Tcnicas de Eletroforese Alexandre Monteiro, Bruna Pasqualotto e Fernanda Subtil Biomedicina Turma: A Introduo Eletroforese em gel uma tcnica

a de separao de molculas que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. Foi introduzida cientificamente em 1939 por A.Tiselius e A.E. Kabat com o objetivo de separar partculas orgnicas. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, com a sua carga ou conformao, as quais apresentaro diferentes velocidades de migrao, proporcionando a sua separao. A eletroforese normalmente utilizada para separar protenas (carga lquida positiva ou negativa) e molculas de DNA (sempre carga negativa devido ao fosfato) e RNA. Quando estas molculas so colocadas em um campo eltrico, migram para o polo positivo ou para o polo negativo. Eletroforese em gel de agarose A agarose um polissacardeo, e forma uma rede que segura as molculas durante a migrao. A eletroforese em gel de agarose um dos mtodos mais utilizados para analisar misturas de protenas ou outras macromolculas. Por ser um gel mais consistente mais fcil de manipular. Dependendo da concentrao de agarose, tm-se uma diferena no gradiente de separao. Inicialmente foi apresentado o laboratrio no qual se faz eletroforese em gel de agarose. O procedimento foi realizado conforme segue abaixo: Para preparar o gel de agarose, simplesmente fez-se a mistura entre o p de agarose e soluo tampo (TBE). Aps, fundiu-se e colocou-se brometo de etdio (para enxergar o DNA luz UV). importante colocar o pente no gel durante o endurecimento do mesmo. O pente cria poos que sero utilizados para a colocao das amostras. Quando a mistura esfriar o gel estar duro. Esta parte do procedimento foi realizada previamente, sendo que o gel pode ser preparado e mantido na soluo de tampo por at duas semanas. Depois se colocou o gel na cuba com tampo TBE, o mesmo da confeco do gel. Em seguida, pipetou-se no primeiro poo o padro de peso molecular e as amostras nos demais poos. Estas so uma mistura do produto do PCR (VAN A) com tampo de amostra com glicerol (DNA precipita, evitando sair do poo e contaminar a corrida) e azul de bromofenol (corre na frente). Fechou-se a cuba e correu-se a amostra utilizando a voltagem de 100V (para este gene)

por 30 minutos. Para verificar se nos eletrodos estava passando corrente, observou-se o desprendimento de bolhas dos mesmos. Depois observar-se-ia o gel em um transiluminador com luz UV. Foi frisado o cuidado na manipulao com o Brometo de etdio pelo fato de o mesmo ser altamente cancergeno. Eletroforese em gel de poliacrilamida O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resoluo e mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 pares de base). Esse gel tambm pode acomodar maiores quantidades de DNA sem perda de resoluo, comparado ao de agarose. Tambm muito utilizado para recuperao e purificao de DNA. Contudo, quando comparamos o gel de poliacrilamida com o de agarose, vemos que este mais difcil de ser preparado, alm de ser muito txico, seja quando em p ou em soluo. Sua corrida se faz numa cuba vertical mediante campo eltrico constante. Este mtodo foi realizado no laboratrio de microbiologia, no qual tambm se realizam os testes de fenotpicos. Para preparar a placa de corrida, inicialmente aplicou-se o gel de poliacrilamida a 10%, aplicou-se em seguida gua, para o gel ficar reto. O gel a 10% mais consistente. Depois deste seco, aplicou-se o gel a 4% (mais mole). Colocou-se na cuba e colocou-se na sequencia o pente. Preencheu-se a cuba com tampo de corrida, tirou-se o pente e lavou-se os poos. Colocou-se um guia para facilitar a aplicao da amostra, a qual foi feita com uma ponteira diferente, em forma de pena. Colocou-se ento a tampa e correu-se a amostra. Ao se observar que o corante azul comeou a sair debaixo do gel, desligou-se a corrida. Retirou-se a placa de dentro da cuba, em seguida desprendeu-se o gel das placas, descartando a frao do gel a 4%, colocou-se em soluo corante (Coomassie Blue) e deixou-se em Over Night em um agitador (para o precipitado do corante no borrar o gel). Depois se descorou o gel com soluo de metanol e cido actico glacial (protenas no descoram). Pode-se secar este gel um equipamento especial, o que faz com que o gel dure muito tempo, podendo ser guardado. Os resultados obtidos com este tipo de eletroforese podem ser utilizados para diferenciar cepas de bactria de diferentes padres moleculares, por exemplo.