Universidad del Valle de México

Protocolo de PCR
Camila Legaspi Blanco
Asignatura: Biología Molecular I
Licenciatura QFBT
Periodo 2022-1
Fecha de entrega: 10 de mayo del 2022
Docente: Llamas García Miriam Livier

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar
secuencias de ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar
la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para
ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada.
Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la secuencia en estudio en sólo unas pocas
horas. (Reacción En Cadena de La Polimerasa (PCR) | NHGRI, 2022)

La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Polymerase Chain Reaction), creada y

desarrollada por Millis y col. de la Cetus Corporation, ha devenido una poderosa herramienta que
cumple con los requisitos de especificidad y sensibilidad que exigen la caracterización de los ácidos
nucleicos, pudiendo detectar con ella de forma fácil la presencia de estas biomoléculas en una
muestra, aun cuando sus cantidades se enmarcan en el orden de los picogramos. La PCR es un método
enzimático in vitro que permite la amplificación de una secuencia específica del ADN.
Esta técnica se basa en el uso de dos oligonucleótidos que luego de reconocer la secuencia
complementaria en la molécula de ADN, son alargados cíclicamente mediado por la acción de la
ADN Polimerasa. Cada ciclo de la técnica generalmente 20 ó 30 en total, implica la desnaturalización
del ADN, el apareamiento de los oligonucleótidos y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir
del oligonucleótido, lo que resulta en un crecimiento exponencial de millones de copias del fragmento
seleccionado. La reacción de síntesis es catalizada por una ADN Polimerasa termoestable, obtenida
del Thermus aquaticus. (Amado, 2022)
Procedimiento
Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos:
a. Desnaturalización
b. Alineación
c. Extensión
 Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna
las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR
(generalmente entre 30 y 40 ciclos).
Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor.
El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce
como “desnaturalización".
Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas
temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más
fuertes, permanecen intactos.
Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.
El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de
aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.
Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir
de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’
al final para ayudar a la detección.
Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that
was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked
by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence.
Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la
secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta
especificidad.
Paso 3º PCR: Extensión
Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura
se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus
aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza
el proceso de síntesis en la región marcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN
de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios
que quedan libres en la solución (dNTPs).
La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada
una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a
3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador,
construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN.
Final del primer ciclo de PCR
Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original.
Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas
tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no
queda definido.
Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud más definida sirve como
plantilla para la nueva secuencia sintetizada.
La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que está limitada por
el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES.
Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, están presentes
en un número mucho mayor que las secuencias de longitud variable.
En otras palabras, la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se
amplifica. (Laboratorio de Diagnóstico Molecular, 2022)
Bibliografía
1. Laboratorio de diagnóstico molecular. (2022). Roche.com.ar.
https://www.roche.com.ar/es/productos/diagnostica/diagnostico_de_laboratorio/laboratorio
_de_diagnostico_molecular.html
2. Amado, P. (2022). Reacción en cadena de la polimerasa. Revista Archivo Médico de
Camagüey, 3(2). http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-
02551999000200011#:~:text=La%20PCR%20es%20un%20m%C3%A9todo,acci%C3%B3
n%20de%20la%20ADN%20Polimerasa.
3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | NHGRI. (2022). Genome.gov.
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa