INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ey SECRETARIA ACADEMICA A DIRECCION DE EDUCACION MEDIA SUPERIOR CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 ” DIODORO ANTUNEZ EHEGARAY” INSTRUCTIVO DE PRACTICAS DE BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DEL TITULAR: NOMBRE DEL PROFESOR DE LABORATORIO: NOMBRE DEL PROESOR DE LABORATORIO: NOMBRE DEL ESTUDIANTE:. GRUPO: EQuIPO: CICLO ESCOLAR: 2021 II SEMESTRE: CUARTO ELABORO: Q.B.P. ALEJANDRA FRAGOSO CAMACHO. 2021COMPETENCIA GENERAL Aplica métodos y técnicas para el estudio de la bacteriologia clinica cumpliendo con la normatividad vigente JUSTIFICACION El presente instructivo contiene actividades practicas, que incluyen conceptos, técnicas, procedimientos, que se realizan en un laboratorio de bacteriologia clinica y que sirven de apoyo para el estudiante en su formacién como Técnicos Laboratoristas Clinicos, y para el docente al coadyuvar en su ardua tarea de planear y formalizar los conceptos tedricos. El uso de este instructivo va a permitir la sistematizacién de la imparticion de esta asignatura a partir de ordenar y explicitar mejor las actividades a realizar y que todos los alumnos reciban la misma instruccién Es importante mencionar, que en los tltimos afios se han desarrollado nuevas tecnolo que escapan al objetivo de este manual, pero que pueden ser consultadas en otras bibliografias especializadas.Practica 1. Practica 2 Practica 3. Practica 4. Practica 5. Practica 6 INDICE Reglamento y bioseguridad en el laboratorio. Material de laboratorio de Bacteriologia y Microscopia. Tincién Simple. Tincién diferencial de Gram. Tincién diferencial de Zieh! Nelsen. Tinciones especiales. Examen practico A. Practica 7. Practica 8. Practica 9 Practica 10. Practica 11. Esterilizacién por calor hmedo y por calor seco. Preparacién de medios de cultivo Medios de cultivo y su control de calidad. Siembra y aislamiento bacteriolégico. Morfologfa colonial. Examen practico B. Practica 12. Practica 13 Practica 14. Practica 15. Practica 16 Practica 17. Exudado Faringeo. Antibiograma del exudado faringeo. Siembra de urocultivo. Pruebas bioquimicas para el urocuttivo. Siembra de coprocultivo. Lectura del coprocultivo, Examen practico C 10 24 29 33 37 4 46 52 57 65 70 75 79 84 89 93INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ : ACADEMIA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 1: REGLAMENTO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Clave: BC-Pi Pagina: 4 de 97 1. MARCO TEORICO El reglamento de trabajo esta conformado por una serie de normas que regiran la actitud, el comportamiento y el desempe/io del estudiante dentro del laboratorio de Bacteriologia Clinica. Tiene como finalidad evitar riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un area donde se manejan microorganismos patégenos y algunos compuestos quimicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como los microscopios y material delicado de cristaleria. La bioseguridad Seguin la OMS (2005) es un conjunto de normas y medidas para proteger la salud del personal, frente a riesgos biolégicos, quimicos y fisicos a los que esté expuesto en el desemperio de sus funciones, también a los pacientes y al medio ambiente. Principios de bioseguridad La bioseguridad tiene tres pilares que sustentan y dan origen a las precauciones universales: a) Universalidad: de este principio nace el concepto de potencialidad, es decir, se asume que toda persona es portadora de algtin agente infeccioso hasta no demostrar lo contrario. Las. medidas de bioseguridad son universales, es decir deben ser observadas en todas las personas que se atiende. b)_ Uso de barreras protectoras: son elementos que protegen de la transmisién de infecciones y se dividen en dos grandes grupos, la inmunizacién activa (vacunas) y el uso de barreras, quimicas, fisicas 0 mecdnicas, para evitar el contacto directo entre personas y entre personas y objetos potencialmente contaminados 0 nocivos. ©) Medidas de eliminacién de residuos La eliminacién de los desechos peligrosos que se generan en las instituciones de salud tiene riesgos y dificultades especiales, debido fundamentalmente a la presencia de agentes biolégicos. Estos riesgos involueran en primer término al personal que maneja los desechos tanto dentro como fuera del establecimiento, que, sino dispone de capacitacién 4suficiente ni medios de proteccién personal, equipos y herramientas de trabajo apropiados se expone al contacto directo con gérmenes patégenos 0 a la accién de objetos corto punzantes como agujas, jeringas, trozos de vidrio, lancetas y otros. El manejo deficiente de desechos peligrosos en centros de salud 0 especificamente en un laboratorio de ensefianza como el nuestro involucra tanto al personal de intendencia como a los estudiantes y profesores expuestos como a la comunidad y al medio ambiente circundante. Agentes biol6gicos Son microorganismos incluyendo los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparésitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infeccién, alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres vivos. Los agentes biolégioos se clasifican en cuatro grupos segtin su riesgo intrinseco, el cual se determina en funcién de su virulencia, su facilidad de propagacién, la gravedad de sus efectos sobre la salud y la existencia 0 no de medidas profilécticas y terapéuticas eficaces, 2. COMPETENCIA A ALCANZAR El alumno aplica el reglamento de laboratorio, con el fin de mantener la seguridad individual y grupal, asi como el cuidado y conservacién de los instrumentos del laboratorio. 3. MATERIALES Instructivo de practicas. Materia bibliografico relacionado con la practica Presentacién en PWP, Prezzi, etc. basadas en el contenido de la practica. 4, DESCRIPCION DE ACTIVIDADES 1. Formacién de equipos de trabajo. 2 Lectura y firma de conformidad del reglamento de laboratorio. 3.- Explicacién 0 presentacién en PWP, Prezzi (por parte del docente titular) etc. que incluya la siguiente informacion: que es bioseguridad, principios bésicos de bioseguridad, niveles de contencién y sus caracteristicas, que es agente un biolégico y su clasificacién segin la OMS, barreras primarias y secundarias.10. 12, 13. 14, 15. 16. REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA CLINICA. Ciudad de México, enero del 2021. Entrar puntualmente al laboratorio. Eventualmente se permitiré una tolerancia de 5 minutos Después de la tolerancia no se permitira al acceso. Ingresar al laboratorio con la bata puesta, abotonada, limpia y planchada. Solo podré quitarsela al salir de éste. Permanecer con la bata abotonada en todo momento durante la estancia en el laboratorio. Deben presentarse al laboratorio con el cabello recogido, ufias cortas y sin esmalte. ‘Queda prohibida la entrada a personas ajenas al laboratorio. Mantener siempre cerrada la puerta del laboratorio. Se prohibe la salida, sin autorizacién de los profesores encargados. Colocar las mochilas y objetos personales en los anaqueles que se encuentran en la entrada del laboratorio, Dejar afuera solamente el material que se va autilizar. Evitar comer, aplicarse maquillaje 0 realizar alguna otra actividad que no se relacione con la asignatura (recortes, cuestionarios, dibujos etc.). Verificar que la mesa de trabajo este en dptimas condiciones para llevar a cabo la practica correspondiente, en caso de encontrarla sucia 0 con material, deberdn reportarlo al profesor. Atender la explicacién para seguir correctamente las instrucciones del profesor. Si hay dudas preguntar antes de iniciar la practica para evitar errores y accidents, (no habra repeticiones, por error del estudiante, ya que no se dispone del tiempo ni reactivos suficientes) asimismo informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra. Leer la préctica antes de entrar al laboratorio, Verificar que al final de la practica las mesas y tarjas queden limpias, para lo cual se asignara un rol Para poder retirarse del laboratorio ser necesario contar con la autorizacién del profesor. Colocar los bancos bajo la mesa durante la préctica, para evitar obstéoulos al caminar en el laboratorio y evitar accidentes. Durante la sesién quedan prohibidos los juegos y abrazos.17. 18. 19. 24 24, Solicitar el material de manera ordenada, para ello solamente podran ir una o dos personas al almacén y los demds integrantes del equipo deben permanecer en su mesa de trabajo, salvo otra indicacién del profesor (es). Colocar los bancos en la parte de arriba de la mesa y hacia el centro de la misma al terminar la sesién. Reponer el material roto o extraviado (por equipo o grupo) en un lapso no mayor de 15 dias. Adquirir el manual, el cual sera personal e identi nombre, grupo, equipo. farlo en el extremo inferior derecho con Todos los integrantes del equipo habran de elaborar de manera individual su reporte préctico sin embargo solo se entregara un solo reporte por equipo el mismo dia al finalizar la practica. El reporte tendré un valor del 10 % de un total del 50% y debera contar con los siguientes requisitos: a. Titulo y numero de la practica 0.0% b. Competencia 0.0% ©. Introduccién (organizador gr&fico) ..........1.0% d._ Diagrama de tiujo. 1.0% e, Resultados. 3.0% Analisis de resultados 0 conclusiones....... 2.5.0% g. Cuestionario 25% h Bibliogratia, 0.0% En caso de no asistir a la practica debe presentar el justificante emitido por control esoolar a la brevedad posible, quedando justificada la inasistencia. La evaluacién continua el trabajo en el laboratorio y el reporte se evaluaran con cero. Para tener derecho al examen °C" debe de cumplir con el 80% de asistencia y practicas aprobadas. Si cumple del 70% al 79% de asistencia y practicas aprobadas tiene derecho al EXAMEN EXTRAORDINARIO. Menos del 70% autométicamente se presenta al EXAMEN A TITULO DE SUFICIENCIA. El no cumplir con alguno de los puntos anteriores, sera motivo de sancién (bajar puntos en la calificacién de laboratorio). En caso de indisciplina se le pediré que salga del laboratorio, anulandose la practica correspondiente del departamental en curso. Firma del estudiante Firma del padre o tutor5. RESULTADOS a) Con base en la descripcién que hace la OMS en cuanto a los niveles de contencién 0 de seguridad biolégica y grupos de riesgo, completa la tabla con la informacién que se te solicita: Nivel de Tipo de Caracteristicas de disefio Equipo de seguridad bioseguridad | _laboratorio b) Completa la tabla: referente a la clasificacién de los microorganismos infecciosos por ‘grupos de riesgo. Grupode | Riesgo | Riesgo Madidas preventivas y terapéuticas riesgo individual _| poblacional eficaces6 Cuestionario 1. Define que es bioseguridad y cuales son sus principios basicos, 2, Menciona dos riesgos a los que esta expuesto un TLC en un laboratorio de bacteriologia. 3. .Qué debe hacerse en caso de derrame de un cultivo bacteriano sobre la mesa? 4. .Qué debe hacerse cuando se derrama un cultivo bacteriano sobre la bata? 5. Menciona dos razones por las que ti pudieras ser causante de un accidente en el laboratorio de bacteriologia clinica. 