TUMSAT-OACIS Repository - Tokyo University of Marine Science and Technology (東京海洋大学)

低温ならびに中温性ヒスタミン生成菌の挙動と迅速
同定法に関する研究

著者 通堂 裕子
学位名 博士(海洋科学)
学位授与機関 東京海洋大学
学位授与年度 2013
学位授与番号 12614博甲第319号
URL http://id.nii.ac.jp/1342/00000987/
 博士学位論文

低温ならびに中温性ヒスタミン生成菌の挙動と

迅速同定法に関する研究

平成 25 年度

（2014 年 3 月）

東京海洋大学大学院

海洋科学技術研究科

応用生命科学専攻

通堂 裕子
 目次

序論 ・・・・・・2

第1章 鮮魚における低温性および中温性ヒスタミン生成菌の
分布 ・・・・・・8
1.1 緒言 ・・・・・・8
1.2 実験方法 ・・・・・・9
1.3 結果 ・・・・・・11
1.4 考察 ・・・・・・12
図表 ・・・・・・16

第2章 低温性ヒスタミン生成菌 Photobacterium phosphoreum および

P. iliopiscarium の低温保存下における魚肉中での挙動 ・・・・・・22
2.1 緒言 ・・・・・・22
2.2 実験方法 ・・・・・・22
2.3 結果 ・・・・・・24
2.4 考察 ・・・・・・25
図表 ・・・・・・27

第3章 高感度融解曲線解析（HRMA）を用いた
ヒスタミン生成菌の迅速同定法の検討 ・・・・・・31
3.1 緒言 ・・・・・・31
3.2 実験方法 ・・・・・・32
3.3 結果 ・・・・・・35
3.4 考察 ・・・・・・35
図表 ・・・・・・38

総括 ・・・・・・48

参考文献 ・・・・・・50

謝辞 ・・・・・・62

1
 序論

ヒスタミン（Hm）食中毒、またはアレルギー様食中毒と呼ばれる食中毒は、宮
木らによって Hm が原因となって発生することが報告され（Miyaki, 1954）、主に発
疹・蕁麻疹・顔面の紅潮・吐き気および頭痛など、アレルギーに類似した症状を示
す食中毒である（Taylor, 1985）。その症状は主に摂食後、10 分から 1 時間程度で発
症し、症状の程度は患者の感受性によって異なるとされている。症状は通常 24 時
間程度で治まるが、完治に数日要する場合もある（Hungerford, 2010）。Hm は、あ
る種の微生物が有するヒスチジン脱炭酸酵素（histidine decarboxylase; HDC）によっ
て、食品中のアミノ酸であるヒスチジンが脱炭酸されることで生成される（Fig. 1）
（Kimata and Kawai, 1953; Lerke et al., 1978）。Hm 食中毒は、主に水産食品を原因と
して発生し、中でも一般的な赤身魚、特にサバ科に属する赤身魚は遊離ヒスチジン
含量が 700～1,800 mg/100 g と非常に高いため（Auerswald et al., 2006）、原因食品と
なりやすい（Lehane and Olley, 2000）。また、赤身魚以外でも、シイラやサバヒーと
いった一部の白身魚において発生事例が報告されている（Chen et al., 2011; Tsai et
。
al., 2005）
Hm 食中毒は、世界中で発生が報告されており、日本においては 1950 年代初頭
には主な食中毒として多数報告され、1970-1980 年の 10 年間には 4122 件の報告が
みられた（Lehane and Olley, 2000）。日本においては、干物や調理品における発生が
多く、アメリカなど諸外国においては缶詰などにおける発生が多い（戸田ら, 2009）。
低温貯蔵技術が普及するとともに衛生管理が徹底されるようになったことで、Hm
食中毒の発生件数は減少し、日本においては、現在ではその発生数は年数件から十
数件程度となっている（Fig. 2）（山中英明ら, 2012）。しかし、Hm 食中毒が学校給
食など大量調理施設で発生した際には、100 名以上の患者を出すような大きな被害
を起こす場合があり（戸田ら, 2009）、2009 年には学校給食のマグロごまフライを
原因として 279 名の、2013 年には保育園給食のイワシつみれ汁を原因として 109
名の患者を出した事例がある（厚生労働省, 食中毒事件一覧速報
〔http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.html〕）。そのため、Hm 食中毒は現在に
おいても食品衛生上重要な問題であると考えられている。Hm は加熱や凍結に対し
て非常に安定であることから、一度食品中に蓄積した場合、加工・調理工程におけ
る除去は困難である。そのため、Hm 食中毒を予防する上では Hm 蓄積の抑制が重
要である。
HDC を有する Hm 生成菌として、これまでに多くの菌種が報告されている。グ
ラム陽性菌では、ピルボイル依存型の HDC を有する（Recsei and Snell, 1985）

2
Clostridium perfringens（Yoshinaga and Frank, 1982）、Lactobacillus buchneri（Martín et
、Tetragenococcus muriaticus（Kimura et al., 2001）、Streptococcus thermophilus
al., 2005）
（Calles-Enríquez et al., 2010）および Oenococcus oeni（Coton et al., 1998）等の複数
の菌種が Hm 生成菌として報告されており、菌種は主にワイン、チーズおよび魚醤
などの発酵食品からの分離が報告されている。グラム陰性菌では、Enterobacter
aerogenes（Enjalbert et al., 1979）、Raoultella planticola（Kanki et al., 2002）、Morganella
morgani（川端ら, 1956）を始めとした腸内細菌科菌群や Photobacterium phosphoreum
（Fujii et al., 1997）や Photobacterium damselae subsp. damselae（Kimura et al., 2000;
Takahashi et al., 2008）を始めとした海洋性細菌など多様な菌種が Hm 生成菌として
報告されている。これらの菌種は、主に鮮魚や、発酵食品を除く水産食品からの分
離が報告され、ピリドキサール型の HDC を有している（Kamath et al., 1991）。
鮮魚および発酵食品以外の水産食品における Hm 食中毒の主な原因菌としては、
グラム陰性で 30-37ºC が至適温度である中温増殖性を有する M. morganii、E.
aerogenes、R. planticola および R. ornitinolytica 等が報告されてきた（Behling and
Taylor, 1982）。そのため、低温保存・流通下において厳密な温度管理を行う事が Hm
食中毒の予防を行う上で重要だと考えられてきた。しかし、低温貯蔵技術が普及し、
温度管理が徹底的に行われるようになった現在でも、Hm 食中毒は散発的であるも
のの発生し続けている（Fig. 2）。
低温性 Hm 生成菌に関する研究は、Okuzumi ら以降複数報告されている（Okuzumi
et al., 1981; 与口ら, 1990b; Morii et al., 1995, 2006; Kanki et al., 2007）Okuzumi et al.
（1981）は、低温性かつ好塩性 Hm 生成菌をマサバより分離し、N 菌群と命名した。
これら N 菌群の一部は後に P. phosphoreum として同定された（Fujii et al., 1997）。
Morii らは鮮魚より発光細菌として P. phosphoreum を分離し、低温下における魚肉
中での Hm 生成を報告した（Morii et al., 1988）。これまでに低温性 Hm 生成菌の
Hm 生成能に環境因子が与える影響に関する研究（栗原ら, 1993a, 1993b; 森井ら,
1994; Morii and Kasama, 1995, 2004）や、HDC 遺伝子（hdc）に関する研究（Kanki et
al., 2007; Morii et al., 2006）が報告されている。さらに、P. phosphoreum は、Hm 食
中毒の原因菌として分離された例も報告されている（Kanki et al., 2004）。同様に
低 温 下 で 高 い Hm 生 成 能 を 示 す Hm 食 中 毒 の 原 因 菌 と し て Morganella
psychrotolerans も報告されている（Emborg et al., 2006）。このように一部の低温性
Hm 生成菌に関して報告があるものの、低温性 Hm 生成菌が原因となって報告され
た Hm 食中毒発生事例は少数であり、なおかつ食中毒発生事例においては原因菌が
明確となっていない事例が存在する。そのため、低温性 Hm 生成菌による食中毒リ
スクに関する詳細な検討を行う事が重要であると考えられる。

3
 前述のように Hm 生成菌は多様な菌種が報告されており、Hm 食中毒の原因究明
を行う際には原因菌の検出および正確な菌種同定が必要とされている。通常 Hm 生
成菌の同定には、Niven 培地など Hm 生成による培地の pH 上昇を利用した培養法
で検出の後、各種性状試験を利用したキット（api、VIDAS、VITEK など）や 16S
ribosomal DNA（rDNA）配列の相同性検索を用いた同定が行われている。しかし、
これらの手法は長い時間を必要とすることから、早急な原因究明を必要とする場合
には、より迅速に行える同定法が必要である。今まで確認されているグラム陰性
Hm 生成菌は、同一のピリドキサールリン酸依存型 HDC を有しており、なおかつ
これらの菌種の hdc 遺伝子は 16S rDNA 遺伝子と同等の解析能を有し、同定に利用
する事が可能である事が報告されている（Takahashi et al., 2003）。さらに迅速同定
法に関する研究も single-strand conformation polymorphism（SSCP）法（Takahashi et al.,
2003, 2007）が報告されている。しかし、本手法は煩雑な手法を必要とする場合が
あることから、さらに簡便な手法が求められている
本研究においては、Hm 食中毒の防止に寄与する事を目的とし、鮮魚における低
温性および中温性 Hm 生成菌の分布を調べると共に、冷蔵保存下における低温性
Hm 生成菌の挙動を調べた。また、hdc 遺伝子を用いた迅速同定法の検討を行った。
以下の検討を行った。第 1 章においては、アジ、サバ、マグロなどの赤身魚を中
心とした魚種を対象に、低温性および中温性 Hm 生成菌の分離・同定を行った。第
2 章においては、第 1 章において分離された菌株のうち、高い Hm 生成能の高い低
温性 Hm 生成菌 2 株を魚肉に接種し、4°C、10°C および 15°C で保存した場合の、
Hm 蓄積量の変化を検証した。第 3 章では、Hm 生成菌の迅速同定を目的に中温性
および低温性 Hm 生成菌の hdc 遺伝子を対象とした PCR-高感度融解曲線解析
（High-resolution melting analysis）の検討を行った。。

本論文の内容の一部は、以下の通り公表済みもしくは公表予定である。
【学術論文】
Yuko Torido, Hajime Takahashi, Takashi Kuda and Bon Kimura. 2012. Analysis of the
growth of histamine-producing bacteria and histamine accumulation in fish during storage
at low temperature. Food Control. 26, 174-177.
Yuko Torido, Hajime Takahashi, Satoko Miya, Takashi Kuda and Bon Kimura. Distribution
of psychrophilic and mesophilic histamine-producing bacteria in retailed fish in Japan.
Food Control. 審査中

【学会発表】

4
○
通堂裕子， 高橋肇，久田孝，木村凡. 鮮魚におけるヒスタミン生成菌の分布及
び低温下におけるヒスタミン生成菌の挙動について. 日本水産学会（2010 年 9 月、
京都）
○
通堂裕子，郷田実穂，高橋肇，久田孝，木村凡．市販鮮魚におけるヒスタミン生
成菌の汚染状況調査と低温性ヒスタミン生成菌の遺伝子解析に関する研究. 日本
水産学会（2012 年 3 月、東京）

5
 COOH CO2
NH2
NH2

NH N
NH N

Histamine-producing bacteria
Histidine decarboxylase

Fig. 1 Histidine decarboxylase reaction of Hm producing bacteria.

