e®, MINISTERIO DE SALUD DEL PERU oo INSTITUTO NACIONAL DE SALUD fy Organismo Publico Descentralizado de Sector Salud ~ Rik. 4. PROCEDIM PARA DIAG OSTICO DEL VIRU INMUNODE goenc! HUMANA Ih TIPO 1 Fac 1) P ~, NOFLUORESCENCIA | DIRECTASALUD ATICA -BIBLIOTEDE. ' HHH MANUAL DE PROCEDIMIENTO PARA DIAGNOSTICO DEL VIRUS | if ee ees NOFLUORESCENCIA INDIRSECTOR SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD gen N°, 0189-2001-T0Pa Its RESOLUCION JEFATURAL um [Q aeTUvsD au 200] Visto, el Oficio No. 056:2001-Comité EditoINS, cursado por el Presidente cel Comite Eztor y, CONSIDERANDO: Que, es objetivo del Insitulo Nacional de Salud, Organisme Publco Descentraizade det Iwinistero de Saud, contar can nomas que regulen 10s procesos para las accicnes técnico-sientifieas o adminiatratives, que permian mejorar los procacmiantos y optinizar los recursos de laInstituciéon: y, Que, {a Divsién de Viroiogie-Laboratorio de VIHi del Centro Nacional de Laboraterios en Salus PUbica na elaoorade el documento cel sistema de la calided denominaco “Manuel de Procedimientes pera Diagnéstice del Virus de le Inmuncdeficioncia Humana Tipo t (ViHi-1) por Inmunofiorasceneia Indrecta’, el mismo que Fa sida revisado por la Ofcina Ejecutiva de Racionalizacitn y el Comite Eeltor y, Estande a fo propuesto por el Comite Ealtory visacion de Ia Cricina General de Asesoria Juridica, de fa Ofecina Gereral de Asesoria Técrica y del Subjefe cel Insttuto Nacional 0 Salud y, En uso de las atbuclones establecidas en el Articulo 9° del Reglamento de COrganizacion y Funciones del Insttuto Nacional de Salud, aprotado por Resolucicn Ministerial N° 17-95-SN/10M; SE RESUELVE: Articulo 1° APROBAR y AUTORIZAR a impiesion del documento técnico-nermativa del Sistema de la calidad: MPR-CNLSP-003 derominado “Manual de Precedimientos para Diagnéstico de Virus de la Inmuncdefciencia Humana Tipo 1 (VIHA) por Inmuncfluorescencia Indirecta’- Serie de Nommas Técnicas N° 29, ef mismo que forma parte dela presente resolucién. Articule 2° REMITIR copia del presente documento a los érganos de line, apoyo, ‘asesoramenio contol, asi como a lee programas y/o proyectos 2 cargo de Ia Insttucién Registrese y comuniquese, Ahisate Mr DR.EDUAROO SALAZARLINES ugpruTo WAcoNALDESALYeonscl de rocodinoris pore Diagnistca del Vius def lemunodetclenca Humane ipo 1 (Hi) por ImmenafborescencieIndkects MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 4 (VIH-1) POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ELABORACION: ‘Ada Valverde Rojas Licenciaca en Tecnotogia Méaica Laboralorio en Enfermedades de Transmisin Sexvaly Chlamyalas Cento Nacionalde Laboratorios en Salud Putlica ‘nstuto Nacional de Salud Soledad Romero Ruiz ‘Meerodiologa Laboraiori en Enfermedades de Transnisidn Sexvaly Chlamyéias Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pabiica Instituto Nacionel de Saludansal de Procedniertos pare Disgnstco de! Vis de a munodsfisincie Humave ipo 1 (Vk) gor hmunoflonscanca intros Catalogacion hecha por el Centro de Documentacién del INS Valverde Rojas, Ada ‘Manual de procedimientos para diagnéstico del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) por inmunofuorescencia indirecta/ Elaborado por Ada Valverde Rojas y Soledad Romero Ruiz.~Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2001 32 p.— (Serie de Normas Técnicas; 29) 4, TECNICA DEL ANTICUERPO FLUORESCENTE INDIRECTA (diag 2. VIH-1/normas 3, MANUALES |. Valverde Rojas, Ada I. Romero Ruz, Soedad Ui, Instituto Nacional de Salud (Perd) IV, Peni Ministerio de Salud ISBN : 9972-857 - 12-3, Esta pubicacion fue reaizada gracias al apoyo finnciro de! ISSN: 1607 - «908 Proyecto «Enfrentando las Amenazas de las Enfermedades Hecho el cepésito legal: 1501052007-3199 Infecciosas Emergentes y Remergentes» (Convento de Co: Ministerio de Salud, 200% ‘operecion ene cl Ministero do Salud dol Peri y Agencia de x. Balavory cusdra 8 ein, Joss Maria, Lima, Pent tos Estados Unitos para el Desarolo intemacional, USAID). Tell. 431-0410 Istituto Nacional de Salud, 2001 4. Capac Yupanqui 1400, Jesus Naria, Lime 11, “elk. 471-9929, Fax 471-0178 © mail postmaster@ins sid pe Paina Web: wonuins.sid oe PR ~ CNS? - 033 rMonsal de Procainienlos pare Dignéstko de vius dele munocencenci Humana tipe 1 (VIE) por nmenofuorescencsIndecta CONTENIDO CONTENIDO 0 INTRODUCCION Nv VIRUS VH 1 SECCION 1 GENERALIDADES 2 14 OBJETIVO 2 12 CAMPO DE APLICACION 2 13 RESPONSABILIDADES 2 14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 2 SECCION 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 3 24 DISPOSICIONES 3 22 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 4 23 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL TRANSPORTE 5 SECCION 3 OBTENCION DE MUESTRAS 5 34 OBJETIVO 5 32 CAMPO DE APLICACION 5 34 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 5 34 PROCEDIMIENTO 6 3.6 OBTENCION DEL SUERO O PLASMA T SECCION 4 CONSERVACION, EMBALAJE, TRANSPORTE Y REMISION DE MUESTRAS. 7 44 CONSERVACION DE LA MUESTRA 1 42 EMBALAIE 1 43 REMISION 9 SECCION § ENSAYO 0 ANALISIS EN LABORATORIO 9 54 RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO 8 52 FUNDAMENTO DEL ENSAYO 10 53 EXAMEN DE LA NUESTRA 0 SECCION 6 DETERMINACION DE LA DILUCION OPTIMA DEL CONJUGADO ANTI ~ INMUNOGLOBULINA HUMANA PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTLVIH MEDIANTE IFI 1 61 OBJETIVO 1" 62 MATERIALES " MPR ~ ONUSP — 068 uw Insituto Nacional de SaludManual ds Procediienios para Diagnésteo det Vius de fa Inmuncdfclencia Humana tbo t (V+) por lamunatoresconiInvocts 63 PROCEDIMIENTO 12 64 INTERPRETACION DE RESULTADOS 12 65 PROBLEMAS EN LA DETERMINACION DE LA DILUCION OPTIMA 12 66 PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA 4 SECCION 7 TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFl) PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTVIH (IFEVIH) 18 7A PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO 15 72 ESQUEMA Y SIMBOLOGIA 15 73 FUNDAMENTO DE LA TECNICA 16 14 MATERIALES Y REACTIVOS 18 75 PROCEDIMIENTO 18 SECCION 8 PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS 19 at PORTAOBJETOS 19 82 CONJUGADOS 19 83 PREPARACION DE AZUL DE EVANS 19 84 PRECAUCION 20 85 PROCEDIMIENTO 20 86 ‘SOLUCION AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (PBS) 0,01M, pH 7,2-7.4 20 ar MEDIO DE MONTAJE 20 88 PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA DE IF 2 SECCION 9 BIBLIOGRAFIA 2B ANEXOA — GUIA TECNICA PARA RESOLVER PROBLEMAS. 5 ANEXOB — ACCIDENTES CON MATERIAL SOSPECHOSO DE CONTENER VIH a ANEXOC — FORMULARIO PARA EL ENVIO DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE VIHISIDA 29 ANEXOD — HOJA DE TRABAJO DE INMUNOFLUORESCENCIA ~ VIH 1 31 ANEXOE — SEROTECA DE VIH 2 ‘ANEXOF — FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE INFECCION POR VIH EN LA RED DE LABORATORIOS DE REFERENCIA NACIONAL 3 ANEXOG —ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE INFECCION POR VIH 4 Figura 1 Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) 1 Figura 2 Sistema basioo de embalaje triple 8 Figura 3 Esquema de aplicacién de la técnica 8 Figura 4 Esquema de lamina IFI ~ VIM -1 15 Figura 5 _Simbologia empleada en el procedimiento 15 wpR ~ CNLSP ~ 003 nm Incite Nocona de SaludManual de Pocedinionlos para Diagndstco del Vias de fe Innunodeeienca Humana to 1 (ViH-1) por Inmunatuarescenia ndvecte INTRODUCCION E! Instituto Nacional de Salud tene como funciones promover, programr, ejecutar y evaluar las investigaciones en salud y el desarrollo de tecnologias apropiadas, a través de la red de laboretorios a nivel nacional. Asimismo, biinca capacitacién y asesoramiento