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIAINSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ : ACADEMIA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LAPRACTICANo.2: MATERIAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICROSCOPIA. Clave: BC-P2 | Revision: 15/02/21 _| Fecha de emision: 22/02/21 | Pagina: 10 de 97 1. MARCO TEORICO EI personal que trabaja en el laboratorio utiliza materiales diversos, disefiados cada uno para Una funcién especifica y poder alcanzar un objetivo concreto. El progreso de la técnica en estos titimos afios ha hecho que en los laboratorios existan nuevos recursos que hacen el trabajo del quimico mas facil y rapido. Es necesario que antes de comenzar cualquier trabajo experimental, el alumno conozca el material que se utiliza. Cada uno de los materiales tienen una funcién y su uso debe ser acorde con la tarea a realizar. La utlizacién inadecuada de este material da lugar a errores en las determinaciones realizadas y aumenta el riesgo en el laboratorio, por lo tanto, es importante conocer su uso y cuidados en general Clasificaci6n del material de bacteriologia clinica segin su uso Material: es cualquier objeto que sirve para un trabajo 0 una operacién manual, son de uso frecuente y su manipulacién es sencilla. La materia de la que estén constituidos puede ser: metal, vidrio, plastico, porcelana, madera u otros, se clasifica de la forma siguiente: a) Material de Sostén: es todo material que se utiliza para sujetar y/o sostener a otro, ejemplo: + Gradilla: material que sirve para colocar tubos de ensaye facilitando su manejo. + Puente de tincién: material sobre el que se coloca el portaobjetos durante el proceso de tincién bacteriana.b) Materiales usados como recipientes: permiten contener sustancias. + Frasco gotero: permite contener sustancias que se necesitan dosificar en pequefias cantidades y que por lo general son sensibles a la luz. + Vaso de precipitados: se emplea para contener, calentar, enfriar, disolver, mezclar, hacer reaccionar diferentes sustancias etc. Es importante mencionar que la precisién de su graduacién es muy baja por lo que no deben ser utilizados como materiales de medicion. + Matraz de Erlenmeyer: por su forma es ttl para realizar mezclas por agitacién, ademas, su abertura estrecha permite la utiizacion de tapones. Nunca debe ser utilizado como material de medicién. + Tubo de ensayo: esta hecho de un vidrio especial (Pyrex) que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo, los cambios de temperatura extremos pueden provocar el rompimiento del tubo. Sirve para contener pequefias cantidades de muestra y preparar soluciones.©) Material Volumétrico: permiten medir volmenes de sustancias liquidas. + Pipetas: permiten la transferencia de un volumen generalmente no mayor a 20 mi de un recipiente a otro de forma exacta, estas permiten medir alicuotas de liquido con bastante precisién. Suelen ser de vidrio y estén formadas por un tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cénica, tienen una graduacion (una serie de marcas grabadas) indicando distintos volumenes. + Probeta: permite medir volimenes superiores més rapidamente que las pipetas, aunque con menor precisién. + Matraz Volumétrico: material de vidrio que se utiliza para preparar soluciones valoradas. | d) Materiales de uso Espe 0: permiten realizar alguna operacién especifica, ‘+ Portaobjetos: lamina de vidrio transparente, rectangular utilizada para fjar muestras u objetos con el fin de observarlas bajo el microscopio.+ Espatula: es una lémina plana angosta que se encuentra adherida a un mango hecho de madera, plastico 0 metal. Es utilizada principalmente para tomar pequefias cantidades de compuestos 0 sustancias sélidas, especialmente las granulares. / + Mechero Fisher: es un instrumento utiizado en laboratorios para calentar muestras y sustancias quimicas. Nota. Precauciones en el uso de! Mechero Fisher: Antes de utilizar el mechero, asegurese cual es la tuberia que suministra el gas y que la manguera de hule esté bien conectada. El mechero debera ser manipulado por una sola persona. Encienda el cerillo antes de abrir la llave que suministra el gas, ‘+ Pizeta: es un recipiente de plastico, cilindrico, sellado con tapa rosca, el cual pose un Pequefio tubo con una abertura capaz de dispensar cualquier liquido que se encuentre contenido en su interior en pequefias cantidades, por ejemplo: agua o de forma particular en bacteriologia soluciones desinfectantes. i: recipiente redondo hecho de vidrio 0 de plastico, posee diferentes diametros, es de fondo bajo con una cubierta de la misma forma que la placa, pero un poco mas grande de diametro ya que se puede colocar encima y cerrar el recipiente como una tapa. En bacteriologia es utilizado para el cultivo de bacterias.+ Asa bacteriolégica: Est formada de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en aro 0 en punta, este instrument de laboratorio nos ayuda transportar o arrastrar microorganismos de un medio a otro medio para su adecuado desarrollo, asi como para la realizacién de frotis. = + Pro pipeta: utensilio de goma, creada especialmente para asegurar la transferencia de liquidos de todo tipo, especialmente los que poseen propiedades especiticas (infecciosos, corrosivos, t6xicos, radiactivos o estériles).. Aparatos utilizados en el laboratorio de bacteriologia clinica Aparato: objeto formado por una combinacién de piezas y elementos que sirve para desarrollar un trabajo o funcién determinados y que generaimente funciona mediante energia eléctrica, su funcién es especifica. + Refrigerador: su utiidad es la conservacién de reactivos y medios de cultivos. La temperatura de conservacion es de 4°C. + Balanza Granataria: Instrumento de precision para pesar los medios de cultivos y reactivos que se preparan en un laboratorio de microbiologia.+ Autoclave: es un aparato de laboratorio que se utiliza para esterilizar. Por esterilizar se entiende la destruccién o eliminacién de toda forma de vida microbiana (incluyendo esporas) presente en abjetos inanimados mediante procedimientos fisicos, quimicos 0 gaseosos. La autoclave esteriiza diversos materiales empleados en actividades de diagnéstico, tratamiento o investigacién en instituciones de salud (hospitales y laboratorios), asimismo su uso se extiende a la industria alimenticia y farmacéutica, En el laboratorio clinico especificamente, la autoclave se utiliza con el fin de eliminar de forma confiable, los microorganismos presentes en los medios de cultivo, material de vidrio y/o metal inoxidable 0 en materiales utiizados para la toma de muestras como: aguias, hisopos, abatelenguas, recipientes etc. (todos deben estar en condiciones estériles), también para la destruccién de material contaminado con agentes biologico intecciosos. Campana de Flujo Laminar (CFL) 0 Cabina de Seguridad Biolégica (CBS): es un aparato diseftado para proteger al laboratorista de los aerosoles y micro particulas asociados al manejo del material biolégico potencialmente t6xico 0 infeccioso, que se genera en actividades como el cultivo de bacterias al manipular el asa bacteriolégica y pipetas, evitar la contaminacién externa de las muestras biolégicas que se analizan en el laboratorio. También son utiizadas para actividades en las que se requiere de un ambiente aséptico como es la preparacién de reactivos y vaciado de medios de cultivo. + Incubadora: es un aparato disefiado para mantener una camara a temperatura, atméstera y humedad controladas, con el fin de conservar organismos vivos en un entorno que resulte adecuado parasu crecimiento. Entre las aplicaciones més comunes, se citan las siguientes: incubacién de cultivos bacteriolégicos, virales, micol6gicos, celulares etc. Las incubadoras varian en complejidad y disefo, algunas Gnicamente controlan la ‘temperatura, mientras que otras, ademas, controlan la composici6n atmosférica. 15Estufa de secado: se identifica también con el nombre de Horno de esterilizacién, es ullizada para el secado y/o esteriizacién de material de vidrio y metal que proviene de la seccién de lavado, también se utiliza para secar sales quimicas. La temperatura de operacién de este aparato oscila entre 60°C a 300°C. Microscopio de luz visible. Es un aparato que ya ha sido utilizado por los estudiantes en cursos previos. Se ha incluido en esta practica para familiarizarlos con su funcionamiento, manejo y cuidados, asi como para desarrollar su habilidad para trabajar con el objetivo de inmersion cuyo uso es indispensable en la observacién de microorganismos y sus estructuras. Las partes que lo constituyen se indican en la siguiente figura. ocular = braze objetivo zt platina o> eum liafragima inivomaico lampara ‘erie icone -El microscopio esta formado por tres tipos de lentes: el ocular, los objetivos “seco débil” (10X), seco fuerte” (45X) e “inmersién” (100X) y el condensador. Los dos primeros intervienen en la amplificacién de la imagen mientras que el condensador forma parte del sistema de iluminacion Cada objetivo tiene grabada una inscripcién su significado se explica en el siguiente ejemplo’ 400.65, 16010.17 ( 0°10") 40 significa el ntimero de aumentos, la apertura numérica es de 0.65, mientras que 160 mm es la longitud desde el objetivo hasta el ocular y 0.17 + 0.01 son los mm de espesor que debe tener el cubreobjetos, en lugar de este tiltimo puede tener la marca "/--", que significa que es insensible a fuertes diferencias de espesor del cubreobjetos, o la marca */0” que indica que no necesita el empleo de cubreobjetos (ver imagen). Numero de aumentos. 2- Apertura numérica 3. Longitud del tubo. 4 Grosor del cubreobjetos 5. Fuelle del objetivo. ' 21 2 El aumento primario del objeto se produce por el objetivo, esta imagen se transmite al ocular donde se lleva a cabo el aumento final. La amplificacién total es el producto de ambas lentes. Una propiedad muy importante del microscopio, es su poder de resolucién o sea su capacidad para mostrar como distintos y separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre si. El poder de resolucién a su vez depende de la longitud de onda de la luz empleada y de una propiedad de la lente llamada apertura numérica (AN). Las lentes con mayor poder de resolucién tienen AN mayores permitiendo observar abjetos de menor tamafio. La AN esta en funcién del indice de refraccién del medio que se encuentra entre el objetivo y la preparacién, el Angulo que forman el eje éptico y los rayos mas exteriores captados por el objetivo. Cuando se utiliza el objetivo de inmersién, es indispensable colocar sobre la preparacién (que debe ser fija 0 permanente) una gota de aceite de cedro que tiene un indice de refraccion igual al del vidrio (1.515), este llena el espacio entre la lente y la Preparacién, corrigiendo la trayectoria de los rayos de luz periféricos y de los que se pierden or reflexidn o refraccién de tal forma que se consigue un notable incremento en la AN y por lo tanto un mayor poder de resolucion.Cuidado y limpieza del microscopio Como todo instrumento de precisién, para su manejo se debe tener especial cuidado por lo que se sugiere lo siguiente: ‘+ Sujetar el aparato firmemente con ambas manos y depositarlo con suavidad sobre la mesa de trabajo. + Verificar que todos los componentes del microscopio embonen perfectamente y su movimiento sea suave y facil, no hay que forzar la colocacién de ninguna pieza ni su movimiento. ‘+ Evitar que el polvo, se deposite en las cremalleras y en las lentes cubriéndolo con una funda de plistico al término de su uso. ‘+ Guardar el aparato en un lugar fresco y seco. ‘+ Conservar las lentes lo mas limpias posibles evitando que se ensucien con las preparaciones y con la grasa de las manos y rimel de pestafias. ‘+ Limpiar las lentes con un hisopo embebido en solucién alcohol-acetona 3:1 y papel seda. También se puede utilizar éter puro, pero nunca disolvente, porque puede disolver el pegamento de las lentes. ‘+ Limpiar el sistema mecénico con un pafo limpio y humedecido con agua destilada y ‘que no suelte pelusa, posteriormente secarlo con otro patio limpio y seco, 2. COMPETENCIA Identifica el material y aparatos pertenecientes al laboratorio de bacteriologia para brindarles el uso correcto en la ejecucién de las diferentes técnicas microbiol6gicas. 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas de précticas. Material bibliografico relacionado con el contenido de la practica. Materiales de laboratorio de bacteriologia (los mencionados en el marco teérico) Aparatos de laboratorio de bacteriologia (los mencionados en el marco tedrico).. Preparaciones fijas 0 permanentes. Hisopos. Pajio limpio de lino, Aceite de inmersion. Solucién limpiadora, 4, DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES 1.- El docente muestra los materiales y aparatos del laboratorio de bacteriologia, explica su uso y precauciones que hay que tener en su manejo. 