6
 25 550 600

Number of Hm food poisonings 500

20 438

400

Number of patients
15
300
10 194
162 165 172 200
111 113
5 73 100
32

0 0
2004200520062007200820092010201120122013
Year

Fig. 2 Numbers of Hm food poisonings and patients in Japan from 2004 to 2013.
Referred from database of food poisoning reported from Ministry of Health, Labour and
Welfare (http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.html).

7
 第1章 鮮魚における低温性および中温性ヒスタミン生成菌の分布

1.1．緒言

Hm 食中毒の多くは水産食品で発生し、主に加工・流通下において温度管理の不
備が発生することによって引き起こされていると考えられている。そのため、Hm
食中毒の予防を行うためには、徹底した温度管理が必要不可欠とされている
（Guizani et al., 2005; Kim et al., 2009; Kim et al., 2001, 2002; Tsai et al., 2005）。アメ
リカ食品医薬品局（U. S. Food and Drug Administration; FDA）は迅速な冷凍もしくは
華氏 40°C（摂氏 4.4°C）以下での保存を推奨している（FDA, 2011）。近年では、徹
底した温度管理の実施と低温流通の発達によって、Hm 食中毒の発生数は減少した
とされているが、現在でも世界中において散発的な発生が報告されている（Lehane
and Olley, 2000; 戸田ら, 2009）。現在我が国においても、年数件から十数件の発生
事例が報告されている（Fig. 2）
。
そのような近年の Hm 食中毒発生状況から、温度管理における不備の発生以外の
要因が存在している可能性が考えられた。さらに、過去の報告において冷蔵下の水
産食品を対象に Hm 量を調査した結果、31%のサンプルで平均 500 mg/kg 以上の Hm
蓄積が確認された例も存在する事から（Dalgaard et al., 2008）、低温性 Hm 生成菌
が原因となって発生している可能性が考えられた。このように、中温性 Hm 生成菌
のみならず低温性 Hm 生成菌が食品中において Hm 蓄積を引き起こしている可能性
がある上、近年の Hm 食中毒事例の中には、原因菌が明確となっていない事例
（Chang et al., 2008）が存在することから、Hm 蓄積の原因究明が困難な場合が存在
する。
現在まで Hm 食中毒、特に発酵食品を除く水産食品における事例において、主に
グラム陰性の Hm 生成菌が原因菌として分離されている。グラム陰性の Hm 生成菌
のうち、中温性 Hm 生成菌としては Morganella morganii、Enterobacter aerogenes、
Raoultella planticola、 R. ornithinolytica（Kanki et al., 2002）、Proteus vulagaris（Kim et
al., 2001）など腸内細菌科菌群に属する菌種や、海洋性細菌である Photobacterium
damselae subsp. damselae や Vibrio parahaemolyticus、V. alginolyticus（Kim et al., 2001）
が分離されている。特に、M. morganii は広範囲の魚種の腐敗サンプルからの分離
例が多数報告されるとともに、高い Hm 生成能を示す（Kim et al., 2003）。そのため、
M. morganii は最も代表的な中温性 Hm 生成菌として考えられている。
一方低温性 Hm 生成菌としては、P. phosphoreum や M. psychrotolerans（Emborg et
al., 2005, 2006）が分離されている。P. phosphoreum は低温下において高い Hm 生成

8
能を示すことが報告されており（Emborg et al., 2005）、0°C においても Hm 蓄積が
確認されたという報告例もある（Morii et al., 1988）。本菌は 15°C 以下では M.
morganii よりも高い Hm 生成能を示す場合があることも知られおり（Lehane and
Olley, 2000）、食中毒の原因菌としても報告されている（Kanki et al., 2004）。しかし
ながらこれまでに報告されている Hm 生成菌における鮮魚および水産食品からの
分離に関する研究の多くは、中温性 Hm 生成菌のみ対象としており（Allen et al.,
2005; Kim et al., 2009; Koohdar et al., 2011; Kung et al., 2010; López-Sabater et al., 1994;
与口ら, 1990a）、低温性 Hm 生成菌を対象とした研究は少数だった（Okuzumi et al.,
1981; 与口ら, 1990b）。これらの研究において多様な魚種において同一サンプルか
ら低温性および中温性 Hm 生成菌を同時に分離し、遺伝子的手法を用いた同定を行
った例はない。
そのため、本章では、広範囲の魚種を対象とし、低温性および中温性 Hm 生成菌
を培養法によって検出し、16S rDNA 配列を用いた菌種同定を行った。

1.2. 実験方法

1.2.1．食品サンプル
本実験で用いたサンプルは、2008 年 3 月から 2010 年 11 月に東京および埼玉の
小売店で購入した生鮮マグロ（Thunnus spp.）、アジ（Trachurus japonicus）、サバ
（Scomber spp.）、カツオ（Katsuwonus pelamis）、サンマ（Cololabis saira）、イワシ
（Sardinops melanostictus, Etrumeus teres）、イサキ（Parapristipoma trilineatum）、ブ
リ（Seriola quinqueradiata）、メカジキ（Xiphiidae gladius）、トビウオ（Cypselurus
pinnatibarbatus japonicus）およびニシン（Clupea pallasii）、計 143 サンプルを用い
た（Table 1）。

1.2.2. 鮮魚からの Hm 生成菌の分離

Hm 生成菌の分離方法は Takahashi et al.（2003）の方法に基づいて行った。すな
わち各サンプルの表皮および周辺の魚肉を 10 g を無菌的に測り取り、ヒスチジン
ブロス（Bacto Peptone [Becton, Dickinson, and Company（BD）、Franklin Lakes、New
Jersey] 10 g、Bacto Yeast Extract [BD] 3 g、glucose [和光純薬工業、大阪] 5 g および
L-histidine [和光] 5 g を 50%人工海水 [Artificial seawater: ASW] [NaCl 23.5 g、KCl
0.66 g、Na2SO4 4.9 g、MgCl2・6H2O 10.6 g および CaCl2・2H2O 0.9 g を蒸留水 1 L
に溶解] [Smith et al., 1991]に溶解後、pH 5 に調整） 90 mL を加え、懸濁した。懸濁
後、各懸濁液を 15°C、48 時間（低温性 Hm 生成菌分離用）および 30°C、24 時間

9
（中温性 Hm 生成菌分離用）で培養した。その後、ペーパークロマトグラフィーを
用いて Hm の検出を行った。ペーパークロマトグラフィーは、以下の方法で行った。
培養液 5 μL を展開液（100% 1-butanol [国産化学、東京]: ammonium solution [国産化
学]=1:1 で混合）によって濾紙に展開した。室温で濾紙を乾燥させた後、反応液 A
（0.5% sulfanic acid [国産化学]+0.1% HCl: 1% NaNO2 を 1:1 で混合）および反応液 B
（Na2CO3 飽和溶液）を噴霧し、赤色を示したサンプルを Hm 陽性とした（Miyaki,
1954）。陽性サンプルの培養液を Niven 培地（Bacto Tryptone [BD] 5 g、Yeast extract
[BD] 5 g、L-histidine [和光] 27 g, CaCO3 [関東化学、東京] 1 g、0.4% bromocresol purple
[東京化成工業、東京] 15 mL および寒天 [国産化学] 20 g を 50% ASW 1 L に溶解後、
pH 5 に調整）（Niven et al., 1981）に画線し、30°C、24 時間および 15°C、72 時間
で培養した。周辺の培地が明るい紫色に変色したコロニーのうち、5～10 コロニー
を釣菌し、ヒスチジンブロスに接種した。30°C、24 時間もしくは 15°C、48 時間培
養後、5 μL をペーパークロマトグラフィーに供し、Hm が検出されたものを Hm 陽
性菌とした。

1.2.3. 分離菌の Hm 生成能の確認

Hm 陽性菌を 30°C、24 時間および 15°C、48 時間で前培養後、終濃度 106 cfu/mL
となるようにヒスチジンブロスに接種し、30°C 分離菌を 30°C、24 時間で、15°C
分離菌を 15°C、48 時間で培養後、0.2-μm フィルター（東洋濾紙、東京）でろ過滅
菌した。ろ液中の Hm 量をチェックカラーヒスタミン（キッコーマン、千葉）を用
いて測定し（Sato et al., 2005）、100 mg/L 以上の Hm 生成が確認されたものを Hm
生成菌とした。その際、同サンプルからの分離菌のうち、同菌種と同定され、なお
かつ同等の Hm 生成能を有する菌が 2 つ以上ある場合、それらの菌を同一株とした。
本研究では、30°C で分離された菌株を中温性 Hm 生成菌、15°C で分離された菌株
を低温性 Hm 生成菌とした。

1.2.4. Hm 生成菌の同定
Hm 生成菌の同定は、Takahashi et al. (2003)の手法に沿って行った。すなわち 1.5％
NaCl 添加 Trypticase Soy broth（BD）に分離菌株を接種後、中温性 Hm 生成菌を 30°C、
24 時間、低温性 Hm 生成菌を 15°C、48 時間で培養し、培養液 1 mL を 15,000xg、5
分 、 4°C の 遠 心 で 集 菌 し た 。 得 ら れ た ペ レ ッ ト か ら の DNA 抽 出 は Mag
Extractor-Genome（東洋紡、東京）を用いて、添付マニュアルに従って行った。DNA
抽出後、16S rDNA の増幅はプライマー27F（5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’）
および 1492R（5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’）を用いて行った（Weisburg et al.,