técnica a fin de fortalever la calidad del diagndstico de las enfermedades ‘ransmisibis, logrando establecer una homogeneidad en la metodologia empleada por los laboratorios para garantzar resuitados confables, reproducibles y oportunes, y asegurar la viglancia epidemiolégica y las acthi- dades de contol Desde la aparicién de! SIDA en el mundo en 1981, y luego del descubvimiento del VIM, se han venido desarrlian- do técnicas de diagndstico para las infecciones por VIH. En la actualidad se cuenta con técnicas de tamizae ‘como Dot Blot, Inmunocromatogratia, y ELISA; y para la confirmacién se emplean metodologias tales como Wester Biot (W.B), Innunofucrescencia Indirecta (IFI), Radio inmunoprecipitacién (RIPA), y Reaccién en cade- nna de la polimerasa (PCR), cuya aplicacién es limitada en paises en desarrollo debido a que las pruebas de tamizaje no estén libres de resultados falsos positivos (su nivel de especifcidad no alcanza el (100%), siendo necesaria la realizaciOn de pruebas confirmatorias como W.B @ IFI, que se caracterizan por una elevada sensi- bilided y especifcidad ‘Actualmenie en el Peri, los laboretorios utlizen la técnica del W.B como herramienta confirmatoria de infeccion Por VIH. Sin embargo, el allo costo hace cada vez més dificil su utlizacién como técnica rutinaria de confirma- ion. Una técnica de sensibildad y especiicidad equivalerte al W.B, es la prueba de IFI, allernativa recomenda- da por la OMS, y que offece la. ventaja adicional de ser mas economica que las otras pruebas confimatovias. En 1994, el Laboratorio de Referencia de VH/SIDA del Instituto Nacional de Salud partcipé en el proyecto Latinoamericano IFLVIH OMS-OPS y, dasde 1995 hasta 1997 se realiz6 la confirmacién de infeccién por VI con iminas producidas por Chile y Argentina para 13 paises latinoamericanos con el auspicio de OPSIOMS. En 1998 se desarrollé en el Insituto Nacional de Salud el proyecto “CULTIVO DE LINFOCITOS PARA LA PRO- DUCCION DE LAMINAS [FI PARA EL DIAGNOSTICO DE VIH"; come resultado de este proyecto se cuenta con luna produccién de léminas, las que han sido validadas, en et Programa de Proficiencia, del CDC - Atlanta Ademds se ha logrado establecer y estandarizar una técnica IFI-VIH de alta sensibilidad, especifcidad y bajo costo. Este Manual representa un esfuerzo para dfundir el diagnéstico confirmatorio de la infeccién por VIH-1 mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IF) a fin de contar con personal de laboratorio debidamente capacitado en IFI-VIH-1 en los estatlecimientos de salud integrantes de la red nacional de laboratorios en el Pent y los laboratorios de ESSALUD, Fuerzas Amadlas, Policia Nacional y Clinicas privadas [NPR ~ CNLSP ~ 003 w Insitute Nasional de Saludanual de Procednlertos pare Dagnitco dol Wius de a amunodeficuncia Humen tipo 1 (VHt) gor nmunefuorscenct Indrocta VIRUS VIH Los virus VH (VIH-1 y VIH-2) son retrovirus de acido ibonucleico (ARN) con envotura, y en general infectan primariamente las céluias blancas de la sengre humana (linfocitos). Se les llama retrovirus porque tienen la pafticularidad de integrar su material genétioo (ARN del genoma) en el ADN celular del huésped (conteniendo ahora el genoma viral) albergando al provirus VIH. El virion del VIH es esférico, de aproximadamente 100 nandmettos de didmetro, su aperiencia extema es la de Un bain de futbol, con una envoltura formada por pentdgonos. En su interior se encuentra la nucleoproteina organizada en una estructura cénica. El virén tene una envoltura de naturaleza lipoproteica y asociada a ella un ‘componente de gucoproteina de paso molecular 160 000 (Gp 160), esta lucoproteina se desdobla en una de 420 000 (Gp 120), la cual correspone al componente que permite al virién adherirse al recepior de la célula hhuésped: el otro componente de peso molecular 41 000 (Gp 41) es una proteina estructura, especitca del virus VIH, al interior se encuentran los liamados antigenos de grupo (GAG), que corresponden a proteinas de peso molecular 17 000 (P17) y 24 000 (P24). En el interior del nicleo se encuentran dos moléculas de ARN y un Componente enzimatico la palimerasa (POL), como la Transctiptasa reversa (P66) y la integrasa o endonuclease (P51 y P31), Todas estas proteinas estructurales son parte del virion y son requeridas para su replicacion, También exsten proteinas no estructurales TAT, REY, VIF, VPR, NEF, VPU, que estén presentes s0 en veluias infectadas. Generalmente estos componentes son responsables de modificar la expresion de las proteinas virales y de la replicaciin del virus, por lo tanto pueden tembién goberar la capacidad infecziosa del virus. Polmerasap 68 pst pat p24 pir Figura 1. Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH}) NPR ~ GNLSP - 003 1 Insts Nasional do Salud1 1.2 13 134 1.32 1.33 134 14 144 Manual de Procedmientos paw Diagréstco del Vius de fa Inmunodefiensa Humana tio 4 (VIK-f} par InnunotucrescenciaInivecta DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 4 (VIH-1) POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA SECCION 1 GENERALIDADES OBJETIVO Establecer las disposiciones que se deben cumplir para realizar el diagnéstico del virus de la inmunedeficiencia humana Tipo 4 (VIH) utlizando el método de inmunoftucrescencia indiocta (FI), CAMPO DE APLICACION Se apc en laboratories de establecimientos de salud que cuenten con personal califcado, instalaciones, equipos y materiales idéneos para llevar a cabo e! diaandstico del VIH a partir de muestras obienidas de paciertes hospitaizados y ambulatorios. RESPONSABILIDADES Los Direciores o Jefes de Departamento o Seccién de un esteblecimiento de salud que realiza el slagndstico del VIH, son responsables de supervisar el cumplmiento de las disposiciones conte- rides en el presente Manual. Los Jeles de Laboratorio son responsables de mantener la competencia técnica do su personal, la idonsidad y confiabilidad de sus equipos, materiales, sustancias, recectivos e instalaciones. ‘Ademés, deben verificar la caldad de los resultados y supervisar el cumplimiento de las Buenas Practicas de Laboratorio y las Medidas de Bioseguridad Los profesionales designados para realizar e! diagnOstico son responsables de controlar el cum- plimiento de las disposiciones contenidas en el presente Manual, mantener la confidencialidad de sus actividades e informar a su jetatura inmediata superior en caso de ocurrencia de desviacio- nes de las especificaciones de los procedimientos establecidos. El personal asignado a les procesos descritos en el presente Manual debe conocer, estar califica- do en las técnicas y méiodos de ensayo, aplicar las medidas de Bioseguridad y de las Buenas Précticas de Laboratorio, y mentener la confidencialidad de las actividades que realiza, DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud - MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA LA O8- TENCION Y ENVIO DE MUESTRAS (I). Serie de Nomas Técnicas N° 15, Diciembre de 1997, MPR ~ CNLSP 093 2 Insite Nacional de SalManual de Procetiients para Diagndsico det Vius dla Inmunodefona Humana ipo 1 (ViH-1) por InmunofuorescencieIndrete 142 143 24 212 213 2134 243.2 21.33 2134 24.35 244 245 216 247 Instituto Nacional de Salud - MANUAL DE NORMAS DE BIOSEGURIDAD. Serie de Normas Téo- nicas N° 18. Diciembre de 1997. PR.T-CNLSP-001. ENVIO DE MUESTRAS BIOLOGICAS EN LA RED NACIONAL DE LABORATO- RIOS DE REFERENCIA EN SALUD PUBLICA. SECCION 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD DISPOSICIONES Las disposiciones contenidas en el Manual de Normas de Bioseguridad, Serie de Normas Técni- cas N° 18, son aplicables para