2.- El estudiante identifica el material y aparatos mostrados. 3. Enfoca las preparaciones fijas proporcionadas y realiza los esquemas correspondientes.10. " 12. 13. 14. 16. 16. PROCEDIMIENTO PARA ENFOCAR LA PREPARACION Limpiar todas las lentes con papel seda. Colocar el objetivo de menor aumento (10X) en posicién de observacién (centrado sobre el sistema de iluminacién), debera escuchar un chasquido, que le indicaré que quedo en la posicion correcta Conectar la tuente de luz y encenderla. Separar completamente la platina del objetivo y colocar la preparacién sobre la platina del microscopio, asegurarla bajo las pinzas del mismo. Centrar la preparacién sobre la abertura de la platina, con los tornillos del vernier. Observar por el costado del microscopio y accionar lentamente el tornillo micrométrico para acercar el objetivo de menor aumento al preparado, sin llegar atocarlo, ‘Ajustar la distancia entre los dos oculares a la distancia de sus ojos. Observar por los oculares, para realizar el enfoque aproximado haciendo descender la platina mediante el tomillo macrométrico hasta hallar la imagen borrosa del objeto. Este enfoque debe realizarse siempre haciendo descender la platina para evitar tocar la lente frontal de los objetivos con el preparado. Realizar el enfoque exacto mediante el tomillo micrométrico hasta obtener la imagen nitida. Pasar al siguiente aumento (40X 0 45X) repitiendo los pasos anteriores. ‘Aumentar la intensidad de luz elevando el condensador al maximo mediante su respectivo tornillo de ajuste y cerrar ligeramente el diafragma iris de tal modo que se mantenga el campo iluminado. Esto se hace debido a que al utilizar aumentos mayores el campo visual se reduce. Girar el revolver ligeramente corrido de la posicién de observacién y colocar sobre la preparaci6n a observar una gota de aceite de inmersién. Ubicar el objetivo de 100X en la posicin de observacién, sobre la gota de aceite. Realizar el enfoque exacto con el tornillo micrométrico. Regular la iluminacién. Limpiar cuidadosamente cuando finalice la observaciin las lentes de los objetivos con papel seda.5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES a) Completa las tablas que se muestran a continuacién con la informa Nota: los dibujos pueden hechos a mano o impresos. Tabla No.1 n que se te solicita Nombre del materiale imagen yasiieacion UseTabla No. 2 ‘Nombre del aparate e imagen Fundamento de su Tuncionamiento Us6 21b) Realizar los esquemas de las preparaciones observadas Observacién: Observacion: ‘Objetivo: ‘Objetivo: 6. CUESTIONARIO 1. Que funciones especiticas tiene la estufa bacteriolégica. 2. Para que se usa el bafio Maria a 37 °C en el laboratorio de bacteriologia clinica. 3. Que uso especifico tiene el asa bacteriologica. 4, Escribe el concepto de apertura numérica 5, Escribe el concepto de poder de resolucién de un microscopio7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIAINSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 3: TINCION SIMPLE. Clave: BC-P3_[ Revi 75/02/21_| Fecha de emision: 22/02/21 _| Pagina: 24 de 97 1. MARCO TEORICO Las bacterias son casi incoloras, cuando se les observa a través de un microscopio éptico, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente por lo que es necesario tefiirlas de forma previa. Latinci6n es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. Los colorantes aplicados a las preparaciones bacterianas tienen las siguientes funciones: -Proporcionar un contraste que permite una mejor observacién de las bacterias. -Facilitar ol estudio en detalle de su morfologia. -Permitir el estudio de las estructuras internas y externas de las bacterias (fiagelos, esporas, niicleo, capsula, pared celular, etc.) - Lograr un aumento mayor (lente de inmersién). Antes de tefir las bacterias, hay que realizar primero una extensién de los microorganismos provenientes de la muestra clinica o un cultivo sobre un portaobjetos, a dicha extensién se denomina frotis, el cual previo a su tincién se debe secar a temperatura ambiente y fijarlo. La fijacién es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares. Y se puede llevar a cabo mediante diferentes tratamientos ya sean fisicos (calor) 0 quimicos (con etanol, formaldehido 0 acido acético). Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a oélulas, tejidos, fibras, etcétera. Especiticamente en bacteriologia el uso de colorantes facilita la observacién de las bacterias al aumentar notablemente el contraste y poder realizar la observacién en microscopio éptico. Los colorantes son compuestos organicos que estan constituides por un grupo croméforo y Un grupo auxocromo, unidos a un anillo bencénico. El grupo croméforo es un solvente organico que imparte color a los compuestos y el auxocromo es el grupo quimico que se ioniza con el cromégeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos. Los colorantes empleados en bacteriologia son colorantes sintéticos. En la practica los colorantes se dividen en dos grupos: acidos y basicos. Los colorantes basicos estan formados por un catién coloreado y un anién incoloro, mientras que en los colorantes acidos es a la inversa. Las oélulas bacterianas son ricas en acidos hucleidos que tienen cargas negativas en forma de fosfatos, estas cargas se combinan con los colorantes basicos cargados positivamente, por lo cual la bacteria se tifie uniformemente, 24ya que existen acidos nucleidos tanto en el nticleo (ADN), como en el citoplasma (ARN). Los colorantes acidos tienen mayor afinidad a combinarse con el citoplasma de las células de ‘organismos superiores. En bacteriologia se usan casi exclusivamente los colorantes basicos (cristal violeta, fucsina, azul de metileno, etc.) Existen dos métodos de tincién principales: 1) Tinoi6n Simple 2) Tincién diferencial Tincién simple: consiste en hacer actuar sobre la preparacién fijada un solo colorante (Azul de Metileno, Safranina, Fucsina diluida al 10%, etc.). Se utiliza para ver el tamaito, la morfologia y el arreglo en el crecimiento de las bacterias. DIVERSIDAD DE FORMA Y AGRUPACION BACTERIANA Cocos actos Espirtos ° S. = now a AYN Diplacoeoe Diladacios 2 a eee Estrotocotos —Eatreptaciog = CS —— eS env" Estafllococos Cocobactios & ae € Tétradae (0 8 sarcmas —_—Lettasehinas B R Procedimiento para la realizacion del frotis. 1. Lavar perfectamente el portaobjetos con jabén y agua cortiente, secarlo con un pafio de algodén y etiquetarlo, 2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama (azul) del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3. Enfriar el asa. Después acercar al mechero el tubo de ensaye o bien la caja Petra conteniendo el cultivo bacteriano y tomar cuidadosamente la muestra. 4. Colocar en el caso de los cultivos liquidos, una gota del cultivo en el centro del portaobjetos y extenderla suavemente en un area circular de 2 om. de didmetro aproximadamente y dejar secar a temperatura ambiente. 5. Esterilizar el asa nuevamente y repetir el paso anterior de 3 a 4 vecesmas. Fijar con dos gotas de alcohol, dejando que estas se evaporen al aire. Colocar previamente, si se trata de un cultivo sélido, una gota de agua destilada en el 25centro del portaobjetos y mezclar en ella una pequefia muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar alaire. 8 Pasar el portaobjetos de 3 a 4 veces sobre la flama del mechero, evitar el sobrecalentamiento de este. Procedimiento para la tincién simple. 1. Cubrir solo el frotis con el colorante y dejarlos actuar durante un minuto, 2. Lavar la preparacién con agua para eliminar el exceso de colorante. Esta operacién se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podria arrastrar parte del frotis consigo. 3. Eliminar la maxima cantidad de agua del portaobjetos golpedndolo por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo y secarlo, pero en ningtin caso se debe frotar el portaobjetos. 4, Observar la preparacién al microscopio llegando hasta el maximo aumento usando el aceite de inmersion. ‘tgsa sobre pottaoujeos ‘seve y escarincon ‘ema ina y store aay asesyessao me = Ss. Fnreon caer S-Adcorarel (orcs) = Se entsiony Goer en 2. COMPETENCIA: Realiza la técnica de preparacién de frotis y tincién simple para identificar las principales formas y agrupaciones bacterianas. 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas Mechero Vaso de precipitados de 100mL Asa bacteriologica Puente de tinci6n Gradilla4 portaobjetos Pizeta con agua destilada Microscopio Frasco gotero con colorantes (azul de metileno, safranina, cristal violeta) Frasco gotero con alcohol etilico Aceite de inmersion Soluci6n desinfectante Cultivos bacterianos en medio sélido y Iiquido 4, DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El docente proporciona los cultivos bacterianos en medio sélido y liquido. .- El docente explica la técnica de preparacién del frotis y tincién simple. El estudiante realiza las técnicas indicadas. El estudiante hace las anotaciones correspondientes. 9 REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES. © Forma’ © Agrupacién: + Aumento total: ‘+ Colorante utilizaco: © Forma’ = Agrupacién: + Aumento total: © Colorante utilizado: + Forma’ * Agrupacion: + Aumento total © Colorante utiizaco:6. CUESTIONARIO 1. Describe que es una tincién microbiol6gica’ 2. .Cudles son las caracteristicas que debe tener un frotis bacteriano de buena calidad? 3. 4Por qué se fija el frotis a temperatura ambiente? 4, Por qué se fija el frotis a la flama del mechero? 5. 4Con los resultados de la tincién simple se puede conocer si la muestra tenida es un cultivo puro? Si o no y porque. 7. ANALISIS DE RESULTADOS 8. BIBLIOGRAFIA.INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 4.: TINCION DIFERENCIAL DE GRAM Clave: BC-P4 | Revision: 15/02/21 | Fecha de emision: 22/02/21 | Pagina: 29 de 97 1. MARCO TEORICO Esta técnica fue desarrollada en 1884 por el danés Christian Gram y es un ejemplo de una tincién diferencial. Con base en esta coloracién se clasifica a la mayoria de las bacterias en dos grupos, bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. En el desarrollo de la técnica se usan 4 reactivos dos colorantes: cristal violeta (colorante primario); safranina (colorante de contraste 0 secundario); lugol que actia como mordiente y un agente decolorante compuesto por aleohol-acetona. En las bacterias Gram positivas el cristal violeta 0 colorante primario se une a la pared bacteriana la cual es relativamente més gruesa (15 a 80 nm), con mayor contenido de peptidoglicano y acidos teicoicos que la pared de las bacterias Gram negativas, la cual incluye tres componentes exteriores a la capa de peptidoglicano (2nm); una zona de lipoproteina, una membrana externa y una capa de lipopolisacarido. El lugol que se adiciona actiia como mordiente fijando el cristal violeta y forma un complejo cristal violeta- yodo- ribonucleato de magnesio, en este momento todas las bacterias se tinten de azul obscuro. El alcohol-acetona es adicionado como agente decolorante asi las bacterias Gram positivas no pierden el complejo cristal violeta yodo y permanecen de color violeta en cambio las bacterias Gram negativas cuya pared es mas delgada (10 a 15 nm) y tiene 5 a 10% de peptidoglicano pierden el complejo cristal violeta yodo y al adicionarles safranina llamado colorante de contraste toman el color rojo. Por esta raz6n las bacterias que retienen el colorante primario y no reaccionan con el ‘colorante de contraste son llamadas Gram positivas y se tifien de violeta, las bacterias que reaccionan con el colorante de contraste se denominan Gram negativas y estas se tifien de color rojo. Procedimiento de la técnica de Gram 1. Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado. 2.- Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa o con alcohol 3. Cubrir el frotis con solucién de cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. 4.- Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de 1o incidir sobre el frotis. 5.