CLASE Nº9 – BIOLOGÍA MOLECULAR Y MARCADORES MOLECULARES

DRA. JULIANA VIANNA

BIOLOGÍA MOLECULAR O TECNOLOGÍA DEL DNA [DIAPO. 2]

- “Ustedes están viendo ahora algo de biología molecular, pero yo igual voy a tener que pasar algunos
conceptos de biología molecular ya que nosotros vamos a necesitarlos para saber como funcionan los
métodos de secuenciación, los marcadores moleculares y de genómica”.
- La biología molecular y tecnología del DNA recombinante son términos que abarcan todo lo que se
relaciona con la manipulación del DNA y del RNA en el laboratorio.
- Esto es muy utilizado en ingeniería genética o biotecnología, que es la aplicación de la tecnología del DNA
para resolver problemas biológicos (tales como la producción de medicamentos como insulina), problemas
médicos (tales como detección de enfermedades, algunas genéticas, otras hasta para detectar diagnóstico
rápido de virus o de bacterias como estamos viendo ahora con el COVID-19), o problemas veterinarios
específicos.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN [DIAPO. 3]

- Todo lo que es biología molecular empezó a evolucionar rápido en los años 1970 cuando descubrieron en
bacterias, en algunas cepas, enzimas capaces de degradar DNA exógeno (o extraño) que penetre a la célula
como modo de protección de la bacteria.
- Por lo tanto, esas enzimas, ellos vieron que cada bacteria producía una enzima específica y que reconocía
una secuencia específica del DNA (secuencia específica de nucleótido) denominada secuencia de
reconocimiento, y que cortaba en ese sitio específico del DNA llamado sitio de restricción.
- Entonces, por lo tanto, y normalmente esos sitios son palindrómicos, o sea, son iguales leyéndolo de ambos
sentidos (de 5’ a 3’ en un filamento o de 5’ a 3’ en el filamento complementario), como se puede ver aquí
en el ejemplo: G-A-A-T-T-C o G-A-A-T-T-C.
- Estas van a cortar de una forma específica y, por lo tanto, una enzima EcoRI (porque vino de Escherichia coli)
reconoce ese sitio de restricción y corta de esa forma.

ESQUEMA DE DISTINTAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN [DIAPO. 4]

- Por lo tanto, tenemos aquí varias enzimas diferentes que provienen de diferentes bacterias, y también
tenemos los sitios de restricción y como esas enzimas cortan esos sitios.
- También podemos ver las bacterias de las cuales se obtuvieron tales enzimas.

¿EN QUÉ CONSISTE LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE? [DIAPO. 5]

- Entonces, ¿cómo generamos un DNA recombinante, lo que es el DNA recombinante?
- Para clonar y para hacer varias técnicas necesitamos en general un DNA recombinante, y ¿qué es eso? Una
molécula híbrida o quimérica del DNA de dos organismos: un DNA que nosotros necesitamos estudiar o
clonar y un DNA de un vector (que puede ser normalmente un plásmido, pero puede ser un cósmido, ahí
vamos a ver).
- La tecnología del DNA recombinante consiste en crear una molécula de DNA híbrido o quimérico que
combina en una nueva forma el DNA de un organismo donador (el organismo en estudio) con el DNA de un
vector (generalmente un plásmido).

DNA RECOMBINANTE Y CLONACIÓN DEL DNA [DIAPO. 6]

- Entonces, ¿cómo hacemos para clonar? Vamos a producir un DNA recombinante, y lo primero que necesito
hacer es utilizar las enzimas de restricción: voy a elegir una enzima y usar la misma para el DNA que deseo
estudiar más el DNA del vector. Lo va a cortar de la misma forma al DNA y, para generar los extremos que
tiene la forma del DNA y poder combinarlos para formar el DNA recombinante.
- Por lo tanto, genero aquí con la enzima ligasa un DNA recombinante con el vector y el DNA que deseo
estudiar.
- ¿Cuáles son los objetivos?
• Producción de un número ilimitado de copias de un segmento particular de DNA.
 • Crear una biblioteca genómica o genoteca.

DIAGRAMA [DIAPO. 7]
- Aquí tenemos una representación de la bacteria con su plásmido, luego vemos el plásmido (en naranja) y
nosotros vamos a cortarlo con la enzima de restricción. Después tenemos el DNA que nosotros queremos
estudiar (en morado), supongamos que el DNA de un perro, y necesitamos clonar fragmentos de DNA de un
perro.
- Entonces, lo voy a cortar usando una enzima y voy a insertar cada uno de los fragmentos del DNA del
organismo en el plásmido de la bacteria.
- ¿Para qué quiero clonar? “Ya se preguntaron ¿qué significa clonar?” Necesito que la bacteria haga el trabajo
de copiar varias veces ese fragmento del perro. “Vamos a decir que es el DNA del gato porque las ‘r’ en
español todavía para mí me cuestan mucho, entonces vamos a hacer del gato mejor. Entonces es el DNA
morado del gato”.
- Lo cortamos con las enzimas, lo insertamos en el plásmido y lo volvemos a insertar en la bacteria. Ahora,
¿cómo lo insertamos? Tal como una corriente eléctrica lo inserto en la bacteria.
- Entonces, si yo quiero copiar sólo un fragmento está bien.
- Yo puedo fragmentar el DNA, seleccionar sólo un fragmento e insertarlo en el plásmido y copiarlo, pero
muchas veces lo que yo quiero construir son varias bacterias con diferentes fragmentos del genoma del
gato, por ejemplo.

BIBLIOTECA GENÓMICA (O GENOTECA) [DIAPO. 8]

- Entonces, cuando yo inserto todo el genoma, todos los fragmentos del DNA del gato en varios plásmidos de
varias bacterias yo voy a hacer una biblioteca genómica o una genoteca.
- Entonces, ¿qué significa eso? Que contiene al menos una copia de todas las secuencias del genoma de un
organismo, que en este caso estamos hablando del gato.
- Para preparar una biblioteca genómica necesito extraer el DNA de las células o tejidos (del gato en este
caso), se utiliza las enzimas de restricción para hacer el corte y luego se ligan los fragmentos en los vectores
(mediante la enzima ligasa).
- (Apuntando al diagrama) Entonces aquí está, yo conecté y tengo el DNA recombinante inserto en la bacteria,
están las bacterias en los cultivos y que van a duplicarse y producir el DNA varias veces. Yo voy a tener varias
colonias, y cada colonia tendrá varias copias del mismo fragmento del genoma del gato.
- Después que me copio yo puedo sacar esa colonia de bacterias que va a tener varias copias del mismo
fragmento del gato. Lo puedo hacer un medio de cultivo y extraer el DNA para lo que yo quiera.
- Este, por ejemplo, es uno de los primeros métodos de secuenciación genómica que consistía en ese proceso
de clonar utilizando una biblioteca genómica (que vamos a ver más adelante los métodos de genómica).

COMO FUNCIONA LA AMPLIFICACIÓN [DIAPO. 9]

- Entonces aquí tengo el DNA, por ejemplo, del gato que quiero estudiar, lo corté y lo inserté en un plásmido
y luego en las bacterias (por un lado, una bacteria con el fragmento 1 y, por otro lado, otra bacteria con el
fragmento 2).
- Las bacterias se empiezan a copiar y ellas empiezan a copiar los fragmentos varias veces.