el cumplimiento de las disposiciones del presente Manual. Para establecer niveles de bioseguridad aceptables dentro del laboratori, se recomienda mane- jar todas las muestras de sangre, suero o plasma como material potencialmente infectante, es decir, capaz de transmitir agentes patogenos. Se deben aplicar las medidas de bioseguridad pertinentes especialmente las aplicables a: El ambiente, El personal, Elvestido, Las muestras y su procesamiento , y La esterilizacién terminal La bicsegurdad es un conjunto de medidas preventivas de senido comin para proteger la salud y la seguriad del personal que rabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesges producidos por agentes. Es responsabilidad de la direccién del laboratoria establecer una organizacién para garantizar la seguridad en todas las reas del mismo mediante la aplicacion de normas y procedimientos de seguridad, claramente detalladas por escrito. Se puede optar por una estructura de personal con dedicacion exclusiva a las tareas de seguridad, o bien, asignar parte del tiempo de trabajo del personal de laboratorio a estas tareas, La administracién del establecimiento de salud debe dar las faciidades para que las normas de bioseguridad se cumpian. El VIH ha sido aislado en sangre, semen, salva, lagrimas, leche matema, liquido cefaloraquideo, \omritos, orina, secreciones cervicales,liquido amnidtico y tejidos de personas infectadas. A) obte- net y procesar cualquier tipo de muestra en el laboratorio se deben tomar las precauciones MPR ~ CNLS® - 003 3 Inetiuta Nacional de Saud‘anual de Pocediionts para Disgdstice del Vius do la Innunsdelcienle Humara tbo | (V1) por Itmurofunrsconea indrcte universales, ya que no podriamos identicar de manera confiable mediante la historia clinica los individuos infectados por VIM. 248 Los principales peligros son las exposisiones por puntura accidental con una aguia, por cortes ‘con equipo coniaminado, por exposiciin de las membranas mucosas 0 de la plel cortada a ‘material contaminado, laceraciones, nerides, rasgunos. Todo el equivo y material de laboratorio deberian ser usadcs como si estuvieran contaminadas, incluidos los articulos de escritorio (ro llevarse pices, lapiceros y plumones a la boca). 22 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 22.4 ‘Tedas les muestras deben ser tratadas coro altamente infecciosas para evitar el posible contagio.. 222 El ingreso al laboratorio debe estar resting, 223 Debe utiizarse siempre guardapolvo o mangilones de leboratorio en la zona de trabajo. 224 El guaidapolvo no debe salir de la zona del Iaboraori, salvo para envialo a lavar 225 No pipetear con fa boca. 226 Esta prohibido comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosméticos en el laboratorio. 227 El cabello largo debe usarse recogdo y cubierto, 228 Lavarse las manos luego de quitarse los guantes y antes de salir de! laboratorio. 229 Utiizar proteccién para los ojos cuando el procedimiento genere goias 0 aerosoles, 2240 Utiizar siempre guantos estelizados y mascarilas. 22.11 Las cortaduras 0 rasguiios en las manos y brazos deben cubrise y protegerse bien. 2242 Deben uilizarse zapatos protectores que cubran completamente los pies (no usar sandalias © 2ape- tos abiertos) 22.13, El procesamiento de las muestras debe realzarse sobre una superficie de trabejo orotegida (papel absorbente plastifcado 0 papel de filtro). 22.14 Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas por el operador antes y después de cada aciividad. 22.45 Los reacives deben estar bien etiquetados, y ser almacenados en viales de plstico con tapa rasca. NPR CNLSP - 003 4 Insti Nasional de SeiadManual de Procedinienos para Diagéstco del Vius de fe nmunodeficencia Humara tpa 1 (VK) por Inmunofuorescenca inaiosta 22.16 22.47 22.48 22.19 22.20 2221 22.22 23 234 232 233 34 32 33 334 ‘Todos los laboratorios deben tener a su disposicién un equipo de primeros auxiis. Informar inmediatamente cualquiar accidente al jefe del laboratorio. ‘Se debe disponer de un lugar para el lavado de ojos en caso de exposicién accidental a salpicaduras. ‘Todos los deshechos del laboratorio deben descontaminarse adecuadamente antes de eliminarlos, en soluciin desinfectante y ser autoclavados a 121°C durante 20 minutos o incinerarse. E material infeccioso debe ser facilmente identificado como tal y ser esterlizado lo antes posible, Si se trabaja con culivo de linfocitos o técnicas molecuiares, utilizar una cabina de fujo laminar tipo 3, ‘Se debe limpiar a diario los pisos con un trapeador limpio y solucién desinfectante. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL TRANSPORTE El envio y transporte de las muestras que no han sido cuidadosamente embaladas, genera riesgos de infaccion para toda la gente que esté directamente en contacto con cualquier parte de} prove- 89. EI manejo descuidado y negligente de las muestras pone en peligro no sélo al personal del laboratorio, sino también al personal administrativo y personal de apoyo. El trénsito de las muestras de un lugar a otro genera un riesgo tanto para el pblico como para el personal del medio de transporte, sea este por via aérea o terrestre. SECCION 3 OBTENCION DE MUESTRAS OBJETIVO Establecer y uniformizar el procedimiento de obtencién de muestras de sangre para realizar el diagnéstico del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH -1). CAMPO DE APLICACION CComprende la obtencién de muestas de sangre inravenosa de pacientes ambultorios u hospitalzados. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Jeringas descartables de 10 mL o tubos al vacio de 10 mL, con o sin anticoagulante. [MPR — CNLS® ~ 008 Inti Nacional de SalutManual de Procedimientos para Ciagnésico del Vius de fa inmunodefiienca Humana tipo 1 (VIK-1) por Innunotuorescencia Indirect 3.3.2 Agujas N° 20, N° 21 6 N° 22, 33.3 Tubos estérles 100 x 13, con tapa de caucho o tapa resca. 334 Compresas y torundas 338 ‘loohol de 70%. 3.36 Bandas 0 tubos flexibles de latex (igadura), 337 Centrifuga. | 3.38 Recipientes de paredes rigidas. | 34 PROCEDIMIENTO 344 Vestir con mandil y guantes. 342 Escoger una vena adeouada para la puncién y extraccid 3.43 Limpar la zona elega con una torunda de alyodén humedecida con aeotol de 70% 3.44 Dejar secar, 3.45 Colocar ol terniquete, heciendo un nudo corredizo por encima del punto escogido para la puncién ¢ indicar al paciente que abra y ciere la mano enérgicamente varias veces, hasta que le vera se encuentre inguigitade, y luego que mantenga la mano cerrada. 3.46 Sin tocar con e| dedo la vena escogida extraer de 5 mL a 10 ml. de sangre. 347 Retirar la aguja de la vena escogida y colocar una torunda de algadén en el punto de puncién, indicando al paciente la flexién del brazo, 348 En la jeringa utlizada retirar la aguja con una pinza. No reinsertar el capuchén y colocar la aguja fen un recipiente de paredes rigidas y de boca ancha que contengan una solucién de hipoclorto de sodo de 3 2 5% para la elminacién de agujas. 349 ‘Abrir el tubo esterlizado y depositar la sangre, heciéndola resbelar lentamente por las paredes. Taparlo inmediatamente, 3410 Si el tubo tiene anticoagulante, mezclar suavemente con la sangre depositada. 