ia Raman y de dicrofsmo ¢ claridad y seguridad que todas las in de la | sa, tienen el mismo tipo de centro ca cofactor de molibdeno (usualmente llamado lenum cofactor). i cofactor posee un dtomo Unico de molibdeno unido a un |i ~ orgiénico, llamado molibdopterina, El dtomo metilico est unido al ligando _-@ través de dos grupos ditiolato, ubicados en posicidn cis Sobre un par de dtomos de carbono, unidos por un doble enlace. En la forma oxidada, ¢ molibdeno parece contener, ademas, por lo menos un dtomo de oxigeno, ‘Una cuarta posicién de coordinacién puede ser ocupada por un segundo Oxfgeno o por un dtomo de azufre, tal como se muestra en la Figura 12.1, _ También se ha sugerido, que la coordinacién del molibdeno podrfa ser seis, con otros dos ligandos adicionales, todavia no identificados. N. C == C-CH(OH)-CH,-OPO? N A =f | / a A Za Ss Ss HN N N pune Me dX o x X=00s Figura 12.1, Estructura del cofactor de molibdeno. __ Fl cofactor es sumamente inestable, lo que ha dificultado su caracteriza- sion y resulta ademés inactivo, en su forma libre. En el estudio de sus caracteristicas estructurales jugaron un importante papel, las investigacio- nes en torno a dos de sus productos de degradacién lamadas formas A y B de la molibdopterina Yel urotion, que es el producto de excrecién metabdli- ca del cofactor en animales, : Por otro lado, el cofactor presente en bacterias contiene una molibdop- terina-dinuclestido, que consiste en un monofosfato-nucledsido, que se Une al Fre foal de la molibdopterina, gencrando un puente-difosiato. Entre ¥a caracterizados de este tipo, podemos citar la moll Y la molibdopterina-adenina-dinucledtido.Pita enzima tiene un interés muy particular ya que, ‘inica molibdoenzima hasta ahora conocida, exenta de ¢ adicionales. Esta situacién permitirfa estudiar, por vez molibdeno sin la interferencia de otros croméforos, Finalmente, resulta interesante agregar que también en este Quimica Bioinorgdnica, ha habido una enorme cantidad de modelos». Estos sistemas son de varios tipos diferentes. Un primer ) estd constituido por complejos sencillos en los que se traté de reproducirla esfera de coordinacién del molibdeno en el Moco. Algunos de ellos fueron mby Gtiles para los estudios EXAFS y para efectuar comparaciones | : ‘trosc6picas con sistemas que contienen el cofactor nativo. Otro stig e «modelos» lo constituyen complejos a través de los cuales se de feproducir la actividad donora de grupos oxo y de comprender la it n versién redox de los tres estados de oxidacién del metal. Por iiltimo, Sistemas tratan de reproducir en forma parcial o total el ma metal ligando presente en la molibdopterina asf como comprender las rela- _ redox entre el metal y el resto orgdnico. = : 123. NITROGENASAS Y FIJACION DE NITROGENO EL i | se nittégeno se encuentra en Ja Naturaleza primordialmente en la atmésfera (opcamadamente el 78% del aire esta formado por N;) y suelo ‘sales de amonio). Como todos los elementos biolég ees! nitrégeno forma parte de un complejo ciclo. Este | pennllteeno» representa la transformacién de nitrégeno in £0, junto con los procesos inversos de degradacién. El nitré Ser reducido a amoniaco por diversos sistemas b eléctricas en la alta atmésfera, Deigica le temperatura y presién. sigue habremos de analizar en detalle el llamado proceso cid ), mediante el cual ciertos microorganismos son de transformar el nitrégeno atmosférico en amoniaco, proceso en ef cual involucrados diversos sistemas bioinorgénicos. ‘Los microorganismos capaces de fijar nitrégeno, pueder ser divididos en dos grandes grupos: a) Bacterias libres (asimbidticas), la mayorfa de las cuales son anaer6- bicas y entre las que podemos mencionar el Chromatium y el Clostridium pasteurianum, con el cual fueron realizados muchos de los primeros estudios sobre estos sistemas. También existen dentro de este grupo bacterias aerdbi- eas, como por ejemplo el Azotobacter vinelandii, o facultativas (que tienen la propiedad de desarrollarse tanto en presencia como en ausencia de aire), pero que s6lo fijan nitrégeno en ausencia de aire, como por ejemplo la Klebsiella pneumoniae. 