- Cubrir el frotis con lugol durante un minuto, luego escurrir el exceso de la solucién yodo- yodurada. Lavar con agua 296.- Agregar sobre el frotis alcohol-acetona, inclinandolo para que el decolorante resbale lentamente por él, hasta no arrastrar mas colorante violeta. Este es un paso critico en el procedimiento, el tiempo de decoloracién requiere de unos 5 a 10 segundos, dependiendo del grosor del frotis. 7.- Répidamente lavar con agua para detener la accién del decolorante. 8. Cubrir el frotis con safranina durante un minuto. .- Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua y dejar secar al aire. 10.- Observar el frotis al microscopio, con el objetivo de inmersién y esquematizar. 11.-Las bacterias Gram positivas se tien de color morado y las bacterias Gram negativas de color rojo. 2. COMPETENCIA Aplica la técnica de coloracién de Gram para la diferenciacion de bacterias. 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de précticas Mechero Vaso de precipitados de 100mL Asa bacteriologica Puente de tincién Gradilla 4 portaobjetos Pizeta con agua destilada 30Microscopic Frasco gotero con colorantes (oristal violeta, safranina) Frasco gotero con lugol Frasco gotero con alcohol-cetona Aceite de inmersion Soluci6n desinfectante Cultivos bacterianos 4, DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El docente proporciona los cultivos bacterianos. 2.- El docente explica la técnica de tincién de Gram. El estudiante realiza la técnica indicada. 4.- El estudiante hace las anotaciones correspondientes 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES. © Forma: © Agrupacion: + Aumento total: © Gram © Forma’ = Agrupacién: + Aumento total: = Gram © Forma’ * Agrupacion: ‘+ Aumento total: © Gram 31CUESTIONARIO 1. Describe el fundamento de la tincién de Gram: 2. {Qué diferencias estructurales hay entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas que hacen que se tifian de morado 0 rojo respectivamente? 3. .Qué es un mordiente? 4, {ual es el paso critico en la técnica de Gram y por qué? 5. Anota el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram negativas y tres Gram positivas. Gram negativas Gram positivas 7.» CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA 32INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS ¥ TECNOLOGICOS 15 . “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 5: TINCION DE ZIEHL-NEELSEN Clave: BC-P5 | Revision: 15/02/21 | Fecha de emision: 22/02/21 | Pagina: 33 de 97 1. MARCO TEORICO Lacoloracién de Ziehl-Neelsen es otro tipo de coloracién diferencial que separa a los géneros ‘Mycobacterium y Nocardia del resto de las bacterias. Las paredes celulares de los géneros mencionados presentan caracteristicamente un alto contenido de lipidos (arriba de 60%) Unidos a polisacéridos, acidos grasos de cadena muy larga como son los acidos micélicos y nocrdicos respectivamente y proteinas. Estos 4cidos parecen jugar un papel muy importante en esta coloracién. En esta técnica se utiliza la fucsina fenicada como colorante primario, esta solucién se aplica con calentamiento a emisién de vapores. Como agente decolorante se aplica una mezcla de etanol y cido sulflirico 0 Acido clorhidrico. El azul de metileno es el colorante secundario. La explicacién que da respuesta a la coloracién involucra varios factores, por un lado, se ha postulado que el alto contenido de acidos grasos interviene decisivamente y al calentar el colorante primario a emisin de vapores, se favorece la disolucién de los acidos grasos y se permite el paso del colorante al interior de la célula. Al suspender el calentamiento y lavar con agua fria se provoca una nueva solidificacién de los acidos grasos de modo que é! colorante se ve impedido totalmente de salir de las bacterias. Por otra parte, el calentamiento aumenta la energia cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Por tiltimo, se ha postulado que el complejo colorante- fenol es mas soluble en los lipidos bacterianos, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las oélulas. Puesto que el proceso de decoloracion es muy enérgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes lipidos como Mycobacterium y Nocardia perder facilmente el colorante primario y fijara entonces el azul de metileno. Las bacterias que resisten la decoloracién son llamadas AAR (Acido Alcohol Resistentes) positivas, y se observan de color rojo. Las restantes se ven de color azul Procedimiento de la tincién diferencial de Ziehl-Neelsen. 1.- Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado. 2.- Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa. 3.- Cubrir todo el portaobjetos con solucién de fucsina fenicada y calentar suavemente la 3preparacién a emisién de vapores. El colorante no debe secarse ni hervir, afiadir més si es necesario. Mantener la emisién de vapores durante 5 minutos. 4,- Esourrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de no incidir sobre el frotis. 5.- Decolorar con alcohol-dcido hasta eliminar el exceso de colorante. 6. Lavar con agua. 7. Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto. 8.- Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua, dejar secar al aire. 9.- Observar el frotis al microscopio, con el objetivo de inmersién y esquematizar. 10.-Las bacterias acido-alcohol resistentes se tifien de color rojo; mientras que las bacterias no resistentes a la decoloracién con el alcohol-dcido toman el color del colorante de contraste utilizado (azul). Fucsina > ‘Calontar a emision ae ‘eeite de Inmeraion ¥ 2. COMPETENCIA Aplica la técnica de coloracién de Ziehl-Neelsen para la diferenciacién de bacterias. 343. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas Mechero Vaso de precipitados de 100mL Porta asa Puente de tincién Gradilla 5 portaobjetos Pizeta con agua destilada Microscopio Frasco gotero con colorantes (fucsina fenicada, azul de metileno) Frasco gotero con alcohol-dcido Aceite de inmersion Solucién desinfectante Cultivos bacterianos Vacuna BCG 4, DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES 1. El docente proporciona los cultivos bacterianos y/o la vacuna. 2.- El docente explica la técnica de Ziehl-Neelsen 3. El estudiante realiza la técnica indicada. 4.- El estudiante hace las anotaciones correspondiente. 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES. © Forma: = Agrupacién: ‘+ Aumento total: * AAR: © Forma’ © Agrupacion: + Aumento total: © AAR: 35CUESTIONARIO 1. Describe el fundamento de la tincin de Ziehl-Neelsen: 2. 4Por qué no debe hervir la muestra durante la tinci6n con la fucsina fenicada? 3. Por qué la decoloracién con alcohol-acido es un paso critico en la técnica de Ziehl- Neelsen? 4. 2Qué significa "BCG", que es y cémo se prepara? 5. Anota tres nombres (género y especie) de micobacterias y de nocardias de interés clinico. Micobacterias Nocardias CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 36INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 \ by “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 6 TINCIONES ESPECIALES (TINCION DE ESPORAS) Clave: BC-P6_[ Revision: 15/02/21 22/02/21 | Pagina: 37 de 97 1. MARCO TEORICO El principal valor de las técnicas de tincién “especial” radica en proporcionar informacién especifica de las estructuras de la célula 0 de las propiedades quimicas de algunos componentes celulares. Estas técnicas se basan en que la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad mayor por los colorantes utilizados que el resto de la célula, 0 por el uso de tratamientos especiales que hacen posible su diferenciacién de tal manera que puede ser utilzada una gran variedad de técnicas para demostrar la presencia de estructuras tales como: cépsula, esporas, pared celular, flagelos, material nuclear etc. Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia lamadas endoesporas. Las cuales se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos t6xicos, etc.), formandose una espora por cada forma vegetativa, al finalizar el proceso de esporogénesis la célula vegetativa se liza y libera la espora al exterior, cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante afios. Algunas de las bacterias productoras de endoesporas son patégenas para el hombre, por lo que su estudio y ‘observacién son de interés clinico. Las endoesporas bacterianas no pueden distinguirse en las preparaciones microscépicas sin previa coloracién debido a la gran refringencia de su protoplasma En las preparaciones \efiidas por técnicas como la de Gram las endoesporas no se colorean debido a la resistencia que ofrece su gruesa cubierta a la impregnacién de los colorantes utilizados, permaneciendo incolora rodeada por la parte coloreada (vegetativa) de la bacteria. No obstante, es posible lograr la tinci6n de las endoesporas por medio de técnicas especiales en las que se emplea el calor como mordiente. Las endoesporas, debido a las caracteristicas de sus envolturas no se tien con procedimientos habituales. La técnica més empleada es la de Schaetfer-Fulton donde la suspensién de microorganismos se tifie en caliente con el colorante verde de malaquita. El calor modifica la permeabilidad de las endoesporas y permite la entrada del colorante a través de las capas externas. A continuacién, el lavado con abundante agua produce la decoloracién de las formas vegetativas, asi como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tifien por tiltimo con un colorante de contraste, la safranina 37Procedimiento de la tincién de Schaeffer-Fulton. 1. Realizar el frotis a partir del cultivo bacteriano proporcionado. 2. Fijar el frotis a temperatura ambiente y después a la flama directa. 3. Cubrir todo el portaobjetos con solucién de verde de malaquita al 5% y calentar suavemente la preparacién a emisién de vapores, manteniéndose asi la preparacién durante 5 minutos. El colorante no debe secarse ni hervir, afiadir mas si es necesario. A partir del momento en que se observa la emision de vapores en la preparacién se debe mantener asi durante 5 minutos. 4, Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua inclinando el portaobjetos, cuidando de no incidir sobre el frotis. 5. Cubrir la preparacién con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. 6. Escurtir el exceso de colorante y lavar con agua. 7. Quitar el exceso de agua y dejar secar alaire. 8. Observar el frotis al microscopio, con objetivo de inmersién y esquematizar. 9, Las endoesporas se tien de verde y las células vegetativas de rojo a rosado. 2. COMPETENCIA Aplica la técnica de coloracién de Schaeffer -Fulton para la observacion de esporas, 38,MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas Mechero Vaso de precipitados de 100mL Porta asa Puente de tincién Gradilla 5 portaobjetos Pizeta con agua destilada Microscopic Frasco gotero con colorantes (verde de malaquita y safranina) Aceite de inmersion Solucién desinfectante Cultivos bacterianos. 4, DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El docente proporciona los cultivos bacterianos, - El docente explica la técnica de Schaeffer-Fulton. El estudiante realiza la técnica indicada, El estudiante hace las anotaciones correspondientes. 5.- REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES. Forma: Agrupacién: ‘Aumento total: Presencia de esporas: Ubicacion de las esporas: Forma: Agrupacién: ‘Aumento total: Presencia de esporas: Ubicacién de las esporas: 396. CUESTIONARIO 1. {Qué son las esporas y cudl es su naturaleza quimica? 2. En qué posiciones pueden estar situadas las esporas dentro de la oélula vegetativa? 3. gLa posicién de las esporas es igual en las bacterias del mismo género? Menciona si o no y da un ejemplo. 4, ¢Por qué se calienta el frotis suavemente a emision de vapores durante 5 minutos? 