы

Лигноцел лю лозны е сы р ье, фер м енты и др ожжи

П шеничная солома бы ла куплена с ф ермы , располож енной на сев еро-

востоке Н идерландов .П шеничную солому в ы сушили на в оздухе (89,5%
сухого в еществ а по в есу) и перемололи, чтобы пропусти ть через сито 4
м м .Х имическ ий состав пшенич ной соломы бы ла определена при пом ощи
м одиф ициров анного TA P P I Tcm- 249 тестов ы м методом, как э то бы ло
описано: глю кан 33,3%; ксилан 19,8%; arabinan 2,2%; rhamnan 0,3%;
м аннан 1,1%; лигнина 21,8%; уронов ы е кислоты 2,5%; и э кстракт ив ны е
в еществ а 10,7%.Смесь промы шленны х ф ерментов G C 220 (G enencor-
D anis co, Р очестер, штат Нь ю -Йорк, США ), содерж ащая целлю лазы
(бум аж ны й ф иль тр), целлобиазы и ксилана зы 116, 215 и 677 ед / мл,
соотв етств енно, с удель ны м в есом 1,2 г / мл. Ф ерментац ия э танола бы л а
вы пол нена при помощи диких хлебопекар ны х дрож ж ей (K onings gis t, D SM ,
Н идерланды ). Указанны е химические в еществ а бы ли приобретены у M erck
(Д арм штадт, Германия).

Щ елоч ная пр ед в ар ительная обр аботка и пр оцед ур а пр ом ыв ки

Щел очную предв аритель ную обработку в ы сушенной на в оздухе

пшенично й соломы пров одили в 215-литров ом нагретом сосуде. О кол о
22,5 кг перемолотой пшеничной соломы (примерно 20,1 литров на
кил ограмм сухого в еществ а) бы ло смоченной 40 л в оды и помещено в
сосуд. Впоследств ии, 2019г изв ести раств оряю т в 145 л в оды и добав л яю т
в сосуд и полученную суспенз ию нагрев аю т до 80-85 ° С при
непреры в ном перемешив а нии с помощь ю мешалки. П осле 8 часов
инкубации (80-85 ° С), сосуд бы л термическ и изолиров ан и в течени е
сл едую щих 16 часов инкубаци и, температур а пшенич ной соломы
суспензии снизилась до 66 ° С. После в общей слож ности 24 часов
инкубации, LTWS переносил и в дренаж ны й сосуд, в котором
обезв ож ив аю т через дв а сита (размер по 3 мм и 0,3 мм, соотв етств енно)
под действ ием силы тяж ести. Тв ердую субстанц ию в ернули в месте с 215
л итрам и св еж ей горячей воды (от 55 до 60 ° С), в дренаж ны й сосуд,
непреры в но перемешив а я в течение 30 минут, и обезв ож ив аю т, испол ь зуя
тот ж е подход, излож енны й в ы ше. П роцедуру промы в ки / обезв ож ив ания
пов торяли пять раз. Уров ень РН мякоти дов одили до рН 6,5 с 25% (по
объем у) раств ора серной кислоты (H 2S O 4). И , наконец, смесь
обезв ож ив аю т снов а до содерж ания сухого в еществ а (105 ° С, 16 ч)
прим ерно 35% и хранят при 4 ° С.

Д л я определения нераств оримого тв ердого содерж имого, образцы

центриф угиров али в течени е 5 минут при 3000 оборотов в минуту,
надосадочную ж идкость удаляли, а остав шийся осадок промыв али путем
пов торной суспензии с в одой. П оследов атель ность промы в ки и
центриф угиров ани я пов торяли три раза с последую щей сушкой осадка в
течение ночи при 105 ° C.

