Les contréles biologiques I. Introduction : ‘Le contréte qualité des médicaments est un ensemble de mesures qui permet de savoir si les médicaments fabriqués ou vendus par une entreprise sont conformes. Aux exigences du marché, A la demande du client, Aux Iégislations en vigueur, Au cabier des charges de Fentreprise. oes Le controle est une opération destinée a déterminer, avec des moyens appropriés, si fe service contrdlé est conforme ou non a ses spécifications ou exigences préétablies par le référentiel et incluant une décision 'acceptation, de rejet ou de retouche. TI. Contrétes microbiologiques : Une analyse microbiologique doit permettre d’isoler et d"identifier un microorganisme spécifique (méthode qualitative) et de quantifier une flore particuliére dans un échantillon (méthode quantitative), Cela est mentionné dans : Les différentes Pharmacopées :Européenne , USP, Japonaise qui sont des références dans le domaine de la qualité et la sécurité pharmaceutique at qui sont intégrés dans le systéme harmonisation internationale des normes en matiére de controle de qualité des médicaments. Les pharmacopées distinguent deux types de produit > Les produits qui doivent étre stériles : ‘* Préparations pour usage parentérale ; ‘+ Préparations ophtalmiques ; Fils et pansements chirurgicaux, matériel chirurgical;.... > Les produits non obligatoirement stérites : © Les matiéres premizres ; Les médicaments & usage non parentéal. L’origine des microorganismes peuvent étre : + Virale © Bactérienne * Fongique Lorigine de contamination des produits pharmaceutiques L’environnement de fabrication (surfaces, air et matériel) Le personnel Matiéres premiéres y compris Peau Conditions de stockage eee Présence de micro-organismes : DR. KADDOUR F+ Modification des médicaments * Diminuer ou annuler lactivité thérapeutique des médicaments % Constituer un danger potentiel pour le patient IL 1 Contréte des produits stériles : U consiste & vérifier Pabsence de : * Tout microorganisme (bactéries, levures et moisissures) : essai de stérilité © Pyrogénes © Endotoxines. A. Essai de stérilit Selon le chapitre 2.6.1 de la pharmacopée européenne cet essai + S"applique aux substances, préparations, produits qui doivent étre stériles selon la Pharmacopée % Consiste a vérifier l'absence de microorganismes viables dans un échantillon controlé * Méthodologie = ssai peut étre réalisé soit par la technique de filtration sur membrane, soit par ensemencement direct du milieu nutrtif avec le produit & examiner. Il comprend dans tous les cas des témoins négatifs appropriés. 1) La filtration sur membrane : est utilisée pour les préparations aqueuses filtrables, préparations alcooliques ou hui préparations solubles dans des solvants aqueux ou huileux ou miscibles a de ‘els solvants & condition que ceux-ci n’exercent pas d’effet antimicrobien. Echantillon filtré dans un appareil contenant une membrane retenant Jes microorganismes Membrane stérile : de porosité < 0,45 um et de diametre d’environ 50 mm. ‘* Membrane de nitrate de cellulose : pour les solutions aqueuses, huileuses ou faiblement alcooliques. ‘* Membrane d’acétate de cellulose : pour les solutions fortement alcooliques. > Appareil de filtration préalablement stérilisé : il doit permettre introduction et la filtration aseptiques de la solution a examiner. Il doit également étre compatible avec un transfert aseptique de la membrane dans le milieu de culture, ou avec une incubation directe dans l'appareil aprés addition du milieu de culture. La filtration sur membrane se déroule comme suit pour les solutions aqueuses : 1, Introduire I’échantillon du produit & examiner dans Ventonnoir de l'appareil de filtration (systéme & vide) : tous les micro-organismes présents dans le prélévement se concentrent 4 la surface de la membrane. 