5. Anota el nombre (género y especie) de tres clostridios y tres bacilos esporulados de interés clinico. Clostridios Bacilos esporulados 7. CONCLUSIONES 8, BIBLIOGRAFIA 40INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No.7 ESTERILIZACION ‘POR: CALOR HUMEDO Y POR CALOR SECO Clave: BC-P7_[Revision: 15/02/21 | Fecha de emision: 22/02/21 _| Pagina: 41 de 97 1, MARCO TEORICO El trabajo de laboratorio en microbiologia requiere siempre ciertos mecanismos de control de las poblaciones microbianas. La esterilizacién es uno de los mecanismos mas utilizados y las técnicas de esterilizacién aplicables dependen directamente de las caracteristicas del material de trabajo 0 de los medios que se vayan a tratar. La esterilizacién es la eliminacién completa de toda forma de vida microbiana de objetos inanimados incluyendo esporas, puede conseguirse a través de métodos fisicos, quimicos 0 gaseosos. En el laboratorio de Microbiologia la esterilizacién se puede utilizar como esterilizacién preparativa 0 como esterilizacién final. La esterilizacién preparativa es la que se realiza para mantener libre de microorganismos el material que vamos a utilizar antes de empezar el trabajo en si mismo o durante el proceso de trabajo (placas Petri, pipetas, medios de cultivo, hisopos, etc.). La esteriizacién final sin embargo tiene como Unico fin destruir los microorganismos con los que se ha estado trabajando. En el laboratorio clinico el método fisico por calor es el més utiizado para la esterilizacién preparativa o final de los materiales. El calor puede ser humedo 0 seco. Autoclave (calor himedo). EI calor himedo por medio de la utilizaci6n de vapor de agua es el agente esterilizante mas frecuentemente utilizado. Este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por desnaturalizacién de proteinas y enzimas, y desestabilizacion de membranas. Para esterlizar material con calor himedo, se emplea la autoclave. La autoclave, desarrollado por Chamberland en 1884, es un aparato (Fig. 1) constituido por una caldera, que se puede cerrar herméticamente con una tapa metalica y que presenta una resistencia eléctrica en su interior que calienta el agua. Este aparato permite que en el interior de la caldera se desplace el aire por una valvula de purga, dejando que se acumule posteriormente vapor saturado a presién, que alcanza temperaturas superiores a los 100°C sin que se produzca ebullicién. E| material a esterilizar se introduce en el interior de la cémara, se somete al vapor de agua con sobrepresién (lo mas comin: 15 Ibs.), hasta aleanzar temperaturas adecuadas para la eliminacién de los microorganismos y todas las formas de 41resistencia, sin que se produzca ebullicién de los medios liquidos. La autoclave se puede utilizar para la esteriizacién de medios de cultivo ya sean sélidos 0 liquidos, soluciones, material de vidrio, goma, ciertos tipos de plasticos (policarbonato 0 Polipropileno), acero inoxidable, material de trabajo como ropa, algodén, gasas, etc. También se utiiza para la esterilizacion final de medios de cultivo o materiales diversos contaminados con agentes biol6gico infecciosos. El proceso de esteriizacién con calor himedo ofrece algunas desventajas como: causar corrosién de algunos materiales, puede bajar el pH entre 0.3 y 0,5 unidades de los medios de cultivo, caramelizar azticares y volatilizar algunos compuestos. Los procesos de esterilizaci6n largos pueden producir una precipitacion de sales. Técnica de manejo de la autoclave. 1. Verificar que la autoclave esté limpia y que el nivel del agua en su interior cubra la resistencia, de no ser asi adicionar agua hasta el nivel de la parrilla que sirve como base. 2.- Acomodar el material a esterilizar dentro del cilindro metalico o en canastilla. 3.- Bajar la tapa, debe quedar cerrada herméticamente. 4. Abrir la valvula de salida de vapor, conectar la corriente eléctrica y encender la autoclave. 5.- Purgar la autoclave, es decir a medida que sube la presién en libras, empieza a salir una mezcla de vapor-aire por la valvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado (empapando la ufia del dedo pulgar en la salida del vapor). 6.- Cerrar la valvula de salida de vapor una vez purgado la autoclave y dejar que la presién suba aproximadamente a 20 libras para ello estar observando el manémetro, lo cual proporciona una temperatura de 121°C. 7. Tomar un tiempo de 15 minutos. 8.- Apagat la fuente de calor una vez transcurridos los 15 minutos a 20 libras de presién y dejar que la autoclave se entrie sola (no abrir la valvula de salida de vapor), abrir hasta que la presién haya bajado a 0.00 libras. 9. Aflojar los tornillos de la tapa utilizando guantes de asbesto, y con el mango levantar la tapa en tal forma que se proteja la cara y cuerpo del técnico y se permita salir al vapor evitando asi cualquier accidente. 10.- Sacar el material esterilizado con cuidado y depositarlo en la mesa de trabajo. Fig. 1 42Horno Pasteur (calor seco). La esterilizacin puede llevarse a cabo mediante calor seco y en este caso se realiza en una estufa denominada homo Pasteur (Fig. 2), en cuyo interior se disponen los materiales que van a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado, o en contenedores especiales para evitar la contaminacién ambiental una vez finalizado el proceso y hasta su utilizacién. La destruccién microbiana se produce por oxidacién de los componentes celulares y desnaturalizacion de proteinas. Este es un proceso menos eficaz por la ausencia de agua y por lo tanto deben incrementarse tanto las temperaturas como los tiempos de exposicién. El homo de esteriizacién consta de una cabina metalica de doble pared, con resistencia eléctrica; un termostato, un termémetro y parillas para colocar el material a esteriizar. El aire caliente circula por el espacio existente entre la doble pared transmitiendo el calor a los objetos que se encuentran sobre las parrillas de! horno. Generalmente, el tiempo y la temperatura del tratamiento para lograr una correcta esterilizaci6n es: 180 a 160° C durante 1 hat %h, respectivamente. Los tiempos y la temperatura pueden variar segin las condiciones de trabajo, tales como cantidad y calidad del material El homo Pasteur se utiliza para esterilizar productos u objetos de porcelana o vidrio como pipetas, probetas, embudos, y generalmente aquellos materiales metalicos que no se pueden esterilizar en autoclave por problemas de corrosi6n y también fluidos oleaginosos. Técnica de manejo del horno de esterilizacién. 1.- Introducir el material a esterlizar y cerrar la puerta del horno. 2.- Encender el horno con el botén de ON/OFF y mediante el termostato, elevar la temperatura hasta que llegue a 160-170° C. 3.- Empezar a contar hora y media cuando se alcancen los 160° C. 4. Transcurrido el tiempo, apagar el horno, esperar a que descienda la temperatura y abrir la puerta con cuidado. 5.- Sacar el material, usar guantes de asbesto para evitar quemaduras. Fig.2 2. COMPETENCIA Aplica las técnicas de esterilizacién por calor himedo y calor seco para la preparacién del material utilizado en bacteriologia. 433. MATERIALES Y APARATOS Instructivo de practicas Matraces Erlenmeyer Tubos de 13x 100 mm. Pipetas Cajas de Petri de vidrio Algodén Cinta testigo Mechero Hisopos Abate lenguas Gasa Papel estraza Pinzas Tijeras Horo Autoclave 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES. 1. El docente explica de manera demostrativa la forma correcta de envolver: hisopos, abate lenguas, cajas Petri, tubos, matraces, pipetas, pinzas, tijeras etc. utilizados en bacteriologia y el manejo y cuidados del autoclave y estufa de esterilizacion 2.- El estudiante realiza la envoltura y esterilizacién del material proporcionado de acuerdo con las instrucciones recibidas y hace las anotaciones correspondiente. 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES @) Completa la siguiente tabla anotando en el espacio correspondiente el nombre del método més adecuado de esteriizacién con base en las caracteristicas del material que se te indica. MATERIAL METODO DE ESTERILIZACION ‘Asa de platino ‘Medios de cultivo adicionados de algun componente termolabi Material oxdable y cristal ‘como pipelas o calas Peli Ropa limpia Material contaminado como cajas Petri sembradas Jeringas, guantes, catéteres, sondas, _articulos desechables de plastico etc. Aire El laboratorio de bacteriologia Hisopos, abate lenguas Material quirargico de acero inoxidable 44b) Elabora los esquemas con nombres de las partes que componen la autoclave y la estufa de esterilizacién. 6. CUESTIONARIO. 1. Menciona cual es mecanismo de accién del calor himedo sobre los microorganismos. 2. Escribe el concepto de técnica aséptica. 3. {Qué caracteristicas debe tener el papel utilizado en la envoltura del material a esteriizar? 4, .Cual es la finalidad de esterilizar el material empleado en los andlisis bacteriologicos? 5. 4Por qué es conveniente que la estufa de esteriizacion cuente con un ventilador interno? 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 45INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 8 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Clave: BC-P8_ | Revi 15/02/21 22/02/21 | Pagina: 46 de 97 1. MARCO TEORICO Para realizar las siembras se requiere de los medios de cultivo, los cuales son una mezcla de sustancias nutritivas, donde las bacterias obtienen su fuente de carbono, nitrégeno, fésforo, potasio, sodio, magnesio y otros elementos para: a) Fomentar su crecimiento ) Facilitar algunas reacciones bioquimicas que pueden ser demostradas directa o indirectamente para ayudar a su identificacion. Los constituyentes habituales de un medio de cultivo son: ‘+ Agar. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. + Extractos. Son concentrados en polvo, deshidratados, obtenidos de érganos 0 tejidos animales o vegetales para producir el medio adecuado, © Peptonas. Se obtienen por digestién enzimatica o quimica de proteinas animales 0 vegetales, son ricas en péptides y aminodcidos. ‘+ Fluidos corporales, sangre o plasma. Se afiaden a los medios de cultivo porque contienen factores de crecimiento que facilitan el desarrollo de algunos microorganismos exigentes. ‘+ Sistemas amortiguadores. Generalmente son fosfatos disédicos 0 dipotasicos que se utiizan para mantener el pH del medio en un determinado valor. ‘+ Indicadores de pH. Son indicadores acido-base que nos ayudan a detectar cambios de pH. ‘+ Agentes reductores. Se afiaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilicos 0 anaerobios. ‘+ Agentes selectivos. Son sustancias que se adicionan al medio de cultivo para inhibir el crecimiento de clerto grupo de microorganismos. 46Los medios de cultivo se clasifican segun su estado fisico en: a Medios liquidos: es un material nutrtivo elaborado a partir de carbohidratos, una infusién de extracto de came y peptona se conocen generalmente como caldos y se emplean fundamentalmente para: cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos 0 bien la produccién de metabolitos especificos, estimular y promover la seleccién de algiin 0 algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen e identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquimicas. Medios sélidos: se preparan a partir de medios liquidos a los que se afiade agar en una proporcién entre 1.5 y 2 %. El agar es un elemento solidificante, se licda completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 °C. Se considera un material inerte pues no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias, tampoco es degrado por aquellas que crecen en él. Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios s6lidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en microbiologia. Medios semisélidos: se preparan a partir de los medios liquidos, agregando a éstos agar en una proporcién menor entre el 0.15 y 0.2 %. Se utllizan para identificaciones bioquimicas y averiguar si el germen estudiado es mévil. Los medios semisdlidos tienen una consistencia blanda. Con base en su funcién se clasifican en: a Medios nutritivos basicos: favorecen el desarrollo de la mayoria de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin proporcionar ventaja alguna en el crecimiento de un organismo en particular, solo contienen algin extracto de came o infusién simple, peptona yagua. Medios enriquecidos: son aquellos medios basicos que han sido complementados con liquidos corporales, vitaminas especificas, aminoacidos, proteinas u otros nutrientes claramente definidos, por ejemplo, agar sangre y agar chocolate. Medios de enriquecimiento: son medios liquidos que estimulan la multiplicacién de algin germen determinado e impiden o inhiben la reproduccién de otros. Medios selectivos: son medios que favorecen el desarrollo de ciertas bacterias que nos interesan y que estan presentes en una poblacién polimicrobiana, inhibiendo el desarrollo de otras con ayuda de agentes inhibidores como colorantes, sales biliares, alcoholes, cidos y antibioticos. Medios diferenciales: se utiizan para poner en evidencia ciertas caracteristicas bioquimicas o metabdlicas que permiten diferenciar entre varias especies 0 géneros que crecen en la misma placa de agar. Medios de identificacién: son los que se destinan para realizar las pruebas bioquimicas en 47donde se resalta alguna cualidad bioquimica que sirve para reconocer la identidad de un microorganismo. 9g. Medios de conservacién o de transporte: se usan para el transporte de muestras clinicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Procedimiento para la preparacién de medios de cultivo. 1 Calcular la cantidad de medio que se quiere preparar, siguiendo las instrucciones que se anexan en cada frasco. Leer cuidadosamente as instrucciones que tiene el medio y aplicarlas, al pie de la letra. La mayoria de los medios de cultvo tienen indicaciones para preparar 1000 mi de medio de cultivo, pero si los requerimientos son diferentes, bastara con aplicar una regla de tres 2.- Disolver un medio de cultivo en la cantidad de agua destilada necesaria (se recomienda disolver la totalidad del medio en una pequefia cantidad de agua, y después agregar el resto). 3.-Calentar a una temperatura cercana a la ebullicién hasta disolverlo completamente, agitando suavemente y teniendo mucho cuidado de quitarlo de la fiama cuando empiece a hervi 4.- Esterilizar el medio de cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 5.- Dejar entriar el medio a una temperatura aproximada de 45°C. 6.- Sanitizar el area dispuesta para el vaciado y encender el mechero. 7.- Vaciar en cajas de Petri estériles, procurando homogenizar constantemente. El mechero debera de permanecer encendido antes y durante el vaciado. 8.- Dejar entriar las cajas para que el medio solidifique. 9.- Identificar las placas anotando en su base el nombre del medio, fecha de preparacién, grupo y equipo. 10. Envolver las placas y en posicién invertida guardarlas en la incubadora a 35 °C durante 24-48 hrs. Nota: Para preparar gelosa sangre u cualquier otro medio que lieve algtin componente que no se pueda esterilizar 0 sea termolabil, se prepara y esteriliza primeramente el medio base, en la autoclave, se deja enfriar entre 45 y 50'C y posteriormente se le agrega la sangre 0 el componente. Para esterilizar los medios de cultivo liquidos previamente se deben dosificar en los contenedores en los que finalmente se van a utilizar. 482. COMPETENCIA Aplica las técnicas bacteriolégicas para la preparacién, esterilizacion y vaciado de los medios de cultivo, 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas Balanza granataria Espatula Mechero Probeta Algodén, gasa papel estraza, masking tape Matraz Erlenmeyer Tubos de ensaye Cajas de Petri estériles Autoclave Agua destilada Medios de cultivo deshidratados (stt- Agar Sal Mantol, AST= Agar Soya Tripticasoina, AVE= Agar Vordo rilan, MIO= Movildad, Indol Orta, TSi= Agar Misra Triple Azicar, CM= Caléa Malonato, CL= Caldo Lactosado, CMH=Caldo Maser Hinton) 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES 1. El docente asigna a cada equipo un medio de cultivo determinado para su preparacion. 2. El docente explica de manera demostrativa el procedimiento correcto para preparar un medio de cultivo 3.- El estudiante realiza los célculos y la preparacién del medio asignado previamente, de acuerdo a las instrucciones indicadas en el marbete del medio e indicaciones del docente. 4.- El estudiante identitica y esteriliza los medios preparados. 5.- El estudiante selecciona el 5% del lote de! medio preparado para someterlo a las pruebas de control de calidad correspondientes y guarda el medio de cultivo restante. 6.- El estudiante hace las anotaciones pertinentes. Nota: en caso de no cumplir con el pH correcto durante su preparacién ajustarlo con una solucién de NaOH 0 HCI N, segtin se requiera. 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES 1. Anota lo que se te solicita con base en el medio de cultive que te fue asignado: a) Nombre del medio de cultivo: b) Formulacién del medio, condiciones de esterilizacién y pH que debe tener al término de su preparacién ©) Géleulo del peso de medio con base en el volumen solicitado. 492. Completar la siguiente tabla. Caractariaicas Caraciristea Meo de Funeion pH | Susvato | innbdor | indeador oe! medio doa colons Golosa Sangre Agar saly ‘maritl Agar azul de metiono (EME) Agar Mac Conkoy Agar ‘Salmonalia ‘Shigela (88) Agar Verde Brllante (ave) gat Bgay 6. CUESTIONARIO 1. {Qué es el agar-agar y cual es su funcién? 2. Menciona 3 precauciones al preparar un medio de cultivo, 503 {Qué es un medio de transporte? 4. {Qué son las pruebas bioquimicas? 5. Escribe el ejemplo de 3 medios selectivos, 3 diferenciales y tres de ensaye o pruebas bioquimicas a) Medios selectivos b) Medios diferenciales ¢) Medios de ensaye 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA stINSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS NO. 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No.9 MEDIOS DE CULTIVO Y SU CONTROL DE CALIDAD Clave: BC-P9_ [Revi 15/02/21 22/02/21 | Pagina: 52 de 97 1. MARCO TEORICO Los medios de cultivo juegan un papel importante en las investigaciones microbiol6gicas por lo que es necesario tomar todas las medidas que garanticen su correcta preparacién y esteriizacién. Se debe controlar su calidad con el fin de comprobar si estos cumplen con sus especificaciones y si la metodologia empleada en su preparacién es satisfactoria. Los medios de cultivo deben de cumplir con una serie de requisitos que marca la norma ISO/TS 11133 parte 1 y 2 en la que se menciona que al adquirir un medio se debe solicitar las especificaciones de calidad, el nombre de! medio, la lista de componentes con las cantidades, la fecha de caducidad, el numero de lote y las condiciones de almacenamiento. La calidad de los medios de cultivo preparados en el laboratorio depende de su formulacién correcta, de los procedimientos de preparacién, de la eliminacién de los agentes microbianos contaminantes, y de las condiciones adecuadas de envasado y almacenamiento (ISO/TS 11132-1: 2009; ISO/ TS 11132-2:2003). Control de calidad de los medios de cultivo Se debe verificar que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el laboratorio tengan las caracteristicas adecuadas con respecto a: *Esterilidad *Propiedades fisicas: pH, color =Productividad promocion de crecimiento: recuperacién 0 supervivencia de los microorganismos de interés. +*Selectividad: Inhibicién de los microorganismos no deseados. +Porcentaje de recuperacién bacteriana. Es el rendimiento o recuperacién de un microorganismo que se espera que se desartolle en el medio de cultivo. Control de esterilidad de los medios de cultivo. Este procedimiento se lleva a cabo cada vez que se prepara un lote de medio de cultivo 0 diluyente. Los medios de cultivo preparados se incuban en estufa a 35 °C durante 24h. Esta prueba se realiza sobre el 5% del lote preparado. El criterio de aceptacién es que no debe haber crecimiento, si se presenta desarrollo se rechaza el lote. 52Prueba de promocién de crecimiento. Para los medios de cultivo liquidos se realiza la prueba de promocién de crecimiento para evaluar su productividad Para realizar esta prueba se selecciona la cepa de referencia recomendada de acuerdo al medio de cultivo a probar, se prepara una suspensién de esta (en fase estacionaria) y se inoculan por separado 100, 10, 1, UFG/ mL en el medio a probar, se incuba a la temperatura y tiempo correspondiente. Transcurrido el tiempo se observa el desarrollo en cada uno de los tubos inaculados. Si el desarrollo del microorganismo en el medio de cultivo de prueba es Positivo en todos los tubos inoculados, el lote de medio se acepta. Para llevar a cabo la prueba de la sele« crecimiento es inhibido y otro favorecido. El criterio de aceptaci6n es observar la inhibicién o crecimiento de! microorganismo probados. idad se emplean dos microorganismos uno cuyo Porcentaje de recuperacién bacteriana. Es el rendimiento 0 recuperacién de un microorganismo que se espera que se desarrolle en el medio de cultivo, Este parémetro aplica tnicamente para agares empleados en la técnica de cuenta en placa. Almacenamiento de los medios de cultivo Se debe determinar y verificar el periodo de validez de los medios preparados en las condiciones de conservacién especificadas. Observar el cambio de color, la evaporacién, la deshidratacién, y si ocurre crecimiento microbiano. En general los medios preparados se guardan a 4° C, no mas de tres meses (ISO/ TS 11132-1: 2009; ISO! TS 1132-2: 2003). 2. COMPETENCIA Realizar las pruebas de control de calidad a los medios de cultivo para que se garantice que los proceso de su preparacién, esterilizacién y vaciado cumplen con las especificaciones. 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de practicas Balanza Granataria Espatula Mechero Probeta Algodén, gasa, papel estraza, masking tape 53Matraz Erlenmeyer Tubos de ensaye Cajas de Petri estériles Agua destilada Medios de cultivo deshidratados (Agar soya tripticaseina, caldo lactosado, agar sal y manitol, agar EMB) Asa bacteriologica Cepas de diferentes microorganismos Gradilla Pipetas estériles de 1 mL Pipeta semiautomatica de 1000 wl Puntas estériles para pipeta semiautomatica de 1000 uL Vaso de precipitado con solucién desinfectante Solucién desinfectante. Incubadora Autoclave 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El profesor da las indicaciones para realizar las pruebas de control de calidad a los medios de cultiv preparados y proporciona los cultivos bacterianos necesarios para la realizacion de las siguientes pruebas’ * Prueba de esterilidad. Incubar los medios de cultivo preparados en la incubadora a 35 °C durante 24h. Esta prueba se realiza sobre el 5% del lote preparado. Se espera que no haya desarrollo en ningtn medio de lo contrario el lote se rechaza. + Prueba de promocién de crecimiento. Separar 3 tubos con medio liquido e inocular cada uno de ellos con una suspension bacteriana de 100, 10 y 1 UFC/ mL, e incubar a 35 °C durante 24-48 h. Si hay desarrollo bacteriano en todos los tubos inoculados, el lote de medio se acepta, de lo contario se rechaza, ‘+ Porcentaje de recuperacion bacteriana. Tomar 3 cajas Petri estériles vacias y depositar en cada un 1 mL de una suspension bacteriana con una concentracién aproximada de 100 UFC/ mL, enseguida agregar 15 mL. aproximadamente del medio a probar y mezclar con movimientos circulares. Dejar solidificar el medio, invert las placas e incubar a 35 + 2° C durante 24-48 h. Cuantificar las UFC/ mL para caloular el porcentaje de recuperacién (RP) del medio de cultive mediante la formula siguiente: UFCimL= No x Fd x Vo No=ntmero de colonias contables del promedio de las diluciones. Fd= factor de dilucién Vo= Volumen sembrado RP = (UFC/mL en el medio de prueba / UFG/mL en el medio de referencia) 100 El criterio de aceptacién de porcentaje de recuperacién bacteriana en cada lote preparado debe ser 2 70 %. De no ser asi el lote se rechaza. 