Agronomski Fakultet

Zavod za kemiju

Vježbe iz kolegija Biljna biokemija

(skripta za internu upotrebu)

Ak. God. 2021./22.

Priredio:

doc.dr.sc. Nenad Jalšenjak

 1. Vježba

Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije klorofila a i b i karotenoida

U višim biljkama nalazimo dvije glavne grupe pigmenata: klorofile a i b, koji daju biljci karakterističnu
zelenu boju, te žute ili narančaste pigmente karotenoide. Klorofil a je glavni pigment koji apsorbira svjetlo u
kloroplastima zelenih biljaka. Po svojoj građi klorofili su porfirinski kompleksi magnezija s dugim postranim
lancem alkohola fitola. U većini viših biljaka klorofil a i klorofil b se nalaze u omjeru 3:1. Klorofili se
međusobno razlikuju po supstituentu na pirolnom prstenu 2. Klorofil a ima u tom položaju metilnu skupinu,
a klorofil b aldehidnu skupinu. Apsorpcijski spektri klorofila se prema tome razlikuju. Klorofil a pokazuje
jaku apsorpciju u crvenom i plavoljubičastom dijelu spektra, dok su apsorpcijski maksimumi klorofila b u
oba slučaja pomaknuti prema centru spektra.
Karotenoidi su duge poliizoprenoidne molekule, koje na krajevima lanaca imaju nezasićene, supstituirane
cikloheksenske prstenove. Razlikujemo karotene koji u svojoj strukturi ne sadrže kisik i njima strukturno
slične ksantofile koji ga sadrže. Karotenoidi se ubrajaju u tzv. pomoćne pigmente budući da apsorbiranu
energiju mogu prenijeti na klorofil. Karotenoidi apsorbiraju u dijelu spektra u kojem klorofili nisu
djelotvorni i na taj način proširuju spektar djelovanja fotosintetskog aparata.

Postupak:

Odvagne se 0,1- 0,5 g svježeg lišća (npr. peršina) i prenese u tarionik. Lišće se zatim homogenizira u
tarioniku uz dodatak nešto čistog kvarcnog pijeska i 3-4 mL acetona. Dobiveni ekstrakt filtrira se kroz
stakleni filtar u vakuumu. Ekstrakt se ispire nekoliko puta s malim količinama acetona sve dok se posljednja
količina filtrata ne obezboji. Filtrat se prenese u odmjernu tikvicu od 25 mL i nadopuni acetonom. Optička
gustoća (A) filtrata mjeri se na spektrofotometru pri 662, 645 i 470 nm.

/nm A
662
645
470

Koncentracija pigmenta izračuna se iz sljedećih jednadžbi:

ca (klorofil a) = 11,75 ∙ A662 – 2,35 ∙ A645 μg/cm3

cb (klorofil b) = 18,61 ∙ A645 – 3,96 ∙ A662 μg/cm3
cc+x (ukupni karotenoidi) = (1000 ∙ A470 – 2,27 ∙ ca – 81,4 ∙ cb) / 227 μg/cm3

Kemikalije i pribor:

 uzorak lišća
 kvarcni pijesak
 aceton
 satno staklo
 tarionik
 menzura 10 mL 2
 špatula
Slika 1. Apsorpcijski spektri klorofila a i b

3
 2. Vježba

Razgradnja škroba amilazom

Za vrijeme klijanja, zrna pšenice (kao i zrna drugih žitarica) sintetiziraju amilazu. Amilaza djeluje na
pohranjeni škrob, pri čemu nastaje šećer potreban za razvoj embrija.

Pri mjerenju aktivnosti enzima mjeri se promjena koncentracije supstrata ili pak promjena koncentracije
produkta. U ovoj vježbi studenti prate vremenski tijek reakcije razgradnje škroba djelovanjem amilaze, te
ovisnost enzimske aktivnosti o pH i temperaturi.

1. Dio vježbe - vremenski tijek reakcije:

Označiti 9 test epruveta. Za svaki označeni vremenski period napraviti mjerenje.