10
1991）。PCR 組成は Table 2 に示した。PCR 反応は、94ºC 5 分、35 cycle（95ºC 30
秒-58ºC 1 分-72ºC 1 分）および 72 ºC、7 分とし、Veriti thermal cycler（Life Technologies
Corp.、Foster City、California）を用いて行った。PCR 産物 5 μL を、1%アガロース
ゲルを用いて 100-bp ladder（GE Healthcare Bio-Science Corp.、Piscataway、New Jersey）
と共に 100 V、40 分で電気泳動に供した。電気泳動後はエチジウムブロマイドで染
色後、増幅を確認した。
PCR 増幅産物を Agencount® Ampure（Beckman Coulter Inc.、Brea、California）に
て精製後、プライマー27F および 530R（5’- GTATTGCCGCGGCTGCTGGC -3’）を
用いてシーケンス PCR を行った。シーケンス PCR 反応は 96ºC 1 分、25 cycle（96ºC
10 秒-50ºC 5 秒-60ºC 4 分）として行った。増幅産物は Agencount® CleanSEQ（Beckman
Coulter Inc.）を用いて精製後、ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer（Life Technologies
Corp.）を用いてシーケンシングを行い、400~450 bp の配列決定を行った。得られ
た配列は DNA data bank of Japan（DDBJ; 静岡）（http://www.ddbj.nig.ac.jp）の The
BLAST 2.0 algorithm を用いて菌種決定を行った。16S rDNA 配列によって菌種の識
別が不可能な菌種に関しては、api 20E, api 50CHE および VITEK（BioMérieux Co.
Ltd.、Craponne、Lyon）を用いて菌種を決定した。

1.3．結果

1.3.1. 生鮮魚からの中温性 Hm 生成菌の分離および同定

Table 1 に示すように 30ºC 培養下において 11 魚種 143 サンプル中 69 サンプル
（48.3%）の培養液で Hm 生成が示され、その培養液から 96 株の中温性 Hm 生成菌
を分離した。中温性 Hm 生成菌は本実験で用いたすべての魚種から分離され、各魚
種における Hm 生成菌の分離率は 35.7%-66.7%を示した。分離率はトビウオが最も
高く、カツオが最も低かった。分離菌株のうち 50 株（51.0%）は Photobacterium 属
と同定され、内 40 株が P. damselae subsp. damselae、5 株が P. leiognathi、4 株が P.
phosphoreum および 1 株が P. kishitanii と同定された。その他の菌株は、M. morganii
23 株、R. ornithinolytica 6 株、Citrobacter freundii 4 株、E. aerogenes 4 株、V.
parahaemolyticus 3 株、R. planticola 2 株、V. alginolyticus 2 株、V. olivaceus 1 株およ
び C. braakii 1 株と同定された（Table 3）。

1.3.2．生鮮魚からの低温性 Hm 生成菌の分離および同定
Table 1 に示すように 15ºC 培養下において、11 魚種 143 サンプル中 82 サンプル
（57.3%）の培養液で Hm 生成が示され、その培養液から 118 株の Hm 生成菌を分

11
離した。低温性 Hm 生成菌は本実験で用いたすべての魚種から分離され、各魚種に
おける Hm 生成菌の分離率は 10.0%-90.5%を示した。アジ・サバで 90.5%および
81.3%と高く、ブリで低かった（Table 1）。分離株は P. phosphoreum 66 株、P.
iliopiscarium 21 株、P. kishitanii 10 株、P. leiognathi 8 株、P. damselae subsp. damselae
3 株、P. aquimaris 2 株、Shewanella baltica 2 株、P. angustum 1 株、M. psychrotolerans
1 株、Leuconostoc mesenteroides 1 株、Brochothrix thermosphacta 1 株、V. litoralis 1 株
および Pseudomonas fluorescens 1 株と同定された（Table 4）。

1.3.3. 分離 Hm 生成菌の Hm 生成量

中温性 Hm 生成菌においては、96 株中 65 株が 1,000 mg/L 以上の Hm 生成を示し
（Table 5）、最高値は 4,124 mg/L であった。中温性 Hm 生成菌で最も多量の Hm 生
成を示した菌株は M. morganii であった。その他 8 株が 500–1,000 mg/L、13 株が
200–500 mg/L、10 株が 100-200 mg/L の Hm 生成を示した。R. planticola、E. aerogenes、
R. ornithinplytica および V. alginolyticus は分離菌株数 2－6 株と多くないものの、す
べての菌株において 1,000 mg/L 以上の Hm 生成が確認された。一方 C. freundii 4 株
は全て 100-200 mg/L の Hm 生成を示した。
低温性 Hm 生成菌は分離菌株 118 株のうち、22 株が 1,000 mg/L 以上の Hm 生成
を示し、最高値は P. phosphoreum の 2,268 mg/L であった。1000 mg/L 以上の Hm 生
成を示した 22 株中 16 株が P. phosphoreum でその他の菌株は P. kishitanii 3 株、M.
psychrotolerans、S. baltica および P. iliopiscarium 各 1 株であった。その他 27 株が
500–1,000 mg/L の、52 株が 200–500 mg/L の、17 株が 100-200 mg/L の Hm 生成を示
した（Table 6）。

1.4. 考察

本章においては、11 魚種 143 サンプルより中温性および低温性 Hm 生成菌の分

離を試みた。その結果、69 サンプルから中温性 Hm 生成菌が、82 サンプルから低
温性 Hm 生成菌が分離された（Table 1）。Hm 食中毒は、主に中温性 Hm 生成菌が
原因で発生していると考えられてきたが、いくつかの Hm 食中毒の原因菌として低
温性 Hm 生成菌が報告されている。本実験において、低温性 Hm 生成菌が、今回用
いた全ての魚種からの分離された事から、それらの魚種において低温性 Hm 生成菌
も Hm 蓄積を起こす可能性があることが再確認された。
本実験において分離した中温性 Hm 生成菌においては、過去の報告と同様に腸内
細菌科菌群、Photobacterium 属および Vibrio 属などの分離が確認された。その中で

12
も最も多く分離されたのが P. damselae subsp. damselae（41.7%）で、次いで M.
morganii（24.0%）が多かった。本実験で分離された M. morganii は、23 株中 22 株
（95.7%）が 1,000 mg/L 以上の Hm 生成能を示した。M. morganii は以前より高い
Hm 生成能を示すことが知られており（Kim et al., 2002, 2003; López-Sabater et al.,
1994）、Hm 食中毒の原因菌としての分離が報告されている（川端ら, 1956）。一方、
P. damselae subsp. damselae は、Hm 食中毒の原因菌としての報告例はないものの、
高い Hm 生成能を有していることは以前より知られていた（Bermejo et al., 2004;
Takahash et al., 2003）。本菌は本実験においても広範囲の魚種から分離され（Table 3）、
なおかつ分離された 40 株中 25 株（62.5%）が 1,000 mg/L 以上の Hm 生成を示した
（Table 5）。以上の結果より、中温性 Hm 生成菌においては、M. morganii と同等以
上に P. damselae subsp. damselae に注意が必要と考えられる。
本実験において分離された低温性 Hm 生成菌 118 株中 111 株が Photobacterium 属
で、このうち 66 株が P. phosphoreum と同定された。P. phosphoreum は過去の研究に
おいても主な低温性 Hm 生成菌として報告されている（Dalgaard et al., 2006; Fujii et
al., 1997; Morii and Kasama, 2004）。また、本実験において P. phosphoreum に次いで
多 く分離された P. iliopiscarium （17.8%）およ び P. kishitanii （8.6%）は，P.
phosphoreum の近縁種であり（Ast and Dunlap, 2005）、これまでの研究において Hm
生成菌として報告されていない菌種である。さらにこの 3 菌種において、97 株中
43 株（44.3%）が 500 mg/L 以上の高い Hm 生成が確認された。これらの結果は低
温貯蔵下において、P. phosphoreum およびその近縁種が Hm 蓄積の原因となること
を示唆している。また、Photobacterium 属以外にも低温性 Hm 生成菌としては、M.
psychrotolerans、P. fluorescens、 S. baltica などの複数のグラム陰性菌が分離される
と と も に 、 グ ラ ム 陽 性 菌 で あ る Leuconostoc mesenteroides お よ び Brochothrix
thermosphacta が分離された（Table 4）。中でも、M. psychrotolerans、P. fluorescens、
S. baltica は以前より Hm 生成菌として報告されており（Emborg et al., 2005; Rivas et
al., 2005）、本実験で分離されたこれらの菌種のなかには、1,000 mg/L 以上の Hm 生
成を示した菌株も存在した（Table 6）。しかし、本実験においてこれらの菌種やグ
ラム陽性菌は Photobacterium 属と比較して分離率が非常に低い。
低温性および中温性 Hm 生成菌双方において優勢であった Photobacterium 属は、
鮮魚において高い頻度で存在しており（与口ら, 1990b）、特に P. phosphoreum は魚
肉腐敗サンプルにおいても優占菌となりやすいことが報告されている（Dalgaard et
al., 1997; Gram and Huss, 1996）。本実験において、本菌は Hm 生成菌として広範囲
の魚種において分布していることが示された（Table 4）。そのため、本実験で用い
た魚種において本菌が存在し、なおかつその菌株が高い Hm 生成能を持っていた場

13
合、低温下においても短時間で増殖する可能性が高く、多量の Hm 蓄積を引き起こ
すリスクが存在する事が考えられた。
Photobacterium 属は冷凍耐性が低いことから、マグロ、カツオおよびメカジキな
ど漁獲後に長距離輸送する事から冷凍状態で流通されることが多い魚種において
（Hiraoka et al., 2004）、分離されにくい可能性が示唆されていた（Fujii et al., 1994）。
しかし本実験では、中温性・低温性 Hm 生成菌双方においてこれらの魚種からの
Photobacterium 属の分離が確認されたことから、これらの Hm 生成菌が冷凍工程を
経ても残存することと、流通工程において汚染された可能性も考えられる。
食品中の Hm 量に関する規制については、我が国においては定められていないが、
複数の国において，規制値もしくは基準値が定められている。アメリカにおいて、
FDA はアジ、マグロ、カツオ、シイラなど Hm 食中毒が発生しやすい魚種におい
て、50 mg/kg 以上の Hm 蓄積が確認された場合、検査を行った検体および検体と同
一ロットは廃棄することが定められている。FDA はその根拠として 500 mg/kg 以上
の Hm が蓄積された食品を摂取した場合、Hm 食中毒を発症するとしており、検体
の一部分に Hm が 50 mg/kg 以上存在していた場合、同一検体および同一ロット中
に 500 mg/kg 以上の Hm が蓄積している可能性があるとしている（FDA, 2011）。ま
た，国際的な食品規格であり、多くの食品製造現場で適応されている Codex
Alimentarius Commission（Codex）は、缶詰や冷凍魚といった特定の水産食品にお
いて取り扱いおよび衛生基準として、食品中に 200 mg/kg 以上の Hm が存在するべ
きではないと定めている（Codex alimentarius, 1981a, 1981b, 1981c, 1981d, 1989a,
1989b, 1995）。低温性 Hm 生成菌において 500 mg/L 以上の Hm 生成能を示す菌株の
割合は、中温性 Hm 生成菌と比較して低いが、18.6%の菌株が 1,000 mg/L 以上の
Hm 生成を示した（Table 6）。そのため、たとえ Hm 食中毒が実際に発生しなくと
も、水産加工品の海外輸出を行う上での規制対象となる可能性が存在する。この事
から、食品中における Hm 蓄積は、食品衛生上のみならず、経済上の観点からも抑
制が必要であると考えられる。
本章ではヒスチジン含量の高い 11 魚種において、Hm 食中毒の原因となり得る
中温性および低温性 Hm 生成菌が存在している事を示した。現在 Hm 食中毒が発生
した際に、原因菌を調査しない事が多く、原因菌を調査する場合でも中温性 Hm 生
成菌のみを対象として調査を行っている例が多いが（Chang et al., 2008; Chen et al.,
2010）、低温性 Hm 生成菌も同様に原因菌として注意するべきである。さらに、本
実験では P. phosphoreum や M. psychrotolerans など、低温性 Hm 生成菌として報告
のある菌種のみならず、P. iliopiscarium、P. kishitanii および P. aquimaris が Hm 生成
菌として分離された。特に P. iliopiscarium は分離率が P. phosphoreum に次いで高く、