2. Si nécessaire, rincer la membrane une ou plusieurs fois pour éliminer les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon, 3. Placer le filtre a membrane dans le milieu de culture et incuber & la température appropriée pendant au minimum 14 jours. Compter les colonies sous un grossissement 10-15x et identifier le type de contaminant. Remarque : on saoo0unPoudres solubles : elles doivent étre dissoutes dans un solvant approprié puis traitées de la méme manire que pour les solutions aqueuses en utilisant une membrane adaptée au solvant choisi. Huiles et solutions Inileuses : les huiles et solutions huileuses de viscosité suffisamment faible peuvent étre filtrées sans dilution préalable sur une membrane séche. Les huiles visqueuses peuvent étre diluées avec un diluant stérile approprié Pommades et crémes Les pommades & excipient gras ct les émulsions du type eau dans huile peuvent étre diluées dans un solvant approprié en chauffant si nécessaire a une température ne dépassant pas 40 °C. 2) Ensemencement direct du milieu de culture : cette technique est réservée aux produits non filtrables & condition que le volume de produit utilisé ne dépasse pas 10% du volume du milieu. 3) Milieux de cultures et leurs températures d"incubation : ‘+ Le milieu liquide au thioglycolate : recherche des bactéries anaérobies mais également des bactéries aérobies a la température de 30 835°C. ‘+ Lemilieu 4 Phydrolysat de caséine et de soja : recherche des levures, moisissures et bactéries aérobies a une température comprise entre 20 et 25°C. 4) Conditions rigoureuses d’asepsie : essai réalisé dans des conditions aseptiques dans des Hotte a flux air laminaire on isolateur 5) Interprétation des résultats : ~ Absence de signes de croissance microbienne : le produit 4 examiner satisfait & essai, ~ _ Présence dune croissance microbienne : le produit & examiner ne satisfait pas & l'essai. B. Recherche de pyrogénes : Lorsqu’un médicament est administré par une voie jugée critique comme la voie intraveineuse, la préparation doit étre dépourvue de pyrogénes pouvant engendrer de graves effets secondaires chez le patient. Les normes de la pharmacopée imposent Pabsence de substances pyrogénes dans les produits pharmaceutiques qui entrent ‘en contact avec Ja circulation sanguine ou le systéme nerveux central. Les pyrogénes sont définis comme étant des substances pouvant provoquer une brusque élévation de la température. Cette classe de pathogtne est variée. Elle regroupe les molécules de nature virale, fongique et bactérienne, dont les endotoxines cconstituées du lipopolysaccharides (LPS) Les symptémes de pyrogénicité : Frissons intenses, cyanose, un pouls rapide accompagné de dyspnée, douleurs lombaires La recherche des pyrogénes est effectuée sur différents types de produits : eau, produits intermédiaires et produits finis, L’essai consiste a mesurer I'ékévation de température provoquée chez le lapin par Vinjection intraveineuse une solution stérile du produit & examiner. C’est un test in vivo qui permet de chercher tous les pyrogénes + Sélection des animaux : - Lapins adultes, en bonne santé, males ou femelles, dont Ia masse >1,5kp, = Nourris suivant un régime complet, équilibré et exempt d’antibiotiques. - _ Ayant bénéficié du repos requis . © Déroulement de Vessai : - Dépyrogénisation du matériel en verre : 250°C pendant 30min ou 200°C pendant th - Préparation des lapins : maintenus individuellement dans un licu tranquille a une température uniforme et privés de nourriture pendant la nuit précédant essai et jusqu’a la fin de celui-ci. on coooune- Essai préliminaire : Y — Mettre les lapins dans des boites contention. Y _Injecter 10m /kg d'une solution apyrogéne de NaCl A 9 g/l chauffée 4 38,5 °C. Y — Mesurer la température de chaque lapin & partir de 90 min au moins avant injection et pendant les 3 h qui suivent Injection. Y Eliminer de Fessai Fanimal accusant une variation de température > 0,6 °C. = Essai définitif: Y —Effectuer Messai sur un groupe de 3 lapins. Y Préparer