3441 Rotular cen una etiqueta donde conste un cédigo que comesponderd a los dalos de la soliitud del pedido, 3.412 Para extraer suero por centifugacién, dejar reposar el tubo incinado unos 30 minutos para permi- ti la formacién de! codgulo. MER ~ CNLSP ~ 003 6 Iesttta Nacional de Sale34.13 35° 35.1 352 353 354 a4 412 443 42 424 4.22 4.23 424 Manusi de Poceslmonts par Disgndice dl Vite de ly Inmunadatienia Hunara tpo 1 (VH-1) por Innurfunrescancia deta Para extraer plasma, centrifugar inmediatamente el tubo con la muestra. OBTENCION DEL SUERO O PLASMA Colocar el tubo con la muestra de sangre debidamente rotulado en la centrifuga, y equlibrar la misma con igual peso. CCentifugar durante 5 minutos @ una velocidad entre 1 500 rp.m. 22.500 rp.m. Trasvasar los sueros a tubos plésticos estériles con tapa rosca utlizando una pipeta Pasteur, micropipetas o pipetas serolégicas descattatles. Rotular debidamente fos tubos con plumén indelatle o lapiz de grafto, idenificandolos cuidaco- ‘samente con el nimero correlativo y verificando que oaincidan con el nimero de ficha que acom- pafian las muestras. SECCION 4 CONSERVACION, EMBALAJE, TRANSPORTE Y REMISION DE MUESTRAS CONSERVACION DE LA MUESTRA S'la ojeoucién de la prueba se programa antes del término de una semana, conservar las mues- tras de suero o plasma entre 2°C a 8°C (refigeracién). Antes de la prueba, se debe esperar 30 minutos para que las muestras alcancen la temperatura ambiente del laboretorio. ila ejecucion de la prueba se programa después de una semana, congelar las muestras @ ~20 “C. En este caso, las muestras congeladas se deben descongelar totalmente, homogenizar y centifugar antes de realzar el ensayo. Evitar congelaciones y descongelaciones repatidas, ya que el tito de anticuerpos aisminuye por ese procedimiento. Las muestras no daben ser sometidas a congelacion y descongelacion mas de una o dos veces. EMBALAJE Los contenedores individuales de las muestras deben ser resistentes a fisuras, gopes y rupturas, y ddeben tener tapa de rosca. Sus tapas deben estar selladas con cinta de seguridad, deben estar envuelias en papel tealla 0 ‘material absorbente ¢ introducides preferentemente en ung funda plastica resistente. La musstia asi envualta debe ser colocada en olro envase metalico o de pléstico, igualmente resistente a las fisuras y rupturas. Colocar suficienie material absortente a su alrededor para que resista y amortigtie los golpes. Este segundo envase debe empacarse con suficiente seguridad, para protegerlo contra dafios MPR - CHLSP — 008 1 Inttte Nocond de SatiManuel de Procedinients pars Diagnésico del Vies fa Innunoderclenca Humana tgo 1 (ViH-1) po Innunafunressecia rete fisicos y agua. Se coloca en un paquete de envio que lo protege de los elementos extemos, tales ‘como dafio fisico mientras se encuentra en trénsito (Véase Figura. 2), 425 Después de cerraras, mpiar por fuera oon un desinfectante con una conceriracién de solucién de claro al 0,1% (1 g/ L), y luego secarlas completamente 426 Alrecibiry antes de abrir los envases, esios deben limpiarse can solucién de claro, y luego eolocar- se en gradilas de metal plastico resistentes a fisuras, Recipiente primario ‘con el material Material absorbente Figura 2. Sistema bdsico de triple embalaje MeR ~ cus? - 008 8 Insite Nacional de SalisManual de Precedienios para Diagnéstco del Vius de ia Innunodefiencis Humane fpo t (Vi) por nmunefuorescencie Insecta 43 434 432 433 434 435 BA 514 512 513 REMISION Las muestras no deben enviarse, si antes no se han hecho los arreglos entre el servicio de trans- porte y la persona que ha de recibir, indicando la fecha de envio, e! nimero de guia, el tinerario, y el ndmero de vuelo, Debe elegirse el itinerario més directo, con el menor numero de transbordos y esperas de transit. ‘Se procuraré que el envio no llegue sabado, domingo o dias feriados. Todas les muestras deben enviarse rotuladas, indicando el cédigo del paciente, la fecha de la toma de muestra escrito con lapiz en la cinta adhesiva o esparadrapo. No se debe emplearse tinta ni cinta de papel, pues son vulnerables @ la humedad. Esta informacion deberd protegerse de todo, dafo humedad y debera colocarse en la parte exterior de la caja de embataje protegida, prefe- riblemente, por una envoltura plastica, Si el trinsito va a demorar mas de 2 horas deben enviarse en una caja térmica con refrigerante. La caja debe poseer exteriormente flechas y una leyenda acerca de la posicién en que debe ‘manejarse, y con las indicaciones de "URGENTE, FRAGIL, MATERIAL MEDICO, MANTENGA- ‘SE FRIO, POSICION VERTICAL, ENTREGA INMEDIATA, TELEFONO Y DIRECCION DEL DES- TINATARIO. NO ABRIR SIN AUTORIZACION, MATERIAL CONTAMINANTE, PELIGROSO" SECCION 5 ENSAYO 0 ANALISIS EN LABORATORIO RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO El VIH-1 es el agente causal del sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Datos actuales indican que el virus del SIDA se transmite a través del contacto sexual, de la exposicion a sangre (incluyendo compartir jeringas y agujas contaminadas) y otros fluidos contaminados. El kit IFLVIH- 1 esta diseftado para detectar la presencia de anticuerpos especificos para VIH-1 Este ensayo emplea como fuente de antigeno viral las proteinas de VIH-1 expresadas en células T infectadas crénicamente. Las células linfoblastoideas de origen humano (H9-HTLV IIIB que son células infectadas y K-562 que son células de control), son fijadas a la superficie de un portaobjeto de vidrio| para inmunofluorescencia. Cuando una muestra de suero o plasma con anticuerpos para VIH-1 entra en contacto con los antigenos de VIH-1 presentes en el citoplasma y la membrana de las oélulas infectadas, se produce el reconacimiento de los antigenos virales por los anticuerpos de la mues- tra, generandose un complejo antigeno-anticuerpo. Este complejo es detectado mediante una segunda incubacién con anti-gamma-globulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceina, la que reconoce los anticuerpos humanos y fluoresce cuando se expone a la luz ultravileta (LUV), MPR - CNLSP — 03 ° Insti Nasional do SaludMana de Procedimientos para Ciagndstco del Vitus de la inmunodefiienca Humana tipo 4 (VIk-t) por Inmunctuoescence Indecta 5.14 La intensidad y ubicacién de la fluorescencia en las células infectadas y no infectadas evaluadas comparativamente son los cfiterios daterminantes para establecer la presencia 0 ausencia de antcuerpos virales. 515 ‘Algunos indlviduos infectados con VIH+2 pueden presentar anticuerpos que reconocen y se unen a los antigenos presentes en los pocilos de células infectadas de IFI-VIH-1, Esto susede porque algunos entigenos presentzn epitopes similares en ambos vius. Este kil de IF-VIH-1 estd disefado para identiicar exclusivamente infecciones por VIH-1 52 FUNDAMENTO DEL ENSAYO 524 El ensayo de IFI para la deteccién de anticuerpos ant-VIH-1 se basa en la unién de los anticuerpos especificos a los antigenos de ViH=1 (HTLV III-B) expresados en la superficie y cltoplasma de ‘élulas linfoblastoideas T numanas fijadas a un portadbjeto. Las células no infectedas cue no expresan antigeno de VIH-{ sirven como contrdl para cada muestra, Las léminas son procesadas para bloquear cualquier actividad viral en las células infectadas mediante la desesacion al ate 0 or fjacién con acetona, a cual ejerce un efecto deshidratante por evaporacién y ala ver disuelve los componentes lipicicos del virus. Este proceso de inactivacién permite también la fiacién de las célUlas infeciadas y no infectadas a sus respectivos pocilos, a saber: las células infectadas en los pocilos superiors y las no infectadas en los pocilos inferiores. 