DNA RECOMBINANTE Y CLONACIÓN DEL DNA – VECTORES [DIAPO. 10]

- Puedo usar diferentes vectores. Yo di el ejemplo del plásmido (10kb), peor hay otros vectores como lo son
los:
• Fagos 𝜆: 10 – 20 kb.
• Fago 𝜆 en un plásmido = cósmido: 40 – 50 kb.
• YAC (cromosoma artificial de levadura): hasta 1 Mb.
- Se pueden usar fagos o cósmidos, en los cuales puedo insertar fragmentos de DNA más grandes del donante
(el gato en este caso del ejemplo).
ESQUEMA DE CLONACIÓN EN FAGOS 𝜆 [DIAPO. 11]
- Aquí estamos usando el fago. Si pensamos el mismo ejemplo yo voy cortando el DNA (Del gato), voy a
insertarlo ahora en un fago y ese va a infectar de ahí a las bacterias.
- Por lo tanto, voy a tener de ahí la misma biblioteca genómica.
*OJO: PREGUNTA: A mi me quedó una duda de la biblioteca genómica. ¿Sí o sí se hace pensando en la
construcción de un organismo? ¿Sí o sí tienen que haber una copia de todos los genes de un organismo?
Porque que pasa si estamos estudiando, por ejemplo, en el gato, la expresión de una proteína en particular
de ese gato. ¿Por qué tendría que tener una copia de todos los genes?
- Hay varias formas. O sea, si yo quiero secuenciar el genoma yo voy a tener la copia de todos los fragmentos,
y ahí voy a secuenciar uno por uno con los métodos de secuenciación antigua.
- Si yo quiero un pedazo solamente del DNA del gato yo puedo hacer con una sonda identificar en cuál clon
está el fragmento específico que yo quiero, y poner un papel filtro con una fluorescencia para yo poder ver
el clon con la colonia de bacterias que está en ese fragmento y de ahí cultivar sólo ese.
- O con radiación también (con rayos X) tu puedes identificar cuál fragmento es utilizando sondas, donde la
sonda es una frecuencia de DNA conocida donde hay una fluorescencia, una radiación que va a hibridar justo
con el DNA que yo ando buscando.
*OJO: CONTRAPREGUNTA: ¿Ese es el proceso de hibridación o no?
- Sí. Ahora, puedo hacerlo de una forma más fácil que es hacer un PCR, que lo voy a explicar ahora, si tu
quieres un fragmento específico.
- Entonces, y vamos a ver ahora con los métodos de genómica actuales que son mejor aún, pero es bueno
conocer todos los procedimientos porque yo voy a estar siempre comparando métodos y, entonces, es
interesante saberlos porque puede tener varias aplicaciones, además.

DNA COMPLEMENTARIO [DIAPO. 12]

- Lo otro es que yo puedo construir una biblioteca también de cDNA. Por ejemplo, cuando existe un tipo de
virus cuyo genoma está formado únicamente por RNA (retrovirus).
- En este caso el RNA no es capaz de replicarse. El retrovirus se inserta y propaga en bacterias a través de
RNA, pero tiene que ser transformado en DNA para ser insertado en el genoma de la bacteria, y esa enzima
que transforma el RNA en DNA es la transcriptasa inversa o transcriptasa reversa.
- El DNA se replica posteriormente y actúa como molde para la síntesis de más RNA.

GENOTECA DE cDNA [DIAPO. 13]

- Entonces, nosotros podemos hacer también una genoteca de cDNA, por ejemplo, cuando yo quiero saber
todo el mRNA que está siendo transcrito en un tejido.
- Por ejemplo, quiero saber cuál es la diferencia entre un tejido sano y un tejido que tiene un cáncer: se extrae
el RNA mensajero y lo voy a transformar en DNA, lo voy a insertar y luego clonar. De ahí vamos a tener una
genoteca no de DNA, sino que de cDNA.
- ¿Por qué es cDNA y no DNA? ¿Cuál es la diferencia entre una biblioteca genómica del DNA completo y una
genoteca de cDNA?
• Respuesta Alumna: Que sería solo el DNA complementario, no sería la hebra completa.
• Pregunta Dra. Vianna: ¿Y cuál es la diferencia ahí?
- Primero estamos viendo sólo la parte que se va a expresar, la parte de los genes, mientras que en la otra
vamos a estar viendo mucha parte del genoma que no son genes, que no tienen función muchas veces.
Además, cuando hablamos de eucariotas (como vertebrados, como nosotros) estamos hablando ahí de que
vemos solamente los exones. ¿Se acuerdan de que en la transcripción los intrones se eliminan?

*OJO: PREGUNTA: Entonces, ¿ahí el cDNA sería como la copia del mRNA?
- Sí, sería la transformación de todo el mRNA que yo estoy sacando en un tejido a DNA, pero se llama cDNA,
no es DNA.
- Es un DNA complementario porque lo que estoy haciendo son parte de genomas que transcriben y se
expresan y, además, no tiene intrones.
IDENTIFICAR SECUENCIAS CLONADAS [DIAPO. 14]
- “Aquí está un poco de lo que Carolina preguntaba antes”, de cuándo y cómo puedo identificar un fragmento
en específico.
- Entonces, una de las formas aquí es que se puede transferir un poco de la colonia para un papel filtro y se
coloca ahí una SONDA (que es una secuencia de DNA o RNA que se ha marcado de alguna manera) que yo
mando a hacer una empresa de la secuencia de DNA que quiero identificar, y ahí va a demarcar hibridizando
en el DNA de la colonia y me va a marcar cuál colonia es y la cultivo de forma especifica.

ELECTROFORESIS [DIAPO. 15]

- Otra técnica que se utiliza bastante en biología molecular es la electroforesis. “No sé si llegaron a hacerla
en el laboratorio, me imagino que con la pandemia está difícil hacer laboratorios”.
- “Ya que llegaron a ver lo que es la electroforesis no necesito explicar muy en detalle, sino que voy a explicar
de manera más rápida”.
- En el fondo es un gel que funciona como una malla, el DNA negativo va a correr hacia el polo positivo, tu
pones corriente eléctrica negativa y positiva y el DNA va a correr hacia el positivo. Por lo tanto, los
fragmentos más pequeños de DNA van a correr más rápido que los más grandes.
- Se puede ver aquí en el gel que tenemos una muestra, se saca un pocillo en que yo puse la muestra, el DNA
corre con la corriente eléctrica, lo paro y lo puedo visualizar, por ejemplo, con sus distancias químicas que
puedo ver en luz UV, o puedo teñir el gel con … (se corta la primera grabación, hay que comenzar con la
segunda) … al más grande.

SOUTHERN BLOT [DIAPO. 16]

- Bueno, hay una técnica que se llama Southern Blot que es simplemente lo que vimos ahora, que hace una
electroforesis de DNA cortado con enzima de restricción, y yo voy a usar una SONDA para hibridizar un
fragmento que tengo interés en identificar si está presente o no en ese DNA.
- Entonces, es lo mismo, una electroforesis de DNA e identifico aquí los fragmentos si están presentes o no
con una SONDA de interés.

SOUTHERN BLOT – PARTE 2 [DIAPO. 17]

- Es utilizado para determinar si un clon contiene todo el gen o sólo parte de él, y para verificar el tamaño
global y la organización de la secuencia del gen o del DNA de interés.
- Entonces “lo mismo que yo dije antes”, utilizo aquí por ejemplo los diferentes fragmentos.
- Puedo querer saber, por ejemplo, si fue o no clonado el DNA que yo estoy estudiando, y me va a identificar
la SONDA si está presente o no en la electroforesis.

OTROS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN [DIAPO. 18]

- Hay derivaciones de ese método para que ustedes sepan, que se llaman:
• Northen Blotting, que es el otro método que utiliza RNA (electroforesis de RNA)
• Western Blottining, que es un método que utiliza una electroforesis de proteína (ocupa anticuerpo en
electroforesis de proteína).
*OJO: PREGUNTA: En el peso de las proteínas, porque hay proteínas que también tienen carga negativa,
¿entonces que prioriza ahí, el tamaño o la carga? Pensando como para que corran.
- Los dos.
- Hay otros métodos que corren, y “tú puedes hacer una electroforesis 3D también, pero ahí tienes objetivos
diferentes”.
- Cuando estás estudiando, por ejemplo, proteómica. “Pero las proteínas no es mucho lo mío. Hablamos de
DNA y RNA, pero proteínas no es mucho lo mío, pero se puede por ejemplo hacer una electroforesis 3D, que
es una proteómica, evaluando los dos”.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA – PCR [DIAPO. 19]

- “¿La PCR entonces ustedes ya la vieron? ¿Sí? No necesito repasar.”
- Es la reacción en cadena de polimerasa, y la PCR genera aproximadamente 1 millón de copias de un
pequeño fragmento de DNA molde.
- Con la secuencia que se desea amplificar son sintetizadas pequeñas secuencias (de cerca de 20 bases)
complementarias a los extremos 3’, los que son llamados primers o partidores.