14
低温下における Hm 生成に関してより詳細な検討を行う必要があると考えられる。
第 2 章においては今回分離された P. phosphoreum および P. iliopiscarium のうち、高
い Hm 生成能を有する菌株を用いて、低温条件下における魚肉中での挙動を調査し
た。

15
Table 1 Prevalence of Hm-producing bacteria in fish samples from retail markets in and
near Tokyo Japan.

Histamine-positive Histamine-producing
Total
Source samples (%) bacterial isolates
samples
30°C 15°C 30°C 15°C
Tuna 24 13 (54.2) 7 (29.2) 18 11
Horse mackerel 21 8 (38.1) 19 (90.5) 12 25
Mackerel 16 8 (50.0) 13 (81.3) 10 20
Bonito 14 5 (35.7) 3 (21.4) 7 5
Saury 14 6 (42.9) 10 (71.4) 7 13
Sardine 13 7 (53.8) 10 (76.9) 12 14
Grunt 11 5 (45.5) 7 (63.6) 6 13
Yellowtail 10 5 (50.0) 1 (10.0) 8 1
Swordfish 10 6 (60.0) 5 (50.0) 10 7
Flying fish 6 4 (66.7) 4 (66.7) 4 5
Herring 4 2 (50.0) 3 (75.0) 2 4

Total 143 69 (48.3) 82 (57.3) 96 118

16
Table 2 Components of the PCR mixture for 16S rRNA PCR.

10×buffer (Takara Taq TM) 5 µL

dNTP Mixture (Takara TaqTM) 4
Forward Primer 5
Reverse Primer 5
Takara Taq (Takara TaqTM) 0.25
Distilled water 25.75
DNA template 5
Total 50 µL

17
 Table 3 Identification and prevalence of Hm-producing bacterial isolates from retail fish samples incubated at 30°C.

Number
Speciesa of Source (Numbers)
isolates (%)
Photobacterium species
P. damselae subsp. damselae 40 (41.7) bonito(4), tuna(1), yellowtail(2), flying fish(1), grunt(4), horse mackerel(8), mackerel(6),
sardine(8), saury(4), swordfish(2)
P. leiognathi 5 (5.2) flying fish(1), grunt(1), saury(2), swordfish(1)
P. phosphoreum 4 (4.2) herring(1), horse mackerel(2), mackerel(1)
P. kishitanii 1 (1.0) mackerel(1)
Morganella morganii 23 (24.0) bonito(1), tuna(7), yellowtail(4), flying fish(2), mackerel (1), saury(1), sardine(1), swordfish(6)

18
Raoultella ornithinolytica b 6 (6.3) bonito(2), herring(1), tuna(1), yellowtail(2)
Raoultella planticola b 2 (2.1) tuna(2)
Enterobacter aerogenes 4 (4.2) mackerel(1), tuna(3)
Citrobacter freundii c 4 (4.2) swordfish(1), tuna(3)
Citrobacter braakii c 1 (1.0) tuna(1)
Vibrio parahaemolyticas 3 (3.1) horse mackerel(1), sardine(2)
Vibrio alginolyticus 2 (2.1) grunt(1), horse mackerel(1)
Vibrio olivaceus 1 (1.0) sardine(1)

total 96 (100)
a:The identify of all isolates were confirmed by partial sequences of 16Sr DNA.
b:Identified by api 20E and api 50CHE.
c:Identified by VITEC system.
 Table 4 Identification and prevalence of Hm-producing bacterial isolates from retail fish samples incubatedat 15°C.

Number
Speciesa of Source (Numbers)
isolates (%)
Photobacterium species
P. phosphoreum 66 (55.9) bonito(4), flying fish(2), grunt(4), herring(2), horse mackerel(15), mackerel(10), sardine(7),
saury(9), swordfish(6), tuna(7)
P. iliopiscarium 21 (17.8) flying fish(1), grunt(4), herring(1), horse mackerel(4), mackerel(4), sardine(4), saury(3)
P. kishitanii 10 (8.6) flying fish(1), herring(1), horse mackerel(2), mackerel(2), saury(1), tuna(2), yellowtail (1)
P. leiognathi 8 (6.8) flying fish(1), horse mackerel(2), mackerel(3), sardine(2)
P. damselae subsp. damselae 3 (2.5) bonito(1), grunt(1), mackerel(1)
P. aquimaris 2 (1.7) horse mackerel(1), grunt(1)

19
P. angustum 1 (0.8) horse mackerel(1)
Shewanella baltica 2 (1.7) grunt(1), tuna(1)
Brochothrix thermosphacta 1 (0.8) tuna(1)
Leuconostoc mesenteroides 1 (0.8) grunt(1)
Morganella psychrotolerans 1 (0.8) sardine(1)
Pseudomonas fluorescens 1 (0.8) grunt(1)
Vibrio litoralis 1 (0.8) swordfish(1)

total 118 (100)

a:The identify of all isolates were confirmed by partial sequences of 16Sr DNA.
Table 5 Histamine production by isolated mesophilic HPB.
histamine production (mg/L)
Strain (No.)
100-200 200-500 500-1,000 >1,000
R. planticola (2) 2
E. aerogenes (4) 4
M. morganii (23) 1 22
R. ornithinolytica (6) 6
V. alginolyticus (2) 2
P. damselae subsp. damselae (40) 9 6 25
V. parahaemolyticas (3) 1 2
P. leiognathi (5) 3 1 1
P. phosphoreum (4) 1 2 1
V. olivaceus (1) 1
P. kishitanii (1) 1
C. braakii (1) 1
C. freundii (4) 4

total 10 13 8 65

20
Table 6 Histamine production by isolated psychrophilic HPB.

histamine production (mg/L)

Strains (No.)
100-200 200-500 500-1,000 >1,000
M. psychrotolerans (1) 1
P. fluorescens (1) 1
P. kishitanii (10) 3 2 2 3
S. baltica (2) 1 1
P. phosphoreum (66) 8 28 14 16
P. aquimaris (2) 1 1
P. iliopiscarium (21) 1 12 7 1
L. mesenteroides (1) 1
P. damselae subsp. damselae (3) 2 1
B. thermosphacta (1) 1
V. litoralis (1) 1
P. leiognathi (8) 4 3 1
P. angustum (1) 1

total 17 52 27 22

21
 第2章 低温性ヒスタミン生成菌 Photobacterium phosphoreum および
P. iliopiscarium の低温保存下における魚肉中での挙動

2.1．緒言

低温性 Hm 生成菌に関する研究は中温性 Hm 生成菌と比べ少ないものの、

Okuzumi et al.（1981）によって「N 菌群」が報告されて以降、様々な研究が報告さ
れており、特に P. phosphoreum に関する研究が多い（石本ら, 1994; Kanki et al., 2004;
栗原ら, 1993a, 1993b）。P. phosphoreum は 35ºC においては発育が見られない一方、
4ºC において増殖および Hm 生成を行う事が知られている（Fujii et al., 1994）。また、
本菌は温度帯によっては、主要な中温性 Hm 生成菌として知られる M. morganii よ
りも高い Hm 生成能を示すこともあり（Lehane and Olley, 2000）、実際に、Hm 食中
毒の原因菌として報告された例もある（Kanki et al., 2004）。
第 1 章において、鮮魚からの低温性および中温性 Hm 生成菌の分離、同定を行っ
た結果、P. phosphoreum に次いで今まで Hm 生成菌として報告されていなかった P.
kishitanii および P. iliopiscarium が分離され、これらの中には 1,000 mg/L 以上の高い
Hm 生成を示す菌株が存在した。特に P. phosphoreum に次いで分離率が高かった
P. iliopiscarium は、なおかつ 4ºC でも増殖が可能である事が報告されている（Rivas
et al., 2006）。
本章においては、これらの低温性 Hm 生成菌のうち、低温下において高い Hm 生
成能の高い P. phosphoreum および P. iliopiscarium 菌株を魚肉に接種し、4°C、10°C
および 15°C における挙動を検討した。

2.2. 実験方法

2.2.1. サンプルおよび供試菌株
冷凍メカジキ（Xiphias gladius）の切り身を埼玉県の小売店より購入し，供試菌
を接種する直前に解凍し，本実験に用いた。
第 1 章において鮮魚より分離した低温性 Hm 生成菌のうち，500 mg/L 以上の Hm
生成能を示した P. phosphoreum 7 株（4A1525、5G1524、6C1528、6H1523、7D155、
9A154、9D1518）、P. iliopiscarium 2 株（6C1521、7I1519）を用いた。接種実験に
は P. phosphoreum 7D155 株および P. iliopiscarium 7I1519 株を用いた

2.2.2. Hm 生成能の高い低温性 Hm 生成菌の選別

22
 鮮魚由来の P. phosphoreum 7 株および P. iliopiscarium 2 株を 15ºC、48 時間で前培
養後、ヒスチジンブロスに接種し、4ºC において培養後 0、72、96 および 120 時間
後に生菌数および Hm 量を測定した。生菌数は、1.5% NaCl 添加 Trypticase Soy Agar
（TSA）（BD）に培養液 100 μL を塗末し、15ºC、72 時間培養後に測定した。Hm
量は、菌液 1 mL を 0.2-μm フィルター（東洋濾紙）でろ過滅菌後、チェックカラ
ーヒスタミンを用いて測定した。

