El objetivo de un curso de histologia es guiar al alumno a ta comprensién de la microanatomia de las células, los tejidos y los érganos, y @-correlacionar la estructura con la funcién Los métodos empleados por Jos histélogos son muy diversos. Gran parte del contenido de la materia histo- logia se puede encuadrar en términos de la microscopia 6ptica, usada por los alumnos en la préctica de labora- torio. La interpretacién mis detallada de la microanato- mia se basa en la microscopia electronica (ME), tanto en la de transmisién de electrones (MET) como en la de barrido (MEB), debido a su mayor aumento Util y a las numerosas téenicas auxiliares de lx biologia celular y molecular, para las cuales la ME representa el ditimo paso en la adquisicién de datos. Estas técnicas auxilia- res incluyen: + Histoquimica y citoquimica, + Autorradiograita Cultivo de drganos y de tejidos. + SeparaciGn de céluias y de organelas por centrifuga- cién diferencial. Técnicas microsedpicas y microscopios especializa- dos. E] alumno puede sentirse ajeno a estas técnicas y a estos procedimientos debido a que, por lo general, no tiene experiencia directa con ellos en un curso normal. No obstante, es importante conocer algo sobre estos procedimientos especiales y sobre los datos que apor- tan, Este capitulo proporciona una visién general de los métodos y ofrece una explicacién acerca de como los datos obtenidos por medio de ellos pueden contri- buir a que el estudiante adquiera sélidos conocimien- tos de histologia. Uno de los problemas enfrentados por el alumno en histologfa es comprender la naturaleza de la imagen bi- dimensional de un corte histolégico o una fotomicrogra- fia electronica, y e6mo se relaciona con Ia estructura tri- dimensional de la cual proviene. Para superar esta bre- cha conceptual, primero se debe presentar una breve descripcidn de los métodos necesarios para obtener cor- tes de tejido y muestras para microscopia electrSnica, Métodos PREPARACION DE LAS MUESTRAS Tincién con hematoxilina-eosina y fijacién con formalina Las muestras examiinadas con mayor frecuencia son cories histoldgicos preparades con métodos de rutina y coloreados con hematoxilina-eosina El juego de muestras entregado a cada alumno para su estudio con el microscopio 6ptico consiste, en su mayor parte, de cortes histolégicos fijados con formalina, inelui dos en parafina y coloreados con hematoxilina-eosina (HE). Las micrograffas para microscopio Gptico presenta- das en la seccidn de Kéminas de este texto son cortes histo- I6gicos que pertenecen a uno de estos juegos de muestras. Ademés, 1a mayorfa de las fotomicrografias que ilustran los tejidos y drganos en tas clases y conferencias de histo- logia se obtienen de estos cortes. En ocasiones se usan otras técnicas para mostrar componentes celulares y tisula- res especificos: varios de ellos se describen a continuacién primer paso en la preparacién de una muestra de tejido 0 de érgano es ta fijacién para preservar Ta estructura La fijacién, por medio de un agente quimico o una mezcla de ellos. detiene el metabolismo celular y conser- va la estructura celular para su futuro tratamiento. La for- mmalina, una solucién acuosa de formaldehido al 37%, es cl fijador mas usado en distintas concentraciones y combi nada con otras sustancias quimicas 0 amortiguadores (but fers), El formaldehido preserva la estructura general de la célula y de los componentes extracelulares, al reaccionar ‘con los grupos amino de las protefnas; como no reacciona con los lipidos, es un deficiente fijador de membranas. En el segundo paso, se prepara la muestra para ser incluida en parafina, Io cual permite que sea seccionada en cortes finos Para permitir el andlisis de la muestra, se Ja infiltra con un medio de inclusién que permite su seccién en cortes finos, de 5-15 tum [1 micrémetro (um) equivale aCuadro 1-1, Caracteristicas rintoriales de distintas es- traciaras con HE Celulas y componente cetwlar Colaracion Heteroccomatina Azul Eucromatina Negativa Nueléolo, Azul Citoplasma Ersastop) Anu Citoplasma on general Rosada Filamentoseitoplasmsticos ——-Rosada Material extracelular Firs coldigenas Rosada Fras elisticas® Rosada, pero en general no se dis- tinguen de las fibras coligenas| Rossida, pero en general no se dis- tinguen de Jas fibras coligenas Azul pero solo si es abundante co mo-en Ia matriz eartlaginosa Rosida Rosada, Fibras reticulares! Sustancia fundamental Matriz dsea (descaliticada) Memnbranai basal * Pam vel se uso una cnica especial, como fucsina w cen. # Para veras se ws una Wena eepecial, come BAS 0 inipegnaciones art 1/1,000 de un milimetro (mm): véase cuadro 1-4]. Esto se logra por medio del Javado de la muestra después de su fijacidn y de su deshidratacién por pasaje por una se- rie de soluciones alcohdlicas de graduacién creciente, hasta llegar al 100%, para eliminar el agua. Luego se emplean solventes orgénicos tales como el xilol 0 el to- Iuol, que son miscibles en alcohol y en parafina, para eliminar el alcohol, antes de la infiltracién de la muestra con parafina fundida. Cuando la parafina fundida se enfria y se endurece, se empareja hasta formar'un bloque de tamaiio adecuado, denominado taco. Este taco se coloca en una maquina cortadora especial, el micrétomo, que Io corta con una cuchilla de acero. Los cortes se colocan sobre un portaob- jetos, al cual se ha agregado albximina como adhesivo. in el tercer paso, se colorea la muestra para permitir su estudio Las muestras todavia no son aptas para su examen con el microscopio, puesto que los cortes parafinados carecen de color. Para colorear los cortes de tejido se elimina la parafina con un solvente orgénico como xilol © toluol y luego se rehidrata por pasajes por una serie de soluciones aleohdlicas de graduacién decreciente hasta llegar al agua. Luego se colorea la muestra con hemato- xilina acuosa. Dado que el colorante de contraste. la eo- sina, ¢s mas soluble en alcohol que en agua, se deshi- drata nuevamente la muestra por pasaje por una serie de soluciones alcohélicas de graduacién creciente, hasta Hegar al 100%, y se colorea con eosina en alcohol. Des- pues se pasa por xilol o toluol, se coloca en un medio de montaje no acuoso y se protege con un cubreobjetos: de esta manera, se obtiene un preparado permanente simi- lar a los utilizados en la ensenanza y en los laboratotios de diagnostico. En el cuadro 1-1 se presenta un resumen de los colores con que la técnica de HE tiie distintas cé- lulas y componentes tisulares. Otros fijadores La formalina no preserva todas las células nt todos los componentes tisulares Si bien las muestras fijadas con formalina y colorea- das con HE son titiles porque permiten apreciar detalles de la estructura general, este procedimiento es inespect- fico y no pone en evidencia la composicién quimica de los Componentes celulares. Ademds, en Ia preparacién de la muestra se pierden muchos de ellos. Cuando se de- sean estudiar algunos de estos componentes 0 estructu- ras, que se pierden con la fijacién con formalina, se pue- den emplear otros métodos de fijacién. Por lo general, estos se basan en el anilisis quimico correspondiente, Asi, el uso de alcoholes y solventes organicos climina os Ifpidos neutros en los preparados de rutina. Para retener los lipidos neutros, como los contenidos por los adipocitos, se emplean cortes por congelacién de tejidos fijados en formalina y colorantes liposolubles; ara retener las estructuras de las membranas se deben utilizar fijadores especiales que contienen metales pesa- dos como permanganato u osmio, que se fijan a los fos- folfpidos. El uso habitual de tetréxido de osmio como jador para microscopiat electrOnica es la razén principal de Ia excelente conservacién de las membranas en las, fotomicrograffas electrénicas. Otras técnicas de coloracién: La técnica con hematoxilina-eosina se emplea en histologia porque permite apreciar caracieristicas estructarales; no proporciona informacion sobre las caracteristicas quimicas A pesar de los méritos de 1a coloracién con HE, el pro- cedimiento no pone en evidencia adecuadamente ciertos componentes estructurales de los cortes histologicos, ta- les como elastina, fibras reticulares, membranas basales y lipides. Cuando se desea estudiar estos compenentes, se pueden emplear otros métodos de coloracién, en su ma yoria selectivos. Estos incluyen el uso de orveina y fuesi- na-resorcina para el material eldstico y de impregnacién argéntica para las fibras reticulares y las membranas ba- sales, No siempre esté aclarado el fundamento quimico de estos procedimientos, pero son efectivos. A veces es més importante saber lo que el método permite observar que conocer su mecanismo fntimo de accién. HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA Los procedimientos quimicos especifics proporcionan informacién deiatlada sobre la funcién de las células y de los Componentes extracelulares de los tejidos Los procedimientos histoquimicos y