DIAGRAMA DE LA PCR [DIAPOS. 20 Y 21]

- “Utiliza ahí un DNA molde, y lo que yo voy utilizando es un tubo. Lo que hacemos todos los días en el
laboratorio es poner el DNA del gato, por ejemplo, que quiero estudiar”.
- “Camila quiere estudiar un gen específico ahora, un gen de la coloración de los gatos, y ella va a colocar acá
el DNA genómico que extrajo, porque extrajo una muestra del DNA del gato y aisló el DNA eliminando las
proteínas, quebrando las células, un procedimiento como de cocina, lo colocó en el tubito y ahora quiere
copiar el gen que determina la coloración del gato”.
- Entonces, por lo tanto, ella va a poner en ese tubo el genoma, bases nitrogenadas (A, T, C y G, las que yo
compro), una enzima llamada Taq polimerasa (que es resistente a temperaturas), el buffer de la enzima (que
posee magnesio), también agua y los partidores que quiere copiar.
- El gen tiene que ser las secciones flanqueadoras del gen. Son secuencias que van a conectar en el extremo
del gen, y conociendo el extremo del gen y las regiones flanqueadoras tu tomas y mandas a la empresa de
la secuencia y te trae el tubito con los primers o partidores.
- “Entonces, como ustedes ya saben, yo estoy pasando rápido la PCR.”
- Va a pasar por ciclos de temperatura, que es la temperatura de denaturación que va a abrir las hebras. Lo
voy a poner en esa máquina de aquí, que es el termociclador (que lo único que hace es variar la temperatura
de forma precisa y rápida en 30 y 35 ciclos de esas tres temperaturas).
- La temperatura más alta va a hacer denaturación de las hebras, después viene el annealing que va a
conectar los partidores, y finalmente la extensión donde la polimerasa inserta las bases y copia las hebras.

AMPLIFICACIÓN DE DNA MEDIANTE PCR [DIAPO. 22]

- Así, después de esos 30 o 35 ciclos, se a va a tener ahí mil millones (230) copias del fragmento, en este caso
del gen que determina la coloración, por ejemplo, melanina, “del DNA de la muestra del gato de la Camila
que ella usó”.

DETERMINACIÓN SEXUAL [DIAPO. 23]

- Entonces, después yo voy a hacer una electroforesis para saber, por ejemplo, si mi PCR funcionó o no.
- Hay miles de aplicaciones para las que puedo hacer PCR: para el diagnóstico de enfermedades, para ver
marcadores moleculares que vamos a ver ahora, y “aquí estoy dando un ejemplo de determinación sexual”.
- Por ejemplo, aquí copie un fragmento del cromosoma Z y W de aves. En aves la hembra es heterogamética
(ZW) y los machos son homogaméticos (ZZ).
- Entonces, yo voy a copiar un fragmento del cromosoma W en que el W tiene una inserción, o sea una
inserción de algunas bases y va a ser un fragmento un poco más largo en esa misma región del genoma.
- Entonces, aquí (a la izquierda de la imagen) tengo un diagnóstico en que un individuo que yo corrí la
electroforesis y me funcionó la PCR es un macho, después hay otro macho, después (al centro de la imagen)
hay un patrón de peso molecular (que yo siempre cojo en la electroforesis para saber más o menos el
tamaño y va de 100 en 100 bases). “Entonces tenemos un fragmento esperado de aproximadamente 300
pares de bases, y me funcionó la PCR bien y tengo el tamaño que esperaba”
- “Aquí tengo dos fragmentos, el que está con la deleción del cromosoma W que tiene dos banditas”.

*OJO: PREGUNTA: Quedé media confundida con esa electroforesis. No entiendo como podríamos ver la
deleción o la particularidad del segmento que se está viendo. No entiendo como leer eso.
- Mira, para hacer el diagnóstico de determinación sexual en aves yo voy a elegir una parte que ya sabemos
del cromosoma Z y W que yo sé que en el W tiene una inserción y en que yo sé que en el W es más pequeño
el fragmento.
- Por eso, sabemos que en el W va a ser más grande y utilizamos esa región del genoma, donde sabíamos que
en el W tenía una inserción. La misma región va a ser amplificada en el Z y en el W, pero el W va a tener una
 inserción, entonces va a ser más grande y, por lo tanto, vamos a usar esa parte del genoma para hacer el
diagnóstico del sexo de una forma rápida.
- Entonces aquí (primera línea de la izquierda), por ejemplo, amplificó el Z; mientras que aquí (en la cuarta
línea contando de izquierda a derecha) amplificó el Z y el W, donde hay una inserción y por eso es un poquito
más grande.

qPCR (QUANTITATIVE PCR) [DIAPO. 24]

- Otra variación de la PCR es el qPCR o una PCR cuantitativa, o sea, a medida que voy haciendo cada ciclo de
amplificación veo como aumentan los números de fragmentos.
- Es la misma técnica, solo que utiliza una PCR cuantitativa y va viendo como amplifica y aumentan los
números de fragmento a medida que ocurre la amplificación.

SECUENCIACIÓN DE DNA – MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE DNA DE SANGER [DIAPO. 25]

- El método de secuenciación de Sanger, porque el descubrió ese dideoxinucleótido que yo voy a explicar
ahora, es un método de secuenciación que todavía se utiliza mucho para secuenciar fragmentos, pero
normalmente los fragmentos son más pequeños (son largos, pero es un método que no se podía secuenciar
todo el genoma) y sólo secuencia 1000 a 1500 pares de bases con alta precisión, entonces se utiliza mucho
todavía.
*OJO: Los métodos de secuenciación de genoma cada vez avanzando y evolucionando más.
- Entonces, yo para este método voy a hacer igual que una PCR. Pero, además, en esa PCR yo voy a utilizar un
dideoxinucleótido (ddNTP) que cuando se inserta tiene una particularidad y va a eliminar la polimerasa.

MÉTODO DE SANGER [DIAPO. 26]

- Entonces, ¿qué voy a hacer? Yo voy a:
• Aislar el DNA.
• Amplificarlo por PCR primero (el fragmento que quiero estudiar, el fragmento, por ejemplo, del gen de
melanina de la Carolina), y voy a copiarlo.
• Hacer reacción para secuenciarlo.
- También puedo utilizar un fragmento clonado o un fragmento específico que yo seleccioné ya y lo cultivé,
también lo puedo clonar y después puedo secuenciar por Sanger.
- Después de clonado o amplificado, lo voy a hacer esa reacción.
- Entonces, hago en el tubo del producto de PCR, por ejemplo, voy a hacerlo 4 reacciones (4 tubos), y en todos
ellos voy a colocar:
• Un partidor.
• Las dNTPs.
• Las polimerasas.
• Pero, en cada uno de ellos voy a adicionar un dideoxinucleotido diferente. En uno colocaré el T (ddTTP),
en otro el C (ddCTP), en otro el A (ddATP) y en el último el G (ddGTP).
- Entonces, aquí está mi secuencia y yo voy a hacer una reacción, como una PCR, donde me va copiando y
copiando el fragmento. Pero:
• Del tubo del T, toda vez que me inserta una T (que es un dideoxinucleotido T), la polimerasa se va a
despegar. Entonces, toda vez que aquí va copiando, entra un nucleótido nuevo, luego un dTTP, la
polimerasa se despega y hasta ahí se llega. De esa manera, en ese tubo voy a tener varios fragmentos que
terminan con T y que tienen relación con mi secuencia en donde terminó la T (en donde yo insértela T en
verdad).
• En el C lo mismo. Entró una C (un dideoxinucleótido C), cortó y ahí siguió de largo. Luego C, cortó y así.
• Lo mismo aplica para A y para G, y si no lo vieron antes es importante saber el método porque lo vamos a
ver después en genómica.
- Entonces, cuando hago una electroforesis, en cada pocillo un tubo, voy a poder ver los fragmentos más
pequeños al mas grandes y voy a poder leer la secuencia. “Mira, aquí la columna de T tiene una T, después
la columna A, después la columna T, después la columna C dos veces, después la columna del A, después la
 columna del A, después la columna del C, la del T, y finalmente la del G”. Así vamos a poder construir la
secuencia.
*OJO: PREGUNTA: Yo no entiendo una cosa. No entiendo el sentido que vaya cortando y que todas terminen
en el mismo nucleótido, no entiendo el para qué. ¿No sería mejor reconstruirlo completo? ¿O después cómo
se va leyendo si se supone que yo no sabía la original o la secuencia original?
- Tú no sabes la secuencia, nosotros estamos descubriendo ahora. Porque como yo sé que aquí, en este tubo,
todos van a terminar con T (en el primero, de izquierda a derecha), y aquí todos terminan con C (en el
segundo, de izquierda a derecha), aquí todos terminan con A (en el tercero, de izquierda a derecha), y aquí
todos con G (en el cuarto, de izquierda a derecha).
- Imagina aquí: La primera base que se inserta es una C, y entonces el menor de todos estos fragmentos es
un el tubo de C va a ser la primera base de la secuencia. Y ahora, en ese tubo de A, va a terminar en A, y así
sucesivamente, por lo que vamos a poder ir leyendo la secuencia.
THE DIDEOXY SEQUENCING METHOD [DIAPO. 27]
- Entonces, antes lo que se hacía era eso.
- Era una electroforesis gigante y larga, y yo iba leyendo y pudiendo determinar mi secuencia.