2.2.3. 魚肉中における挙動
2.2.3.1. 魚肉への接種
冷凍魚肉サンプルを流水解凍後、1 cm×1 cm に切り分け、25 g を無菌的に量り
取った。供試菌株（P. phosphoreum 7D155、P. iliopiscarium 7I1519）を終濃度 104 cfu/g
となるように接種し、4ºC、10ºC および 15ºC において保存した。4ºC 保存下におい
て 0、3、5、7 日後に、10ºC 保存下においては 0、1、2、3 日後に、15ºC 保存下に
おいては 0、12、24、36、48 時間後に一般生菌数、Hm 生成菌数および Hm 量測定
を行った。本実験において、対照群として未接種のサンプルを用いた。未接種サン
プルは接種サンプルと同様に各温度で保存後、各項目の測定を行った。実験は同一
サンプルを用いて 3 回行った。

2.2.3.2. 一般生菌数および Hm 生成菌数の測定

サンプル 25 g に対し、225 mL のヒスチジンブロスを加え 10 倍希釈後、ストマ
ッカー400（Seward、Worthing、West Sussex）を用いて懸濁した。必要に応じて食
品懸濁液を生理的食塩水で 10 倍に段階希釈後、1.5% NaCl 添加 TSA に 100 μL 塗抹
し、15ºC、72 時間培養後、菌数を測定した。Hm 生成菌数の測定には最確数法（MPN
法）を用いた（Cochran, 1950）。食品懸濁液の各段階希釈液をヒスチジンブロス 3
本に接種し、15ºC、48 時間培養した。培養後、Hm 生成をペーパークロマトグラフ
ィーによって確認し、Hm 陽性管数から最確数表を用いて Hm 生成菌数を求めた。
ペーパークロマトグラフィーは第 1 章と同様の方法で行った。

2.2.3.3. 魚肉中における Hm 量の測定

魚肉サンプル 1 g に対し，24 mL の 0.1M EDTA/sodium 溶液（pH 8）を添加し、
20 分間の煮沸を行った。加熱後、冷却したサンプルを 10,000xg、5 分、4ºC で遠心
を行い、上澄みを Hm 量測定に用いた。Hm 量は、チェックカラーヒスタミン（キ
ッコーマン）を用いて測定した。

23
2.3．結果

2.3.1. 4°C 培養下における Hm 生成能

第 1 章において鮮魚より分離された P. phosphoreum および P. iliopiscarium から、
9 株の 4ºC 培養下における挙動を調べた（Table 7）。その結果、9 株中 7 株で 120 時
間後に 29-815 mg/L の Hm 生成が確認された。中でも、P. phosphoreum 7D155 が 459
mg/L、P. iliopiscarium 7I1519 が 815 mg/L の Hm 生成を示した。以上の結果より、
7D155 および 7I1519 株を以下の実験に用いた。

2.3.2．魚肉中における低温性 Hm 生成菌の挙動
Fig. 3-5 に低温保存下における魚肉へ Hm 生成菌を接種した場合の Hm 生成菌数、
一般生菌数および魚肉中の Hm 量の変動を示した。
4ºC 保存下において、P. phosphoreum 7D155 を接種したサンプルの Hm 生成菌数
は、培養 3 日目に 106 MPN/g、5 日目までに 108 MPN/g に達した。さらに魚肉中に
おける Hm 量は、5 日目に 400 mg/kg、7 日目には 870 mg/kg であった（Fig. 3A）。
P. iliopiscarium 7I1519 を接種したサンプルにおいて Hm 生成菌数は、培養 3 日目に
106 MPN/g、5 日目に 108 MPN/g に達した。Hm 量は、5 日目に 360 mg/kg, 7 日目に
は 1,760 mg/kg に達した（Fig. 3B）。両接種サンプルにおいては、7 日目まで魚肉の
変色および腐敗臭が確認されず、腐敗は見られなかった。対照群において Hm 生成
菌数は、7 日目までに 105 MPN/g に達したが、Hm の生成は確認されなかった（Fig.
。
3C）
10ºC 保存下において、7D155 を接種したサンプルの Hm 生成菌数は培養 2 日目
に 106 MPN/g に到達した。Hm 量は、2 日目に 100 mg/kg、3 日目に 220 mg/kg に達
した（Fig. 4A）。7I1519 を接種したサンプルにおいても、2 日目に Hm 生成菌数が
106 MPN/g に達した。Hm 量は、2 日目に 140 mg/kg、3 日目には 170 mg/kg であっ
た（Fig. 4B）。両接種サンプルは保存 3 日目において僅かに魚肉の色に変化がみら
れたものの、腐敗臭は確認されなかった。対照群でも Hm 生成菌数は 106 MPN/g
に達したが、Hm 生成は確認されなかった（Fig. 4C）。
15ºC 保存下において、7D155 あるいは 7I1519 を接種したサンプルは共に、Hm
生成菌数が 12 時間後に 106 MPN/g、36 時間後に 108 MPN/g に達した。Hm 量は、
7D155 接種サンプルにおいて 24 時間後には 90 mg/kg、36 時間後には 420 mg/kg、
48 時間後には 980 mg/kg であった（Fig. 5A）。7I1519 接種サンプルの場合は、24 時
間後で 170 mg/kg の、36 時間後で 240 mg/kg の、48 時間後で 610 mg/kg の Hm 生成
が確認された（Fig. 5B）。両接種サンプルでは 48 時間後には腐敗が確認された。対

24
照群では 48 時間に一般生菌数が 108 cfu/g に達したが、Hm 生成菌数は 106 MPN/g
であった。しかし、魚肉中における Hm の生成は確認されなかった（Fig. 5C）。

2.4. 考察

本実験において、低温下で高い Hm 生成を示した鮮魚由来の低温性 Hm 生成菌 2

菌種 P. phosphoreum および P. iliopiscarium を解凍メカジキに接種し、4ºC、10ºC お
よび 15ºC で保存した結果、4ºC では 5 日後、10ºC では 2 日後、15ºC では P. iliopiscarium
7I1519 において 24 時間後に 100 mg/kg 以上の、P. phosphoreum 7D155 において 50
mg/kg 以上の Hm 蓄積が確認された（Fig. 3A、Fig. 3B、Fig. 4A、Fig. 4B、Fig. 5A、
。食品中における Hm の規制値や基準値としては、上述したように FDA は
Fig. 5B）
規制値として 50 mg/kg と定めている。本実験では、全ての保存区分の接種サンプ
ルにおいて、短時間で 50 mg/kg 以上の Hm 蓄積が確認された。この結果より、本
実験で用いられたような低温性 Hm 生成菌が魚肉中に存在していた場合、短時間で
魚肉中の Hm 量がそれらの規制値・基準値に達する可能性が存在し、Hm 食中毒の
発生しやすい魚種の冷凍魚や加工品の輸出時に影響が出る可能性が考えられた。
4ºC および 10ºC 保存下では、Hm 生成が確認された際、わずかに魚肉の色に変化
が見られたものの、腐敗臭は確認されなかった。特に 4ºC 保存下において、P.
phosphoreum 7D155 は、1 週間以内に魚肉中で腐敗に先行して 1,000 mg/kg 以上の
Hm 生成を示した。魚肉が腐敗してしまった場合、食用とされる事はないが、低温
保存下において腐敗に先行して Hm が蓄積された場合、食材として用いられるので、
Hm 食中毒の原因となる可能性が考えられる。
本実験では、P. iliopiscarium 7I1519 は P. phosphoreum 7D155 と同様の低温下にお
ける増殖能および Hm 生成能を示した。Hm 生成菌は 106 cfu/ml に達してから Hm
生成する事が報告されている（Takahashi et al., 2003）。本実験の魚肉接種実験でも、
すべての温度区分で Hm 生成菌数が 106 MPN/g 以上に達してから Hm 蓄積が確認さ
れた。このことから、低温性 Hm 生成菌が低温下で迅速に増殖することによって、
短時間で Hm 蓄積を行う可能性が示唆された。そのため、本実験で示されたように、
低温下で高い Hm 生成能を示す低温性 Hm 生成菌が存在していた場合、魚肉中で短
時間に多量の Hm 蓄積が発生する危険性が存在する。
マグロやカツオなど通常冷凍状態で流通される魚種が低温性 Hm 生成菌によっ
て汚染されていた場合、解凍工程において Hm 蓄積の発生が起こる可能性が報告さ
れている（Dalgaard et al., 2006）。そのため、これらの魚種を解凍するにあたって、
長時間常温・冷蔵下に曝さないことが推奨されている（大日本水産会, ヒスタミ

25
ン食中毒防止マニュアル）。さらに、冷凍工程などにおいて死滅または VBNC
（Viable But Non-Culturable）状態であったとしても、細菌由来の HDC の作用によ
って Hm 蓄積が発生する可能性もある。Kanki et al.（2007）は、P. phosphoreum 由
来の HDC は冷凍条件下でも活性を 3 ヶ月以上失わず、なおかつ至適温度において
酵素反応を示し、Hm 生成が行われることを報告している。そのため、冷凍魚にお
いて Hm 生成菌が死滅もしくは損傷状態であっても HDC の酵素反応が可能な温度
条件に置かれた場合、食品中における Hm 蓄積が発生すると考えられる。
本章においては、魚肉中に接種した P. phosphoreum および P. iliopiscarium の低温
下における挙動を調査し、低温下においても Hm 蓄積のリスクが存在し、従来 Hm
食中毒の予防手段として考えらえてきた温度管理のみでは食品中における Hm 蓄
積を完全に制御することが困難である事を示した。この事から、Hm 蓄積の予防と
共に、多量の Hm が蓄積した食品が Hm 流通することを防ぐ事が重要だと考えられ
る。さらに、食品中における Hm 蓄積や食中毒が発生した際には迅速な原因究明や
対策を行う事が必要とされることから、原因菌となる Hm 生成菌の迅速な同定が必
要となる。そのため、第 3 章においては、低温性 Hm 生成菌も含めたグラム陰性
Hm 生成菌共通の hdc 遺伝子を用いた迅速同定を試みた。

26
Table 7 Viable count and Hm content in Histidime broth incubated at 4ºC of P.
phosphoreum and P. iliopiscarium isolates used for the screening strong Hm producers.

bacterial count (log cfu/mL) histamine (mg/L)

Species Strain 0h 72h 96h 120h 0h 72h 96h 120h
P. phosphoreum 4A1525 2.8 4.0 5.0 5.3 ND ND 103 373
5G1524 2.7 5.4 5.3 6.7 ND ND ND 64
6C1528 2.7 4.3 5.1 5.1 ND ND ND ND
6H1523 3.1 5.4 5.7 6.4 ND ND ND 29
7D155 2.8 5.0 5.4 6.1 ND ND ND 459
9A154 2.7 4.1 5.5 5.7 ND ND 146 417
9D1518 3.5 5.6 6.6 6.9 ND ND ND 56
P. iliopiscarium 6C1521 2.9 3.7 4.0 4.3 ND ND ND ND
7I1519 3.1 6.4 7.1 7.5 ND ND 196 815

27
 10.0 2500
A
8.0 2000

6.0 1500

4.0 1000

2.0 500

0.0 0
0 2 4 6 8
10.0 2500
B
8.0 2000

6.0 1500

4.0 1000

2.0 500

0.0 0
0 2 4 6 8

10.0 2500
C
8.0 2000

6.0 1500

4.0 1000

2.0 500

0.0 0
0 2 4 6 8

Storage time (days)

Fig. 3 Growth of histamine-producing bacteria (open diamonds), aerobic viable bacteria
(closed diamonds) and histamine accumulations (triangles) in swordfish meat at 4°C. A:
Inoculated with strain 7D155 (P. phosphoreum), B: Inoculated with strain 7I1519 (P.
iliopiscarium), C: Control, Error bars represent standard deviation of three independent
experiments.