5.22 Para realizar el ensayo se incuba una muestra de suero o piasma diluido en los pocillos superiores € inferiores (con células infectadas y céluas no infectadas como control de la reaccion, respecti- varrente) a 37°C por 30 minutos. Si la muestra presenta anticuerpos contra el VIH-1, éstos se unen a los antigenos virales presentes en el citoplasma y la membrana de las células infectadas, El Tiaterial no unido a los antigenos es removido mediante sucasivos lavadlos. Posteriormente, se afiade un antisueto antgamma-globulina humana conjigado con isotiocianato de fluoresceina (FITC) a las células infectadas y ro infectadas del portaobjeto y nuevamente se incuban 37°C. El ‘material no unido es eliminado mediante lavado, Finalmente, se prooede a preparar la lémina para su observacion en un microscoplo con luz utravioleta. 523 Si se encuentran presentes los anticuerpos en el suero estudiado apareceré una fluorescencia caracterisica de localizacién especifica y visible con luz ultravioleta. La interpretacién de la lectura se establece comparando la fluorescencia observada en las células infectadas y no infectadas para cada muestra. 53 EXAMEN DE LA MUESTRA 534 Examinar la muestra cuidadosamente para observar si hay contaminacién microbiana, hemélsis grosera, lipemia o si el plasma esta gelficado antes de realizar el ensayo, ya que estos factores pueden interferir negativamente en el procesamiento 0 la interpretacién de resultados. 532 De ser ests el caso, debe obtenerse - on lo posiblo - una nueva muestra que retina las condiciones indicadas. Cuando sea neceserio se debe retirar el material particulado por medio de una breve centifugacién previa al ensayo MPR ~ CNLSP ~ 003 10 lrsteo Nacinal de Salud‘Manual de Procedimintes para Diagndsico del Vira do fe Innunedeiencia Hunana tho 1 (ViH-1) por Inmunofressenia Indirect SECCION 6 DETERMINACION DE LA DILUCION OPTIMA DEL CONJUGADO ANTI-NNUNOGLOBULINA HUMANA 641 62 62.1 622 623 624 625 626 627 628 6.29 6.2.40 2.41 6.2.12 6.2.13 6214 6.2.15 6.246 6.2417 6.218 62.181 6.2482 62.183 6.2184 PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTIVIH MEDIANTE IFI OBJETIVO Determinar experimentalmente la dilucin Optima de trabajo. Nota: El Kit IFF-VIH indica la diucion ideal del conjugedo provisto. MATERIALES Suero humano, positivo para VIH con un titulo (punto final) de anicuerpos determinado median- tela prueba de IF Portzobjetos, con 12 pocilos. Los 6 pocillos superiores, con 20% de célules de cultvo infectadas H9-HTLY IIKB y 70% de oéluas no infectadas; y en los 6 pocilos inferiores, con 100% de células no infectadas como contol. ‘Suero de Cabra anti-lyG humano conjugado con fluorescein, Fragmento F(AB)2 molécula ‘completa Cappell, caidlogo No 55201 (01180). PBS: solucién amortiquadora de fostatos, pH 7,2- 7,4. ‘Solucién de contraste: Solucién de Azul de Evans 100X. Medio de montaj: Giizerina al 90% en PBS @ partes de glcerol +1 parte de PBS). Cubre objetos de 60 mm x 22 mm. Micropipetas de O ul a 20 UL. Tubes para dilucién. Kopin Incubador de 37°C. Fosfato de sodio monobasico monohidratado, Fostato de sodio dibésico antidro, Cloruro de sodio, para la preparacion de PBS. Camara himeda. Rela) ‘Agua destlada, Centrifuge, ‘Microscopio de Inmunotluorescencia. Kit IFI-VIK-1 para‘60 determinaciones: Frotis ce IFI-VIH 10 laminas Conjugado FITC 100 ul Azulde Evans 2mL Medio de montaje 5 mL MPR — CNLSP - 003 " Insite Nacional de Salih= Sa.uD DFIINA GENERAL OE FS1ADI°TICA E WEORMATICA- BOLIDTEA Manual de Procedientos paw Diagrdto del Vis de a Inmanodefiincia Humana ipo 1 WIE) nor MIN-STERIO DO. 6.2.18.5 Control nagativo 200 6.2.48.6 — Contral postive 200 L 6.2.18.7 —Cubre objetos 10 unidades 6.2.18.8 Gulia de Procedimientos 1 unidag 6.3 PROCEDIMIENTO 6.34 Retrar dos portaobjetos de estuche (2°C - &°C) 6.32 Secar los pertaobjetos @ temperatura ambiente (20°C - 30°C). 633 Diltir los sueros controles “/10 con PBS (pH 7,2 7.4). 6.34 Colocar 20 ul de los suercs diluidos en cada uno de los pocillos superiores e inferiores. 6.35 Incubar les poriaobjelos en una cémmara himeda a 37°C durante 30 minutos. 636 Enjuagar los portaobjetos en PBS rapidamente, descartar el PBS y repetir el lavado con PBS durante 5 minuios, usando un kepli 637 Dejar secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C) durante 8 10 minutos. 638 Tituiar ol conjugado anti-IgG humano mediante 5 dituciones desde 1/20 hasta 1/320, utiizando diuciones 1:2. En la Figura 3, se describe el esquema de aplicacién de la técnica, 6.39 ir solucin de azul de Evans 100X (1X dilucién fina). 6.3.10 Agregar 20 uL de cada dilucién del conjugado a cada pocilo superior e inferior del portaobjetos ‘correspondiente, 6.3.1 Incubar los portaobjetos en una cémara hémeda @ 37°C durante 30 rminutos. 6.3.12 _Lavar los portacbjetos con PBS por § minutos, descarlar el PBS, repetir el lavado con PBS durante 5 minutos, y enjuagar con agua destilada, 6.313 —_Dejar secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C ~ 30°C) durante 8 210 minutos. 6.314 Colocar el medio de montsje y fa laminilla cubreobjeto. 6.345 Leer en microscopio de IFI, con aumento de 40X. 64 INTERPRETACION DE RESULTADOS La dlucion Optima de! conjugado sera la mas alla dilucién cue revele la fluoresoencia mas brilan- te, con la més alta dticion dei suero positive, 65 PROBLEMAS EN LA DETERMINACION DE LA DILUCION OPTIMA 654 No se observa fuorescencia espectfica con el nuevo canjugado. Recomendacién: No usar conju- gado poco sensible, 652 No hay disminucién de fuorescancia con la més alta diucién del conjugado. Recomendacién: Titular ‘nuovamente el conjugado con diuciones més alas hasta que se cbserve una caida de la fuorescencia ‘MPR ~ CRSP ~ 005 Init Nacinal de Saudenue de Prececimentos pare Diaaréstco del Vius dela Inmunodelienia Humane tpo 1 (Vit) por Innuncurescend tnreta TITULACION DE CONJUGADO CONJUGADO 400uL 10uL = 100uL_— 100. uh 100 uL — 100uL_ 100 ut DESCARTAR ETT 4o0uL 100 ul_—S 100k 00 uk 100 uk 100 uh. PBS PBS Pas PBS PBS PBS ou 42 DILUCION DE TUBO 4N0 12 12 DILUCION FINAL DEL CONJUGADO 40 1120 140 1180 160 1/820 20 ul de Conjugado 1/10 4120 140 1180 1/160 1/320 ene ea ee cme Cl Ce ee ee Figura 3. Esquoma de aplicacién de la técnica. MPR - ON.SP 003 3 Insituo Necal de Salud66 66.1 6.6.2 6.6.3 66.4 665 6.6.6 6.6.7 668 6.6.9 6.6.10 batt 6.6.12 6.6.13 6.6.14 6.6.15 6.6.16 Menuet de Precedimientos para Diagnésico del Vius de fa Innunodefilerta Humane tio 1 (VIN) por Innundtuoresceci Ire PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA No utiizar el kit 0 alguro de sus componenies pasada la fecha de vencimiento, No intercambier reactives de distintos Kits ni tapas de los viales. Llevar el kit a temperatura ambiente (20°C - 30°C) antes de aplicar la técnica. Mantener el kit retigerato (2°C - 8°C) cuando no este en uso. Utiizar una técnica as6ptica (puntas o ips y viales estériles) al abrir y retirar materiales de los viales del kit, Eviter la contaminacién de los reactvos. No utlizer reactivos que estén turbios y revelen crecimiento microbiano, Cualguier elemento que conspire contra la transparencia de la imagen dard malos resultados y el porta objeto resultard dificultoso pare leer. Es indispensable utlzar una punta o tips para la micropipeta para cada muestta y contol La contaminacién del control negativo o de cualquier muestra con trazas de un suero positive pueden dar resultados falsos positivos. La contaminaciin del conjugado por cualquier muestra 0 control causara la neutralizacion parcial © completa y puece llevar a resultados falsos positives, No intercambiar las tapas de los viales para evitar la.contaminacién cruzada. Para elo, los viales han sido provistos con tapas.de distinto color. Coger los portaabjetos por su extremo translicido (rea para colocar el némero de orden). Al abrir el estuche pst, no presionar ni tocar los pocilos de las células, Utiizar agua destilada en la preparacién de los reactivos. No sacudir los portacbjetos para evitar la contaminacién cruzada entre