citoguimicos se basan en la unidn especifica de un colorante 0 en el an- ticuerpo marcado con colorante fluorescente contra determinado componente celular o en la aetividad enzi- matica inkerente a un componente celular. Ademés, la autorradiografia dctecta la incorporaci6n, por las eélu-las y los tejidos, de precursores con isétopos radiactivos de muchas de las grandes moléculas que se encuentran normalinente en las oélulas, antes de la fijacién. Muchos de estos procedimientos se pueden usar en los prepara- dos para microscapio dptico y microscopio electrénico. Antes de estudiar la quimica de la coloracién de ruti- na y de algunos de los niétodos histoquimicos y citogui- micos, conviene examinar brevemente cémo sé fija e in cluye una muestra. ‘a de las muestras histolégicas La composicidn quimica de un tejido preparado para la coloracién de rutina es muy diferente de la del tefido vivo Los componentes que quedan después de Ia fijacion son, en gran medida, grandes moléculas que no se di- suelven con facilidad, en especial después de aplicar el fijador. Estas grandes moléculas. en particular las que reaccionan con otras moléculas de gran tamaiio para for- mar complejos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte histolégico. Algunos ejemplos de estos complejos son: + Nacleoproteinas, formadas por dcidos nucleicos liga- dos « proteinas. + Proteinas intracelulares del citoesqueleto, que for- man complejos con otras proteinas. + Proteinas extracelulares en grandes agregados inso- lubles asociadas con moléculas similares a través de enlaces cruzados con moléculas vecinas, como ocurre en la formacién de fibras de coligeno. * Complejos fosfolipido-proteina (0 hidrato de carbo- no) de las membranas. En su mayor parte, estas moléculas constituyen la es- tructura de las células y de los tejidos. puesto que repre~ sentan los elementos morfogénicos texturales. Son la base de Ia organizacién visible en los tejidos con el mi- croscopio dptico. En muchos casos, un elemento estructural es al mis- mo tiempo una unidad funcional. Por ejemplo, en el ca so de las proteinas que forman los filamentos contrécti les de las células musculares, estos filamentos son los componentes esiructurales visibles y ademas participan en el proceso de contraccién. El RNA del citoplasma se ve como parte de un componente estructural (ergasto- plasma de las eélulas glandulares, sustancia de Niss] de lus neuronas) y al mismo tiempo es un participante acti- vo en la sintesis de proteinas. Muchos componentes tisulares se pierden durante 1a preparacién de las muestras de tejido para {a coloracidn con hematoxilina-eosina A pesar de que la mayor parte de los deidos nucleicos, las proteinas y los fosfolipidos se conservan en los cor- tes histoldgicos, muchos se pierden. En general se pier cien las proteinas y los sicidos nucleicos pequefios, como el RNA de transferencia, durante Ia preparacién de la muestra de tejido. También se pueden perder moléculas grandes, por ejemplo, al ser hidrolizadas por un pH des- favorable de las soluciones fijadoras. Son ejemplos de moléculas grandes que desaparecen durante la fijacién Ge rutina en fijadores acuosos: + Glucégeno (un ghicido que se almacena en el interior de las células, comin en los hepatocitos y en las célu- las musculares). + Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (hidratos de carbono complejos extracelulares que se encuentran gn el tejido conectivo [véase p. 103]) Sin embargo, estos componentes se pueden conser- var, si se utilizan fijadores no acvosos para el glueégeno © si se agregan a Ia solucién fijadora agentes ligadores especiales que preservan las moléculas de la sustancia fundamental que contienen gliicidos. Como se describis antes, también se suelen perder los lipidos neutros du- rante las preparaciones histolégicas de rutina, debido a su solubilidad en solyentes orginicos. En la preparacién de muestras de tejide para su inclusi6n en parafina, también se pierden componentes solubles, iones y moléculas pequeitas En la muestra histolégica ya no se observan metaboli- tos intermedios, glucosa, socio, cloruro y sustancias si- milares. Aunque estas peguenas sustancias se pierden durante la preparaci6n de cortes de rutina coloreadas con HE, muchas de ellas pueden ser estudiadas en prepara- dos especiales, en general con considerable pérdida de la integridad estructural. Estos pequefios iones y moléculas solubles no constituyen clementos texturales morfogéni- cos, sino que son las sustancias eapaces de ser procesa- das o que participan en las reacciones celulares. El agua. una molgcula muy versétil, participa en estas reacciones y contribuye a la estabilizacién de la estructura macro- molecular por medio de enlaces de hidrégeno, Fundamentos quimicos de la coloracién La hematoxilina y la eosina son fos colorantes usados con mayor frecuencia en histologfa Un colorante deido, como la eosina, \leva una carga Cuadro 1-2. Algunos colorantes dcidos y basicos Color Colorantes hisicos Verde de metilo Vere Asul de metileno Amul Pironia G Rojo Azul de toluidina Azul Colorantesscidos Pucsina deida Roje Azul de anilina Azul Eosina Rojo Natanja G Naranjaneta negativa en su por neral es Na‘anilina Un colorante bésico Neva una carga neta positiva en su poreiGn coloreada y su frmula general es anilina'Cl La hematoxilina no es estrictamente un colorante pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes, El color de una anilina no se relaciona con su carécter écido © basico, segiin se puede observar en el cuadro 1-2. mn coloreada y su férmula ge- Los colorantes basicos reaccionan con las componentes aniénicos de las células y de los tejidos (componentes que llevan carga neta negativa) Colorantes basicos. Los componentes aniénicos in cluyen los grupos fosfato de los dcidos nucleicos, los gtupos sulfato de los glucosaminoghucanos y los grupos carboxilo de las protefnas. La capacidad que poseen es- tos grupos aniSnicos de reaccionar con un colorante bé- sico se denomina basofilia. Se dice que los componen- tes tisulares que se colorean con la hematoxilina exhi ben basofilia. La reaccién de los grupos aniénicos varia con el pH. En consecuencia: * A un pH alto (alrededor de 10), los tres grupos estén ionizados y disponibles para reaccionar con el colo- rante bdsico por medio de uniones electrostéticas. + Aun pH ligeramente deido 0 neutro (5-7), se ionizan Jos grupos sulfato y fosfato, que quedan disponibles para reaccionar con el colorante basico por medio de uniones electrostaticas. + Aun pH bajo (menor de 4), soto tos grupos sulfato permanecen ionizados para reaccionar con las anilinas bisicas. En consecuencia, se puede usar la tincién con colo- rantes basicos a pH controlado para centrar el estudio en grupos anidnicos espectticos, y dado que estos aniones especificos predominan en ciertas macromoléculas. la tincidn sirve como un indicador de estas macromoléeu- las. Un procedimiento adicional que se emplea junto con las tinciones a pH controlado es la digestion enzimatica selectiva de sustratos del corte histolégico antes de pro- ceder a la coloracién (fig. 1-1). Como ya se menciond, la hematoxilina no es un colo- rante basico en sentido esiticto, Se utiliza con vn mor- diente, 0 sea un intermediario entre el componente tex- tural y la anilina, que hace que la tincién con este tltimo se asemeje a la de un colorante basico. La unién en el complejo tejido-mordiente-hematoxilina no consiste en un simple enlace electrastitico y cuando ta hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido. A causa de esto, la hematoxilina se presta para los procedimientos Lintotiales en los que es seguida por soluciones acuosas de colorantes dcidos. Los colorantes basicos verdadgros a diferencia de Ia hematoxilina, por lo general no s usa en secuencias en las que al colorante basico le si- gue uno écido, porque Ia anilina basica tiende a diso- ciarse del tejido durante los lavados en soluciones acuo- ‘sas que se realizan entre ambas colorac jones. Los colorantes dcidos reaccionan con los grapes catiénicos de las células y de fos tejidos, en particular los grupos amino ionizados de las proteinas Colorantes decides. La reacci6n de estos grupos catis- nicos con un colorante dcido se denomina aeidofilia. Las reacciones de los componentes celulares y tisulares con colorantes dcidos no son tan espectficas ni precisas como las reacciones con colorantes basicos Si bien la unidn electrostatica constituye el principal factor en la unin primaria del colorante con el tejido, 10 €s el tinico y por Io tanto los colorantes acidos a ve- ces se emplean combinados para colorear en forma se- lectiva distintos componentes de los tejidos. Por ejem- plo, en la técnica de Mallory se usan tres colorantes ci dos: azul de anilina, fuesina acida y naranja G. Estos ti- fien con selectividad el colfgeno, el citoplasma en gene- ral y los critrocitos, respectivamente, La fucsina deida también tifie los mticleos. En otras