28
 10.0 400
A
8.0
300
6.0
200
4.0
100
2.0

0.0 0
0 1 2 3 4

10.0 400
B
8.0

Histamine (mg/kg)
Log MPN (cfu) /g

300

（（mg/kg））
6.0
200
4.0
100
2.0

0.0 0
0 1 2 3 4

10.0 400
C
8.0
300
6.0
200
4.0
100
2.0

0.0 0
0 1 2 3 4
Storage time (days)

Fig. 4 Growth of histamine-producing bacteria (open diamonds), aerobic viable bacteria

(closed diamonds) and histamine accumulations (triangles) in swordfish meat at 10°C. A:
Inoculated with strain 7D155 (P. phosphoreum), B: Inoculated with strain 7I1519 (P.
iliopiscarium), C: Control, Error bars represent standard deviation of three independent
experiments.

29
 1400
A 10.0
1200
8.0 1000
6.0 800
600
4.0
400
2.0 200
0.0 0
0 15 30 45 60
1400
B 10.0
1200

Histamine (mg/kg)
8.0 1000
Log MPN (cfu) /g

（（mg/kg））
6.0 800
600
4.0
400
2.0 200
0.0 0
0 15 30 45 60
1400
C 10.0
1200
8.0 1000
6.0 800
600
4.0
400
2.0 200
0.0 0
0 15 30 45 60
Storage time (hours)
Fig. 5 Growth of histamine-producing bacteria (open diamonds), aerobic viable bacteria
(closed diamonds) and histamine accumulations (triangles) in swordfish meat at 15°C. A:
Inoculated with strain 7D155 (P. phosphoreum), B: Inoculated with strain 7I1519 (P.
iliopiscarium), C: Control, Error bars represent standard deviation of three independent
experiments.

30
 第 3 章 高感度融解曲線解析（HRMA）を用いた
ヒスタミン生成菌の迅速同定法の検討

3.1. 緒言

食中毒の予防および原因究明を行う上で、原因微生物の特定は必要不可欠である。
現在も微生物検査の微生物同定における公定法としては、現在も基本的に培養法や
性状試験が広く用いられている。しかし、これらの手法は特異的な培地や数日から
一週間程度の時間を必要とする場合があり、なおかつ同種株間においても性状に差
異が出る場合がある（Drancourt et al., 2000）。一方、遺伝子的手法は、培養法と比
較して短時間で同定が可能という利点を持っており、これまでに様々な研究が行わ
れてきた（Keer and Birch, 2003）。遺伝子的手法による同定法として、ポリメラーゼ
連鎖反応（Polymerase Chain Reaction: PCR）およびシーケンシングによって得られ
た配列を用いた同定が行われており、特に 16S rDNA 遺伝子を始めとする遺伝子配
列の保存性の高い領域を用いたシーケンシングによる菌種同定が広く用いられて
いる（Drancourt et al., 2000; Weisburg et al., 1991）。
近年、迅速・簡易・低コストな微生物同定の手法として、高感度融解曲線解析法
（High-resolution melting Analysis: HRMA）が注目されている。本手法では、加熱変
性により 2 本鎖 DNA から 1 本鎖へ乖離する際の温度が、その DNA の GC 含量、
長さおよび配列に依存していることを利用し、サンプル間の遺伝子配列の差異を調
べる事ができる（Gundry et al., 2003）。本手法で用いられる SYBR-Green （Gundry et
al., 2003）、RezoLight（Pietzka et al., 2009）および LCGreen（Wittwer et al., 2003）等
の 2 本鎖 DNA に結合して蛍光を発する DNA 結合色素は、2 本鎖 DNA の状態では
蛍光を発するため、DNA の加熱変性による１本鎖への乖離に伴って蛍光量が減少
する。HRMA ではその蛍光の減少をモニタリングすることで得られる乖離温度（融
解温度：Tm 値）および融解曲線から、サンプル間の遺伝子配列の違いを示す事が
可能である（Erali et al., 2008）。
HRMA に関する研究が報告される以前にも、リアルタイム PCR を用いた融解曲
線解析による遺伝子型決定に関する研究が報告されている（Lay and Wittwer, 1997;
Ririe et al., 1997）が、これらの手法においては、DNA 増幅後に別の系で DNA 結合
色素を添加してから加熱融解を行っていた。HRMA では閉管系で PCR から融解曲
線解析まで行うことができ（Gundry et al., 2003）、なおかつ、一塩基多型（Single
Nucleotide Polymorphism: SNPs）のスクリーニングも可能である（Erali et al., 2008）
など、従来の融解曲線解析よりも詳細な解析を行うことが可能である（Wittwer et al.,

31
2003）。
HRMAはその簡便性から、ヒト遺伝子（Vossen et al., 2009）や作物（Koeyer et al.,
2010）の変異調査など、異なる遺伝子配列の識別法として様々な分野で用いられて
いる。微生物を対象とした研究も、Mycobacterium chelonae/M. abscessus間の迅速同
定に関する研究（Odell et al., 2005）を始めとして、現在まで多くの研究が報告され
ており、近年ではウィルスを対象としたHRMA法も報告されている（Lin et al., 2008;
Steer et al., 2009）。微生物におけるHRMAの利用方法としては主に、タイピング法
もしくは迅速同定法としての利用が挙げられる。タイピング法の利用例としては、
複数遺伝子のSNPsを用いたYersinia pseudotuberculosisのタイピング（Souza and
Falcão, 2013）や、乳製品腐敗菌であるBacillus licheniformis（Dhakal et al., 2013）に
おけるタイピング等が報告されている。さらに、今までに報告されたHRMAを用い
た迅速同定法に関する報告としては、16S rDNAを標的遺伝子とした病原菌の迅速
検出に関する報告（Ajitkumar et al., 2012; Cheng et al., 2006; Navrátilová et al., 2013;
Robertson et al., 2009; Šimenc and Potočnik, 2011）が多く、近縁種間における迅速同
定に関する報告もされている（Arancia et al., 2011; Gori et al., 2012; Pietzka et al.,
2009; Winchell et al., 2010）。また、今まで報告されたHRMA法では、対象の多くが
Mycobacterium（Alonso et al., 2010; Odell et al., 2005; Pietzka et al., 2009）、ブルセラ菌
（Winchell et al., 2010）やカンジダ菌（Arancia et al., 2011）などの臨床微生物であ
ったが、近年、食中毒原因菌（Campylobacter jejuni, Listeria属, 腸管出血性大腸菌）
を始めとした食品微生物を対象とした報告も増加している（Jin et al., 2012; Kagkli et
al., 2012; Price et al., 2007）。
本研究の第 1 章および第 2 章において、中温性 Hm 生成菌と同様に、低温性 Hm
生成菌も広範囲の魚種に分布し、なおかつ、低温保存下においても低温性 Hm 生成
菌が短期間で Hm 蓄積を引き起こす可能性がある事を示した。このことから、中温
性のみならず、低温性 Hm 生成菌も Hm 食中毒の原因となり得るリスクを有してい
ると考えられる。本章においては、本研究では、新たに Hm 生成菌として分離され
た菌種も含めた低温性および中温性 Hm 生成菌の迅速な同定を行うことを目的と
し、中温性 Hm 生成菌 6 菌種（M. morganii、P. damselae subsp. damselae、E. aerogenes、
R. planticola、P. vulgaris、Erwinia spp.）および低温性 Hm 生成菌 4 菌種（P. phosphoreum,
P. iliopiscarium, P. kishtianii, P. aquimaris）を対象とし、HRMA による同定法の検討
を行った。

3.2. 実験方法

32
3.2.1 供試菌株
本実験では、供試菌株として、中温性 Hm 生成菌は M. morganii 3 株（ATCC 35200、
JCM 1672、AP28）、R. planticola 3 株 （ATCC 43176、4131、8433）、E. aerogenes 3
株 （ATCC 43175、8D29、5-6-3011）、P. damselae subsp. damselae 3 株 （ATCC 33539、
JCM8968、6J29-1）、P. vulgaris 3 株 （AU34、AU33、AU36）、Erwinia spp. 1 株（MB31）
を用い、低温性 Hm 生成菌は P. phosphoreum 4 株（IAM 12085、MB 36、2-8-1510、
5-4-1520）、P. iliopiscarium 6C1521 株、P. kishitanii 4 株（ATCC BAA-1194、4D152、
7I1524、7-9-157）および P. aquimaris 2 株（N14、8I156）を用いた。
上記供試菌株のうち ATCC 株は The American Type Culture Collection より、JCM
株は The Japan collection of Microorganisms より、IAM 株は Institure of Applied
Microbiology より譲渡された。その他の株は Takahashi et al.（2003）および第 1 章
で行った分離実験において鮮魚より分離された菌株を用いた。さらに、本実験の対
照として、Klebsiella pneumonia 5A15 株（鮮魚由来分離菌株）を用いた。

3.2.2. DNA 抽出
供試菌株を 1.5％ NaCl 添加 Trypticase Soy broth（BD）に接種し、中温性 Hm 生
成菌は 30ºC で 24 時間、低温性 Hm 生成菌は 15ºC で 48 時間培養した。培養後、1 mL
の菌液を 8,000×g、5 分、4ºC で集菌した。得られたペレットから NucleoSpin® Tissue
（タカラバイオ株式会社、滋賀）を用いて説明書の指示に従って DNA 抽出を行っ
た。DNA 抽出物は-20ºC で保存し、使用時に 5 ng/μL に希釈したものを PCR 及び
PCR-HRMA に供した。