AUTORRADIOGRAFÍA DE ADN RESULTANTE [DIAPO. 28]

- Pero, después descubrieron un método, que aquí está, por ejemplo, en donde se va leyendo la secuencia en
base a los 4 tubos en los que se hizo mi reacción y voy leyendo T, TC, TTG, y así antes se leía la secuencia de
DNA.
- Se hacía como una PCR, pero en cuatro tubos, pero se utilizaban dideoxinucleótidos que eliminan la
polimerasa cuando se inserta y se hace una electroforesis gigante.

MÉTODOS AUTOMÁTICOS DE SECUENCIACIÓN [DIAPO. 29]

- Pero, después dijeron “no necesitamos hacer 4 tubos, sino que podemos hacer un único tubo, pero utilizar
cada dideoxinucleótido con una fluorescencia de color diferente”.
- Entonces, se hace la reacción en un único tubo, pero utilizando dideóxinucleótido con fluorescencia, y ahí
se hace una electroforesis en un capilar, “que es como un pelo”, que pasa por un electro láser, que primer
va a poner el tubo con carga positiva dentro de la máquina el tubo con carga negativa, y entonces la
electroforesis igual pasa los fragmentos pequeños y va a leer la fluorescencia ahora.
- El fragmento más pequeño, por ejemplo, ahí tiene una C. Después, el segundo más pequeño una G, y va
leyendo la secuencia con el capilar.
- Comentario Dra. Vianna: “Biología Molecular es como realidad virtual, ¿cierto?”.

VIDEO DE DNA SEQUENCING 3D

- DNA sequencing is the process of working out the order of the building blocks, or bases, in a strand of DNA.
- Before we can sequence the DNA, it has to be cut up into smaller pieces that are inserted into plasmid DNA
(“ahi está mostrando como se clona”) and then put into bacterial cells (“pero recuerden que puede ser
clonando o product de PCR para secuenciar”). This makes it possible to produce lots and lots of copies of it
as the bacterial cells multiply.
- The DNA is then isolated from the bacteria and sent for sequencing. The isolated DNA is transferred to a
plate (“aislo al DNA de la bacteria y lo colocó en una placa”) where the sequencing reaction will take place.
A mixture of ingredients is added, and these include:
• Free DNA bases (A, C, G, T) (“colocó entonces las bases”).
• DNA Polymerase Enzyme (“la DNA Polimerasa”).
• DNA primers (“y los primers, los partidores”).
• And Modified DNA bases labelled with colored fluorescent tags are also added (“ahí están los
dideoxinucleótidos marcados con fluorescencia”), and these are called terminator bases
- To start the sequencing reaction everything is heated to 96 degrees Celsius. This separates the DNA into two
single strands. The temperature is then lowered to 50 degrees, and this enables the DNA primers to bind
 the plasmid DNA. The temperature is then increased to 60 degrees, and the enzyme DNA polymerase binds
to the primer DNA.
- DNA polymerase starts making a new strand of DNA by adding unlabeled DNA bases to the target DNA (“ahí
funcionan como una PCR, ¿cierto? Sí.”). It continues to add DNA bases until a terminator base is added
(“hasta que entra un dideoxinucleótido”).
- These terminator bases have been chemically altered so that no more bases can be added to the new strand
of DNA. Once a terminator base is added, the DNA polymerase enzyme sops making DNA and falls aways
from the strand.
- Everything is then heated to 96 degrees Celsius again to separate the new DNA strand from the original
strand. This process of heating and cooling is repeated again and again to produce lots of fragments of DNA
od different lengths. The lengths of each fragment depends on when a terminator base got added.
- (“Ahí tienen los diferentes fragmentos de cada tamaño, y cada fluorescencia termina donde está la base que
corresponde”).
- To read the sequence of the DNA, the various fragments are separated by length using a process called
electrophoresis. A capillary tube is lowered into each well of the plate and an electrical charge is applied.
(“Ahí está el capilar, que es como si fuera un pelo, pero donde va a ocurrir la electroforesis”). This causes
the negatively-charged DNA molecules to move through the capillary tube (“entonces va a hacer que los
fragmentos corran por el capilar como la electroforesis”).
- Each capillary contains a porous gel. The shorter the fragments of DNA move through the gel, the more
easily than the longer DNA fragments (“Entonces, los fragmentos menores van más rápido, cierto”).
- As a result, the fragments become arranged by size, from the shortest to the longest (“quedan ordenados
de menor a mayor”). As the DNA fragments come to the end of the capillary a laser makes the terminator
baes light up, the color is detected by a camera and recorded.
- Each terminator base is labeled with a different color: ‘A fluoresces green’, ‘C blue’, ‘G yellow’ and ‘T red’.
The shortest DNA fragments will be read first, and the longest read last.
- The sequencing machine records the color of the terminator bases as a series of colored blocks. Each colored
block represents the labelled terminator base at the end of each fragment of DNA. By converting the colors
into letters, we get the sequence of our piece of DNA.

MÉTODOS AUTOMÁTICOS DE SECUENCIACIÓN [DIAPO. 30]

- Bueno, entonces ahí nosotros secuenciamos y vemos los picos y vamos a después comparar ahí las
diferentes secuencias de un individuo con otro (por ejemplo, aquí) y vamos a ver lo que nos interesa, lo que
llamamos de polimorfismo, que es la variación entre los individuos. Entonces, que tenga un sitio
polimórfico, un sitio que varía entre los 4 individuos, los 4 gatos, por ejemplo, que la Carolina está
estudiando (el 1, el 2, el 3 y el 4) con el gel de la melanina, entonces voy a estudiar como varían estos sitios
polimórficos entre las secuencias de estos 4 gatos.
- Entonces eso se puede ver, el polimorfismo, que sería cómo varían.

MARCADORES MOLECULARES - ¿QUÉ SON LOS MARCADORES MOLECULARES? [DIAPO. 31]

- Ahora podemos entrar a los marcadores moleculares, y “lo voy a retomar e nuevo después en genómica
porque hay muchos marcadores que nosotros utilizamos hoy en día, que son basados y hacemos
constantemente, son basados en nuevos secuenciamientos genómicos. Como, por ejemplo, de los pingüinos
que están aquí en la foto, yo trabajo con genómica de pingüinos. Yo secuencie el genoma de los pingüinos,
de todas las especies de pingüinos, pero después les hablo de eso”.
- Entonces, ¿qué son los marcadores moleculares? Son diferentes secuencias de DNA que son transmitidos
de una generación a otra (heredables), que son fenotípicamente neutrales, son estables durante el
desarrollo y al ambiente.
- Pregunta Dra. Vianna: ¿Qué significa que son neutrales los marcadores moleculares?
• Respuesta Alumna 1: ¿Qué no tienen carga?
• Respuesta Dra. Vianna: No, pero podría ser en ese sentido. Tiene sentido más genético.
• Respuesta Alumna 2: Se me ocurre que quizás no generan un cambio.
 • Respuesta Dra. Vianna: Eso, que no tiene implicancia en el fenotipo. Son como un aro en la oreja de una
vaca, por ejemplo, un marcador, pero no tienen implicancia en su fenotipo, no son regiones que están bajo
selección natural.
- Entonces, todo lo que tiene implicancia fenotípica está bajo selección natural, pero los marcadores no
porque nosotros queremos ver otras cosas con ellos (de los que hablaremos un poco).
- Hay varias técnicas que se utilizan para ver los marcadores moleculares, tales como Southern Blot, PCR,
electroforesis y secuenciación.

MARCADORES MOLECULARES – TIPOS [DIAPO. 32]

- Hay varios tipos:
• Los primeros fueron isoenzimas, RAPD (que son random amplified polimorfic DNA, que son
amplificaciones al azar de PCR en el genoma, “entonces así lo hago entre las diferentes bandas en los
individuos”).
• Luego vinieron los RFLP, que es usado con enzimas de restricción.
• Más tarde los microsatélites, que todavía se utilizan y también pueden ser llamados de SSR o STR.
• Las secuencias, variaciones que nosotros vemos, los polimorfismos, que llamamos cuando varían
principalmente los genomas los llamamos de SNPs, que es Single Nucleotide Polimorfism (SNPs).
Podemos utilizar ahí secuencias de DNA como de mitocondria, evaluar intrones y podemos hasta utilizar
técnicas que son genómicas hoy en día, como RAD-seq (“que explicaré en la clase de genómica”).