Од нов р ем енное осахар ив ания и фер м ентация

SS F из LTWS пров одили в 100-литров ом бродиль ном чане (A pplikon,

S chiedam, Н идерланды ) с контролем рН и температуры (Biocontroller AD I
1020). Р еактор был заполне н 35 литрами в одопров одной в оды . Следую щие
сол и бы ли добав лены к воде: суль ф ат аммония ((NH 4) 2S O 4), 425 г;
м онокалийф осф ат (K H 2P O 4), 255 г; и суль ф ат магния (M g2SO 4.7H 2O ),
42,5 г. Р Н дов одили и поддерж ив али на уров не 5,0 с помощь ю раств ора
H2S O 4 2 м и 20% (в ес к объему) Ca (OH )2 суспен зии. Процесс начина ется
с э тапа предв аритель ного гидролиза (I) в течен ие 8 часов при 37 ° С и
скорость перемешив ания изменяет ся в пределах от 450 оборотов в м инуту
до 700 оборотов в минуту. Во время этой ф азы , 48,42 кг промы того LTWS
(с содерж анием сухого в еществ а около 35%) и 1105 мл G C 220 бы ли
добав л ены в ручную . Коэ ф ициент субстрата зав исит от вязкост и суспенз ии
LTWS в реакторе. После предгидролиза следую щие компоненты бы л и
добав л ены к LTWS : раств ор микроэ лементов , 85 мл; раств ор в итаминов ,
85 м л ; Р аств ор ж ирной кислоты , 106,25 мл; антипен ны й A cepol 77
(Emerald П ена Control), 42,5 мл; антибиоти ки пеницилли н и стептом ицин
(S igma-A ldrich), 212,5 мл; в торая доза препара та ф ермента G C 220, 787
м л ; и заранее смоченны е св еж ие дрож ж и (K onings gis t, DS M , Н идерл анды ),
1071 г (около 353 г сухих дрож ж ей, 4,2 г сухих дрож ж ей / л
ф ерм ентационно й ж идкой среды ), в се в соотв етств ии с методами,
описанны ми в ы ше.S SF ф аза (II), бы ла иницииров ана добав лением
дрож ж евы х клеток и реактор бы л закры т для анализа вы деления CO 2
(U ras 10E, H artmann & Braunn).П оток газообразного азота от 5 до 40 л /
м ин бы л добав лен в бродил ь ны й чан в качеств е газа- носителя
произв одящего CO 2. Так как CO 2 образуется в э кв имолярны х объем ах с
э танол ом из глю козы пекарским и дрож ж ами, измерени я темпов
произв одств а CO 2 мож ет бы ть исполь зов аны для оценки скорости
произв одств а э танола. Пробы отбирали в течение в сего э ксперимент а,
обрабаты в аю т и анализирую т на состав мономерны х сахаров ,
органическ их кислот, глицерин а и э танола методами ж идкостной
хром атограф ии в ы сокого дав ления, как описано ранее. Р аств оримы е
ол игомерны е сахара и нераств оримы е полимерны е сахара бы ли
определены , как описано вы ше.

В осст анов ление этанола и оценка кач еств а

Посл е зав ершения процесса S S F , ф ерментац ионную среду в бродиль ном

чане нагрев али до 83 ° С. Газообраз ны й азот (15 л / мин) ф ункционирует
в качес тв е газа- носителя испаренного э танола. Этанол концентриров ал и
при помощи холодной падаю щей спирали (длина 270 см, диаметр 2 м м ),
которую охлаж даю т водой при 4 ° С. Доля дистиллят а конденсиров ан ной
см еси э танола / воды собиралась в буты лку охлаж денную таю щей
л едяной водой.