54‘+ Prueba de selectividad. Para esta prueba se seleccionan dos cepas de referencia de acuerdo al medio de cultivo a probar. La apariencia, tamafio y morfologia de las colonias de una de las cepas (cepa target) debe ser la reportada en el certificado del proveedor y el crecimiento de la otra cepa (no target) debe estar en parte o completamente inhibida. El lote se acepta si el desarrollo de la cepa target es de acuerdo con lo indicado por el proveedor, la cepa no target es inhibida parcial o totalmente. Cualquier resultado diferente a lo mencionado anteriormente el lote se rechaza, 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES Hacer las observaciones y/o calculos correspondientes para elaborar el informe de control de calidad del medio preparado. Llenar el siguiente cuadro. REPORTE DE CALIDAD Nombre del medio de cultivo evaluado Numero de lote de medio evaluado Fecha de realizacién del andlisis CRITERIO PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD ACEPTADO RECHAZADO pH Color Aspecto PBAS. FISICAS. Consistencia Esterilidad Promocién de crecimiento PBAS, BACTERIOLOGICAS. Porcentaje de recuperacién Prueba de selectividad Nombre del analista: 556. CUESTIONARIO 1. Menciona cuales son los pardmetros de calidad con los que debe cumplir el agua destilada utilizada en la preparacién de los medios de cultivo, 2. Por qué es importante hacer el ajuste de pH al preparar el medio de cultivo? na tres fuentes de error en la preparacién de los medios de cultivo, 4. {Qué parametros de calidad se pueden afectar al utilizar material mallavado? 5. {Qué efectos se observan cuando un medio de cultivo deshidratado no se cierra hermeéticamente? 7. CONCLUSIONES 8.BIBLIOGRAFIA 56INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 10 SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIOLOGICO. Clave: BC-P10| Revi 15/02/21 22/02/21 | Pagina: 57 de 97 1.» MARCO TEORICO La técnica més usada en el laboratorio de microbiologia es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propésito de cultivarlos. Una vez que el medio de cultivo esta debidamente preparado se procede a inocular la muestra deseada. Para aislar © separar los diferentes tipos microbianos que se encuentran en una muestra (agua, materias primas, alimentos, etc.) se pueden utilizar distintas técnicas de siembra. Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porci6n de la muestra (indculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento, Dependiendo del estado fisico del medio de cultivo (liquido, sdlido 0 semisdlido) la siembra se puede realizar con asa bacteriolégica en anillo, asa en punta, varilla de vidrio (espatula de Drigalsky), hisopo 0 pipeta estéril ‘Siembra en medio de cultivo sélido en caja Petri. ‘Siembra por estria simple. 1. Esterilizar el asa bacteriolégica para evitar contaminaciones; para ello se le incinera ala lama del mechero, hasta que todo el flamento esté incandescente 2. Dejar entrar el asa cerca de la llama y luego tomar la muestra con el asa y descargar el inoculo en el cultivo haciendo estrias contindas abarcando el ancho de la caja. 3.-Esterilizar el asa e incubar las placas a 35°C. 4.-Marcar las cajas con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembr6, grupo y equipo. S-Invertir las cajas sembradas para evitar que el agua de condensacién caiga sobre lo sembrado e incubarlas a 35°C., por 24 a 48 horas. 37Siembra por agotamiento en estrias o estria cruzada. 1.- Esterilizar el asa bacteriolégica en el mechero y dejar enfriar. ‘Tomar la muestra con el asa y descargar el inoculo en el cultivo haciendo estrias continuas hacia el centro de la placa. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla en el agar. 4.-Hacer una segunda serie de estrias tocando la porcién final de la estria anterior. Esterilizar el asa nuevamente y enfriar en el agar. 6.-Repetir los pasos 4 y 5 hasta efectuar 4 areas de estrias sobre la superficie de la placa. Esteriizar el asa e incubar las placas a 35° C., 0 a la temperatura indicada por los profesores. 8.-Marcar las cajas con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembré, grupo y equipo. 9-Invertir las cajas sembradas para evitar que el agua de condensacién caiga sobre lo sembrado e incubarlas a 35°C, por 24 a 48 horas, 06:0 Primera stra Sequndaestia Tercera Cuartaesea © © 58Siembra masiva (con hisopo). 1.Embeber el hisopo de algodén estéril en un tubo que contiene un cultivo liquido previamente homogeneizado. 2.- Eliminar el exceso de inoculo presionando el hisopo contra las paredes internas del tubo. 3.- Diseminar el inoculo por toda la superficie de la placa conteniendo el medio de cultivo sélido. 4.- Incinerar el hisopo. 5.-Marcar las cajas con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembré, grupo y equipo. 6-Invertir las cajas sembradas para evitar que el agua de condensacién caiga sobre lo sembrado e incubarlas a 35°C., por 24 a 48 horas. Esta técnica permite sembrar inéculos abundantes sobre superficies grandes (cajas de Petri, botellas de Roux, etc.) a fin de obtener un crecimiento confluente. Siembra en placa vertida. 1. Tomar con una pipeta estéril un volumen de inoculo (generalmente 1 mi) y colocarlo en el tubo que contiene agar fundido y se homogeneiza 2.- Verter el contenido en una placa de Petri vacia y estéril .- Homogeneizar el contenido de la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones y se dejar solidificar. 4.-Marcar las cajas con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembré, grupo y equipo. 5.-Invertr las cajas sembradas para evitar que el agua de condensacién caiga sobre lo sembrado e incubarlas a 35°C., por 24 a 48 horas. 59Transcurrido el tiempo de incubacién se observarén colonias en profundidad (inmersas en el medio) y en la superficie. Esta técnica permite el desarrollo de ricroorganismos aerobios, aerobios facultativos y microaerofilicos |__ aS -@ colonas asiasas vet en placa Siembra del medio de cultivo en tubo. Siembra en picadura o puncién en medio de cultivo semisdlido. 1.- Esterilizar el asa bacteriolégica en punta en el mechero y dejar entriar. 2. Quitar el tapén al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo. 3.- Tomar con el asa el inoculo. 4. Introducir el asa con la muestra en el tubo conteniendo agar a inocular, sin tocar las paredes de este y en forma paralela asegurandose que el inoculo quede distribuido a lo largo de toda la puncién 5. Retirar el asa e incinerarla. 6.- Flamear la boca del tubo y taparlo. 7.-Marcar los tubos con las iniciales de los cultivos propor grupo y equipo. 8.- Incubar a 35°C., por 24 a 48 horas. nados, fecha en que se sembré, Esta técnica permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxigeno y su movilidad. Siembra por picadura y estria en medio de cultivo sdlido inclinado. 1.- Esterilizar el asa bacteriolégica en punta en el mechero y dejar enfriar. 2. Quitar el tapén al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo. 3.- Tomar con el.asa el inoculo, 4.- Introducir el asa con la muestra en el tubo conteniendo agar a inocular, sin tocar las paredes de este y en forma paralela asegurandose que el inoculo quede distribuido a lo largo de toda la puncién. 5.- Deslizar suavemente el asa en zigzag sobre la superficie del pico de flauta. 6.- Retirar el asa e incinerarla. 7. Flamear la boca del tubo y taparlo, 8.-Marcar los tubos con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembr6, grupo y equipo. Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y aerobios facultativos. 60Siembra en medios de cultivo liquidos. 1.- Esterilizar el asa bacteriolégica en el mechero y dejar entrar. 2.- Quitar el tap6n al tubo que contiene la muestra y flamear la boca del tubo. 3.- Tomar la muestra con el asa en anillo. 4.- Inclinar ligeramente el tubo a inocular e Introducir el asa descargande el inoculo en la pared del tubo. 5. Flamear la boca del tubo y taparlo. 6.- Homogeneizar el inoculo en el medio de cultivo colocando el tubo entre las manos y haciendo suaves movimientos rotatorios. 8.- Retirar el asa e incinerarla. 9.-Marcar los tubos con las iniciales de los cultivos proporcionados, fecha en que se sembr6, grupo y equipo }0.- Incubar a 35°C., por 24 a 48 horas. Generalmente este tipo de siembra se utiliza para aumentar el numero de microorganismos. 61‘Sujotar et tapén det ube ean tos odes anulary monique, abrir ot Introdueirel aca on ol interior det v a - 7 4 i mss 4 Hdd =] oe @ eens OM Serhinscnpsns sectors Siembraen edie cali sido ae a 2.-COMPETENCIA Aplica las diferentes técnicas de siembra para el aislamiento de microorganismos provenientes de las muestras médicas. 3. MATERIALES Y REACTIVOS Instructivo de précticas Mechero Asa bacteriolégica Hisopos estériles Tubos con medio de cultivo liquido Tubos con medio de cultivo sélido en columna e inclinados Cajas Petri con medio de cultivo Cajas con cultivos bacterianos Marcador, masking tape. 624. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El profesor da las indicaciones y proporciona los cultivos bacterianos necesarios para la realizacion de las diferentes técnicas de siembra. El estudiante realiza las técnicas de siembra en placa por estria simple, estria cruzada y masiva, en tubo por picadura y estria, picadura o pase, El estudiante identifica e incuba el material sembrado. §. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES Completa la siguiente tabla. Instrumento Consistencia de! Técnica de utilizado para Finafidad ‘medio de cultive aislamiento inocular los medios de cultivo Liquido Semisélido Sdlido en tubo Sdlido en tubo inclinado Soiido en placa Sdlido en placa Sdlido en placa 636. CUESTIONARIO 1. cQué es aislar? 2. 4Por qué es necesario el aislamiento como paso previo a la caracterizaci6n de las bacterias presentes en las muestras clinicas? 3.- 4Por qué se incubar las cajas de Petri con la tapa hacia abajo? 4.- {Qué sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente? 5. 4Por qué debemos trabajar cerca del mechero? 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 64INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 \ny “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 11 MORFOLOGIA COLONIAL Clave: BC-P11| Revision: 15/02/21 22/02/21 _ | Pagina: 65 de 97 1. MARCO TEORICO Una colonia es una agrupacién de bacterias formada a partir de la reproduccion de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sélido: aunque varia de tamafio generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo 0 bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estatilococos o los estreptococos, Las colonias bacterianas suelen ser de caracteristicas constantes para el medio de cultivo Uusado, la temperatura de incubacién y el microorganismo que se trate, por lo que su estudio es de gran utiidad tanto en la clasificacién como en la identificacion. No obstante, se requiere también estudiar la fisiologia y propiedades inmunolégicas de las bacterias para poder realizar una identificaci6n completa. Las caracteristicas consideradas para la descripcion de la morfologia colonial de las bacterias, son: 1, Tamajio: Se describe en milimetros, cuando miden menos de 1 mm son puntiformes; medianas hasta 4 mm de diémetro; grandes, cuando miden mas de 4 mm de diametro. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja, 2. Golor: pueden tener varios colores debido a pigmentos propios o por absorcién de algunas sustancias del medio. 3. Forma: circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme; las colonias puntiformes son tan pequefias que no es posible distinguir sus caracteristicas morfolégicas. 4. Borde o margen: el contomo de la colonia se observa al hacer un corte en un plano perpendicular a la base esta. Puede ser entero o mostrar irregularidades como ondas, lébulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra 0 enrollado. 5. Elevacion: inclinando la caja y observando de lado, la colonia puede ser plana o elevada; esta ultima, a su vez, puede ser convexa, pulvinada, umbonada. Superfcie: apariencia externa o superficial de la colonia: lisa, rugosa o granular. Aspecto: htimedo 0 seco. Luz transmitida: transparente, traslucida y opaca, 1. Luz reflejada: brillante o mate. (0. Consistencia: dura o suave; esta Ultima a la vez puede ser cremosa, mucoide, friable. 