MARCADORES MOLECULARES – NIVELES DE VARIACIÓN [DIAPO. 33]

- Entonces, hay varios niveles de marcadores molecular que nosotros tenemos que elegir el marcador
molecular adecuado para la pregunta adecuada que yo quiero hacer. “Yo les voy a explicar el por qué”.
- Hay 3 niveles de variaciones en marcadores moleculares:
• Primero, el más sensible. Se ve una variación de generación a generación, y es utilizado mucho para ver
diferencia entre individuos (p. ej. en una genética forense donde necesito saber quién es el asesino,
entonces hay que identificar a un individuo del otro; para parentesco, saber quién es el papá). Necesitamos
que tenga alta variación entre individuos de una misma especie, y necesito un marcador más variable (“si
el marcador no fuese variable, yo voy a ser igual a ti, y eso no me va a dar información”).
• Segundo, un marcador en una mayor escala temporal y espacial. Se utiliza, por ejemplo, quiero ver
diferencias entre poblaciones, “lo que yo hago mucho”, la estructura poblacional (son más o menos
estructuradas las poblaciones de una especie, y lo que quiero decir es que con más estructuradas son más
diferenciadas las poblaciones y tienen menos flujo génico, mientras que menos estructuradas son menos
diferenciadas y tienen más flujo génico y son más homogéneas). Entonces, necesitamos un marcador que
sea variable, pero tampoco tanto.
• Tercero, ya es menos variable. Por ejemplo, vemos procesos más evolutivos, como reconstruir una
filogenia, procesos de especiación, definir especies, entonces necesitamos un marcador menos variable
que, “entre nosotros humanos tiene poca variación, pero de un humano a un gorila yo veo diferencias”.
Podemos ver más diferencias entre especies y menos diferencias en una misma especie. ¿Por qué? Porque
si uso un marcador muy variable para ese nivel de escala puedo tener un mutaciones que van a cambiar,
por ejemplo, cambia de T a C, y después vuelve a C, T, y eso no es deseable en procesos evolutivos porque
puede dar resultados un poco erróneos. Es informativo en procesos evolutivos, filogenia, especiación y
taxonomía.
*OJO: PREGUNTA: Cuando dice marcador variable, ¿a qué se refiere exactamente? ¿Cómo es eso de que el
marcador sea variable? Porque no entiendo muy bien el concepto, yo me imagino que si estamos marcando
algo el marcador sería el mismo, pero lo que cambia sería la secuencia genómica. Entonces, queremos que el
marcador se mantenga para que sea objetivo, por así decirlo, ¿o no?
- El marcador es un tipo. Por ejemplo, si yo digo que voy a estudiar con marcador molecular el DNA
mitocondrial, puedo usar el mismo marcador. Si yo digo voy a usar el marcador molecular el microsatélite,
ese es otro marcador.
- Yo estoy hablando de cuál marcador voy a elegir para cuál pregunta quiero contestar. Entonces, por ejemplo,
los microsatélites son más variables que una secuencia, entonces los microsatélites serán los más adecuados
de utilizar para una paternidad.
- Entonces, por ejemplo, aquí (diapositiva 30, se devuelve) nosotros estamos evaluando la variación en un
marcador (se supone que es el marcador de citocromo B de DNA mitocondrial). Entonces va a haber
variación entre la población, y el marcador muestra la variación entre individuos (hay una variación entre la
población y me puede contestar algo).

MARCADOR MOLECULAR – PODER DE RESOLUCIÓN [DIAPO. 34]

- Entonces, aquí, por ejemplo, tenemos más o menos organizado el poder de resolución del marcador, o sea,
mientras más variable sea el marcador molecular, mayor poder de resolución tendrá.
- Por ejemplo, los microsatélites (SSRs) y los SNPs pueden tener alta información, pero si voy usando
marcadores más antiguos menos poder de resolución voy a tener.

RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) [DIAPO. 35]

- “Voy a explicar este marcador, que es el RFLP. Es un poco antiguo, pero las técnicas nuevas de genómica de
marcadores moleculares de material genómico utilizan algo parecido con esto, y por eso lo voy a explicar”.
- Entonces, ese marcador se basa simplemente en las enzimas de restricción. Significa evaluar fragmentos
largos polimórficos utilizando las enzimas de restricción.
- Evalúa que cualquier mutación (inserción, deleción o substitución de base) que destruye o crea un sitio que
no es reconocido por la enzima de restricción.
- Las enzimas de estricción son usadas en mapas genéticos, produciendo un arreglo de fragmento de genes.
- Existen más de 200 enzimas, y cada una reconoce un sitio específico de DNA.

DIAGRAMA EXPLICATIVO DE RFLP [DIAPO. 36]

- Entonces, aquí tengo un genoma y lo voy a cortar con la enzima EcoRI. En ese genoma hay 3 sitios en los que
la enzima EcoRI reconoce como su sitio de restricción y lo corta.
- Ahora tengo un individuo que tiene 4 fragmentos, los voy a correr por una electroforesis y voy a ver esos
fragmentos.
- Si quiero evaluar diferencias dentro de la población hare lo mismo con otro individuo, pero al otro individuo
va a tener una mutación en uno de los sitios de restricción, va a tener un polimorfismo (una variación en ese
sitio), y la EcoRI ya no va a cortar ahí. Entonces, en vez de tener cortar en 3 sitios y tener 4 fragmentos, ahora
cortará en 2 sitios y tendrá 3 fragmentos.
- Así lo podemos evaluar haciendo una electroforesis para los diferentes individuos, evaluar la presencia o
ausencia de bandas, y ver ahí como varía de un individuo para otro, y necesitamos patrones de banda.
- Obviamente que esta técnica también se puede utilizar para otras cosas. Por ejemplo, yo tengo aquí u gen
que genera una enfermedad, o sea, un gen sano que supongamos que tiene un sitio de restricción que
normalmente corta un gen sano, pero yo sé que hay una mutación en esa posición de ese gen que cambia
esa posición y causa una enfermedad X (estoy inventando, podría ser una enfermedad que hace que el
individuo no produzca una coloración, o que este sea ciego, o lo que sea, falta de una enzima, etc.). Entonces,
por lo tanto, uso la enzima de restricción y cuando no tiene la mutación no lo va a cortar, entonces también
puedo usar eso para el diagnóstico de enfermedades, pero no es el caso aquí en donde queremos evaluar
la variación no más, pero se puede utilizar para otras finalidades.

OTRO DIAGRAMA EXPLICATIVO DE RFLP [DIAPO. 37]

- “Aquí yo me adelanté, me olvidé de las diapos”.
- Yo en el primero (el diagrama con la letra A) corto, mientras que en el otro (el diagrama con la letra B) tengo
una mutación y, por lo tanto, no va a cortar en ese individuo.
- Entonces, esa región es un sitio polimórfico que varía de un individuo a otro.
DNA REPETITIVO [DIAPO. 38]
- Otra técnica que es muy utilizada es el DNA repetitivo.
- Gran parte del genoma son de regiones no codificadoras, como elementos transponibles (o transposones,
“que muchas veces llevan genes de resistencia”), satélites, minisatélites y microsatélites
- Son neutrales, no están bajo la selección, pero son regiones pueden ser muy informativas como
marcadores moleculares, que es lo que nosotros queremos.

TIPOS DE DNA REPETITIVO EN EL GENOMA [DIAPO. 39 y 40]

- Entonces, hay dos tipos de DNA repetitivo en el genoma:
• El DNA repetitivo disperso, y significa que una copia está en una parte del genoma, y después la otra
copia está en otra parte del genoma.
• El DNA repetido en tándem, y significa que la copia está una tras otra “por ejemplo, TAC-TAC-TAC”.
- El DNA repetitivo disperso hay de varios tipos, en eucariotas obviamente, y se clasifica de acuerdo con el
tamaño de la unidad de repetición. Tenemos:
• Las repeticiones de unidades más largas, que son secuencias que se repiten de cada mil bases
(generalmente), que son conocidas como LINES (que es la sigla en inglés) o elementos largos intercalados.
• Las formas más pequeñas, cuya longitud es generalmente inferior a 500 bases, que se denominan SINES
(que es la sigla en inglés) o elementos cortos intercalados.
*OJO: Los LINES están unas 10 mil veces en el genoma, mientras que los SINES aproximadamente unas 100
mil veces en el genoma.
- Pero, el DNA repetido en tándem es el que más me interesa aquí porque ha sido muy utilizado, incluso
recientemente.
- Si hay muchas copias (miles) de las unidades de repetición de un lugar del genoma el DNA se denomina DNA
satélite. El tamaño de la unidad de repetición presenta normalmente un rango que va de 5 a 500 pb, y hay
de dos tipos:
• Los minisatélites, que son repeticiones de 10 a 100 bases que se repiten en tándem, una detrás de la otra.
• Los microsatélites, que son repeticiones de 1 a 5 bases que se repiten en tándem, una detrás de la otra.