3.2.3. プライマー設計
本実験でプライマー作成に用いた hdc 遺伝子配列 M. morganii 10 株（ATCC 25830、
ATCC 35200、JCM 1672、AP28、BO249、BO25、BR119、HPP301、HPP309、87411）
（accession number AB083200、AB083201、AB083202、FJ469557、FJ469558、FJ469559、
FJ469560、FJ469561、FJ469562、FJ469563）、R. planticola 3 株（ATCC 43176、4131、
（AB083205、AB083206、FJ469564）、 R. ornithinolytica 2 株（HPP15、HPP19）
8433）
（FJ469565、FJ469566）
、P. damselae subsp. damselae 7 株（ATCC 33539、JCM 8968、
（AB084251、AB084252、FJ469569、FJ469570、
BR100、BR107、BR132、BR147、BR165）
、P. vulgaris 1 株（AU34）
FJ469571、FJ469572、FJ469573） （AB083204）、Erwinia spp.
1 株（MB31）
（AB083208）および P. phosphoreum 3 株（NBRC 13896、MB36、YS4-7）
(AB084250、AB259287、AB259288)は DDBJ のデータベースから入手した。
すべての配列は CLUSTALW program 及び GENETIC software を用いてアライメン

33
トをとり、得られたアライメントの 4-137 部位 134 bp を増幅するようにプライマー
を作成した（Fig. 6）。Forward primer（hdcH-f）：5’-ATY AVY AAC TGB GGT GAY
：5’-TTV GTN ACR TAV CCC CAG C-3’はファス
TGG-3’及び reverse primer（hdcH-r）
マック（FASMAC Co. Ltd., 神奈川）に依頼して作成した。

3.2.4. hdc 特異的プライマーを用いた PCR および HRMA

作成したプライマーの特異性を確認するために、M. morganii ATCC 35200、R.
planticola ATCC 43176、E. aerogenes ATCC 43175、P. damselae subsp. damselae ATCC
33539、P. vulgaris AU34、Erwinia spp. MB31、P. phosphoreum IAM 12085 および K.
pneumoniae 5A15 株を PCR に供した。
PCR 反応には LightCycler® 480 High resolution
melting Master（Roche Applied Science, Penzberg, Upper Bavaria）を用い、反応組成は
Table 8 に示した。PCR 反応には Veriti thermal cycler（Life Technologies Corp.）を用
い、PCR 条件は 95ºC 5 分、45cycle（95ºC 10 秒-56ºC 50 秒-72ºC 10 秒）で行った。
PCR 反応後、増幅産物は 3% NuSieveTM 3:1 agarose（タカラ）を用いて 100 bp ladder
（GE Healthcare Bio-Science Corp.）と共に 100 V、40 分で電気泳動を供した。電気
泳動後はエチジウムブロマイドで 5 分間染色後、特異的なバンドの確認を行った。
PCR および HRMA（PCR-HRMA）を M. morganii 3 株（ATCC 35200、JCM 1672、
AP28）、R. planticola 3 株（ATCC 43176、4131、8433）、E. aerogenes 3 株（ATCC 43175、
8D29、5-6-3011）、P. damselae subsp. damselae 3 株（ATCC 33539、JCM8968、6J29-1）、
P. vulgaris 3 株（AU34、AU33、AU36）、Erwinia spp. 1 株（MB31）、P. phosphoreum
4 株（IAM 12085、MB 36、2-8-1510、5-4-1520）、P. iliopiscarium 1 株（6C1521）、P.
kishitanii 4 株（ATCC BAA-1194、4D152、7I1524、7-9-157）および P. aquimaris 2 株
（N14、8I156）を用いた。PCR-HRMA は LightCycler ® Nano（Roche）を用いて行
った。反応条件は PCR 反応後、95ºC 60 秒及び 40ºC 60 秒のプレヒーティングを行
い、1 秒間につき 0.1ºC の温度上昇で 70ºC から 85ºC まで加熱融解変性を行った後
に、40ºC 10 分の加熱とした。HRMA 条件のプログラミングおよび得られたデータ
の解析は Lightcycler® Nano Software version 1.1（Roche）を用いて行い、融解曲線及
び Tm 値を求めた。融解曲線は、蛍光強度の減少に対する温度推移の変化（dF/dT）
によって求められた。さらに中温性 Hm 生成菌 6 菌種、低温性 Hm 生成菌 4 菌種お
よび Erwinia spp.、P. phosphoreum および P.kishitanii の Difference melting curve を作
成した。Difference melting curve を作成するにあたって、融解曲線の直線回帰を行
った。融解曲線の直線回帰においては、蛍光強度推移領域の前後領域において正規
化を行った。その後、標準となる菌株を選択し、標準株の融解曲線に対する
Difference melting curve を求めた。本実験は 3 回繰り返して行った。

34
3.3. 結果

3.3.1. 特異的プライマーの作成および PCR 条件の決定

DDBJ より得たアライメントより作成したプライマーhdcH-f/hdcH-r の特異性を
確認するために、供試菌 7 株（M. morganii ATCC 35200、R. planticola ATCC 43176、
E. aerogenes ATCC 43175、P. damselae subsp. damselae ATCC 33539、P. vulgaris AU34、
Erwinia spp. MB31、P. phosphoreum IAM 12085）および K. pneumoniae 5A15 を用い
て PCR 及び電気泳動を行った。その結果、全ての供試菌において、特異的なバン
ドが確認された。一方、非 Hm 生成菌である K. pneumoniae 5A15 において増幅は確
認されなかった（Fig. 7）。

3.3.2 中温性 Hm 生成菌における HRMA

中温性 Hm 生成菌 6 菌種、16 株について、hdc 遺伝子を標的とした HRMA を行
った結果、
、菌種毎に特異的な Tm 値および融解曲線が得られた。Tm 値は、M. morganii
80.81±0.19ºC（n=3）、R. planticola 78.32±0.04ºC（n=3）、E. aerogenes 79.81±0.05ºC（n=3）、
P. damselae subsp. damselae 76.35±0.22ºC（n=3）、 P. vulgaris 78.07±0.03ºC（n=3）お
よ び Erwinia spp. 78.89ºC （ n=1 ） で あ っ た （ Table 9 ）。 さ ら に 正 規 化 領 域 を
70.01-72.01ºC および 82.94-84.90ºC として作成した Difference melting curve におい
ても、種特異的な融解プロファイルが得られた（Fig. 9）。

3.3.3 低温性 Hm 生成菌における HRMA

低温性 Hm 生成菌においては、
P. phosphoreum 4 株、P. iliopiscarium 1 株、P. kishitanii
4 株および P. aquimaris 2 株を用い、中温性 Hm 生成菌と同様の条件で PCR-HRMA
を行い、融解曲線を得た（Fig. 10）。得られた Tm 値は Table 10 に示され、P.
phosphoreum（Tm=78.59±0.12ºC）および P. kishitanii 全株（Tm=78.60±0.08ºC）は非常
に Tm 値 が 近 似 で あ っ た 。 ま た 、 さ ら に正 規 化 領 域 を 71.49-73.55ºC お よ び
81.11-82.85ºC として Difference melting curve を作成した結果、Tm 値と同様に P.
phosphoreum 4 株および P. kishitanii 4 株株が近似のプロファイルを示した（Fig. 11）。
さらに、正規化領域を 72.53-74.45ºC および 82.02-84.07ºC として Erwinia spp.、P.
phosphoreum/P. kishitanii の Difference melting curve を作成した結果、Erwinia spp.と
P. phosphoreum/P. kishitanii の識別が可能であった（Fig. 12）。

3.4. 考察

35
 本実験で用いた中温性 Hm 生成菌 6 菌種（M. morganii、R. planticola、E. aerogenes、
P. damselae subsp. damselae、P. vulgaris、Erwinia spp.）は、過去の研究において強い
Hm 生成能が確認された菌種（Takahashi et al. 2003）を選択した。特に M. morganii
および P. damselae subsp. damselae は高い分離率と強い Hm 生成能を示し、Hm 食中
毒の危害菌となる可能性が高い Hm 生成菌と考えられている。本実験において中温
性 Hm 生成菌 6 菌種、16 株を PCR-HRMA に供した結果、全ての菌種において種特
異的な Tm 値および融解プロファイルが得られた。そのため、本手法によってこれ
ら 6 菌種の識別が可能であり、迅速同定法として利用できる可能性が示唆された。
また、本実験において用いた M. morganii 3 株のうち、1 株（AP28 株）が他の 2 株
と異なる Tm 値を示したが（Fig. 8）、Difference melting curve においては相似の融解
曲線を示した（Fig. 9）。M. morganii 3 株のうち、ATCC 35200 株および JCM 1672
株は M. morganii subsp. morganii であり、AP28 株は M. morganii subsp. sibonii であり、
なおかつ AP28 株と他 2 株の hdc 遺伝子配列との相同性は 95.9％を示した。この結
果より、本実験で用いた配列領域において M. morganii の亜種レベルで識別する事
が可能であった。
低温性 Hm 生成菌としては、P. phosphoreum および第 1 章で新たに Hm 生成菌と
して分離された P. iliopiscarium、P. kishitanii および P. aquimaris を用いて HRMA の
検討を行った。その結果、P. phosphoreum および P. kishitanii はほぼ同じ Tm 値およ
び融解プロファイルを示し（Table 10、Fig. 10、Fig. 11）、今回用いた領域において
は識別ができなかった。しかし、両菌種共に低温増殖性を有し、なおかつ性状も近
しいことから、本領域においては“P. phosphoreum / P. kishitanii グループ”として
他の種から識別が可能であった。また、P. aquimaris および P. iliopiscarium に関して
は、中温性 Hm 生成菌を含めた他菌種と異なる Tm 値および融解プロファイルを示
したことから、他菌種との識別は可能であることが示唆されたものの、菌株数が非
常に少ないことから、更なる検討が必要と考えられた。さらに、元々1990 年代に
P. phosphroeum として分離され、その後 16S rDNA 配列による再同定によって P.
aquimaris と決定された菌株である P. aquimaris N14 株は、P. aquimaris 8I156 株と近
似の融解プロファイルを示した。しかし、中温性 Hm 生成菌や他の低温性 Hm 生成
菌と異なり、融解プロファイルにわずかながら差が見られた（Fig. 11）。そのため、
P. aquimaris に 関して も 、 更な る 検討 が必 要 で ある と 考え られ た 。 また 、 P.
phosphoreum・P. kishitanii グループと Tm 値が近しい Erwinia spp.の Difference melting
curve を作成した結果、これらは識別可能であった（Fig. 12）。そのため、低温性
Hm 生成菌・中温性 Hm 生成菌間の識別は可能であると考えられた。
これまでの研究で、グラム陰性 Hm 生成菌として腸内細菌科菌群から海洋性細菌