6) Microorganismos simbisticos, que fijan nitrégeno en asociacién con plantas, como por ejemplo el Rhizobium meliloti que se encuentra asociado a Jos nédulos de las raices de leguminosas. Otras bacterias se asocian con los nédulos de hojas o con liquenes, que son una combinacidn de un hongo con una alga verde-azul, fijadora de nitrégeno. Una propiedad interesante de los Sistemas gue se desarrollan en los nédulos de rafces es la presencia de una de tipo hemoglobina que ha sido aislada y purificada y a la que se ina leghemoglobina, pareciendo existir una correlacién directa entre __ la presencia de esta proteina y el proceso de fijacién de nitrégeno. El sistema enzimatico que llamamos corrientemente nitrogenasa es extte- te complejo y esta formado por dos proteinas separadas, lamadas m ite proteina de hierro y proteina de molibdeno-hierro. Estos dos __ sistemas furcionan conjuntamente y en el caso del Clostridium pasteurianum | fa proteina de hierro tiene un peso molecular de unos 60.000, mientras ae de Fe/Mo, que peor es la més pesada, tiene un peso molecular damente 230,000. = : : ‘se muestra en la Figura 12.3, 1a proteina de hierro estil en ae dos subunidades idénti oseen una tinica Te quematizad oh forma delun pequatio cubito) 7 695 {gATP. Por su parte, la proteina de Mo/Fe es unFigura 12.3. Las dos proteinas componentes de la nitrogenasa, separados en aproximadamente 19 A, mientras que la distancia ene ge B dos cofactores de Mo/Fe es de unos 70 A. : Adicionalmente a estas dos protefnas basicas las nitrogenasas requieren la participacién de un amplio ntimero adicional de otras pro- teinas, sistemas que se encuentran codificados por genes especfficos para la fijacién de nitrdgeno (nif). = La estequiometria global del proceso de fijacién ya ha sido determinada ¥ transcurre segtin: N,+8H* + 16 MgATP + 8c” = 2NH, + H, + 16 MgADP + 16P, Pero antes de analizar las caracterfsticas y probables mecanismos de la Teaccién, conviene describir las propiedades estructurales de los sitios Metdlicos involucrados en las dos protefnas participantes en la misma. Al Tespecto, vale la pena remarcar que recién a partir de 1991, se dispone de datos estructurales de esos cimulos, obtenidos por métodos difractométri- £08 de nitrogenasa de Azotobacter vinelandii y que permiten tener uni ‘Magen mds clara que la hasta ahora disponible, basada esencialmente en Medidas EXAFS y otros datos espectroscdpicos, asf como en cor Res de esos datos con los de una gran variedad de «modelos». En Jo que hace a ta protefna de hierro, el tinico el sistema Presente en ella €s, como ya se dijo, una ferredoxina de tipo 4:4.agrega un centro redox adicional a este que aparece como posible que el cl ¢ S—S: S}- + 2¢° = 2S?-, es decir, sulfuro en un lugar de un grupo disulfuro podria liberar dos electrones. resultan ser las caracteristicas del FeMi n reproducir oe resultad ios EXAFS. Algunos de estos «moae ~ QUIMICA BIOINORGANICA DEL MOLIBDE generales del mismo pueden describirse como sigue: o es la responsable de transferir un electron a [a p ‘en un proceso que es dependiente de ATP. El sustrato se ie se dijo en reiteradas oportunidades, al FeMoco, En ausencia de sy reducible, por ejemplo, en una atmésfera de argdn, sdlo se oben reduccién de protones a H,. También resulta interesante menciona también bajo una atmdsfera de nitrégeno, la evolucién de H, contintia a una presién de 50 atm. de N;. Para la nitrogenasa, funcionando bajo condiciones dptimas, a 30°C, la reaccidn Ifmite es; N,+8H* + 8e" + 2NH, +H, y para cada electron transferido se requiere la hidrélisis de dos MgATP a MgADP. Por otra parte, aun no se ha clarificado el papel que juega el «cluster»-P en este proceso, aunque evidentemente debe estar involucrado de alguna manera en el manejo y transferencia de electrones, El llamativo y