Néchantillon a analyser (chauffage & 38,5 °C). Y — Injecter lentement la solution dans la veine marginale de Voreille du lapin. ¥ — Mesurer la T° a partir de 90 min au moins avant linjection et pendant les 3 h qui suivent. - Résultats : déterminer Y La T initiale : la moyenne de 2 valeurs déterminées 4 un intervalle de 30 min dans les 40 min précédant injection Y La T maximale : la T la plus élevée notée dans les 3 h suivant Vinjection. ¥ ‘max - Tinitial VY SATHATI+ AT: + ATs t...cccATen | Nombre de | Satisfait 4 Pessai | Ne satisfait pas a Pessai lapins [si BAT < SiZATE a 9S 03 iis [2.65 refaire Pessai sur 6 lapins 06 280 430 refaire Pessai sur 9 lapins | 09 445 5.65. refaire essai sur 12 lapins Liz 6.60 ____| 6.60_produit non conforme C. Essai des endotoxines bactériennes (Test LAL): Les endotoxines sont retrouvées dans les parois des bactéries Gram négatif de nature Lipo-polysaccharidique (LPS) (par exemple : E. coli, S-Typhi, Haemophilus influenzae) et chez certaines algues ou plantes supérieures. Elles peuvent se retrouver également dans lair ambiant et sont susceptibles de contaminer les :matiéres premiéres utilisées en production hospitaliére. Les endotoxines sont irés résistantes aux procédés de stérilisation employés en routine tels que la sterilisation par la chaleur humide ou Ia filtration microbiologique. En raison des dangers potentiels des endotoxines pour ke patient et de leur résistance aux procédés de stérilisation, la présence des endotoxines dans les produits pharmaceutiques notamment dans les préparations injectables doit impérativement étre contrélée. Le dosage des endotoxines produites par des bactéries gram-négatives, se fait par une réaction enzymatique réalisée in vitro aide d'un réactif, le lysat d'amébocytes de limule (LAL), obtenu & partir des cellules circulantes du Limulus polyphemus; un systéme enzymatique contenu dans le LAL est activé pour obtenir de la coagulase, enzyme qui va scinder une protéine, le coagulogéne, contenue dans le réactif LAL en un ‘270s fragment Ja coaguline et en un petit peptide. C’est la coaguline formée qui est proportionnelle & la Préparation du lysat Les amébocytes du sang de limule sont séparés par centrifugation, le culot est lavé puis lysé. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation et le surnageant est stocké & + 4 °C pendant plusieurs mois, ou congelé 4-20 °C pendant plusieurs années. Le lysat est lyophilisé. La sensibilité de chaque lot est déterminée Le lysat doit étre standardise vis-a-vis d°au moins deux endotoxines de référence car sa sensibilité varie avec les endotoxines DR. KADDOUR F aPour les techniques utilisant un substrat chromogéne, le lysat est modifié en éliminant partiellement Ja protéine coagulogéne. ‘Pour toutes les méthodes utilisées dans le test LAL. la quantité de coagulase activée est proportionnelle 4 la quantité dlendotoxines présentes, ce qui permet selon les méthodes une détermination semi-quantitative ou quantitative Dans la monographie 2.6.14 « T'essai des endotoxines bactériennes », la Ph. Eur. 21 décrit trois méthodes permettant la détection ou la quantification des endotoxines : 1) La méthode de gdlification : = Elle repose sur la. propriété que posséde le lysat de coaguler en présence d’endotoxines : les molécules de coaguline formées vont sagréger pour former un gel. - Cette technique consiste a placer des quantités équivalentes de LAL et de solution a tester dans des tubes en verre apyrogéne, les mélanger puis les incuber & 3741°C pendant une heure avec les contréles positif et négatif. La réaction est positive si un gel solide est obtenu durant inversion momentanée du tube reactionne! 2) Technique turbidimétrique : Lors de la mise en présence du LAL et d’endotoxine, la formation de coaguline s"accompagne de apparition d’un trouble dont laccroissement est mesuré par photometric. 