los pocilos. Al dispensar la muestra, no tocar los pocilos ni rayar con la punta de la micropipeta. La prolongada observacién microscbpica de la muestra disminuye la fluorescencia. Tener cuida- Co de no exponer cada campo mas de 15-30 segundos, ‘Asegurar que el microscopio de inmunofluorescencia,filros y lampara, estén en épimas condi- dones. Para probar la lampara conviene usar diluciones del control positive periédicamente para constatar si se mantiene el mismo titulo. MPR - GNLS® 003 “ Insttlo Nacional de SaidMansal de Frocedinianos para Diagnéstco del Vius do a Irmurodeficincia Homan fp 1 (IH) por Inmunofvoesconca narecia SECCION 7 TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IF!) PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTI-VIH ((FI-VIH) 1A PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO Sien & suero del paciente existen anticuerpos VIH, estos se unirén al anligeno viral que esta en las células adheridas al portaobjeto. Este complejo es detectado mediante la adicon de anti- inmuncglobulina humana conjugada con fluoresceina, siendo esta reaccion observada me- ante microscopio de fuorescencia 12 ESQUEMA Y SIMBOLOGIA Figura 4, Esquema de lamina IFl - VIH - 1. Del 1-6: mezcla de células infectadas (H9_HTLV III-B) con células no infectadas (K562). Del 7 al 12 células no infectadas ( Pocillos control negativo).. SiMBOLOS . ‘Antigeno VIH ~ 4 > Antcuergo anti VIH ~ 1 Conjugado FITC s ug Figura 5. Simbologfa empleada en el procedimiento. MPR — CNLSP - 063 18 Instuto Nacional de Studanual Ye Procedinenios para Disgnéstco del Vius de fa lnmunodefcincs Humana Yoo 1 (ViK-1) gor hmunofborescencie Indredta 13 FUNDAMENTO DE LA TECNICA Las células humanas H9 expresando antigenos de VIH ~1 (HO HTLV Ill — B) esién firmemente adhericas a los pocilles 1 ~6 del portacbjeto. El antigeno esta fjado y permeabilizado ror acetona, Antigeno VIH - 4 Célula infecteda 7.34 ‘Se afiaden 20 mL de la muestra de suero diluida a un pocillo de células infectadas (1 - 6) y aun pocilo de célules no infectadas (7 ~ 12) y se incuba el portacbjeto a 37 °C. Si la muestra tiene anticuerpos contra el VIH - 1 se forma un complejo entigeno ~ anticuerpo sobre las células, infectadas. En,el pocilo de células no infectadas no haora unién de anticuerpos. Se retiran los anticuerpos no unidos durante los lavados. Aniicverpo —_Anticuerpos Muestra Ani VIH-1 —Agunidos diluida en unido al PBS Antigeno 73.2 Luego del proceso de lavado, se colocan 20 mL de una dilucién apropiada del conjugado anti IgG- humana con FITC a ambas tiletas de pocllos con células infectadas (1 - 6) y no infeciadas (7-12), se incuba a 37 °C. . Conjugado Anticuerpo Conjugado diluido en Anti VIH-1 FITC PBS unido al Antigeno MPR — CNLSP ~ 023 6 Inia Nacional de SalutMansa! do Procediniotos pare Dignisto ob Virus dela Iimunedeicenca Humana tipo 4 (VIK-1) por inmanofuorscence Indes 133 Si en la primera incubacion se unieron las entiouerpes especticos de la muestra al antigeno VIM ~ 1 entoncas en la segunda incubacion estos anticuerpos son a su vez acoplados con el conjugada FITC, formando una estructura de tipo ‘sandvich’. Los restos del corjugado son retrados por lava- dos Anticuerpo Conjugado Anti VIH 4 FITC unido al uurido al ‘antcuerpo anti Antigeno VIH-1 734 La unién del conjugado FITC al complejo antigeno - anticuerpo demuestra la presencia de anticuerpos en la muestra problema. La presencia de la estructura “sandwich” formada por: corjugado FITC / anticuerpo ant VI ~ 1 / antigeno VIH ~1 es detectada por la fuoresvencia ‘mitida por el fluorocromo (FITC) bajo la excitacién de la luz ultravioleta. Sino se observa ‘luorescencia es porque la muestra no contione anticuerpos. Luz Ultravioleta —— ws ws os Anieero, Cogan FTC ii VIH-1 —unido al antcuerpo unidoat anti VIH-1 uae Antigeno ' a PR ~ CNLSP ~ 003 7 Init Nacional de SaluéManual de Procesimentes ara Diggndstico del Vii cote Imunedefciencia Humana tpo 1 (VH-4) par imnurofusrescensaIndvcte 14 MATERIALES Y REACTIVOS 744 Paortaobjetos con 12 poxilos de células de cultvo (25% de oélulas infectadas Ho HTLV-II mez- cladas con 75% de células no infectacas; 30 000 células en total on cada uro de fs porilos). 742 ‘Suero Humano reactive ara VIH mediante la técnica de IFI (suero control positivo). 743 ‘Suero Human no reactive para VIH mediante la técnica de IFI (suero contol negatwvo}. 744 ‘Suero de Cabra ant-1gG humano conjugado oon fluoresceina Fragmento F(AB')2 molécula oom- pleta, 745 PES: solucién amorfguadora de fosfaios, pH 7,2 a 7,4 746 ‘Sdlucién de contraste: Solucidn de Azul de Evans 100X . TAT Medio de monigje: gicerina al 90% en PBS (9 partes de gicerol + 1 parte de PBS), 748 Laminillas cubreobjetos de 60 x 22 mm. 75 PROCEDINIENTO 754 Rotirar os porlaobjetos del congelador. Se requiere un portaabjeto (6 determinaciones) para 3 muestras problemas, 1 control PBS, 1 control negativo y 1 control postive, 752 Anotar en la hoja de trabajo, el orden de la ubicacién de cada muestra que se colocard en los posillos de los portaobjatos. 753 Secar los portzobjetes a temperatura ambiente (20°C - 30°C), durante § a 10 minutos, T5A Centritugar las muesiras durante 6 minutos a 1000 rpm, Cuidar de mover el sedimento y traba- jar con el sobrenadante. 785 Diluir las muestras centifugadas y los controles a 1:10 en PBS. 756 ‘Afiadir 20 ul. de control positive, contrel negativo y conttol PBS a cada uno de los pocilos indicados, utilizar un solo control pesitivo, control negativo y control PBS por corrda. 757 Colocar 20 ul de cada muesta dilvida tanto en el pocilo superior como en el inferior. En esta elapa tenga exiremo cuidado en no dafier las células fladas y no contaminar otros pocilos. 788 Incuber los portaobjetos en una camara hiimeda a 37°C durante 30 minutos. 759 Enjuagarios en PBS rpidamente, descariar el PBS y sumergir nuevamente en PBS durante 5 minutos con agitacién suave. Repeti el lavado por 5 minutos (se recomienda usar un Kopin), 7.5.40 Secar los portaabjatos a temperatura ambiente (20°C - 30°C) durante 5 a 10 minutos. NeR ~ CML — 008 ‘8 lnstito Nacona! de Sad75.11 7.5.12 7.5.13 75.14 75.15 75.16 82 824 822 823 624 825 a3 a3 83.14 83.1.2 Manual de Prosedimieatos para Ciagréstco del Vitus de la inmunodefionia Humana tpe 1 (ViK-) por inmunotuorescencaIreta Diluir ef corjugado anti-lgG humano a su dilucion Optima de trabajo, y afiadir la solucion de azul de Evans 100X (1X dlucion final). Ver Seccién 6. Agregar 20 ul. de conjugato diluido a todos los pocilos. Incabar los portacbjetos en una cémara himeda a 37°C durante 30 minutos. Enjuagarios en PBS rpidamente, descartar el PBS y sumergir nueramente en PES durante § minutos con agitacion suave. Repeti el lavado por 5 minutos (se recomienda usar un Kopin). Secar los portaobjetos a temperatura ambiente (20°C - 30°C), durante 5 a 10 minutos. Agregar 5 UL de medio de moniaje a cada pollo y colocar una laminilla cubreobjeto sebre el pottacbjeto. Leer en microscopio de inmuncfluorescencia. Los portaobjetos mentados se fue den mantener hasta 24 h a 4°C en la osourdad. ‘SECCION 8 PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS PORTAOBJETOS, Se deben almacener congelades preferentemente 2 -70°C, de no ser posible a -20°C. Se reco- mienda no utilzar los portaobjeios con mas de 12 meses de antigiiedad. CONJUGADO La conservacién ptima es 2 4° No se debe usar conjugados con fecha de vencimiento expirada, Se recomienda fraccionar ol conjugado en alicuotas (ej. 100 mL) para evitar que la solucién stock de conjugado sutra cambios de temperatura excesivos, al sacarlo del refigerador y trabajar con él Utlizar siempre tips estérles