Mjerno vrijeme, t/min = 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, i 10

U svaku epruvetu dodati po 2 ml škroba otopljenog u puferu pH 5. U posebnu epruvetu staviti 2 mL

destilirane vode umjesto škroba koja će poslužiti kao kontrola.

Menzurom dodati 7 mL 1 mol/dm 3 HCl u epruvetu t = 0 i u kontrolnu epruvetu. U preostale epruvete dodati
po 1 mL enzima i zabilježiti vrijeme početka reakcije. Nakon naznačenog vremena zaustaviti reakciju
dodatkom još 7 mL 1 mol/dm 3 HCl i promućkati sadržaj epruvete. Zatim u svaku epruvetu dodati po 1 mL
otopine joda. Otopina joda oboji otopinu škroba u plavo.

Očitati apsorbanciju na spektrofotometru pri 580 nm. Kontrolu upotrijebiti za određivanje nultočke
instrumenta. Upisati dobivene vrijednosti u tablicu u bilježnici. Od dobivene vrijednosti odbiti apsorbanciju
kontrole.

t/min 0 0.5 1 2 3 4 5 10 K
V(škrob) 2 mL 2 ml
H2O
V(enzim) 1 mL 1 mL
V(HCl) 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL
nakon nakon nakon nakon nakon nakon nakon
komentar odmah odmah
0.5 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 10 min
V(indikator) 1 mL 1 mL
komentar na kraju na kraju

Obrada mjernih podataka:

Postotni udio hidroliziranog škroba (%) računa se prema izrazu:

% = (Z/X) ∙100

Z=X-Y

4
Gdje X označuje količinu škroba na početku reakcije t = 0, a Y označuje količinu škroba u vremenu t. Prema
tome, Z predstavlja količinu hidroliziranog škroba u vremenu t.

Nacrtati ovisnost postotnog udjela hidroliziranog škroba (ordinata) o vremenu izraženom u minutama
(apscisa).

Slika 2. Graf ovisnosti udjela hidroliziranog škroba o trajanju reakcije

2. Dio vježbe - utjecaj pH na reakciju:

Označiti 6 test epruveta.

pH vrijednosti, pH = 3, 4, 5, 6 i 7

Dodati 2 mL otopine škroba u puferu odgovarajućeg pH u epruvete. Pustiti odvijanje reakcija onoliko
vremena koliko je potrebno za hidrolizu oko 75 % škroba (potrebno vrijeme očitati iz grafa dobivenog u
prethodnom pokusu) ili 50% ukoliko je reakcija spora. Dodati 1 mL otopine enzima u svaku epruvetu, te
zabilježiti vrijeme početka reakcije za svaku epruvetu. Po isteku vremena dodati 7 mL 1 mol/dm 3 HCl i
protresti sadržaj epruvete. Potom, u svaku epruvetu dodati po 1 mL otopine joda. Očitati apsorbanciju na
spektrofotometru pri 580 nm. Upisati dobivene vrijednosti u tablicu u bilježnici. Od dobivene vrijednosti
odbiti apsorbanciju kontrole.

pH 3 4 5 6 7 K
V(škrob) 2 mL 2 ml
H2O
V(enzim) 1 mL 1 mL
V(HCl) 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL
komentar istovremeno odmah
V(indikator) 1 mL 1 mL
komentar na kraju na kraju

Izračunati postotni udio hidroliziranog škroba i nacrtati ovisnost postotnog udjela hidroliziranog škroba o
pH.

5
 Slika 3. Graf ovisnosti udjela hidroliziranog škroba o pH vrijednosti medija

Reagensi:

 Citratni pufer (limunska kiselina i natrijev citrat (10 mmol/dm 3), pH 5, ohlađen).
 1 mol/dm3 HCl
 Otopina joda: 5 g KI, 0,36 g KIO3 u 1 dm3 2 mmol/dm3 NaOH
 0,05 % otopina škroba u 0,05 mol/dm3 citratnog pufera kod pH 3, 4, 5, 6, 7

Priprava 10 mmol/dm3 citratnog pufera pH 5:

Prirediti 500 mL 10 mmol/dm3 natrijevog citrata (1,47 g/500 mL) i 250 mL 10 mmol/dm 3 limunske kiseline
(0,53 g/250 mL). Držati u hladnjaku.