MICROSATÉLITES (O SSR O SRT) [DIAPO. 41]

- Nos vamos a concentrar en los microsatélites, que han sido muy utilizados y se utilizan todavía en genética
para estudios de paternidad y cosas así.
- Los microsatélites tienen repeticiones que pueden ser de dos, tres, cuatro o cinco bases, y se denominan:
• Dinucleótidos, si son de dos bases (CACACACACACACA).
• Trinucleótidos, si son de tres bases (TAGTAGTAGTAGTAG).
• Tetranucleótidos, si son de cuatro bases (CATGCATGCATGCATG).
• Pentanucleótidos, si son de cinco bases (CATGGCATGGCATGGCATGGCATGG).
- Entonces, ¿por qué los microsatélites son tan utilizados para la paternidad y para diferencias entre
individuos? Porque esas repeticiones, a la hora de la replicación, generan el error de la polimerasa y se
inserta o se elimina una repetición. Entonces, es muy variable entre un individuo y otro.
- De esa forma, los microsatélites tienen más variación que las sustituciones de bases en la secuencia de DNA
cuando se reemplaza una base por la otra (un polimorfismo de una base, una substitución). Entonces tienen
más variación que una base, y por eso es más utilizado.
- Entonces, por ejemplo, aquí (en el diagrama) yo tengo cuatro repeticiones de CA, pero si evalúo mi otro
alelo tengo tres, después el otro alelo tiene cinco, y el último alelo tiene siete repeticiones.

STR [DIAPO. 42]

- Entonces, aquí tengo los microsatélites (“también se pueden llamar STA, STR”), y “tengo (en el diagrama de
color rojo) un CAGG CAGG repetidos 7 veces en una cromátida y 4 en otra”.
- “Tengo cuatro individuos diferentes, y el primer individuo es un heterocigoto donde en un lado tiene 7
repeticiones y en el otro lado tiene 4”.
- “El segundo individuo es un homocigoto porque tiene 5 repeticiones en ambas cromátidas hermanas”.
- Si nosotros amplificaos ese fragmento vamos a ver una sola banda para ese individuo, mientras que si
amplificamos el fragmento del individuo heterocigoto voy a ver dos bandas: una más pequeña (que es la
con 4 microsatélites) y una más larga (con 7 microsatélites).
- Aquí, por ejemplo, de nuevo (en el tercer individuo, en el de color verde) “tenemos otro heterocigoto, donde
(en la primera cromátida) tiene 6 (microsatélites) y (en la segunda cromátida) tiene 4 (microsatélites), y aquí
(en el cuarto individuo) también tenemos otro heterocigoto, donde tenemos (en la primera cromátida) 10
(microsatélites) y (en la segunda cromátida) 5 (microsatélites)”.

*OJO: PREGUNTA: Ahí, ¿mientras más grande sea la diferencia entre los dos van a ir cambiando como el
número? Cuando yo lo amplifique, por ejemplo, en el primero voy a ver dos bandas, mientras que en el
segundo voy a ver una.
- Sí (pasa a explicarlo con la paternidad con microsatélites [DIAPO 45]).
- Mira, aquí (en la primera columna, de izquierda a derecha) tengo, por ejemplo, un individuo que tiene una
banda más pequeña y el otro más grande. Esto significa que aquí el tiene más repeticiones, porque el
fragmento es más grande.
- Aquí (en la segunda columna, de izquierda a derecha), por ejemplo, tenemos un fragmento más pequeño
que ese. Pongamos que aquí (en la primera barra, de abajo hacia arriba, en la columna 1) tiene 3
repeticiones, mientras que aquí (en la primera barra, de abajo hacia arriba, en la columna 2) tiene 1
repetición. Si aquí tiene 1, supongamos que aquí (en la segunda barra, de abajo hacia arriba, en la columna
1) tiene 4, y aquí (en la segunda barra, de abajo hacia arriba, en la columna 2) tiene 6 repeticiones.

*OJO: PREGUNTA 2: Me quedó una duda parecida, pero es con respecto a los patrones de banda. Entonces,
por ejemplo, si lo ocupo en un test de paternidad, ¿el grado de polimorfismo que tendría que haber entre un
padre y un hijo, tendría que ser igual y se tendría que ver igual en las bandas, o como con cierta cantidad de
bandas que tengan iguales ya se da que es el padre o no?
- Recuerda que nosotros tenemos 46 cromosomas, donde 23 vienen del padre y 23 vienen de la madre. De
esa manera tenemos 2 cromosomas 1, 2 cromosomas 2, 2 cromosomas 3, y así, que son cromosomas
homólogos. Que sean cromosomas homólogos significan que uno vino de la madre y otro del padre.
- Entonces, un fragmento de microsatélite se va a atar al cromosoma que vino de la madre, mientras que otro
fragmento de microsatélite se va a atar a otro que vino del padre. Entonces, uno va a tener que ser idéntico
al de la madre y otro idéntico a del padre.
- Aquí (en la diapositiva 45, que habla de paternidad con microsatélites) tenemos un caso de una madre
(círculo negro) y un padre (cuadrado blanco), donde la madre es heterocigota con los alelos M’ y M’’,
mientras que el padre es heterocigoto con los alelos M’’’’ y M’’’.
- Se tienen 6 hijos, pero queremos saber si ¿son todos hijos de esa pareja? Según lo que muestra el diagrama
de Pedigree sí. Por ejemplo, para:
• El 1 su M’’’ vino del padre y su M’’ de la madre
• El individuo 2 su M’’’’ vino del padre, y el M’’ de la madre.
• El individuo 3 su M’’’’ vino del padre, y el M’ de la madre.
• El individuo 4 su M’’’ vino del padre, y su M’ de la madre.
• El individuo 5 su M’’’’ vino del padre, y su M’’ de la madre.
• El individuo 6 su M’’’ vino del padre, y su M’ de la madre.
- Todos son hijos y tienen diferentes genotipos, tienen diferentes números y alelos de diferentes tamaños.
*OJO: CONTRAPREGUNTA: ¿Al final no es como que tengan que tener todo idéntico, sino que ciertos patrones
tienen que estar? O sea, es que me sigue confundiendo un poco.
- O sea, tiene que tener un fragmento idéntico del padre y uno idéntico de la madre. Por ejemplo,
supongamos que el individuo número 1 tiene el M’’ de la madre y, supongamos, que en lugar de tener el
M’’’ tiene otro fragmento. Eso de ahí ya probablemente me indica que no es el padre, sino que podría ser
otro macho el que haya sido su padre que tuviera ese fragmento.
*OJO: PREGUNTA 3: ¿Se analiza todo el material genómico o todo de ciertos genomas?
- O sea, microsatélites, cierto, en cada locus de microsatélites tu lo analizas por separado. No me importa
donde está en el genoma, son neutrales y no están bajo selección (a no ser que tenga pegado un gen, pero
eso lo veremos después).
- Además, normalmente no se confía en un solo microsatélite. Yo voy a ver diferentes microsatélites a lo largo
del genoma, y normalmente para paternidad en humanos se utiliza como 10 a 12 loci de microsatélite para
confirmar la paternidad. Entonces, cuando pongamos que ese loci es un marcador que es, por ejemplo,
CACA, un dinucleótido, pero después voy a correr utilizando otro locus en otra arte que utiliza otra
amplificación ara hacer lo mismo con los mismos individuos (con e padre, la madre, potencial padre y lo s
hijos, y así voy a hacer 10 loci diferentes.

MICROSATÉLITES [DIAPO. 43]

- Entonces, aquí está por ejemplo la secuencia de un microsatélite.
- “Yo lo representé aquí de la forma (AC)29, que significa que AC se repite 29 veces, y es un fragmento de 180
pares de bases.
- Entonces, cuando secuencio veo algo como el diagrama de la diapositiva.

SECUENCIACIÓN [DIAPO. 44]

- Pero, yo puedo no hacer una electroforesis, sino que puedo colocar una fluorescencia y el equipo me da
exactamente el tamaño del fragmento.
- De esa manera no necesito hacer una electroforesis, y el equipo me dice “ese individuo tiene 176 – 174”.

