A KLOROFILLÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

A klorofilláz in vivo a klorofill lebontásában szerepet játszó, membránhoz kötött enzim.

A klorofill a,b-ről és a feofitin a,b-ről képes a fitolt hidrolizálni. Az enzimaktivitást a
gyakorlaton az in vitro hidrolízis alapján fogjuk megvizsgálni.

Eszközök: dörzsmozsár, tölcsér, osztott kémcsövek, rázótölcsér, centrifuga és

centrifugacsövek, fotométer és küvetták.
Anyagok: növényi anyag, géz, 50 mM-os foszfát puffer (pH 7,1) 80%-os aceton, aceton,
petroléter.

Módszerek:

A./ Az enzimaktivitás összehasonlítása különböző növényekben

Aprítsunk apró darabokra növényfajonként vagy kezelésenként kb. 1,5 g levelet, majd
jól keverjük össze a mintát. Mérjünk ki minél gyorsabban (nehogy megszáradjon, mivel akkor
a minták nem lennének összehasonlíthatók) 0,3 és 0,9 g-ot. 0,9 g-ot dörzsmozsárban 15 ml 50
mM-os foszfát puffer (pH 7,1) és aceton 1:1 (v/v) arányú elegyében alaposan eldörzsölünk.
(A reakció a homogenizáláskor azonnal megindul!) A homogenizálás kezdetén az összevágott
leveleket csak nedvesítsük meg az eleggyel, a többit fokozatosan adjuk hozzá úgy, hogy a
dörzsmozsarat át is tudjuk mosni vele. Az összerázott homogenátumból növényenként 3×4
ml-t csiszoltdugós kémcsövekbe öntünk, melyeket lezárva a mintákat 30 percig
szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás végén a reakciót az aceton koncentráció 80%-
osra emelésével (6 ml tiszta aceton hozzáadásával) állítjuk le. (A mintákat az aceton
hozzáadása után jól össze kell rázni!). A 80%-os acetonban lévő mintákat speciális
szűrőpapíron szűrjük, vagy 5 percig 10000 g-vel centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk az oldatból
a kicsapódott fehérjéket. A szűrleteket vagy felülúszókat rázótölcsérbe öntjük, 10 ml
petrolétert adunk hozzájuk, összerázzuk, majd elválasztjuk a petroléteres (felső) fázist az alsó
acetonostól (a fázisok szétválását kevés telített NaCl oldat hozzáadásával segíthetjük). Az
acetonos fázisokat osztott kémcsövekbe engedjük le (a petroléteresekre nem lesz szükségünk),
majd térfogatukat azonosra állítjuk 80% acetonnal feltöltve úgy, hogy a lehető legkevésbé
hígítsuk azokat. Ezt követően mérjük (a híg oldat miatt valószínűleg hosszú küvetták
felhasználásával), majd – a 80%-os acetonra vonatkozó egyenletek alapján (ld. gyakorlati
jegyzet 75. oldal) – a térfogatokat is figyelembe véve számoljuk az átalakult klorofill a és b
mennyiségét (az acetonos fázisban lévő klorofillid a-t és b-t). A klorofill és a klorofillid
spektruma nem különbözik, ezért könnyen mérhetjük és számolhatjuk. Inkubálás közben
határozzuk meg a minta kiindulási (összes) klorofill a és b tartalmát a 0,3 g-os mintákat 80%-
os acetonban eldörzsölve, szűrés vagy centrifugálás után kéthullámhossz módszerrel. (Egy
másik, 80%-os acetonban eldörzsölt mintából a kirázásos procedúrával meghatározhatjuk a
kiindulási klorofillid tartalmakat is. Ez azonban friss, zöld növényeknél minimális.)

Feladatok:
1.) Hasonlítsuk össze különböző növények klorofilláz aktivitását (az átalakult klorofill a és b
mennyiségét).
2.) Hasonlítsuk össze friss és öregített növények klorofilláz aktivitását (az átalakult klorofill a
és b mennyiségét).
B./ Az enzimaktivitás függése a reakcióelegy acetonkoncentrációjától

Kb 2 g (ha lehet, akkor 1 napig öregített levelet) vágjunk apró darabokra, keverjünk
össze és mérjük ki minél gyorsabban az egyes mintákhoz szükséges 0,3 g-os adagokat. A
mintákhoz szükséges elegyek összemérését és a leállítást a megadott táblázat szerint
végezzük. (A mintákhoz 5 ml, adott acetonkoncentrációjú elegyet készítünk, de a
homogenátumból csak 4 ml-nyit használunk, ehhez van megadva a leállításhoz szükséges
aceton mennyisége.)

Aceton mintához leállításhoz

tartalom puffer aceton aceton
(%) (ml) (ml) (ml)

20 4,0 1,0 12,0

30 3,5 1,5 10,0
40 3,0 2,0 8,0
50 2,5 2,5 6,0
60 2,0 3,0 4,0
70 1,5 3,5 2,0
80 1,0 4,0 0

A leveleket, először csak megnedvesítve, alaposan dörzsöljük el 5 ml megfelelő

acetonkoncentrációjú pufferben. A homogenátumból 4 ml-t csiszoltdugós kémcsőbe öntünk.
Minden mintát 30 percig inkubálunk szobahőmérsékleten, majd az aceton koncentrációját
80%-osra emelve állítjuk le a reakciót. A klorofill és klorofillid elválasztását az A pontban
leírtak szerint folytatjuk.

Feladat: Ábrázoljuk az átalakult klorofill a és b mennyiségét az aceton koncentráció

függvényében!