técnicas con anilinas scidas miltiples se em- plea la hematoxilina para teiiir los muicleos primero y después se aplican los colarantes dcidos con el fin de te- fiir selectivamente el citoplasma y las fibras extracelula- res, La tincidn selectiva de los Componentes texturales por los colorantes dcidos no se debe a propiedades espe- cfficas de la anilina el tejido, sino mas bien a factores relativos, entre los cuales figuran el tamafio y el grado de agregacién del colorante y la permeabilidad y el gra- do de “densidad” del tejido. Los colorantes basicos también se pueden emplear combinados 0 en secuencia (p.cj., verde de metilo y pi- ronino, para estudiar la sintesis y la secrecién de protei- nas) pero estas combinaciones no son de uso tan exten- dido como las de Ios colorantes écidos. Los componentes de los tejidos que reaccionan con colorantes basicos 0 con hemataxilina se denominan bas6filos Basofilia y acidofitia. Algunas sustancias intracelula- res y Ia matriz extracelular presentan basofilia (gr. de amar lo basico), es decir, reaccionan con colorantes ba sicos, Estos incluyen: + La heierocromatina y los nuciéolos del nicleo (debi- dos principalmente a los grupos fosfato ionizados de los deidos nucleicos). + Componentes citoplasmdticos como el ergastoplasma (también debido a los grupos fosfato ionizados del RNA). + Sustancias extracelulares tales como los hidratos de carbono complejos de la matriz del cartilago (debido a grupos sulfato ionizados). Los componentes texturales que se tifien con colorantes dcidos se denominan acidéfilos La tincién con colorantes dcidos es menos especitica, pero una cantidad mayor de sustancias intracelulares y Ja matriz extracelular presentan acidofilia. Son acid6fi- las:No * ae = : Poe oe Brae S18 sy Fig. 1. A, Germen dentario en desarrollo teBido con azul de toluidina 2 pH 6,5. Obsérvese la tinciGn del citoplasma de los ameloblastos (AC). de Ja dentina (P), de Ta precentina (Pe), de! citoplasma de los adonteblastos (OC) y de los componentes de la papila dentaria (DP), El esmalte (FE) en esarrollo no aparece tenido. El azul de toluidina colorea los grupos aniénicos (P.¢.. COO , POs”, SO.2) y en consecuencia presenta eseasa especi Ficidad, B. Esta muestra (un corte de la misma serie gue el de a fig. 1-1) fue tratada con Ia enzima ribonucleasa para climinar el RNA de! tejido antes de tesirlo con azul de toluidina, también a pH 6.5. Nétese que el citapkasma de los ameloblastos (AC) ¥ odontoblastos (OC) ha perdide su in- tensa coloracién debido a la digestion del RNA. Com los nicleos eonticnen principalmente DNA, que no és afectado por la ribonucleasa, se tien con gran intensidad y su aspecto es similar al que spaeece en fa figura T-1 A. Del mismo modo, la matriz dentinal (D), la predentina (Pa) y la papi Ja dentaria retienen sus propiedades tintoriales, quiz debide « Ta presencia de compuestos sulfatados en la matriz. En este ejemplo, li enzima ribo rnucleasa se aplics como reactive antes de tei Kt rauesira, con el fin de contribuir la jdentificacién del RNA. cuando se la usa en forma combi a slesonitribonueleasa y zinias para In eoteecién ee polisacaridos. + Casi todos los filamentos citoplasmdticos, ea especial los de las células musculares. + La mayor parte de los componentes membranosos in- iracelulares y gran parte del citoplasma no especiali- zado de otro modo. + La mayorfa de las fibras extracelulares (debido prin- cipalmente a grupos amino ionizados) Algunos colorantes basicos reaccionan con componentes texturales de manera tal que su colpr normal varia de azul a rojo 0 prirpura; este cambio de absorbancia se denomina metacromasia Metacromasia, El mecanismo subyacente de este fe- ‘ogi se puede apreciar en las figuras J-I A y B, De acuerdo con los mismos prineipios se pueden emplear varias otras enzimas, por ejemplo la némeno es la presencia de polianiones en el tejido. Al teffir con una solucién colorante basica concentrada, co- mo cl azul de toluidina, las moléculas del colorante es- tn suficientemente cerea como pura formar agregados diméricos y poliméricos cuyas propiedades de absoreién son diferentes de las de las moléculas de colorante indi- viduales no agregadas. Presentan metacromasia las estructuras celulares y ti- sulares que poseen elevadas concentraciones de grupos sulfato y fostatos ionizados, tales como la sustancia fun- damental del cartflago, los grénulos de los mastocitos gue contienen heparina y el reticulo endoplasmético ru- goso de las células plasmaticas. En consecuencia, el azul de toluidina aparece de color purpura a rojizo. cuando colorea estos componentes.Grupos aldehido y reactivo de Schiff La capacidad de la fucsina basica diluida (reactivo de Schiff) de reaccionar con los grupos aldehédo para dar un color rojo determinado es la base de las reacciones de dicido peryddico-Schitf y de Feulgen La reaccién del dcido peryédico-Schiff (PAS), tite los ghiicidos y las macromoléculas ricas en ghicidos. Se utili- za para demostrar glucdgeno en las células, mucus en dis- tintas células y tejidos, la membrana basal que subyace a los epitelios y las fibras reticulares del tejido conectivo. La reaccién de Feulgen emplea una hidr6lisis dcida débil con cloruro de hidrégeno para colorear el DNA. La reaccién del PAS se basa en los siguientes hechos: + Los anillos de las hexosas de los monosaciridos po- seen carbonos adyacentes, cada uno de ellos con un grupo hidroxilo (-OH). + Las hexosaminas de los glucosaminoglucanos contie- nen carbonos adyacentes, con alternancia de grupos -OH y grupos amino (-NH,). + El dcido perysdico rompe la unién entre estos dtomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehfdo. + Estos grupos aldehido reaccionan con el reactive de Schiff para obtener un producto de color magenta. La tinci6n del PAS de las membranas basales (véase fig. 1-2) y de las fibras reticulares se basa en el conteni- do 0 la asociacién de proteoglucanos (hidratos de carbo- no complejos con un nticleo proteico). La coloracién del PAS es alternativa a los métodos de impregnacién ar- géntica, basacos también en la reaceién con las molécu- las de azsicar de los proteoglucanos, La reaeciGn de Feulgen separa las purinas de la deso- xirribosa del DNA por hidrdlisis éeida débil; el anillo del gltcido se abre y forma grupos aldehido, Estos, a su vez, reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un producto de color magenta. La reaccién con el DNA es estequio- métrica y, en consecuencia, se puede usar en métodos espectrofotométricos para cuantificar el DNA contenido en el niicleo de una célula, EI RNA no se colores con el reactivo de Schiff por carecer de desoxirribosa, Fig. 1-2. Fotomicrografia de tejido renal tefido con lu 6 nici del PAS para demostrar y localizar glacidos por méto dos histoguimicos. Las membranas basales son PAS posit vas, sega se evidencia por su intensa coloracién rojo pur plirea, Los tibulos renales (7) se encuentran bien delineados por fa membrana basal tefiida que los rodea. Los capilares slomerulares (C) y el epitelio de Ia efpsula de Bowman (BC) también poseen membranas basales PAS positivas * Digestién enzimatica La digestion encimética de un corte histoldgico que forma parte de una serie, coloreade para detectar un componente especifico tal como glucégeno, DNA o RNA, se usa para confirmar la identificacion del material teftido El material intracelular que se colorea con la reac- cién de PAS se puede identificar como glucsgeno por pretratamiento de los cortes histolgicos con diastasa 0 con amilasa, La eliminacién del material teftido des- pués de estos tratamiento identifica positivamente al glucdgeno. _Lamicroespeetrofoometia de Felgen & 6 fara analiza desé | conte- lets arrollada | SU edhie octet s ‘que se multiplica ‘nido normal de DI ‘eélula normal, que s tun espermatozoide © des; véas 51). En los Sac “uni herramienta muy valiosa para los patél quinirgi- “cos, para pia Sopot ees ot maligno y para facilitar las decisiones referidas al pron ‘0 y al tratamiento. La técnica de citome- “tria estitica Uc los cortes de W a solo se. 5 _por la elas y os ctmuls coloreados. Dé esta manera, ‘deseribir los patrones de ploidta’ \ceres oi pose oattaey : - ovatio. Se dice que los ad ienen predominio de patrén ‘eH bled eifecnciioe @ Neneh bee ‘ que los 1 ‘on aneuplotdia (miltiplos ‘no integrales de la cantidad haploide de DNA) y te- traploidia, =De modo similar, 1a predigestién con desoxirribonu- cleasa (DNAsa) de cortes de tejido elimina la tincién de Feulgen en esas muestras, y la digestién con ribonuclea- sa (RNAsa) de cortes de epitelio secretor de protefnas elimina la tinci6n del ergastoplasma con colorantes bési- cos (fig. 1-1). Histoquimica enzimatica También se usan métodos histoquimicos para identificar y localizar enzimas en las células y los tejidos Para localizar enzimas en los cortes de tejido, se debe cuidar especialmente la fijacién para preservar la activi- dad enzimética, Por lo general, e! método de