PATERNIDAD CON MICROSATÉLITES [DIAPO. 46]

- Entonces aquí, por ejemplo, tengo un estudio de paternidad con microsatélites en que se utilizaron 6 loci
diferentes.
- Tenemos a la madre (diagrama superior), al hijo (diagrama central) y al padre (diagrama inferior).
- Entonces, este loci aquí del hijo (el primer cuadro) tiene un fragmento de 12 y 13, y en la madre tengo 12
repeticiones y 13, mientras que en el padre tengo 10 repeticiones y 13. Entonces, probablemente vino de la
madre y el 13 del padre.
- Aquí (en el segundo cuadro) el individuo (el hijo) tiene 11 y 12, donde el 11 vino del padre que es
homocigoto, mientras que el 12 de la madre.
- Aquí (en el tercer cuadro) el individuo (el hijo) tiene 8 y 13, donde el 8 viene de la madre y el 13 del padre.
- Aquí (en el cuarto cuadro) el individuo (el hijo) es 8 homocigoto, donde recibe 8 y 8 tanto del padre como
de la madre.
- Aquí (en el quinto cuadro) el individuo (el hijo) tiene 11 y 12, donde el 11 lo recibe del padre y el 12 de la
madre.
- Aquí (en el sexto cuadro) el individuo (el hijo) tiene 12 y 13, donde el 12 lo recibe de la madre (homocigota)
y el 13 del padre.

*OJO: PREGUNTA: Entiendo todo el tema de los microsatélites, ¿pero cuáles serían las desventajas de usar,
como, un gen? ¿Por qué no es tan variable? Por lo que decía al principio, ¿ya que se podría cambiar sólo uno?
Porque igual habrían alelos.
- O sea, lo primero de todo es que cómo quiero usar marcadores neutrales, no quiero que ver nada en los
resultados sea influenciado por la selección natural. Quiero ver algo que es un marcador, no quiero ver algo
que sea fruto por la selección natural.
- Ahora yo, por ejemplo, estudio genética de poblaciones, pero también estoy estudiando genética
adaptativa, y quiero ver cuáles genes están bajo selección y tienen función con cada ambiente y todo eso,
pero no es el objetivo de los marcadores moleculares.
- Además, los genes son muy muy muy conservados. Cuando más, como se llama, esencial sea la función del
gen, menos variable son, porque cualquier variación son eliminados por selección natural, ¿cierto? Algunos
genes tienen un poco más de variación porque no son tan cruciales para la existencia de la vida, de los
organismos, y ahí pueden estar bajo la selección del ambiente.
- Algunas variaciones de un gen pueden ser benéficas en un ambiente. Por ejemplo, surge una nueva
mutación, por ejemplo, una planta que es más resistente a la sequía y esa planta va a reproducirse más y va
a aumentar la frecuencia de ese nuevo alelo cuando hablamos de selección natural, pero no queremos ver
eso, sino que estamos viendo una región neutral que no esté bajo selección.
*OJO: CONTRAPREGUNTA: Claro, y ahí que sea menos variados, ¿me va a costar identificar más a los padres
porque más personas pueden tener el mismo?
- Claro, si es menos variable va a ser más difícil. O sea, si yo secuencié u gen que es esencial para nuestra
existencia, por ejemplo, de una enzima importante humana, podemos secuenciar a todo el curso y vamos a
ser todos idénticos.
- Muchas veces se usan intrones, que son las partes que están entre los genes que son eliminadas durante la
transcripción.

- Entonces, aquí tenemos una confirmación de paternidad del hijo por la madre y por el padre utilizando ahí
6 loci diferentes.

A MICROSATELLITE LOCUS CAN SHOW LINKAGE TO A DISEASE GENE [DIAPO. 47]

- El microsatélite es un marcador neutral, pero muchas veces puede estar pegado a un gen y dar información,
por ejemplo, relacionada a una enfermedad o algo así, o a alguna característica de producción.
- Aquí (en el primer dibujo del diagrama A) es sólo un ejemplo de un gen donde el P dominante genera una
enfermedad, que está presente en la madre. Ella es heterocigota y tiene la enfermedad, y aquí (en el
segundo dibujo del diagrama A) el padre es normal, tiene el recesivo y está pegado a un microsatélite.
- Yo sé que el alelo que va a dar la enfermedad está asociado a microsatélites que tiene 5 repeticiones. Quizás
no quiero amplificar el gen para ver cual es el alelo, o sale muy caro secuenciar, necesito hacerlo con todo
mi ganado, no sé, entonces sólo haré una PCR y una electroforesis y puedo ver que tiene un microsatélite
asociado a este alelo.
- Aquí en la población siempre está asociado un alelo de 5 repeticiones. Entonces, por lo tanto, voy a utilizar
eso, por ejemplo, para ver en la familia de vacas, no sé, cuáles de los hijos heredaron las 5 repeticiones y,
por lo tanto, aquí (en el diagrama de Pedigree, figura B) quienes tienen la enfermedad aquí claramente son
los negritos, cierto, que heredaron el M’’ que son de 5 repeticiones.

SECUENCIACIÓN DE DNA – ADN MITOCONDRIAL (DNAmt) [DIAPO. 48]

- Otra secuencia que es muy utilizada, nosotros tenemos el DNA nuclear y tenemos un DNA extranuclear.
¿Cuál es? Ahí está, que es el DNA mitocondrial. En plantas también tienen el DNA de cloroplastos.
- Lynn Margulis, que es otra mujer importante en ciencia, ella hasta describió la teoría endosimbionte, que
decía que alguna vez las procariotas incorporaron a otras procariotas, formando así las eucariotas, y por eso
tienen un DNA propio.
- Entonces, el DNA mitocondrial es la mitocondria que nosotros tenemos son idénticos de nuestra madre y
así sucesivamente, un linaje materno, porque cuando los espermios fecundan el óvulo, la mitocondria
está en la base de la cola y queda afuera. “Entonces, mi mitocondria es idéntica a la de mi mamá, y a la de
mi mamá de mi mamá, y la de mi mamá de mi mamá de mi mamá, y así.”
- Es encontrado múltiples copias en la célula y, por lo tanto, cuando la muestra está más degradada el
secuenciar DNA mitocondrial es más bueno porque para cada célula tienes un DNA nuclear, pero tienes
varias copias de DNA mitocondrial. Entonces, es mucho más fácil estudiar muestras de huesos, de fecas, de
DNA degradado (en un cadáver medio descompuesto, etc.), es mucho más fácil el DNA mitocondrial. “Por
ejemplo, yo trabajé con el DNA de hueso de animales y es más fácil”.
- Es un DNA circular, tiene varios genes y la región más variable es la región control. Tiene dos partes
hipervariables, llamadas hipervariable I (HVI) e hipervariable II (HVII). Es el origen de replicación del DNA
circular y, por lo tanto, por eso es variable, pero algunos genes también son menos variables por su
distribución, como el citocromo b y otros genes, que también son usados para estudios de variación entre
poblaciones y entre especies.

ADN MITOCONDRIAL – PARTE 2 [DIAPO. 49]

- Es un DNA circular de doble hebra, cuyo tamaño promedio es de 15 a 17,5 kpb.
- La tasa de mutación en el mtDNA de vertebrados es mayor que el genoma (o DNA) nuclear.
- Hay genes conservados, como aquellos involucrados en la fosforilación oxidativa (citocromo b), genes de
rRNA y tRNA.
- Hay regiones variables, tales como la región control.
- Hay muchos primers, que están diseñados universales, es decir, que yo sé que funcionan para muchas
especies par amplificar el DNA mitocondrial.

DNA CLOROPLASTO (cpDNA) [DIAPO. 50]

- Lo mismo con el DNA de cloroplastos (cpDNA). Las plantas tienen tanto DNA mitocondrial, pero también
tienen DNA de los cloroplastos porque tienen estos organelos que hacen la fotosíntesis (nosotros no
tenemos estos organelos, los vertebrados no).
- El cloroplasto también tienen un DNA circular, utilizado como marcadores moleculares de igual manera.

DNA CLOROPLASTO – PARTE 2 [DIAPO. 51]

- En la mayoría de las plantas es de linaje maternal, pero en otras (como en árboles coníferas) son de linaje
paternal.
- Entonces, en plantas el cpDNA puede ser materno o paterno.

SECUENCIACIÓN: ADN MITOCONDRIAL [DIAPO. 52]

- Entonces, ¿qué tengo que hacer con para secuenciar este DNA mitocondrial?
1º. Recoletar las muestras, como por ejemplo de tejido (p. ej.”yo estudié genética de manatíes hace muchos
años atrás, y para eso ocupé tejido de la cola”).
2º. Extraer el ADN.
3º. Amplificar el ADN por PCR.
4º. Secuenciar el DNA.
5º. Analizar el DNA, comparando a un individuo con otro.