aparentemente innecesario consumo de energfa requerido para producir la evolucién de una molécula de H, por cada molécula de N, que es teducida, esté seguramente relacionado con Ja necesidad de. generar ua sitio reducido al cual se liga el N, luego de desplazar al H,. También se ha sugerido que la evolucion de hidrogeno protege a la enzima del oxigeno. La proporeién de evolucién de hidrégeno en relacién con la reduccién de nitrégeno, suele aumentar a medida que disminuye el flujo electrénico que llega a Ja proteina. Esto ocurre cuando hay una disminucién de reductor 0 de MgATP, y tiene lugar porque la proteina de Fe Mo parcialmente reducl- da, se oxida por liberacién de H, antes de que el nitrégeno pueda ligarse al centro metilico, El proceso puntual de transformacién de N3, activado a través oF unidn a los centros metélicos del FeMoco (véase también Io discutido eo S Capitulo 9) puede ser imaginado como un ciclo de cambios sucesivos & estados de oxidacion del sistema metdlico, debido a la introduccién oe de protones sobre el N, activado, como se esquematiza © igura 12.9, Otro aspecto muy interesante de la nitrogenasa es que existe” See £08 OIfOS sustratos que también son reducidos por la misma, Eee ye tamafio, desde cl H* hasta sustratos tan grandes como.el I-butind 7. 7 isonitrilo, CH,=HNC, también parece existir la posibilidad do ie 4 Sustratos diferentes puedan unirse simultdneamente al sitio active: © 4 _ trato particularmente Util es el acetileno, que es reducido por 1a ni ‘ie _ aetileno, y este proceso ¢s habitualmente utilizado ara estudiat Ja enzima. Otros sustratos reducibles son el ICN, que ee mezcla de CH, y NH: el N30 que se reduce a Ny ¥ a8r de las dos nuevas nitro, tambii racién de una pequefia cantidad de taney protien aie : ae en el sistema de Fe/Mo, roe iVersos tipos de estudios espectrosed| cos irmado un elevado grado de similitud Ga Stace: de Tor sre, tie cos de las nitrogenasas de Fe/Mo y de Fe/V, tanto en Jo que hace 4 |, enzimas participantes como al tipo de ctimulos metélicos presentese ie: Remarcable resulta también el hecho, de que las tres nitrogenae I menos en el caso del Azotohacter vinelandii, puedan ser transformadas : en otra. Si la concentracin de molibdeno resulta adecuada, sdlo se os la nitrogenasa de molibdeno, pero si la concentracién de molibdeno queda por debajo de ciertos limites, el organismo produce la nitrogenasa de vanae dio, si se pone a su disposicisn este elemento. Recién cuando existe déficit tanto de molibdeno como de vanadio, se reprime la generacién de nitroge- nasas de estos metales y se produce la nitrogenasa de hierro, Desde el ‘punto de vista evolutivo parece razonable pensar que las nitrogenasas mds «anti- guas» deben ser las de hierro. A medida que ayanz6 la evolucién, la Natura- leza puede haber cambiado hierro por vanadio, aunque este metal es mucho menos abundante que el primero, simplemente porque posee una mayor flexibilidad redox (por lo menos tres estados de oxidacién utilizables en biologfa, frente a los dos de! hierro) lo que lo hace mas adecuado para Procesos que requieren cambios multiclectrénicos. Finalmente, en la evolu- ci6n posterior, el molibdeno, que es aun menos abundante que el vanadio, demostré ser el metal més eficiente, para participar en este tipo de reacciones. 125. METABOLISMO DEL MOLIBDENO E! molibdeno se encuentra en muy bajas concentraciones en Epes todos Ios fluidos y tejidos del organismo. Las concentracone mils oy se localizan en el h{gado, el rindn, el bazo ip el pulmén. ere ampliamente distribuido en todo tipo de alimentos de tajos, em que los niveles requeridos por el organismo son Rieder ae cual set diffcil llegar a condiciones de deficiencia de este micron’ 4 imen alimentario. P = de nanert x “A nolibdene es absorbido en forma de ais phono gre jament i eficiente. Una peculiaridad : i 0 Be asa ae Ja concentracidn de sulfato mento de su absorcién, como en el oreiniste (n, dicta reducen marcadamente (ed yt