eleccién es la fijaci6n débil con aldehido, En estos procedimientos se observa el producto de reacciGn de la actividad enzimiética en lugar de la enzima propiamente dicha, En general, se emplea un reactive de atrapamiento, un, colorante o metal pesado, para atrapar 6 fijar el producto de reacciGn de la actividad enzimética, que precipita en el sitio de la reaceién. En una reaccién tipica para detectar una enzima hidrolitica, el corte histo- logico se coloca en una solucisn que contiene el sustrato (AB) y un agente de atrapamiento (7) que precipitaré uno de los productos como se sefiala a continuacién: AB+T_om™, ATL+B donde AT es el producto final atrapado y B es el sustra- to hidrolizado. Con estos métodos el lisosoma (véase p. 85), identi- ficado en un principio por estudios de centrifugacién diferencial de células, fue equiparado a un componente vacuolar observado en fotomicrogralfas electrGnicas. En tejidos fijados débilmente, las hidrolasas cidas y las esterasas Acidas que contienen los lisosomas reac- cionan con un sustrato adecuado. La mezcla reactiva contiene ademas iones plomo para precipitar. por ejemplo, como fosfato de plomo derivado de ta accién de la fosfatasa écida. Entonces se puede visualizar el producto precipitado de la reaccién con microscopios Optico y electrénico. Se han desarrollado procedimientos histoquimicos Spticos y electrénicos para demostrar Ia fosfatasa alcali- na, adenosintrifosfatasas (ATPasas) de muchos tipos, entre ellos la ATPasa activada por Na*-K-, que es la ba- se enzimitica de la bomba de sodio de las células y de los tejidos, distintas esterasas y numerosas enzimas res- piratorias (fig. 1-3), Inmunocitoquimica Si se inyecta una proteina extrafia u otro antigeno en un animal se producen anticuerpos Un anticuerpo es una protefna producida por determi- nadas células sanguineas que se une con la sustancia ex- trafia que estimula su produccién y por lo general la pre- Fig, 1-3, En esta fotomicrografia se aptecia la actividad de la ATPase ‘ao largo de los plegamientos laterales complejos, en la regién apical ide cdhilas epiteliales de vesfcula biliar de conejo. Esta localizacion histoguiimica corresponde a Ia loealizacién del sistema de transporte del sodio en estas eéllas con transporte muy activo. »26.000. cipita, En el Iaboratorio se pueden purificar y conjugar Jos anticuerpos (es decir, unir por enlaces quémicos) con un colorante fluorescente como Ia fluoresceina. Enton- ces se aplica este reactive a cortes de tejido fijados dé- Dilmente 0 congelados sobre portaobjetos de vidrio, con el fin de localizar el antfgeno en las células y los tejidos Después se examina y se fotografia la reaccién con un microscopio de fluorescencia La especificidad de la reaccién entre antigeno y anticuerpo es la base fundamental de la inmunocitoquimica En un procedimiento tipico se afsla una protefna espe- cifica, por ejemplo actina, de las células miisculares de una especie, por ejemplo rata, y se inyecta en la circula- cidn de otra especie, como el conejo. La actina estimula la formaci6n de anticuerpos antiactina que circulan en la sangre del conejo. Se extraen los anticuerpos de la san- are de conejo, se conjugan con un colorante fluorescente y se usan para tefiir tejidos o células que supuestamente contienen actina, como los fibroblastos del tejido conee- tivo, Si hay actina, los anticuerpos se unen a ella y se puede ver la reacci6n en virtud del colorante fluorescen- te fijado a los anticuerpos (fig. 1-4). Se usa un micros- copio de fluorescencia para mostrar la fluorescefna, aho- ra unida indirectamente al antigeno. También es posible conjugar sustancias como oro o ferritina (una molécula que contiene hierro) a la molécula de anticuerpo. Estos marcadores se pueden ver directamente con el mictosco- pio electronico.Fig. 1-4, Fibroblasto de pict humana fotografiado en eultivo con el microseopio de fluorescencia. Lat sno-anticuerpo, producida direciame: rentos de actina organizados en fasetculos lineales aparecen Tluorescentes y muestran su distribucién en e tina espeeifico conjugado von el colorante fluorescein. La reaeci¢n an zacién de la actina, Los fila Ja. (Gentieza del Dr. E.S, Lazarides 1984.) Los métodos histoqutmicos enzimdticos se combinan con los métodos inmunocitoquimicos tradictonales para anplificar aun més la reaccién de localizacién que se puede obtener con la fluorescetna En estos métodos se conjuga la enzima peroxidasa con el anticuerpe primario y. una vez producida la reacciGn antfgeno-anticuerpo, se demuestra la actividad de peroxidasa por el procedimiento histoquimico, para detectar la localizacién del complejo (reaccin directa), Este método se puede refinar aun més por fijacién de la peroxidasa a una anti-y-globulina (anticuerpo secunda- rio) que se fija al anticuerpo primario y amplifica la reaccién (reaccién indirecta). Como el producto final de la reaccidn de peroxidasa también es visible con el mi- croscopio electrdnico, este método se adapta fécilmente a la inmunocitoquimica para ME, Se pueden usar anti- cuerpos monoclonales conjugados con ferritina 0 con particulas de oro como matcadores de anticuerpos pri- marios, para obtener localizaciones mas exactas de los antigenos en los cortes histolégicos estudiados con el microscopio electrénico de transmisidn de lo que es po- sible con los anticuerpos policlonales tradicionales. EI método de marcaci6n indirecta tiene la ventaja adi- cional de que un tnico anticuerpo secundario se puede usar para localizar la unién espeeffica intracelular 0 tisu- élula fue “teBida" gon un antieverpo antiae ce en el enitivo, resulta en la local a cslula 6 lar con varios anticuerpos primarios diferentes, En los estudios con el microscapio dptico, se puede conjugar el anticuerpo secundario con diferentes colorantes fluores- centes, por lo gue se pueden demostrar varias marcas en el mismo corte de tejido. Autorradiografia En ta autorradiografia se coloca una emulsion fotogrdfica sobre un corte de tejido para localizar ‘material radiactivo dentro de éste Muchos precursores moleculares pequefos de molé: culas de mayor tamaio, tales como Ios aminosicidos que son incorporados a las protefnas y los nucieétidos que se incorporan a los dcidos nucleicos, se pueden marear por sustitucién por un dtomo o étomos radiacti- vos en su estructura molecular y la consecuente radiae- tividad utilizada para localizar la moléculas de mayor tamafio en las células y Ios tejidos. Se ha usado eficaz~ mente este procedimiento por inyeccién de las molécu: las precursoras marcadas a animales, 0 por introducci6n de los precursores marcados a los cultivos de células 0 de drganos. De esta manera se han estudiado la simtesis de DNA y la posterior division celular. la sintesis y se- crecién de protefnas por las células. y la localizacién deproductos sintéticos dentro de las células y en la matriz extracelular. Con esta técnica se montan sobre portaobjetos los cor- tes histolégicos que incorporaron el material radiactivo. En un cuarto oscuro se sumerge el portaobjetos en una emulsién fotogrifica, para formar una delgada pelicula en la superficie. Después de una exposicién adecuada, por Io general de dias 0 semanas, se revela la emulsién expuesta del portaobjetos por medio de técnicas fotograficas es dar y se monta permanentemente con un cubreobjetos. Se pueden colorear los tejidos antes 0 después de la exposi- cién y del revelado. Con este procedimiento se exponen y revelan los grénulos de plata de la emulsiéa sobre las mo- léculas con marca radiactiva y aparecen como puntos ne- gros sobre las porciones del tejido, al examinarlos con el microscopio éptico (fig. 1-5A). Los grinulos de plata de la emulsi6n revelada se pue- den emplear simplemente para indicar la localizacién de una sustancia, 0 se pueden contar para proporcionar in- formacién semicuantitativa sobre la cantidad de una sus- tancia determinada en un sitio especifico. Por ejemplo, después de inyectar en el animal timidina tritiada, las Fig. 5. A. Fotomicrogratia de un cor células que incorporaron este nucledtido al DNA antes de la divisi6n, pero que aun no se han dividido, tendran alrededor del doble de grénulos de plata sobre sus mi- cleos que las que se dividieron después de incorporar el nuclestido marcado. También se puede realizar autorradiografta en cortes delgados de material plistico que se examinan con el ME. En esencia se usan los mismos procedimientos, pe- ro como ocurre con todas las técnicas de prepara ra MET, los procesos son mucho més delicados y diffci- les, Sin embargo, también se obtienen resultados con re- solucién y localizacién mucho mayores (fig. 1-5B). Historradiografia La historradiografta es una fotografia por rayos X (microrradiografia) de una muestra colocada sobre un portaobjetos La historradiografia expone la masa igual que una ra- diografia comtin, Aunque los rayos X se pueden usar para examinar tejidos blandos, su mayor utilidad’es para anglio linfético de un