36
まで多様な菌種が報告されている。そのため、Hm 生成菌の分離および同定を行う
上では、複数の菌種に対応できるように複数の試験を行わなくてはならない場合が
あり、なおかつシーケンシングを用いた場合は費用および時間が必要される。
HRMA は少ない遺伝子配列の差違を識別することが可能であることから、シーケ
ンシングの代替法として利用することが可能だと考えられている（Ruskova and
Raclavsky, 2011）。そのため、ヒスタミン生成菌における従来の同定工程において，
簡便化および迅速化に HRMA が有用であると考えられた。
本実験では、菌株を分離後に本手法を用いる状況を想定し、供試菌として純菌を
用い、本手法がシーケンシングの代替法として有用である事を示した。しかし、今
後検査現場における利用を考える上で、より工程や時間を短縮する必要がある
（Ruskova and Raclavsky, 2011）。そのため、今後は colony-PCR や食品からの direct
PCR-HRMA を検討し、SSCP 法（Takahashi et al., 2003, 2007）や MALDI-TOF mass
法（Fernández-No et al., 2010）など今まで報告されているグラム陰性 Hm 生成菌の
迅速同定法との比較を行う必要があると考えられた。さらに、HRMA において有
効な Tm 値及び融解曲線を得るためには、増幅時の Ct 値が 15~35 である必要がある
（Whinchell et al., 2010）。しかし、本研究においては検出感度の検討は行っていな
い。そのため、今後本手法を応用するにあたって、各 Hm 生成菌における検出感度
の検討も行う必要があると考えられた。
本章においては、HRMA 法がグラム陰性の Hm 生成菌の迅速同定に用いること
ができる可能性を示唆した。特に主要な中温性 Hm 生成菌である M. morganii, E.
aerogenes, R. planticola, P. damselae subsp. damselae のみならず、P. vulgaris 及び
Erwinia spp.の識別を行うことが可能であり、本実験に供さなかった菌種でも、本手
法によって識別を行える可能性が示唆された。また、低温性 Hm 生成菌においても
HRMA は有用である可能性が示唆されたものの、一部識別が難しい菌種が存在し
た た め 、 更 な る 検 討 が 必 要 と 考 え ら れ た 。 主 な 低 温 性 Hm 生 成 菌 で あ る
Photobacterium 属は hdc 遺伝子に関する情報が不足していることから、今後これら
の菌種における hdc 遺伝子配列決定を行うことで、実際に食品工場等の現場におけ
る利用が検討されることが期待される。

37
Table 8 Components of the PCR mixture for PCR-HRMA.

Master mix 2 x con. a 10 µL

2.5mM MgCl2 a 2
Forward Primer 1
Reverse Primer 1
ddH2Oa 1
DNA template 5
Total 20 µL
a: Lightcycler®480 High resolution melting master mix

38
Table 9 Observed hdc gene amplicon melting temperature of mesophilic Hm producing
bacteria.

Strain melting temperature (°C)

M. morganii ATCC 35200 80.92±0.05
M. morganii JCM 1672 80.93±0.07
M. morganii AP28 80.59±0.09
R. planticola ATCC 43176 78.30±0.06
R. planticola 4131 78.29±0.09
R. planticola 8433 78.37±0.07
E. aerogenes ATCC 43175 79.81±0.08
E. aerogenes 8D29 79.86±0.07
E. aerogenes 5-6-3011 79.76±0.05
P. damselae subsp. damselae ATCC 33539 76.48±0.08
P. damselae subsp. damselae JCM 1666 76.10±0.09
P. damselae subsp. damselae 6J29-1 76.48±0.08
P. vulgaris AU34 78.08±0.06
P. vulgaris AU33 78.05±0.08
P. vulgaris AU36 78.10±0.06
Erwinia spp. MB31 78.89±0.08

39
Table 10 Observed hdc gene amplicon melting temperature of psychrophilic Hm producing
bacteria.

Strain melting temperature (°C)

P. phosphoreum IAM 12085 78.65±0.07
MB36 78.41±0.01
2-8-1510 78.69±0.04
5-4-1520 78.62±0.09
P. iliopiscarium 6C1521 77.81±0.09
P. kishitanii ATCC BAA-1194 78.49±0.00
4D152 78.64±0.03
7I1524 78.64±0.07
7-9-1517 78.64±0.08
P. aquimaris 8I156 76.97±0.05
N14 76.85±0.04

40
Fig. 6 Alignment of partial histidine decarboxylase gene sequence of Hm producing
bacteria. Red square box: primer position. Residues conserved in all the isolates are on
black.

41
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 7 PCR detection of Hm producing bacteria using hdcH-f/hdcH-r as primers. Lanes: M,

100 bp DNA ladder marker; 1, M. morganii ATCC 35200, 2, R. planticola ATCC 43176, 3,
E. aerogenes ATCC 43175, 4, P. damselae ATCC 33539, 5, P. vulgaris AU34, 6, Erwinia
spp. MB31, 7, P. phosphoreum IAM 12085, 8, K. pneumoniae 5A15, 9, Distilled water.

42
Fig. 8 Melting curve for mesophilic Hm producing bacteria. Pink: P. damselae subsp.
damselae, blue: P. vulgaris, aqua: R. planticola, purple: E. aerogenes, yellow: Erwinia spp.,
green: M. morganii.

43
 M. morganii
AP28

Fig. 9 Different melting curve of 134bp hdc gene for six mesophilic Hm producing
bacteria species. . P. damselae subsp. damselae（pink）, P. vulgaris (blue), R. planticola
(aqua), E. aerogenes (purple), Erwinia spp. (yellow ocher), M. morganii (green). The P.
vulgaris AU34 was selected as reference strain for plotting graph, and is represented with
base line.

44
 P. iliopiscarium
Strain 6C1521

P. aquimaris

Fig. 10 Melting curve for psychrophilic Hm producing bacteria. red: P. phosphoreum, pink:
P. iliopiscarium, blue: P. kishitanii, green: P. aquimaris.

45
 P. aquimaris
Strain N14

Fig. 11 Different melting curve of 134bp hdc gene for P. phosphoreum (red), P.
iliopiscarium (pink), P. kishitanii (blue) and P. aquimaris (green). The P. aquimaris strain
8I156 was selected as reference strain for plotting graph, and is represented with base line.

46
Fig. 12 Different melting curve of 134bp hdc gene for P. phosphoreum (red), P. kishitanii
(blue) and Erwinia spp. (yellow ocher). The Erwinia spp. strain MB31 was selected as
reference strain for plotting graph, and is represented with base line.

47
総括

Hm 食中毒は、主に水産食品を原因食品として現在も散発的発生しており、食品
衛生上・品質上重要な問題となっている。そのため、本研究においては Hm 食中毒
のリスク評価および迅速な原因究明に寄与することを目的とし、鮮魚における低温
性・中温性 Hm 生成菌の分布、低温下における低温性 Hm 生成菌の魚肉中における
挙動を調査することで、鮮魚中における Hm 蓄積のリスクに関する知見を得ると共
に、HRMA を用いた迅速同定法の検討を行った。
本研究では第 1 章において、鮮魚より中温性・低温性 Hm 生成菌の分離及び同定
を行った結果、本実験で用いた全ての魚種において中温性・低温性 Hm 生成菌双方
の汚染が確認された。さらに、中温性 Hm 生成菌のみならず、低温性 Hm 生成菌に
おいても、分離菌株の中に高い Hm 生成能を有する菌株が確認された。そのため、
中温性 Hm 生成菌のみならず、低温性 Hm 生成菌にも、広範囲の魚種において Hm
蓄積を起こす可能性が示唆された。また、低温性 Hm 生成菌においては、P.
iliopiscarium, P. kishitanii, P. aquimaris 等の菌種が低温性 Hm 生成菌として初めて分
離された。これらの菌種の中で、500 mg/L 以上の Hm 生成を示す菌株が存在する
ことから、主な低温性 Hm 生成菌である P. phosphoreum と同様に Hm 食中毒の危害
菌となる可能性が考えられた。
そのため第 2 章において、P. phosphoreum と P. iliopiscarium の分離菌株の中で、
高い Hm 生成能を示した菌株を用いて低温下における増殖および Hm 生成を調査し
た。その結果、P. iliopiscarium の分離菌株は魚肉中においても P. phsphoreum と同等
の Hm 生成能を示した。そのため、今後の研究において、P. phosphoreum と同様に、
これらの菌種に関しても Hm 生成能や hdc 遺伝子の解析を行う事で、より低温性
Hm 生成菌による Hm 蓄積のリスク評価に寄与することが求められる。
さらに、第 3 章において、低温性および中温性 Hm 生成菌の迅速同定法として
HRMA の検討を行った。その結果、中温性 Hm 生成菌においてはシーケンシング
の代替法として利用可能であることが示唆され、低温性 Hm 生成菌においても、同
様に利用できる可能性が考えられた。特に、本手法は微生物検査現場における簡便
な同定法としての利用が期待されていることから（Ruskova and Raclavsky 2011）、
今後食品製造における応用が検討されることが期待される。
Hm 食中毒の予防としては主に温度管理が重要視されているが、本研究において、
低温条件下でも低温性 Hm 生成菌による Hm 蓄積が起こる危険性が示唆された。こ
の結果より、温度管理では Hm 食中毒の発生リスクを完全に抑制する事は困難だと
考えられた。そのため、低温性 Hm 生成菌の Hm 蓄積のリスクを考慮に入れたうえ

48
で、多量の Hm が蓄積された食品が流通することを防ぐ必要がある。さらに低温流
通下における Hm 蓄積が発生する可能性から、流通工程においても食品中の Hm 量
の増加が懸念される。FDA や Codex 等において、食品中の Hm 量に関する規制値
および基準値が設けられているが、我が国では、現在まで Hm 量に対する規制値は
設定されていない。それゆえ、食品流通工程における Hm 量の増加が発生した場合、
対応が困難となりうる可能性がある。そのため、今後は規制値の検討や検査体制の
構築等による本食中毒の予防が望まれる。また、本研究で検討を行った HRMA 法
は、加工品における食中毒事例においても、迅速かつ簡便に原因菌の同定を行える
可能性がある。そのため、今後は食品への応用を検討することによって、Hm 食中
毒の迅速な原因究明への貢献が望まれる。
本研究において、中温性 Hm 生成菌と共に、低温性 Hm 生成菌が Hm 食中毒の発
生リスクを有している事を改めて示すと共に、Hm 食中毒の迅速な原因究明を行う
ために、HRMA による迅速同定法を用いることができる可能性を示唆した。今後
本研究で得られた知見が、Hm 食中毒の予防及び原因究明に寄与することが期待さ
れる。

49
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 謝辞

本研究を行うに当たり、東京海洋大学食品生産科学科 木村凡教授には終始、懇
篤なる指導とご鞭撻を賜り、心から感謝いたします。また、論文作成にあたり、懇
切なご指導とアドバイスを下さった、同大学同学科 崎山高明教授、後藤直宏准教
授、久田孝准教授に心から御礼申し上げます。なお、本研究において多くのご助言
及びご指導を頂きました同大学同学科 高橋肇助教、宮聡子さん、共同実験者とし
て常に力を尽くして下さった東京海洋大学食品微生物学研究室の皆様に心から感
謝いたします。

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