3) La méthode chromogénique ou colorimétrique : Dans cette méthode, la protéine coagulogéne peut étre éliminge du réactif LAL et remplacée par un substrat chromogéne spécifique de la coagulase : le 5-aminoacid-polypeptide (5-pep) lié Sous action de la coagulase activée , la liaison 5-pep-pNA est coupée, libérant ainsi le pNA qui colore en aune la solution et qui peut étre mesuré par spectrophotométrie (& 545 nm). La vitesse de libération du pNA est fonction de la concentration en endotoxines dans I'échantillon ENDOTOXINES Pro-enzyme [| Enzyme duLaL ————™ activée Glu-Ala-AigpNA 4 * Proteme bstrat chromogene { coagulogéne Peptide ¢ Turbidite Colorimetric* Interférence dans le test LAL : La plupart des essais utilisant le LAL ont été réalisés avec des substances pharmaceutiques et médicales. II ‘est admis que ce test bien que précis demeure sensible aux interférences Les principales causes d’interférences sont : 1) Température 2) PH 3) L’activation ou Pinhibition du LAL 4) L’adsorption des endotoxines 5) La présence de certains cations, 6) La modification de enzyme ou de la protéine coagulase, 7) Les conséquences de la stérilisat isation 113 Contréle microbiologique environnemental : Il est réalisé dans le but d’identifier les voies de contamination possibles afin de mettre en place les actions comrectives avant que le produit ne soit contaminé. © Contrile de Vair : exposition des boites de pétri ouvertes renfermant un milieu de culture standard pendant 4h. Aprés incubation a 37°C pendant 48h, un dénombrement de particules est ceffectué. © Contréle du personnel : estimation de la charge microbienne retrouvée sur les mains gantées des opératcurs en faisant I'empreinte des cing doigts (pour les deux mains) sur un milieu gélosé nutritif coulé sur une boite de pétri. Aprés incubation & 37°C pendant 48h, un dénombrement de particules est effectué. © Controle des locaux : un écowvillon humidifié, roulé doucement sur la surface & controler (25 cm’), est utilisé pour réaliser une suspension bactérienne de Sml. Un inoculum de Iml est ensemencé dans 2 boites de pétri pour chaque écouvillon. Les boites sont ensuite incubées 32°C pendant 5 jours. UL. Autres contréles biologiques : MILI Toxicité anormale : Ce test consiste & observer chez Ja souris, une mortalité aprés administration d'une dose efficace (non toxique) du médicament & analyser et cela afin de vérifier absence d’une toxicité anormale qui serait due a tune toxicité surajoutée lors du processus de fabrication et/ou de conditionnement. + Voies d’administration : ~ Per-os: Iml, - Parentérale (IP, SC, IV) : 0,5ml DR. KADDOUR F* Contréle de routine : Administration du volume indiqué 08 souris privés de 4 @ Absence de mortalité nourriture la veille de essai Essai conforme NN iis at de I" mais recevant de Peau, © Mortalité d’une ou de Refaire Pessai sur 10 ‘Conditions habitulles de T? plusieurs souris ~- ——> souris et observer pat alimentation. 24h Mortalité dune ou de plusieurs souris © Expertise essai non conforme - _ Administrer & 10 souris le produit 4 analyser en une seule prise. - 3.4 4h aprés administration, remettre 'aliment en notant exactement son poids afin d°évaluer la consommation des souris par rapport au lot témoin absolus (10 souris). - Les animaux sont gardés en observation pendant 7 jours et pesés a J0, J2, J7. - A J0, 32, 17, noter : les troubles observés, la mortalité et Y évolution pondérale comparée entre le lot essai et le lt témoin absolus. ~ L’essai est satisfait si aucun des animaux ne meurt durant la période d’ observation. Si un animal meurt, essai est refait sur un autre groupe d’animaux .Lessai est satisfaisant si aucun des animaux du second groupe ne meurt au cours de la période d’observation, autrement le produit est non conforme. MHL2 Tolérance oculaire : * But: Prédire a partir de la connaissance de la toxicité sur ceil d’un animal vivant, le risque toxicologique chez Phomme. © Technique : L’instillation est effectuée dans