animal al que se le administe0 timidina tritada. En algunas de las células se ven islomerados de grinulos de plata metifea con el aspecto de pequefias particulas negras (fechas). Estas eélulas se estén preparanco para ta divi ‘ion y han incorporado la timidina a sus aticleos, Al incidir contca los eristales de haloro de plata de una eraulsion fotogréfiea que cubre Ia muestra por tin cierto pervade (exposicidn), las partfeulas radiactivas de luz al inci sobr tra cosa que el sorta intestinal, En esta muestra s ats detalles citoldgicos y al tamafo relativamente peguetio de los imulos de plata se concéntran sobre invaginaciones apicales (inv) v luce a plata met anulos de plata, la localiza ihulos endloefticns (11h). (Fotomierografia cortesta de Marian R, Neusta.) fener emitidas por la timidina witiada crean una imagen latente (eomo hace la la pelicula de una camara fotogrifica). Tras el revelado del portaobjetos eubierto con la emulsion, la imagen latente, que no es ro de plata activado, se hace visible porque ta sal se microscépico. (Preparado original gentileza de E. Kallenbach.) B. Autorradiog ‘nyeet6 en el animal "1 unido a facior de crecimiento nervioso (NGF). y se extrajo el tejido | hora mas tarde Se preparé la muestra en forma similar a la usada para e] mictoscopio 6ptico, como en la Ta cual aparece como grénulos negros en el examen fla por microscopio clectrénico de la regin apical de mura I-L A. Sin embargo, debido 2 la mayor resolucién y 16n del '=1-NGF es may precisa, Notese que losFig. 1-6, Micronradiografi de un corte de hueso de 200 jum de expe sor. Las areas e) niegro cortesponden a tejidos blandos; las dreas Blancos cantiencn altas coneeniraciones de sales de caleior y las dreas arises clans y oscuras teflejan mayor y menor concentracién del mi ‘eral de caleto, respeetivamente, (Gentileza del Dr. J. Jowsey, 1984.) el examen de cortes de hueso u otro tejido mineralizado, En la préctica, el carte de hueso se coloca en contacto con una emulsién fotogrifica sobre un portaabjetos y se expone a un haz de rayos X. Después se revela la emul- sién fotogrifiva y se observa con el mictoscopio éptico 1-6). Ene} portaobjetos se pueden agregar estinda- res de masa conocida © preparar un portaobjetos auxiliar tratado de la misma manera, para obtener datos semi: cuantitativos de la cantidad de material éseo en distintas partes del corte. MICROSCOPIA Microscopia dptica Un microscopio, simple (de una lente) 0 compuesto (de varias lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite ka observacién de mayores detalles de los posibles a simple vista, El microscopio mas simple es una lente de aumento 0 un par de anteojos. El poder de resolucién del ojo humano, es decir 1a distancia a la cual dos objetos deben estar separados pa- ra verse como dos objetos (0,2 mm) se determina por el espaciamiento de las células fotorreceptaras de la retina. EI mieroscopio tiene por objeto aumentar una imagen hasta e] nivel de resolucién de fa retina, para captar la Cuadro 1-3, Resolucion det ojo vs de instrunentos Distarcia entre dos prnios (que se ven separados jo humano| 0.2 mim Microscopie de campo claro 0.2m ME 250m MET Tedrieo 0405 nm Conte de telido 10mm formacién que de otra manera estarfa por debajo de ese nivel, El cuadro 1-3 compara la resolucién del ojo con la de distintos instrumentos. El poder de resolucién es la capacidad de ta lente o del sistema dptico de un microscopio de producir imdgenes separadas de objetos que se encuentran muy préximos La resolucién depende no sdlo del sistema éptico sino también de la longitud de onda de la fuente luminosa y de otros factores como el espesor del espécimen, la cali- dad de la fijacién y la imensidad de la coloraci6n. Con una tuz que tenga una longitud de onda de 540 nm (cua- dro 1-4), luz que pase por un filtro verde a la cual el ojo humano es muy sensible, y con objetivos y condensado- res adecuados, el poder de resolucién maximo que se puede alcanzar seria de alrededor de los 0.2 jum (véase en p. [7 cémo se calcula). Esta es la resolucién teérica que, como ya dijimos, depende de que todas las condi- ciones sean dptimas. El ocular aumenta la imagen pro- ducida por el objetivo, pero no puede aumentar la re- solucién Exisien distintos microscopios dpticos disponibles pa- ra ¢] uso general y especializado en la investigacién y el estudio biolégicos modernos, Sus diferencias se basan, especialmente, sobre factores tales como Ia longitud de onda de la iluminacién del espécimen, la alteraci6n fisi- ca de la luz que incide o sale de la muestra y los proce- sos analiticos especificos que se pueden aplicar a la ima- gen final, En esta seccién se describen brevemente estos insirumentos y sus aplicaciones. El microscopio que usan los estudiantes ¢ investigadores se denomina microscopio Sptico o de campo claro Microscopio de campo claro. Este microscopio es descendiente directo de los disponibles a partir de 1800, que inauguraron la primera era importante de investiga- cién en histologia. En esencia, el microscopio de campo claro consiste en: Cuadro 1-4, Equivalencias en las medidas de longitud T Angstrom (A). = 0.1 nandmetro (am) 1OAngstroms = {UD nandmetio (antes miliraieréa mp.) 1,000 nanémetros = 1.0 mierSmetro (ium) [antes )] 1000 miersmettos = LD.milimeto (mm)+ Fuente luminosa que ilumina la muestra, es decir, una kimpara por debajo de la platina, + Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra. + Platina, sobre la cual se coloca el portaobjetos o muestra, + Objetivo que recibe la luz que atravesé la muestra. + Ocular (0 par de oculares en los microscopios binocu- lares de uso mas comin) a través de los cuales se exa mina directamente la imagen formada por el objetivo La muestra que se va 8 observar con el microscopio “piico debe ser bastante fina como para que la luz pueda atravesarla, Si bien parte de la luz es absorbida al pasar por el espécimen, el sistema éptico del microscopio de campo claro no produce un nivel 1itil de contraste en la muestra no coloreada, Por este motivo se emplean los distintos métodos de tincisn ya vistos. A continuacién se deseriben otros sistemas Gpticos que intensifican el contraste sin coloracién. Elmicroscopio de contraste de fase permite observar células y tejidos sin colorear y resulta especialmente itil para célutas vivas Microscopio de contraste de fase. Este microscopio aproveeha las pequeias diferencias de los indices de re- fraccidn en las distintas partes de una célula y en distin- tas partes de una muestra de tgjido. La luz que pasa por regiones de mayor indice de refraccién (zonas densas) experimenta una deflexién y queda fuera de fase con respecto al haz principal de las ondas de luz que atrave saron la muestra, El microscopio de contraste de fase aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos dpticos del objetivo y del con- densador, anula la amplitud de la porcidn fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste ttil sobre Ia imagen. Lus partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen: las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas del espécimen, En consecuencia, el microscopio de contras- te de fase se usa para observar células y tejidos vivos, tales como las eélulas de los cultivos de tejido, y para examinar cortes semifinos (de unos 0.5 jm) no colorea- dios de tejidos incluidos en material plistico. Dos modificaviones del microscopio de contraste de fase son el microscopio de interferencia. que permite también cuantificar la masa de tejido y el microscopio de interferencia diferencial (que wtitiza el sistema 6pti- co de Nomarski), que es especialmente itil para estudiar las propiedades de superficie de las células y de otros elementos biolégicos, En el microscopio de campo oscuro, el objetivo no recibve luz directa de la fuente luminosa Microscopio de campo oscuro. En este microscopio,, el objetivo slo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el micros- copio de campo oscuro est equipade con un condensa- dor especial que ilumina la muestra con luz fuerte indi- recta. En consecuencia, el campo visual se observa co- mo un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequefias particulas brillantes de la muestra que reflejan parte de Ia luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las particulas de polve que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapo- sitivas en una habitacién oscura. La luz reflejada por las particulas de polvo Hega hasta la retina del ojo y las ha- ce visibles. La resolucién del microscopio de campo oscuro no puede ser mejor que la del microscopio de campo claro, dado que emplea la misma fuente de longitud de onda Sin embargo, se pueden detectar particulas individuales ais pequenas en las imagenes de campo oscuro, debido al mayor contraste creado. El microscopio de campo oscuro es itil para observar autorradiografias, en las cuales los granulos de plata re- velados aparecen blancos sobre el fondo oscuro. Desde