Pomiješati 325 mL 10 mmol/dm3 natrijevog citrata i 175 mL 10 mmol/dm 3 limunske kiseline. Dobiva se 500
mL pufera pH 5. Potrebno je provjeriti pH!

Priprava 1 mol/dm3 HCl:

Odmjeriti 124,5 mL konc. HCl i nadopuniti destiliranom vodom do 1500 mL.

Priprava citratnih pufera pH 3, 4, 5, 6:

Prirediti štok otopine:

500 mL 0,05 mol/dm3 natrijevog citrata (7,35 g/500 mL)

500 mL 0,05 mol/dm3 limunske kiseline (5,25 g/500mL)

6
Pufere prirediti prema sljedećoj tablici:

pH Natrijev citrat/mL Limunska kiselina/mL Ukupna količina/mL

3 6,3 83,7 90
4 31,0 59,0 90
5 265,5 184,5 450
6 72,9 17,1 90

Priprava fosfatnih pufera pH 7, 8:

Prirediti štok otopine:

50 mL 0,05 mol/dm3 KH2PO4 (0,34 g/50 mL)

500 mL 0,05 mol/dm3 K2HPO4 (1,3 g/150mL)

Pufere prirediti prema sljedećoj tablici:

pH KH2PO4/mL K2HPO4/mL Ukupna količina/mL

7 35,1 54,9 90
8 4,8 85,2 90

Priprava 0,5 % štok otopine škroba:

Prokuhati 1,0 g škroba u 200 mL vode. Provjeriti volumen nakon kuhanja.

Priprava 0,05 % otopine škroba u pripremljenim puferskim otopinama:

Dodati po 10 mL štok otopine škroba u po 90 mL pufera pH 3, 4, 6, 7 i 8, čime se dobiva 100 mL gotove

otopine.

Dodati 50 mL štok otopine škroba u 450 mL pufera pH 5, čime se dobiva 500 mL gotove otopine.

Priprava otopine -amilaze:

Otopi se 0.010 g pripravka -amilaze ječma u 10 mL vode. Od te se otopine razrjeđenjem 7,5 mL u

25 mL vode dobije radna otopina. Čuvati u hladnjaku, izvaditi 24h prije vježbe.

7
 3. Vježba
Hillova reakcija

Kada se izolirani kloroplasti osvijetle u prisutnosti odgovarajućeg oksidacijskog sredstva dolazi do razvijanja
kisika uz istovremenu redukciju dodanog akceptora elektrona. Ova reakcija, nazvana prema njenom
pronalazaču engleskom znanstveniku Robertu Hillu, može se prikazati sljedećom općom jednadžbom:

2H2O + 2A 2AH2 + O2

gdje je: A nefiziološki akceptor elektrona, a AH2 njegov reducirani oblik.

U ovoj reakciji voda je donor elektrona, a kao akceptor (Hillov reagens) može poslužiti 2,6-
diklorfenolindofenol (DCPIP), spoj plave boje u oksidiranom, a bezbojan u reduciranom obliku. U slučaju
DCPIP-a reakcija glasi:

Izolacija kloroplasta špinata

Odvagne se 20 g ispranog svježeg lišća špinata s kojeg se prethodno uklone peteljke i oštećeni dijelovi. Lišće
se posuši filter papirom te usitni. Usitnjeni biljni materijal prenese se u mikser, koji sadrži 40 mL hladnog
izolacijskog medija (0,4 mol/dm3 saharoze, 0,3 mol/dm3 NaCl i 0,02 mol/dm3 tris pufera pH = 7,5). Smjesa
se homogenizira 15 sekundi pri maksimalnoj brzini miksera. Nakon što se ukloni biljni materijal sa stjenki
miksera, smjesa se ponovno homogenizira 10 sekundi. Homogenizirana smjesa se profiltrira kroz 4 sloja
gaze, a filtrat se skuplja u prethodno ohlađenu kivetu za centrifugiranje.