IDENTIFICACIÓN DE POLIMORFISMO DE DNA [DIAPO. 53]

- Entonces aquí, por ejemplo, tengo una electroforesis con varias muestras. Primero se pueden ver tres
muestras en las que no funcionó la PCR, y luego donde comienza a funcionar la PCR ya comienza a verse de
color blanco.
- Después está el patrón de peso molecular, más adelante se puede ver que sí funcionó, después nuevamente
que no, más adelante que sí, otra que funcionó un poco clarito, otras unas poco más inespecíficas y así.
- Se compara unas secuencias con otras y vemos los sitios que varían, analizando esos sitios polimórficos,
porque los sitios que no varía (los monomórficos) no me informan nada.

POLIMORFISMO [DIAPO. 54]

- El polimorfismo es la presencia en la población de dos o más formas de un gen o de una variación que
vemos en un cromosoma.
- Estos pueden ser:
• Simplemente una base de diferencia como vimos en secuencias, a los que nosotros llamamos de SNP
(single-nucleotide polymorphism).
• Cambios en el largo de fragmentos producidos por la presencia o ausencia de sitios de restricción en
moléculas de DNA, que son llamados RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
• Pueden ser variaciones en el número de repeticiones (reducciones o aumentos) de secuencias de DNA,
que son llamados SSR (simple sequence repeat) o microsatellite o STRs.

SNPs = SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISM [DIAPO. 55]

- Hablamos de los SNPs que, por ejemplo, variamos mucho los puntos que varían entre los individuos, aquí la
secuencia dentro del genoma nosotros llamamos de los SNPs (single nucleotide polymorphism).
- Se estima 1 SNP por 1000 bases en un genoma.
- Puede o no alterar a estructura de la proteína (posición codón).
- Base de datos SNP para humano (http://www.genome.wi.mit.edu/snp/human/).
LOS SNPs (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS) O MUTACIONES DE PUNTO [DIAPO. 56]
- Entonces, podemos llamar alelos diferentes cuando tienen SNPs en la misma posición diferente, y vamos a
retomar a los SNPs cuando hablemos de cromosomas (de genómica).
- Pueden ser identificados una única substitución, y son generalmente bialélicos.

DIVERSIDAD GENÉTICA SECUENCIAS [DIAPO. 57]

- ¿Cómo evaluamos la diversidad genética en secuencias? Por ejemplo, aquí, en secuencias de mtDNA, aquí
solamente están representados los sitios polimórficos (S = número de sitios polimórficos).
- ¿Cuántos sitios polimórficos (S) tenemos aquí?
• Pregunta Alumna 1: No entiendo, ¿los sitios serían los números 112, 134, y así? (refiriéndose a las
columnas de la tabla)
• Respuesta Dra. Vianna: Sí, mira. Aquí (en las columnas) están representados solos los sitios polimórficos,
mientras que los monomórficos (que no varían) no. Entonces, la secuencia, pero sólo los sitios con lo que
varían, y aquí (el número de la columna representa) la posición de la secuencia: la posición 112, la posición
134, y así. (Por otra parte), aquí (en las filas) son los haplotipos, que son lo mismo que los alelos: si varían
en al menos una nueva base diferente, es un nuevo haplotipo. Si se secuencia uno y otro y presentan lo
mismo, es el mismo haplotipo, pero si secuencie a otro individuo con una base de diferencia es otro
haplotipo.
- Entonces, aquí (en las filas) tengo los haplotipos (donde K = número de haplotipos) y aquí (en las columnas)
los sitios polimórficos.
- Entonces, ¿cuánto sitios polimórficos tengo (S)? Tenemos 12 sitios polimórficos. Por otro lado, ¿cuántos
haplotipos tenemos (K)? Tenemos 13 haplotipos diferentes.
- Otra medida de diversidad que se puede caracterizar, supongamos en una población, es la diversidad
haplotípica. Es como un índice de diversidad de especies que ve la frecuencia relativa de cada haplotipo
porque podemos tener:
• Muchos individuos con ese haplotipo o pocos individuos con ese haplotipo o pocos individuos con los otros
haplotipos, y hay la diversidad va a ser baja.
• Pero, si tengo una forma más equitativa del número de individuos con la forma de cada haplotipo la
diversidad va a ser un poco más alta.
- Entonces, es como un índice de diversidad que mide el número de haplotipos o la frecuencia relativa de
ellos. La diversidad haplotípica (H) se calcula como 𝐻 = 1 − ∑ 𝑝𝑖2 , en donde 𝑝𝑖2 es la frecuencia del
haplotipo i.
- El otro, representado por 𝝅, es la diversidad nucleotídica. Corresponde a la diferencia nucleotídica
promedia por sitio entre 2 secuencias (entre pares de secuencia). Si se tiene dominancia de un haplotipo y
hay secuencias que se diferencian de una base de la otra, voy a tener una baja diversidad haplotipica, pero
si tengo más número de haplotipos y más diversos en su frecuencia voy a tener una mayor diversidad
nucleotídica.

DIVERSIDAD GENÉTICA SECUENCIAS – PARTE 2 [DIAPO. 58]

- La tabla hace referencia a la posición de los sitios polimórficos en las 95 secuencias de 825 nucleótidos.
- Entonces aquí tengo más o menos los valores ahí de esa tabla, que corresponden a:
• S = 12.
• K = 13.
• H = 0.36.
• 𝜋 = 0.035.

DIVERSIDAD GENÉTICA, DIPLOIDES [DIAPO. 59]

- ¿Y cómo veo la diversidad entonces, por ejemplo, con marcadores diploides? “Que yo antes estaba hablando
de la secuencia de un mtDNA.
- ¿Cómo caracterizo la diversidad de un individuo cuando miro un microsatélite? Para decir que ese individuo
es más diverso que este otro. Si un individuo es homocigoto tendrá los mismos alelos repetidos, y será menos
diverso que un individuo que es heterocigoto que tendrá dos alelos.
- Puedo ver también si una población es más diversa que otra, ¿y cómo caracterizo la diversidad de una
población? Este es un gel de electroforesis de microsatélite. Aquí están los pocillos y vemos que:
• En el primero (primera columna) hay un homocigoto.
• En el segundo (segunda columna) hay otro homocigoto, pero para otro alelo, uno más pequeño.
• En el tercero (tercera columna) hay un individuo heterocigoto, con esos dos alelos anteriores.
• En el cuarto (cuarta columna) hay un individuo homocigoto para el alelo más grande.
• En el quinto (quinta columna) hay un individuo heterocigoto.
• En el sexto (sexta columna) hay un individuo homocigoto para el alelo más grande.
• En el séptimo (séptima columna) hay un individuo homocigoto para el alelo más pequeño.
• En el octavo (octava columna) hay un heterocigoto, y así.
- Bueno, y ¿cómo puedo medir aquí la diversidad?:
1º. Número de alelos que hay en la población, que en este caso es sólo dos. No hay ninguno que sea más
grande o más pequeño, y podemos identificar sólo dos.
2º. Frecuencia de cada alelo, que es el número de alelo dividido por el total de individuos (que es genética
de poblaciones).
3º. Frecuencias genotípicas
4º. Heterocigocidad observada, por ejemplo el número de individuos heterocigotos dividido por el número
total de individuos.
5º. Heterocigocidad esperada bajo Equilibrio Hardy-Weinberg
- Estos son algunos índices con los cuales se pueden evaluar la diversidad, “pero eso igual lo van a ver todo
en genética de poblaciones de seguro”.

*OJO: PREGUNTA: Y esa rayita que está arriba, como al principio, ¿qué es?
- No, ese es DNA que queda en el pocillo. Aquí es donde tu pones el DNA, pero no es una banda.

LOCALIZACIÓN DEL MARCADOR [DIAPO. 60]

- Donde está ubicado el marcador nos puede dar información diferencial y, por lo tanto, cumple objetivos
diferentes.
- En los mamíferos:
• Podemos estudiar el DNA mitocondrial, y así por ejemplo podemos ver un linaje materno. De esa manera,
en genética de poblaciones, estamos viendo si las hembras migran o no.
• Si, por ejemplo, estudio el cromosoma Y o regiones de este o intrones, estamos viendo el linaje paterno.
• Si estamos viendo cromosomas autosómicos, como por ejemplo microsatélites, estoy viendo un linaje
biparental, y ahí tenemos un reflejo de la población de los dos (de machos y de hembras).