el punto de vista clinico es til para observar cristales en la orina, tales como los de Acido trico y los de oxalato, y para detectar espiroquetas, en particular Treponema pallidum, el microorganismo causal de la sifilis, una de las enfermedades de transmisién sexual. El microscopio de fluorescencia utiliza la propiedad de fluorescer que tienen ciertas moléculas bajo la luc wliravioleta Microscopio de fluorescencia. Una molécula que fluoresce emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta (UV). El microscopio de fluo- rescencia se usa para revelar moléculas fluorescentes: naturales (autofluorescentes), tales como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Como las moléculas auto- fluorescentes son escasas, su aplicacién més difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en el cuso de la deteccién de antigens o anticuerpos en pro- cedimientos de coloracién inmunocitoquimica (fig. 1-4), También se pueden inyectar moléculas fluorescentes es- pecificas en un animal o directamente en células, y usar~ las como marcadores. Estos métodos sirvieron para es- tudiar las uniones intercelulares (con hendidura), para marcar la trayectoria de las fibras nerviosas en neuro- biologia y para detectar marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados. Se insertan distintos filtros entre Ta fuente de luz UV y la muestra, para producir luz. monocromattica 0 casi monocromattica (longitud de onda tnica o una banda es- trecha). Un segundo grupo de filtros se inserta entre el espécimen y el objetivo, y sélo permite que la estrecha banda de longitudes de onda de la fluorescencia Hlegue hasta el ojo o incida en una emulsién fotogréfica u otro procesador analitico. El microscopie de barrido confocal combina componentes de un microscopio éptico con un sistema de barrido para disecar dpticamente el espécimen Microscopio de barrido confocal. Este microscopio es un sistema relativamente nuevo que se usa para estu-Fuente lumineso (lampore) Lente Condansodor | objeto Bai ~ tent ob 1 i Fa a eee Mal = bess =p ate ee [aE sell , Obie a eee Be eicceonee | Se tee) pe de oe “én nN Amplificador aio ens By a cacy | (esa Imagen a oem ae iiczosconie wiczoscono ari tieerroteo asenewco of THANSISION Se Bafa Fig. 1-7. Diagramas comparativos entre la marcha de rayos luminosos en el microscopio Optico (izquerda), como si estuvieran cabeza abajo, en et MET (coniro)y en el MEB (derecha). Las flechas representan cl espécimen y Ia imagen aumentada proyectada diar la estructura de los materiales biolégicos. Emplea un sistema de iluminacién con rayo Miser que es muy convergente y, en consecuencia, produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada, Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo laser a través del espécimen, iluminando un solo punto por ver (Tig. 1-8). Se registran los datos de cada punto de la muesira recorrida con este rayo mévil y se guardan en una computadora. Luego se puede Tlevar Ia informacién a un monitor de vicleo de alta resolucién para crear una imagen visual. La principal ventaja de este sistema es su capacidad de tomar imagenes de la muestra en cortes 6pticos muy finos (aproximadamente 1 um de espesor). Las regiones fuera de foco se restan de Ia imagen por medio del programa de la computado- ra, con To cual se crea una definicién maxima de la ima- gen, En estos aspectos, Ja microscopia confocal se ase- _meja a los procesos de imagenes por barrido de la to- mograffa axial computarizada (rayos X) (barrido por TAC). Las imégenes obtenidas con éptica comin, 0 no confocal, contienen partes del espécimen en foco y fue- ra de foco superpuestas, por lo cual no son tan defini- das. Ademis, al utilizar s6lo la estrecha profundidad de la imagen en foco, es posible crear imagenes multiples a diferentes profundidades dentro del espécimen. Asi, li- teralmente se puede disecar capa por capa del espéci men, en todo su espesor, También es posible emplear fa computadora para lograr reconstrucciones tridimensio- nales de una serie de estas imagenes. Dado que es muy definida cada imagen individual localizada a una pro- fundidad especifica dentro del espécimen, la imagen tridimensional resultante también es muy definida, Ademés, una vez que la computadora reunié cada una de las imagenes parciales, se puede rotar la imagen tri- dimensional reconstruida y observarla en cualquier orientaciGn que se desee. El microscopio de luz ultravioleta utiliza lentes de cuarzo y una fuente de luz wltravioleta Microscopio de luz ultravioleta. La imagen en el mi- croscopio de luz UV depende de la absoreién de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de Juz UV tiene una longitud de onda de unos 200 nm. Por lo tanto, puede alcanzar una resolucién de 0,1 1m. En principio, la microscopia UV no es muy diferente del funciona- miento de un espectrofotsmetro, pero sus resultados son registrados en fotogratias. No se puede observar la muestra directamente a través del ocular porque la luz UV no es visible y dafia la retina. EI método sirve para detectar écidos nucleicos, espe- icamente las bases piricas y pirimidicas del nuclesti- do, También es titil para detectar protefnas que contie- nen determinados amino’cidos. Si se emplean longitu- des de onda especificas para la iluminacién, se pueden obtener mediciones espectrofotométricas con el micros-copio UV para cuantificar el DNA y el RNA de cada cé- lula, Segtin se describe en la pagina 6, tiene ut idad cl nica para evaluar el grado de ploida (miltiptos de la cantidad de DNA normal) en cortes tumorales. El microscopto de polarizacién emplea la propiedad de las motéculas 0 especiro de moléculas muy ordenadas para rotar el Gngulo del plano de la luz polarizada Microscopio de polarizacién. Este microscopio es una simple modificacién del microscopio Sptico, donde se coloca un filtro polarizante, denominado potarizador, entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador, entre el objetivo y el observador. Se pueden rotar el polarizador y el analizador; la dife- rencia entre sus dngulos de rotacién se usa para determi nar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada, La capacidad que tiene un cristal o estructu- ra pardcristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia (doble refraccién). Exhiben birrefringencia, entre otras estructuras comunes, el mis- culo estriado y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares (células de Leydig). Microscopia electronica Dos tipos de microscopio electrénico nos permiten obtener datos morfolégicos y analiticos sobre células y tejidos: el microscopio electrénico de transmision Espejos de barrido: = Deslizedor de refinnon ‘Objetive Muerte LJ Seporador Se hoces Sieraco (MET) y cl microscopio electrénico de barrido (MEB) El ME aventaja al microscopio dptico en que la longitud de onda del haz de luz del ME es aproximadamente 1/200 de la del mictoscopio éptico, lo cual aumenta la resoluci6n en un factor de 10°. El microscopio electrénico de transmisién emplea fa interaccién de un haz de electrones con una muestra para producir una imagen Microscopio electrénico de transmisién. En princi- pio, Ia “6ptica” del MET es muy similar a la del micros- Copio Sptico (fig. 1-7), salvo que el MET usa un haz de electrones en lugar de un haz de luz visible. Este mi- _ eroscopio se basal en los siguientes principios + Una fuente, un filamento de tungsteno c: emite electrones (edtodo). + Un dnodo, hacia el cual son atraidos los eleetrones. + Una diferencia de potencial entre el cétodo y el énodo imparte un voltaje de aceleracién entre 20.000 y __ 200,000 volts a los electrons, que crea el haz. # El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen Jas mismas funciones que las lentes de vidrio de un microscopio dptico. jentado que El condensador forma el hazy modifica el didmetro del haz. que incide en el plano del espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un abjetive, y se aumenta atin mas con una o mas lentes proyectoras. La imagen final se visualiza so- Apertura ol detector Foto multipicodor 1-8, Diagrama de la marcha de rayos en el microscopic confocal, (Gentileza de Sarastro, Inc., USA),DESARROLLO DELA MICROSCOFIA, ELECTRONICA Los principios electrénicos del MET y del MEB son similares a los de un tubo de rayos catédicos (TRC), como los usados en un aparato de televisién, Los primeros ME, construidos a principios de la dé- cada de 1930, fueron desarrollados independiente- mente en varios paises por cientificos € ingenieros que trabajaban con televisores. Aunque entonces se estudiaron algunos virus y otros materiales paracris- talinos desecados con el ME, recién en la década de 1950 se desarrollaron métodos adecuados de fija- cin, inclusi6n y corte, que permitieron la aplicacién. del MET como herramienta de rutina en fa investi- gacién biolégica. bre una pantalla cubierta por fésforo. Las porciones de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillanies; las