le cul- de- sac conjonctival d’un eeil chez 6 lapins. L”autre ceil non traité sert de témoin. Les paupiéres sont maintenues fermées penclant 10 sec. Les lapins sont observés par deux personnes pendant 1h le 1, 2, 3,4 et 7 jour puis le 14 et 20*™ jourjusqu’a disparition des Iésions. L’évaluation de I'irritation oculaire au niveau de ia conjonctive, iris et la comée se fait selon une échelle numérique de 0 a 4. DR. KADDOUR FConjonetive ‘Absence de gonflement |e Gonflement, y compris la membrane nictitante 1 CHEMosIS Gon wee éversion de la paupiére a Gonflement avec paupiére a demi fermée_ 3] Gonflement avec paupiére fermeée plus que la mofié ou complement 4 | = — = + ‘Absence de larmoiement _ _ 0 Larmoiement léger (ne pas tenir compte des Iégéres seerétions existantes normalement | 1 | dans angle interne) LARMOIEMENT | Larmoiement, avec humidification des paupidres et des poils avoisinant les paupitres | 2 Larmoiement, avec humidification des paupitres et des poils sur de large surfaces autour | 3 deel Rougissement de | Vaisseaux normaux - ia ___ fo Taconjonctive | Vaisseaux nettement plus injectés que la normale 1 palpébral | Vaisseaux difficile & distinguer individuellement : - [_ ~ Couleur rouge vif, diffuse [1 = Couleur rouge foncé, diffuse _ Iris _ Tris normal — — on 0 Iris nettement plus plissé que la normale, congestion, gonflement, irs réagissamt encore | 1 Ala lumiére méme lentement (une ou plusieurs de ces caractéristiques) , hémorragie, destruction importante (une ou plusieurs de ces | 2 ‘Cornée _ ‘Aucune modification visible, ni perte de brillance ou de polk 0 Degrés Présence de zones translucides (diffuses ou disséminées), détails de Pris clairement | 1 opacification | visibles_ = Présence de zones transiucides facilement identifiable, détails de Piri légbrement 2 masqués Présence d'une zone opalescente, aucun détail de Pris visible, contour de lap 3 discernable résence d'une opacité coméenne totale rendant Viris et Ta pupilleinvisibles a Surface @opacité | Un quart au moins mais non nulle _ __|o [ Eintre te quart ef ta moitié 1 Entre la moitié et le trois quart 2 _ Des trois quarts & toute la surface. 3 ‘¢ Résultats : calculer les indices suivants : Indice d’irritation Oculaire individuel qui correspond a la somme des notes obtenues pour chacun des 6 lapins a chaque temps d” observation LO : Indice d’irritation Oculaire moyen qui est la moyenne des 1.O. des 6 lapins 1.0.Max : Indice d’irritation Oculaire Maximum qui est la valeur de '1.O la plus élevée. 1.0. Max Classification 1.0 Max <05 ‘Non irritant 05_= LO Max <15 : Trés faiblement irritant 15 LO Max <25 Légerement irritant 25 = 1.0 Max <50 Irritant 50_= 1.0 Max <80 = ‘Tres irritant LO Max > 80 Extrémement irritant on ao00URIML3 Tolérance cutanée : © But: ILs’agit de déterminer la tolérance locale du produit suite & une application unique sur la peawrasée du tapin afin de prédire, A partir de la connaissance de la toxicité sur un organisme vivant, le risque toxicologique chez "homme. © Technique : ‘Sur la peau rasée de 6 lapins, réaliser 3 incisions de 3cm espacées de 0,5 cm environ au niveau du flanc droit tandis que celui de gauche reste tel quel. Le produit & examiner est déposé puis une gaze ainsi imbibée et recouverte de para-film est appliquée sur les 2 flancs. Apprécier ’érythéme et Vaedéme sclon une échelle ‘numérique et ce aprés 24h et puis aprés 72h. ¢ Résultats : calculer Vindice d’irritation primaire cutanée IP _ E24h(E, Oe) + 72h(E, Oe) IP a IP<0.5 0.5IPD 22PS SPB IIL4 Titrages biologiques La stabilité des médicaments issus de la biotechnologie est cruciale. Elle est souvent difficile & maintenir et peut étre de durée relativement courte. La modification post-transductionnelle de certains médicaments peut affecter leur biogquivalence introduisant une variabilité du produit d°un lot & un autre. Titrages in vitro : essais immuno-enzymatiques (ELISA ****) DR. KADDOUR F