К ром е того повы шение содерж ания э танола пров одили на в торой стадии
дистил ляции, которая бы ла пров едена над группой перегон ки с объем ом
котл а 3 л. Бы ла исполь зов ана ректиф икацио нная колонна Олдершоу- типа,
содерж ащая 28 теорети чес ких ступен ей. Котел бы л заполнен 2 до 2,5 л
см еси э танола / воды , полученной на перв ой стадии дистилляции. Таким
образом, несколь ко процессов перегон ки бы ли пров едены для
произв одств а достаточ ного количес тв а материала. Дистиллят ны е ф ракции
прибл изитель но 20 г собирали раздель но и анализиров али на содерж ание
э танол а. Во в ремя перв ой ф азы дистилляции, ф легмов ое число держ ал и на
уров не 2. П осле получения перв ы х 100 г, флегмов ое число бы ло
ув ел ичено до 3. Это бы ло сделано, чтобы обеспечить необходимое
содерж ание э танола в дистилляте (в о в ремя периодиче ской дистилляции
наиболее летучий компонен т непреры в но изв лекается из ж идкости в
чане). Все дистилля тны е ф ракции бы ли проанализ иров аны на содерж ание
э танол а при помощи газож идкост ной хроматограф ии с исполь зов анием
огне- ионизационно го детектор а (КЗС-F ID ). Конечны й образец дистил л ята
(в се объединенны е фракции дистиллята с достаточны м содерж анием
э танол а) анализиров ал и на содерж ание в оды (титров ани ем по Карлу
Ф ишеру, AS TM D 1364), кислотности (кислотно- основ ного титров ания,
AS TM D 1613), содерж ание аниона (хлорид, суль ф ат, нитрат и карбонат
изм еряется с помощь ю ионообменной хроматограф ии (ДВС)) и
органическ их компонентов , отличны х от э танола (газож идко стно й
хром атограф ии- масс- спектрометр ии (G LC-M S )).

Тв ердое / ж идкостное разделен ие остат ка перегонк и

Посл е стадии перегонк и, остаток отделяли центриф угиров ани ем (H eine

Zentrifuge, тип D M -K Z 2237-2V 2, 1977), в резуль тате чего образуя
ж идкую ф ракцию и ф ракцию , содерж ащую преимущес тв енно тв ерды е
частицы . Скорость подачи кубов ого остат ка состав ило около 6 л / мин при
скорости перемешив а ния 3500 оборотов в минуту.

Опр ед еление кач еств а тв ер д ой фр акции д ля сжигания

Тв ердую ф ракцию оценив али в качеств е топлив а для сгорания. О на бы л а

проанализиров ан а с помощь ю стандар тны х методов химичес кого анал иза
топл ив а из биомассы в соотв етств ии с голландским N EN N TA 8200 серии.
Пол ученны е резуль таты бы ли исполь зов аны для расчета сж игания в
псев доож иж енном слое агломераци и и показа телей загрязне ния.
Подходящая технология преобразов ания бы ла вы брана с исполь зов анием
собств енны х знаний и данны х из литературы .Экс периме нты горения бы л и
вы пол нены в ходе лабораторны х эксперимен таль ны х F BC (скорость
подачи примерно 0,15 кг / час). Р еактор имел диаметр 7 см (в низу) и 11
см (вв ерху) и вы сотой 110 см и бы л изготов лен из 253 M A . Воздух бы л
испол ь зов ан для псев доож иж ения слоя песка.Ф БК работало при
тем пературе около 850 ° C и 5% до 6% кислорода по объему в сухом
дым ов ом газе. Чтобы предотв рати ть потери тепла, установ ка была
эл ектрич ески подогрев алась изв не путем отслеж ив ани я э лементов .
Тв ердую ф ракцию термичес ки сушат до сгорания (примерно 3% в лаги по
в есу) и измель чаю т (2 мм диаметром сито).Топлив о транспортирую т в
реактор с помощь ю шнеков ого дозатора. П ри сгорании ф ерментацио нны х
остатков , золь ная пы ль бы ла убрана с ды мовы м газом и собрана
ф иль трами Сокслета(200 ° C).Ды мовы е газы анализиров али онлайн на
нал ичие: NO x, O 2, CO 2 и SO 2, и оф ф -лайн (мокры й химический реактив )
дл я SO 2 и HCl.О саж дение зонда, охлаж денного в одой, бы ло помещено в
дым ов ой газ для имитац ии кипени я трубы в котле. После окончания
э ксперимента, зонд осторож но удаляли и осматрив али.