Slika 4. Suspenzija kloroplasta prije (lijevo) i nakon (desno) centrifugiranja.

8
Filtrat se centrifugira 1 minutu kod 1400 RPM. Supernatant se dekantira u čistu ohlađenu kivetu i ponovno
centrifugira 5 minuta pri 3500 RPM (slike). Supernatant se ovoga puta odbaci, a talog se suspendira u 10 mL
hladnog izolacijskog medija pomoću staklenog štapića. Suspenzija kloroplasta se čuva na ledu. Pripravi se
otopina za mjerenje razrjeđenjem 1 mL suspenzije kloroplasta u 10 mL izolacijskog medija.

Hillova reakcija

Spektrofotometar se podesi na valnu duljinu 600 nm.

Da bi odredili učinak koncentracije klorofila i intenziteta svjetla na brzinu redukcije DCPIP-a, u epruvete se
dodaju sljedeće inkubacijske smjese:

Izolacijski Suspenzija
Epruveta de-H2O / mL DCPIP / mL
medij / mL kloroplasta* / mL
0 3,5 1 0,5 -
1 3,5 0,5 0,5 0,5
2 3,5 0,5 0,5 0,5
*Dodaje se neposredno prije mjerenja

Epruveta 0 služi kao "slijepa" proba prema kojoj se mjeri optička gustoća uzoraka 1 i 2, ali i kao dokaz da se
boja DCPIP-a ne gubi stajanjem ili nekim drugim procesom.

Epruveta 1 služi kao neosvijetljena kontrola i omotana je s dva sloja aluminijske folije.

Smjese je potrebno dodavati redoslijedom navedenim u tablici, a nakon dodavanja prethodno izmješane
suspenzije kloroplasta epruvete je potrebno vorteksirati 5-10 sekundi i zapisati vrijeme. Odmah zatim uzorak
se prelije u kivetu i mjeri se apsorbancija uzoraka, a potom se uzorci osvjetljavaju tijekom 15 minuta.
Mjerenje se pritom ponavlja svake 3 minute. Smanjenje mjerene apsorbancije pokazuje smanjenje
koncentracije DCPIP-a, odnosno napredovanje reakcije.

= 600 nm
Epruveta 0 min 3 min 6 min 9 min
0
1
2

Na grafu prikažite ukupnu promjenu apsorbancije s vremenom.

9
Slika 5. Lijevo: Epruvete broj 1 i 2 nakon provedene Hillove reakcije. Desno: S epruvete broj 1
uklonjena zaštitna folija. Uočiti boju reakcijske smjese u lijevoj epruveti.

Kemikalije i pribor:

 Približno 40 g svježeg špinata,

 izolacijski medij, 1000 ml (0,4 mol/dm 3 saharoze, 0,35 mol/dm3 NaCl i 0,02 mol/dm 3 tris pufera
podešenog na pH = 7.5 s 10-12 mL 1M HCl),
 DCPIP 100 mL, 4x10-4 mol/dm3 u vodi, čuvati u hladnjaku omotano folijom. Prije upotrebe
razrijediti 2 mL stock otopine vodom u tikvici od 10 mL.

 epruvete,
 pipete,
 mikser,
 izvor svjetlosti,
 odmjerne tikvice, 25 mL,
 centrifuga,
 kivete za cetrifugiranje,
 vaga,
 spektrofotometar s kivetama od 1 cm

10
 4. Vježba

Analiza vitamina C

Vitamin C ili askorbinska kiselina je vitamin topljiv u vodi. Važan je antioksidans, sudjeluje u metabolizmu
masnih kiselina, sintezi kolagena i karnitina. Izuzetno je nestabilan te gubi aktivnost kuhanjem ili
skladištenjem. Glavni izvor vitamina C su biljke, naročito šipak, crvena paprika, svježi špinat, svježi i kiseli
kupus, limun, naranče i jabuke. Dnevna količina potrebna organizmu je oko 60 mg.