con el conjugado para evitar cualquier tipo de contaminacién que lo deterore itreversiblemente. Elminar el sobrante de conjugedo diuido en PBS uilizado en la técnica de IF-VIH PREPARACION DE AZUL DE EVANS Férmula soludién stock Azul de Evans 100X: Auldeévans 10, ‘Agua destiada 100 mL. MPR -CNISP - 03 19 Insta Nocona de Salud‘Manuel de Procediminto pare Dagndsico dl Vins 6 ls Inmunedterca Humana to 1 (VH-t) por Innunofucrescencia hndkecta 84 PRECAUCION 844 Este colorant es mutayénico y cancerigeno, por lo que al peser el polvo s2 debe usar guantes y mascarita. El procedimiento deberta realizarse en una campana. | | | 85 PROCEDINIENTO | 85.1 Ditirel Azul de Evans en el agua destiada hasta su completa disolucién 852 Guardarla solic en un fraseo oscuro, etqueténdolo como Azul de Evans 100K. | | Nota: E1Azude Evans ode olconugad como cobrante de contrat pare reduc afrescercianespesica | © transordo, Sorooomionda mantener esto real reigerado. La solucin cneentada se puede mantener hasia 2mocee en efgercin | . | 86 ‘SOLUGION AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (PBS) 0,01M, pli 7,2 - 74 | 86.1 Formula | Naci 5g. Na,HPO, 17g. NaH PO,H,0 2239. ‘Agua destlaca 10L. 85.2 —_Preparacién 85.21 Pesarlos reacives y cclocaros en un fresco 0 matrez volumétrico de 2 L. 8.6.22 Agregar agua desieda hasta completar los 2 L. 8623 Disoler completamente. 86.24 —Colocar ta solucién en un recipente de 10 L y completar hasta el volumen final de 10 L, agregando agua destilada; mezclar vigorosamente. 86.25 Tomar una alicuota y medir el pH que debe estar dentro del rango 7,-7.4 86.26 Se recomionde guardar el PES en ol rffigerador a 4°C. Estabilidad 6 meses. 81 MEDIO DE MONTAJE Br Formula Tris base 0,4M: Tris(hidroximetil-aminometano «4,8 Agua destlada 100 ml. | | WeR- CALSP - 008 0 to Nadia de Sad eeManual de Procedniantes pare Diaqéstice del Vis de le Inqunedefciescia Hunan tipo + (VH-A) por Innunafusrescencia lnc 87.2 8724 87.2.2 87.23 87.3 873.4 87.3.2 873.3 HCI 0,2N: HCI concentrado 1.6 mL. Agua destiada 400 mL. Preparacion Para 10 mL. de Tris base 0,4M, adicionar HCI 0,2N hasta aleanzar un pH 8,6. Adicionar 10 mL de esta mezcla 2 90 mL de glicercl Controlar el pH. No usar glcerol envejecido e hidralizado porque acidifica el medio de montaje. Interpretacién de Resultados El suero control positive deberé presentar uorescancia en el 30% de las células con el gatrin tipico para este entigeno. El suero cortrol negative y el control de PBS no deberin prasentar fluorescencia. Reaccién Positiva: Esta debera presentar fluoresoencia tipica de membrana en el numero correcto de oéluias segtn lo determinado por el control positivo. Les sueros positvos con bgjo tituo de anticuerpos pueden dar una reaccién mas tenue aunque fipica en un porcentaje menor de o2lulas infectatas, Reaccion Negativa: Esta deberd presentar ausencia de fluorescencia, MPR - CHLSP ~ 003 2 lnsitito Nacional de SadMental de Proceinirtos pare Diagnistio de ar34 88 8841 88.11 882 88.2.1 883 883.1 Nota: MIN'STERIO DE §aLUD OFIcINA GENERAL DE EStADieTiCA E INFORMATICA -BIELIOTECA Vis la Inmundeicenea Pamana tipo T (VIF) por hme Reacci6n Inespecifica: Esta presenta igual fluorescencia en las células infectadas y no intecta- as que impide la interpretacion correcta PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA DE IFI EI suero control positivo no presenta fluorescencia, Acciones Correctivas: Buscar la presencia de antigeno en otros sueros positives. Revisar la identficacién y dilucién del suero control utiizado Ensayar el conjugado anli-humano con antigeno y suero control distnto, Repotir la prueba. El suero control negativo presenta fluorescencia. ‘Acciones Correctivas: ‘Analzar la fluoresoencia observada en el control negativo, comparandola con la detectada con 1 control positvo. No usar el conjugado si la fluorescencia en el control negativo es similar a la observada con el antigeno en el control positv. No usar el conjugado si se detecta fuorescencia con algtin contaminante en las osiulas con el antigeno, por ejemplo: micoplasmas, bacteries, levaduras, etc EI suero muestra presenta fluorescencia inespectfica, Acciones Correctivas: Diluir la muestra a 1:100 (duct firal) y volver a realizar la prueba. Si en este caso se observa fluorescencia especifica en el 30% de la células, se puede diagnosticar como postiv. En el Anexo A so precenta una Guia para resolver problemas en la Fluoresconcie de las muestras. MPR ~ CNLSP 03, 2 Into Nacional de SaManvel de Procediienios pare Dagréstco del Vius de fa munodefcncia Humane ipo 1 (ViH-) por hmunotorescenie Indreta oA 92 93 94 95 96 a7 98 99 9.10 att 9.12 9.13 ota SECCION 9 BIBLIOGRAFIA ‘Ascher MS, Wilber JC. Inmunofluorescence for diagnosis of retrovirus infection. Arch Pathol Lab Med 1990; 114: 246-248. Constantine NT, Farag NM, Watts DM. Evaluations of a synthetic peptide-based assay and @ repid dot-blot recombinant test for the detection of antibodes to HIV-1 and HIN2. J Egypt Pub Health Assoc 1990; 115: 1-10. Fields D M, Howley PM. Fields Virology. Third Edition. Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, 1996. OMS. Guia para el transporte Seguro de Sustancias Infecciosas y Especimenes Diagnésticos. Division para la Vigilancia y el control de Enfermedades Emergentes y otras Enfermedades Trens- misibles. Ginebra, 1997. Guillén A, Beltran M, Quispe N, Valverde A, Zavaleta A. Manual de Nomes de Bioseguridad. Instituto Nacional de Salud. 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GUIA TECNICA PARA RESOLVER PROBLEMAS 1 PROBLEMA: EL CONTROL POSITIVO NO REACCIONA CON LAS CELULAS INFECTADAS CAUSA PROBABLE SOLUCION Uso de suero equivocado Repetir la prueba con el suero correcto Dilucién de suero incorrecta Corregir fa ditucion del suero Conjugado diluldo incorrectamente Corregir fa dilucién del conjugado Deterioro del antigena Repetir la prueba con otros portaobjetos del mismo Kit con control positivo Deterioro del contol positive Repetr la prueba con nuevo control positive 2 PROBLEMA: CONTROL NEGATIVO REACCIONA EN UNA O AMBOS POCILLOS CAUSA PROBABLE SOLUCION Uso de suero equivocado Repetir la prueba Dilucién de suero incorrecta Corregir la dlucién del suero Conjugado diluido incorrectamente Corragir la dilucién del conjugado Las condiciones de incubacién Usar la camara himeda para la. incubacion no se cumplieron Deterioo del Antigeno Repeiir la prueba con nueva lamina wpe - CNLSP ~ 003 25 Inattvto Necnal de Saudonus! ds Procedimentes pra Disgnéstico del Vitus cole innunidefciéncta Huns’ dmo 1 (V1) por umurofuorescenca ndivcta Ag PROBLEMA: FLUORESCENCIA DE ESCASA INTENSIDAD CAUSA PROBABLE Estuche mal almacenado 0 mal transportado del almacenamiento Ditucién de suero:incorrecta Conjugedo diuido ingorractamente Contarrinacion grosera de fas muestras Baja concentracién de anticuerpos en la muestra SOLUCION Observer fecha de’ vencimiento y condiciones Corregir la dilucién ‘del suero Cotregir la‘ dilucién’ de! conjugado ‘Conservar las miesiras a 2°C - 8°C hasia un maximo de 7 dias Obtener nueva muestra y procesar Obtener riieva muestra un mes después y procesar nueyamente Ad FLUORESCENCIA IRREGULAR CAUSA PROBABLE. Muestra seca en el portaobjeto Inadecuado volimen de muestra Contaminacién cruzada SOLUCION Incubar. en cémara himeda Colocar el vollimeni adecuado y repetir la prueba Repetir la’ prueba, AS — DISTORSION DE LA IMAGEN OPTICA CAUSA PROBABLE Insuficiente medio de montaje Exceso de medio de montaje Burbujas de aire bajo la laminilla cubreobjeto cubreobjelo sin relirar ef mecio de moitaje SOLUCION Remover con cuidado la laminila cubreabjeto y montar