porciones que absorbieron 0 es- parcieron los electrones por su densidad inherente 0 de- bido al agregado de metales pesados durante la prepara- cién del espécimen, aparecen oscuras. Se coloca una placa fotogréfica 0 un detector de video por encima o por debajo de Ia pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalls Las muestras para el microscopio electrénico de transmisién se preparan sobre la base del mismo principio que las para el microscopio éptico, pero requieren métodos mds finos Los principios sobre los cuales se basa Ta preparacién de los cortes histolégicos para la observacién con el MET son en esencia iguales a los empleados para el mi- croscopio dptico, con la restriceién adicional de que en cada paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 Ordenes menores o mas finos que los utilizados para el microscopio éptico. E] MET con una longitud de onda en el haz de electrones de aproximadamente 0,1 um, tie~ ne una resohucién tedrica de 0,05 nm. Debido a la gran resolucién del MET la calidad de la fijacion, es decir, el grado de preservacion de a estruc- tura subcelular debe ser la mejor posible. La preparacién de rutina de los espectmenes para ta microscopta electronica de transmisién comienza con la fjacién con glutaraldehido, seguida de un lavado con wt buffer y de una fijacién con tetréxido de osmio El glutaraldehido, un dialdehido, conserva los compo- nenies proteicos al formar enlaces eruzados entre ellos; el tetrdxido de osmio imparte densidad electronica a las estructuras celulares y tisulares por ser un metal pesado, y asf aumentar la ulterior formacién de la imagen en el MET. jones ideales, se deben perfundir los tejidos aldehido y buffer antes de cortarlos del ani- con gl mal, Por lo general, se fijan para el MET piezas de teji- do no mayores de 1 mm? (comparado con las muestras para microscopio dptico, que se pueden medir en em). El proceso de deshidrataciGn es idéntico al empleado en la microscopia dptica, y se infiltra el tejido con resina monomérica, por lo general una resina epoxi, que luego se polimeriza. El tejido incluido en material plastico se seceiona por media de micrdtomos especialmente diseitados, que usan cuchitlas de diamante Debido al limitado poder de penetracién de los elec- trones, el espesor de los cortes preparados para el mi- croscapio electrénico de transmisién varia entre 50. am y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder Ser manipulados: se los hace flotar desde el filo de la cu- chilla en la superficie de una bandeja Hlena de liquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre re- cubiertas por plstico. Estas rejillas tienen 50-400 orifi- cios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados. No es necesario eliminar el pléstico de las muestras para observarlas por el MET; més bien es esencial su presencia para estabilizar las estructuras de los cortes extremadamente delgados. El haz pasa por los agujeros de la rejilla de cobre, después por la muestra y luego se enfoca la imagen sobre la pantalla del visor 0 sobre una pelicula fotografica, TINCION ESPECIAL DE LOS CORTES PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA oF TRANSMISION “Muchos dé los métodos histoquiinicos usados en la microscopia 6ptica han sido adaptados para la mi- croscopia electrénica. E] empleo de dialdehidos de ‘bajo peso molecular, en particular glutaraldehido. co- mo fijadores primarios te permitido la aplicacion de muchos métodos histoquimicos enziméticos estiindar “a tejidos para la observacién con MET, a menudo s6- Jo con modificaciones menores de buffers y de reacti- vos de attapamiento, Los procedimientos para fosfa- tasa y esterasa se han adaptado bien para el MET. Por ry se efecitian las reacciones sobre cortes de tejido um que después se fijan con tetréxido de ‘osmio y se incluyen para el corte para MET (fig. 1-3). La sustituciGn del compuesto que contiene un me- tal pesado por un colorante fluorescente, por lo ge- neral conjugado con un anticuerpo, permite la adap- tacién de métodos inmunoeitoguimicos para la mi- croscopia electronica, como ocurre en la adaptacién de la reaccién de la peroxidasa basada en el uso de diaminobencidina. Estas técnicas tienen particular utilidad para dilucidar las fuentes celulares y las vias intracelulares de determinados productos de secre- cin, la localizacién de receptores especificos sobre Ia superficie de las células y la localizacién intrace- Jular de fiirmacos y sustratos ingeridos. De modo si- milar, las técnicas mds refinadas permitieron el de- sarroilo de autorradiografias de rutina con ME como método de investigacién (véase fig, 1-5B).Es necesaria la coloractén de rutina de los. ceries para microscopia electronica de transmisién para incrementar el contraste, para que se puedan observar y fotografiar con facilidad los detalles de las estructuras celulares Por lo general, la coloracién de los cortes para mi- croscopio electrénico de transmisién se realiza por me- dio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados, Estos io- nes de metales pesados se unen a los tejidos durante Ia fijacién 0 la deshidrataci6n o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte, El tetrs- xido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se tune a los componentes fosfolipidicos de las membrana: Jo cual agrega densidad a la membran: A menudo se agrega nitrato de uranilo a las solucio- nes alcohdlicas usadas en la deshidratacién, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios, La inmersin secuencial en so- luciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teflir los cortes antes de observarlos con el MET, Si bien aun no se conoce con exactitud la guimica de estas reacciones, los procedimientos empir cos derivados permiten la abtencién de fotomicrografias electrOnicas de gran contraste. Sevier tubo La congelacién-fractura es un método especial de preparacién de la muestra para microscopia electronica de transmision, de gran importancia en el estudio de membranas El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijacor del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crigprotector, como el glicerol. y se congela répidamen- te a unos ~160°C. Se previene la formacion de cristales mediante el uso de crioprotectores, el congelamiento ra pido y muestras de tejido muy pequefas. Se coloca el te- Jido congelado en el aparato de congelacién-fractura, {que pose una cAmara de vacio y se fractura con el filo de una cuchilla 0 navaja. De preferencia, el plano de fractura pasa por la porcion hidrofébica de la membrana plasmétiea vy expone su superficie interna La fractura resultante de la membrana plasmética pro- duce dos nuevas superticies. Se denomina cara E a la superficie que tiene detrés al espacio extracelular; se de~ nomina cara P a la superficie que tiene detras al proto- plasma (citoplasma). Se puede dejar el tejido fracturado en el aparato durante un periodo variable. pero breve, para que se evapore el agua congelada (sublimacién) y Imagen final ED rein sm iso punto eculon Imogen 4 intermedia veal Objetive _—_Popile de solide pe ‘el objetivo are condensodor lee aoe Oc i Pes i Condensader ureioana Diofroame: de comps eee lluminaeisn Keehlar 2 través dol microcopio Troyecto de fot haces «ue formon fa imagen Troyecto dolor hee dotlominecton Fig. 1-9. Diagrama de un microscopie dptico modemo con un corte transversal de sus eomponentes Funcionales y de la marcha de lox rayos. (Gen= tileza de Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY.)se destaquen en relieve ciertos detalles estructurales de la superficie interna de la membrana plasmética. Enton- ces se cubre la muestra con platino para obtener una ré plica de la superficie fracturada, Se disuelve el tejido y la réplica de la superficie se coloca en ta rejilla para ser ‘examinada con el MET. Esta réplica revela detalles a ni- vel macromolecular (fig. 2-6) Con el microscopio electrénico de barrido el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que explora la superficie Microscopio electrénico de barrido. En muchos as- pectos, este microscopio se asemeja mis que el MET a los tubos de televisién de donde deriva la microscopia clectrénica, Para analizar la mayorfa de los tejidos se fi- ja la muestra, se deshidrata por desecacién de punto erf- tico, se cubre con una pelfcula evaporada de oro-car- bon. se monta en un taco de aluminio y se coloca en la camara de muestras del MEB. En los tejidos minerali- zados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejfa y analizar las caracteristicas estructurales del mineral. Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a través de la superficie de un tubo de televisién. Los electrones reflejados desde la superficie (electrones dispersados hacia atrds) y los clectrones forzados hacia el exterior de 1a superficie (electrones secundarios) son captados por uno o més detectores y reprocesados para formar una imagen tridi- mensional en un TRC de alta resoluci6n (tubo de televi- sién). Se pueden tomar fotograffas del TRC para registrar Jos datos o la imagen en una cinta de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodoluminiscencia de las molé- culas del tejido por debajo de la superficie y los electro- nes de Auger emitidos en la superficie, Muchos microscoptos combinan las caracteristicas de un microscopio electrénico de transmision y las de un microscopio electrénico de barrido para dar un microscopio eleetronico de transmisiGn-barricia que permite ef microandlisis por rayos X con sonda electrénica Con Ja configuracién del MEB se puede obtener una imagen de transmisidn si se inserta un iejilla de sostén a nivel de la muestra, se reciben los electrones transmiti: dos con un detector y se reconstruye la imagen sobre un TRC, Esta tiltima configuraci6n de un MEB o microsco- pio cleetrénico de transmision-barrido (METB) facilita el uso de los instrumentos para el microandlisis por ra- yos X con sonda electrénica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reu- nir los rayos X emitidos cuando el haz bombardea el corte histoldgico, y mediante analizadores apropiados, se construye un mapa que muestra Ia distribucidn en los cortes de los elementos que tienen mimero atémico ma- yor de 12, en concentracion suficiemte para producir ra- yos X en cantidad tal que se pueda analizar. En conse- cuencia, el MET y el MEB se pueden convertir en sofis ticadas herramientas analiticas, ademas de su utilidad como instrumentos “6pticos” Se han consiruido microscopios electrénicos de alto voltae con valtajes de aceleracion que varian entre 500,000 y 1.200.000 volt Los ME de alto voltaje (MEAYV) han sido particular- mente titiles para estudiar cortes histolégicos entre 0.25-0,5 um, es decir 3-5 veces el espesor de los que se usan en el MET convencional. Por medio del uso de pa- res de fotografias en estéreo se ha logrado una mejor comprensién de la estructura tridimensional de las orga- nelas y de las superticies celulares y examinar las rela- ciones entre las distintas organelas citoplasmticas. USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO OPTICO Esta breve introduccién al uso correeto del micros- copio dptico esta dirigida a los estudiantes que usardin el microscopio para la observacién de rutina de los preparados histolégicos. Si los siguientes comentarios parecen elementales, sélo se debe a que la mayoria de os que usan el microscopio no aprovechan todas sus, ventajas. A pesar de Ia actual disponibilidad de sofisti- cados equipos, en muchos casos se carece de la ins- truccién formal requerida para saber usar correctamen- te el microscopio optico. Los sistemas dpticos onerosos y bien corregidos s6- Jo fancionan en forma éptima cuando los trayectos de Jos haces de iluminacién y observaciGn estén contra- dos y tienen un ajuste correcto. El uso de ajustes y ali- neamientos adecuados contribuye sustancialmente al reconocimiento de detalles muy diminutos de la mue: ay a la fiel manifestacién de los colores para la vi- sidn directa 0 la microfotogratia La iluminacién Koehler es una de las claves de la ‘buena microscopia y estd incorporada en el disefio de casi todos los microscopios modems que se usan en la- boratorios © para Ia investigacién. En la figura 1-9 s ilustran los dos trayectos de los rayos luminosos y todos, Jos controles de ajuste de un microscopic modemo de laboratorio, y se debe emplear como guia al seguir las instrucciones que se dan a continuacién, par? obtener tuna iluminacién adecnada en el mictoscopio. ‘Los ajustes necesarios para conseguir una buena ilu- minacién Koebler son pocos y sencillos. Los pasos a seguir son: + Enfocar la muestra. + Cerrar el diafragma de campo. + Enfocar el condensador, moviéndolo hacia arriba 0 hhacia abajo hasta que el contorno de su diafragma de campo sparezea bien nitido (en foco).. * Centrar el diaftagma de campo con los controles de centrado de la subplatina (donde esta el condensa- dor). Luego abrir el diafragma de campo hasta que cubra todo el campo observado.* Retirar el ocular (0 usar un telescopio de centrado 0 un accesorio telescépico de fase, si se dispone de ellos) y observar la pupila de salida del objetivo. Se Yer un campo circular iluminado cuyo radio es di- rectamente proporcional a la apertura numérica del objetivo. A medida que se cierra el diaftagma del condensador, su contorno aparecera dentro de este campo circular. Para la mayoria de los preparados te- fiidos se debe cerrar el diafragma del condensador hasta cubrir aproximadamente dos tercios de la aper- tura del objetivo. EI resultado de este ajuste es la ave~ nencia maxima entre resolucién y contraste. Si se ponen en practica estos cinco simples conse- jos, la imagen obtenida sera la mejor que permita la “ptica del microscopio, Veamos ahora las razones. Principios de la microscopia de campo claro Primero, gpor qué se ajusta el diafragma de campo para cubrir sélo el campo observado? El iluminar un campo mds grande del que el sistema dptico puede “ver” solo conduce a teflexiones internas 6 a una pér- dida de luz, lo que trae como consecuencia mayor “rui- do” o una disminucién del contraste de la imagen. Segundo, {por qué se pone énfasis en el ajuste del diafragma del condensador 0, en otras palabras, en la apertura de iluminaciGn? Este diafragma ejerce gran influencia sobre la resolucién y el contraste con que se pueden observar ciertos detalles en la muestrz Para la mayoria de las aplicaciones practicas, Ia re- solucién es determinada por la ecuacién i a AN jar + AN tsar donde d= distancia entre Tos puntos del detalle resuelto (en sm) longittd de onda de Ia luz usada (verde = 540 nm) AN = apertura numérica 0 seno de fa maitad del ngulo Fimitado or los rayos més periféricos que, partiendo de un punto cualquiera del objeto, penetran en el objetivo (0 condense dor) y contribuyen a la formacién de la imagen multiplicada por el fndice de refraccién del medio interpuesto entre el ob- Jetivo (0 condensador) y la muestra {COmo ejercen influencia directa sobre la resoluci6n la fongitud de onda y la apertura numérica? Las estruc- turas de la muestra refractan ta luz, El dingulo de refrac- cién es directamente proporcional a la longitud de onda ¢ inversamente proporcional al espaciamiento entre las estructuras. Segiin Emst Abbe, un espaciamiento es tructural dado sélo se resuelve cuando el sistema 6ptico de observacién (objetivo) puede ver una cierta cantidad de la luz refractada producida por el espaciamiento. A mayor. apertura del objetivo, mayor cantidad de lu re- fractada participa en la formacién de la imagen, con lo que se resuelven detalles menores y tas imagenes son mas nitidas, : Sin embargo, nuestra sencilla frmula demuestra que Ja apertura del condensador es tan importante co- mo la apertura del objetivo. Esto es l6gico si se consi- dera el dngulo de refraccién de un haz oblieuo 0 uno de mayor apertura. En esencia, este dangulo se mantic- ne constante, pero es presentado al objetivo de manera tal que es captado con facilidad. Cémo afecta el ajuste de la apertura al contraste (que no es mas que la diferencia de intensidades entre las dreas claras y oscuras de la muestra)? En teoria, lo més cercano a fa transferencia real de contraste entre la muestra y Ja imagen se obtiene por la interaccién Gnterferencia) entre los rayos no refractados y los te- fractados, Para la transferencia de contraste entre transmisién total y absorcién completa en una muestra, la relacion de intensidad entre la luz. refractada y la no refractada debe ser 1:1 con el fin de obtener una interferencia destructiva total (negro) o una interferencia constructi- va total (blanco). Cuando !a apertura del condensador es igual a la apertura del objetivo, la luz no refractada penetra en el objetivo con intensidad completa, pero Ta luz tefractada sdlo to hace en forma parcial, lo que produce disminucién del contraste. En otras palabras, al cerrar la apertura del condensador hasta los dos ter- cios de la apertura del objetivo se consigue una rela- cidn de intensidad entre la luz refractada y la no re- fractada cercana a 1:1, y en consecuencia, Se optimiza el contraste. Si se ciemra la apertura del condensador (0 se baja el condensador) y se pierde este equilibrio se producen fenémenos de interferencia 0 artificios de la imagen, tales como anillos de refraccién 0 Iineas que rodean las distintas estructuras de la muestra. La ma- yor parte de las técnicas microscépicas empleadas pa- 1a aumentar el contraste (p.ej., campo oscuro, ilumina- cién oblicua, contraste de fase, modulaci6n del con- traste) se basan en el mismo principio, es decir supri men o reducen la intensidad de la luz no refractada pa- ra mejorar un contraste de la muestra inherentemente bajo. Si se siguen los pasos descritos y se mantienen lim- pias las lentes, la calidad y fidelidad de las imagenes Observadas s6lo se modificarin de acuerdo con el ren- dimiento del sistema dptico.