Izvor vitamina C Količina vitamina C / mg u 100 g biljke

Šipak 2000
Crvena paprika 190
Kivi 90
Kiseli kupus 50
Naranča 50
Limun 40
Mandarina 30
Špinat 30

U organizmu se askorbinska kiselina reverzibilno oksidira do dehidroaskorbinske kiseline sa potpunom

vitaminskom aktivnošću.
Ravnotežna reakcija oksidacije askorbinske kiseline jest:

Određivanje koncentracije vitamina C titracijom s otopinom kalijevog jodida

Redoks titracija s otopinom kalijevog jodida jedan je od načina određivanja koncentracije vitamina C.
Kako je jod relativno netopljiv u vodi, to se u otopinu mora dodati kalijev jodid. Na ovaj način nastaje
kalijev trijodid (KI3), čime se bitno povećava topljivost joda.
Trijodid oksidira vitamin C do dehidroaskorbinske kiseline:

C6H8O6(aq) + I3- + H2O C6H6O6(aq) + 3I- + 2H+

Postupak:

Pripremiti standardne otopine vitamina C te otopinu uzorka.

Titracija standardne otopine vitamina C:

U Erlenmeyerovu tikvicu od 250 mL pipetirati 25 mL standarde otopine vitamina C koncentracije 0,5
mg/mL. Dodati 10 kapi otopine škroba i smjesu titrirati otopinom joda uz stalno miješanje. Titracija završava
pojavom plavo-ljubičaste boje koja traje duže od 20 sekundi (slika). Zapisati utrošak otopine joda pri titraciji,
a titraciju ponoviti 3 puta.

11
Na isti se način provodi i titracija uzorka.

Kako je vitamin C nestabilan, to se titracija mora provoditi sa svježe pripremljenim otopinama vitamina C,
koje je potrebno čuvati na tamnom mjestu.

Račun:

U 25 mL standardne otopine vitamina C koncentracije 0,5 mg/mL, masa vitamina C je ms = 12,5 mg.

Iz podatka o volumenu utrošene otopine jodida prilikom titracije standardne otopine vitamina (Vs) možemo
izračunati volumen jodida potreban za titraciju 1 mg vitamina C, V (1 mg, vit. C):

12.5 Vs
V otop . jodida za standard =V = mg/mL V (1 mg, vit. C) =
Vs ms

Prema tome, iz volumena utrošenog jodida za titraciju uzorka (Vu) lako se računa masa vitamina C (mu) u
uzorku:

12.5
m u= =4 V u mg /100 mL mu = V (1 mg, vit. C) ∙ Vu
Vs

Zadatak je odrediti masu vitamina C u 100 mL uzorka i usporediti dobivenu količinu s deklariranom
količinom vitamina C u proizvodu.

Slika 6. Erlenmeyerova tikvica s uzorkom vitamina C u točki završetka titracije; uočiti boju

12
Reagensi:

 Otopina škroba:
0,50 g škroba otopiti u 50 mL zagrijane vode.

 Otopina jodida:
5 g kalijevog jodida (KI) i 0,268 g kalijevog jodata (KIO 3) otopiti u 200 mL destilirane vode. Dodati
12 mL konc. sumporne kiseline i dopuniti vodom do oznake volumena 500 mL.

 Standardna otopina vitamina C (pripraviti svježe):

0,125 g vitamina C otopiti u 250 mL destilirane vode da bi se postigla koncentracija od 0,5 mg/mL.

 Uzorak vitaminskog pripravka:

5 g vitaminskog pripravka otopiti u 100 mL destilirane vode.
Deklarirano: 1 g vitaminskog pripravka sadrži _______ mg vitamina C (5g vaganog uzorka tj. 100
mL otopine uzorka sadrži _______ mg vitamina C).

13