nuevamente con sufciente medio de monteje Retiar la laminila ciitrecbjeto y utlizar una nueva Presionar muy suaivemente la lamilla eR - CNLS® 008 Instuto Nason de SaudBa B2 B3 B4 BS Manual ie recediionts para Diagndstico del Vins de la inmurdetcienia Humana tbo t (ViH-) gor lnmurofuorescencls Invests ANEXO B ACCIDENTES CON MATERIAL SOSPECHOSO DE CONTENER VIH PRIMEROS AUXILIOS En caso de salpicaduras, sacar la ropa contaminada. Permitr el sengrado inmediato de la herda, Lavar la zona afectada con agua y jabén, aplicar un antiséptico disponible, si es necesario se cubre la herida con un apésito. Si estin afectados los ojos, nariz 0 boca, lavarlos bien con grandes cantidades de agua. REPORTE Y EVALUACION Informar inmediatemente al médico de turno y otras personas designadas (jefe del laboratorio, investigador principal, comité de bioseguridad). ‘Anotar los detalles del accidente y evaluar la gravedad del accidente. Es importante que el trabajador de salud sea asesorado lo més rapido posible, Si se va a ullizar quimioprofilaxis, ésta debe comenzar lo més pronto posible, preferentemente dentro de las primeras 2 horas de la exposicién (se sabe que el VIH esté circulando en la sangre de 4.a 6 horas antes de penetra al infocito T4) EVALUACION DEL ACCIDENTE Determinar sila herida y algin fluido corporal estén involucrados a fin de establecer si la exposi- cién del trabajador de salud es signiticativa. TIPO DE FLUIDO CORPORAL Sangre, suero, plasma o cualquier liquido bioldgico contaminado con sangre. ‘Muestras de laboratoro o culivos que pueden tener grandes cantidades de VIM VHB VHC (virus de la hepatitis B y C respectivamente) Organos 0 tejidos transplantados. Liquido pleural, amnictco, pericardio, peritoneal, sinovial o cefaloraquideo. Las heces, secreciones nasales, esputo, l&grimas, orina o vémito no han sido implicados en la transmision de VIH, VHB 0 VHC, si es que éstos no estuviesen visiblemente contaminados con sangre. VIAS DE ENTRADA Heridas superficiales (por ej. cortes, abrasiones, magulladuras) 0 profundas (perdutanea, mordeduras, etc.) a través de las cuales puede penetrar material infectado. ‘Membranas mucosas (ojos, nariz, boca). MPR - CNLSP 03 a Insitute Nacgnal de Sokalanual de Procedniertos para Diagnéstcn del Vius de fa lamunodetioanca Humana ti 1 (IK) gor hmunofurescenie Indirect Nota: : ‘Se debe determinar e! area de piel expuesta y el tiempo de exposicién. Por lo tanto, o¢ rnecesario saber si el tipo de fiuido corporal y herida indican que ha sucedido una cexposicin significativa, - Se debe tener un consentmiento estricto del trabajador de salud y mantener una estricta confidenciaidad de toda la informacion que se ha oblenido. BG LESION SIGNIFICATIVA ‘Tomar una muestra de sangre basal del trabajador para serologia de VIM. Examinar de la misma manera, la muestra del paciente con la que se conteminé el personal de salud. Se econseja administrar zidovudina (AZT) al accidentado a una dosis de ataque de 400 mg. lo antes posible y luego 200 mg. cada 8 horas por 6 semanas como minimo. S la serolagia de VIH del trabajador es negativa, esta prueba debe repetise a ls 3 y6 meses. Sal Cabo de este tiempo la seroogia para VIH se mantiene negativa, se concluiré que no existe infec- ion. Mientras tanto s2 deben tomar las precauciones neceserias (evita el embarazo, no donar sangre, proteger a la pareja en las relaciones sexuales usando preservativos, etc). El trabajador tiene derecho a que se proteja su confidencialidad. Siel resultado de la muestra basal es positiva la infaccién no puede ser atibuida al accidente, By DESINFECTANTES SUGERIDOS Hiposloito de socio,0,3%-0.5% de claro. Alcohol 70%, ‘Alcotolisopropanol, 70%. Formaldehido, 4%. Glutaraldehido, 2%, ‘Agua Oxigenada, 6%. lodo potvidonico, 2,5%. UPR — oNLSP ~ 003 28 Insitute Necoral ée SalManual de Procedmients para Disgnésten del Vius de la Inmunodefienia Humane tpo #(ViH-t) por lnnunoforescencia Inet ANEXOC INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PUBLICA FORMULARIO PARA EL ENVIO DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE VIHISIDA FECHA DE Sonica Ns RECEPCION 4. DEL ESTABLECIMIENTO arco = 2. DEL PAGIENTE =a ES FEGHADE RESIDENCIA HABITUAL 7 oa | Meo NAGIMIENTO (Wiatre, Prodns y Departamento) p [aw | en | 20 | Fem [a [es | ato ist. Row. Edad 80 (9) re Vin de tension: Sons sanguinea Penta jc mae nets) No doornata 3.DELA MUESTRA Tipo de mune: SUEROIPLASMA Ler fosneice tern ‘SALVA oRINA Resultados dl pocesameito dea la muesiaen ol ie oak PRUEBARAPIDA PRUEBAELISA Tawa “eouen ore ranean Teauwein—| Te Fee DE ERAGON] RETA VSIAL Pimer — [wuonoecorte | eorvra segundo [corde come EUS euIse Reepoase [PELIOO PATER TPELBORATERNO TRE Sal abet FIRMAY SELLO FIRMAY SELLO (Respaneabe del Lboratoro) (Qirctr de Estacion) MPR - CNLSP ~ 003 2 Insitute Nacional de SaludManual de Prozedmiento pa Diagrdsc del Vius de la Inmunodefiensia Humana too 1 (VIK-1) nor InnunatuorescanciaIdireta RESULTADOS DEL LABORATORIO REFERENCIAL ELISA: Reacivo [No Reactivo | FECHA DE ELISA, WESTERN BLOT — Positive TER TOSS egstvo[—] interes] aa 6 OS Tae ore Tom Bombe FEGHADEIEA poe 3] se |e Ponta ogavo ew Lata toe = Indaterninado FEGHADE WALOT Roxporeati [PELDOPRERS TRON Ra Selvabortoro FRAY setLo reernate da Urn) PR ~ ONLSP 093 0 Init Naina do SledManual de Procedimlenas para Diagéstco de! Vius de fe Inmunodefiiencia Humana tipo { (Vk) por Inmurofuooscanca ndocta ANEXO D HOJA DE TRABAJO DE INMUNOFLUORESCENCIA-VIH 1 Vi Fecha tote Conjugado Cappel T Dilucién de la Antigeno Muestra @URENe 2AhENne oueENnS @uRen= sanens ousens oaRens MPR - GNLSP - 003 3 Insitute Nacional do alodManual do Procodiminlos pare Diognétco del Vine 6 Is Inmunedoflorci Hurana tiv 1 (ViN-t) por Innunafveescensia Indocte. ANEXO E SEROTECA DE VIH A BC DE Ho A DEF GHI 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8] 9 9 CAJA N°: CAJA N°: NPR - CNLSP - 009 2 Instat Nasional de Sud‘Manus de Procedmentos para Dagnésco del Vius dela Innunedefidencie Humana tio # (ViH-1) por Inmunathorescende Indirect ‘ANEXO F FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE INFECCION POR VIH EN LA RED DE LABORATORIOS DE REFERENCIA NACIONAL. TABORATORIO DE REFERENCIA | LABORATORIO DE REFERENCIA LABORATORIO REGIONAL NACIONAL Cae) nem | PORELISAY POR FI POR ELISA Y a Sco sma T TOMA +) « MUESTRA RESULTADO 1 (+) () SE REPORTA ‘SE REPORTA REALE POSITIVO AL NEGATIVO AL ‘SEREPORTA tas. rer. REG. || | LAB, REF. REG. POSITIVO AL (+) |] Lessoraronio SEREPORTA ¥ INDETERNMINADO INESPECIFICO t i) J REPETIRALOS: MESES ‘SE REPORTA REMITE MUESTRA NO REACTIVO ALLABORATORIO DE REFERENCIA ¥ NACIONAL REALIZAZ0 | ELISA SEREPORTA 'SEREPORTA T Posirivo NEGATIVO “) ‘SE REPORTA RESULTADO INDETERMINADO ol i SE REPORTA dad NOREACTVO * TODOS LOS POSITIVOS DEBEN REPORTARSE AL PROCETSS NPR - CNLSP ~ on8 2 Inti Nano SalusManuel de Procedimtnts para Diagnslico del Virus do fe Inmunedefciencla Humana tro + (V-1) por Innunofuorescensia dnote ANEXO G ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE INFECCION POR VIH ter ELISA Resultado (+) Resultado (-) 2do ELISA SE REPORTA NO REACTIVO Resultado (+) oc ——_ Resultado (-) IFI SE REPORTA NO REACTIVO sa INESPECIFICO WESTERN j BLOT + INDETERMINADO REPETIR 3 MESES + INDETERMINADO PCR NPR CNLSP ~ 008 4 Instuto Navona de SaludMPR-CNLSP-003 (tra- Eason) Institute Nasional de Salud NUMERO DE NOMBRE DE LA PERSONA 5 EIEMPLAR NaS ie oe hsierer FECHADEASIGNACION | NOMBRE DE REGISTRADOR 3. MANUALES DESCRIPCIONES: 7. TECNIGA DEL ANTIGUERPO FLUORESCENTE INDIRECTA/agnéstico 2 VIH- 17 normas ESTE LIBRO SE IMPRIIIO EN TELEFONO 423-4160 / 24.6206 NOVIEMBRE 2001, LIMA PERU