65 BeeneDicha caracteristica se determina tocando la colonia con el asa estéril y por tanto debe ser la Ultima caracteristica en describirse. 11. Produccién d pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en el agua, que puede difundir al medio de cultivo. Con experiencia en la observacién de cultivos, las caracteristicas de morfologia colonial vienen a constituir una guia muy util en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos por lo que el estudiante de esta asignatura debe prestar atencién a estas caracteristicas que son informacion importante en el estudio d los cultivos en el laboratorio. Crecimiento en medio de cultivo solido en caja Pet MORFOLOGIA COLONIAL FORMA ee ff #@ = Puntitorme Circular Filamentosa Granular Rizolde Fusitorme| ELEVACION _ ae ate Convexa Pulvinada_Umbiicada BORDE DH BOAeEHA BB Entera Ondulada Lobulada Dentada Filamentosa Arrissada Crecimiento en medio de cultivo liquido En el laboratorio es frecuente el uso de medios de cultivo liquidos y los microorganismos presentan un tipo caracteristico de crecimiento en dichos medios propiedad que se utiliza para facilitar su estudio. Los diferentes tipos de crecimiento en medio liquido se ilustra en el siguiente esquema. Oo @ ® 6 UUUS ANILLADA MEMBRANOSA PELICULADA FLOCULENTO 662. COMPETENCIA Describe las caracteristicas de la morfologia colonial de las bacterias, asi como su crecimiento en medio liquido como parte de las pruebas de identificacién presuntiva. 2 Instructivo de précticas Mechero Asa bacteriolégica MATERIALES Y REACTIVOS Cultivos bacterianos en medio sélido. Cultivos bacterianos en tubos con medio de cultivos semisdlidos, agar inclinado, caldo etc. 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES 1. El docente da las indicaciones y proporciona los diferentes cultivos bacterianos en medios sélidos de cultivo sélidos en placa y tubo, medios liquidos y semisdlidos. 2.- El estudiante selecciona tres colonias bacterianas aisladas en el medio de cultivo sélido en placa para hacer su descripci6n morfolégica, basandose en las instrucciones del profesor y las descritas en el manual. Describe ademas el tipo de crecimiento observado en los medios de cultivo liquidos y semisdlidos en tubo. 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES a) Describir la morfologia de tres colonias seleccionadas en la tabla siguiente Nombre del medio de cultivo Caracteristicas Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Tamajio (mm) Color Forma Bordes Elevacion Superficie Aspecto Luz refiejada Luz Transmitida Consistencia Pigmento 67b) Describe y esquematiza el tipo de crecimiento que se presenta en los tubos con caldo nutritive. Tubo No.1 ‘Tubo No.2 Tubo No.3 6. CUESTIONARIO 1. {Qué es una UFC? 2. {Qué es el fendmeno de “swarming”? Menciona el nombre de un microorganismo que lo presente. 3.- {Cuél es el objetivo e importancia de la técnica de aislamiento de siembra por agotamiento en estrias? 4.- ¢Existe alguna relacién entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio liquido con la tension superficial del medio y los requerimientos de oxigeno del microorganismo? 685.- Como se observa el crecimiento de los microorganismos en medio liquido dependiendo de su requerimiento de oxigeno: Aerobio estricto: Microaerotilicos: Aerobio facultativo: Anaerobio estricto: 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 69INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA_ NOMBRE DE LA PRACTICA No.12 EXUDADO FARINGEO Clave: BC-P12| Revi 15/02/21 22/02/21 | Pagina: 70 de 97 1. MARCO TEORICO Generalidad El exudado faringeo es uno de los estudios mas solicitados dentro de los laboratorios clinicos, debido a que las infecciones en el tracto respiratorio superior son de las mas frecuentes. Los cultivos de la garganta se obtienen principalmente para la detecci6n de estreptococos beta- hemoliticos del grupo A Esta prueba de laboratorio se hace para aislar e identificar organismos que puedan causar Una infeccién en la garganta tales como: Candida albicans. Esta levadura causa aftas, una infecoién de la boca y de lengua y en ocasiones de la garganta. Estreptococos del Grupo A. Causan faringitis estreptocdcica, escarlatina y fiebre reumatica. Neisseria meningitidis. Agente causal de la meningitis El diagnéstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice la toma y manejo de la muestra siguiendo a detalle las instrucciones al respecto. La interpretacién del resultado del laboratorio debe estar apoyado por un buen diagnéstico linico y los antecedentes epidemiolégicos del caso. La muestra para aislamiento de agentes intecciosos debe ser tomada ANTES de instaurar la terapia con antimicrobianos. Una vez tomada la muestra ésta debe identificarse incluyendo todos los datos relevantes del paciente como son: nombre completo o clave, diagnéstico presuntivo, fecha de toma y tipo de muestra. Casos en los que se solicita el exudado faringeo. El médico solicitard esta prueba cuando el paciente presente dolor de garganta y fiebre que pueda ser debida a una infeccién respiratoria de vias altas. Los sintomas varian y pueden incluir: ‘+ Dolor de garganta. Fiebre. Dolor de cabeza. ‘Amigdalas rojas con puntitos blancos 0 amarillos en la parte posterior de la garganta. Cuello hinchado y blando. Debilidad. Pérdida de apetito 70Indicaciones para el paciente previo a la toma de muestra. ‘+ No tomar antimicrobianos 0 suspender el tratamiento entre cinco a diez dias previos a la realizacion del examen. ‘+ Presentarse en ayuno total. ‘+ Sin aseo bucal. No se deben usar enjuagues bucales antisépticos antes del examen, Proce iento para la toma de muestra. 1, Humedecer dos hisopos con solucién salina. (0.85%), uno sera utilizado para realizar un trotis y tenilo por la técnica de Gram y el otro para la siembra de la muestra en los medios selectivos y/o diferenciales 2. Solicitar al paciente se siente comodamente, decline la cabeza hacia atras, que inspire profundo, que abra la boca y emita un sonido “aah” (la emisién de un “aah” por parte del paciente sirve para elevar la Uvula y ayuda a reducir el reflejo de la néusea). 3. Emplear un abatelenguas estéril para hacer descender la lengua suavemente e introducir tun hisopo por detras de la Uvula, cuidando de no tocar las paredes laterales de la cavidad bucal.. El hisopo se frota firmemente sobre las paredes de la faringe y ambas amigdalas y en cualquier area de inflamacién, ulceracion y exudacion, se debe evitar tocar la lengua, dientes o los labios para no diluir 0 contaminar la muestra. Proce nto para el aislamiento y la ident sacin de microorganismos patégenos. 1. Descargar la muestra de uno de los hisopos haciendo un frotis sobre la superficie de un portaobjetos, fijarlo a la flama del mechero y tefiilo por la técnica de Gram. 2. Frotar con el segundo hisopo el borde de una placa de Agar Sangre, Agar Sal y Manitol, Agar Mc Conkey y Agar Biggy. Cubriendo solo un sexto de la superficie; posteriormente con el asa bacteriolégica extender la muestra en la superficie de la placa con una estria masiva. 3. Incubar las placas a una temperatura de 36 a 37° C durante 18 a 24 horas. Posteriormente se seleccionan las colonias sospechosas de microorganismos patégenos de cada uno de los medios. La garganta puede doler al momento del examen e igualmente se puede experimentar una sensacién de nduseas cuando se toca la parte posterior de la garganta con el aplicador de algodén, pero el examen sdlo dura unos cuantos segundos. Ss rao sania 1M2. COMPETENCIA Aplica la técnica de toma de muestra de exudado faringeo para el aislamiento de patégenos relacionados con infecciones de las vias respiratorias altas. 3. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS Instructivo de précticas Hisopos estériles Abate lenguas estériles Mechero Asa bacteriologica Puente de tincién’ Portaobjetos Estufa bacteriolégica Autoclave Microscopio Agar sangre Agar de Sal y Manito! Agar Biggy Agar Mc Conkey Cristal violeta Lugol Alcohol- Acetona Safranina Solucién salina estéril (0.85%) 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES El docente da las instrucciones para la toma de muestra del exudado faringeo. El estudiante realiza la toma de muestra, siembra en medios selectivos y/o diferenciales y tincién del frotis. Transcurrido el tiempo de incubacién de los medios inoculados guardarlos en refrigeracion para realizar el antibiograma. 5. REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES a) Anotar las observaciones del frotis. Forma: Agrupacion Tincion de Gram 72b) Observar en los medios inoculados y si hay crecimiento seleccionar las colonias sospechosas de microorganismos patégenos de cada uno de los medios. escribir su morfologia colonial en la tabla siguiente: Medio de cultivo ‘Agar Sangre | Agar sal y Manitol ‘Agar Biggy/ Agar McC. Caracter icas Tamario (mm) Color Forma Bordes Elevacion Superficie ‘Aspecto Luz reflejada Luz Transmitida Consistencia Cami medio: Pigmento/hemdlisis/variacion de pH) en la coloracién del 6. CUESTIONARIO 1. gPor qué el Agar Sal y Manitol es un medio selectivo y diferencial? 2. {Qué tipos de hemélisis podemos observar en el Agar gelosa sangre? Explica. B3. .Cual es la finalidad de hacer un frotis al inicio de la toma de muestra del exudado? 4, {Qué microorganismos no patégenos podemos encontrar en la faringe? 5. {Qué microorganismos patégenos se aislan de la faringe? 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 74) INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No. 13 ANTIBIOGRAMA DEL. EXUDADO FARINGEO Clave: BC-P13| Revision: 15/02/21 | Fecha de emision: 22/02/21 _| Pagina: 75 de 97 1. MARCO TEORICO El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones mas importantes de los laboratorios de microbiologia clinica. Su realizacién se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad 0 antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximacién, su resultado como factor predictivo de la eficacia clinica. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibidtico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o poblacién bacteriana El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinacién de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. E1 antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de Petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibiéticos. Tan pronto el disco impregnado de antibidtico se pone en contacto con la superficie himeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibidtico difunde al agar. El antibidtico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formandose un gradiente de concentracién. Transcurridas 18-24 horas de incubacién los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicién. La concentracién de antibiético en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como coneentracién critica y se aproxima a la concentracién minima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilucién. Sin embargo, los métodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la CMI por lo que hay que convertir el diametro del rea de inhibicién alrededor del disco a las categorias de sensible, intermedio 0 resistente (S, |, 0 R) de acuerdo a la tabla publicada por los organismos encargados del control de tales métodos, por ejemplo, el Comité Nacional de Esténdar de Laboratorios Clinicos de los estados unidos de Norteamérica (National Committee for Clinical Laboratorios Standards). Método de Bauer - Kirby 1. Preparar previamente suficientes cajas de Petri con medio agar de Mieller-Hinton, es importante que e! medio tenga un grosor de 4mm y sea uniforme Para lo cual adicionar 20 ml del medio. 152. Seleccionar las colonias de interés, con el asa tocar de 4 @ 5 colonias de morfologia semejante e inocular en un tubo que tiene 1 ml de soluci6n salina 0.85%.de tal forma que la turbiedad observada en ese tubo sea comparable con el tubo No. 0.5 del estandar del nnefelémetro de McFarland, Esto equivale a una concentracién de aproximadamente 1x10" 8 UFCimL BacteriasimL. 3. Retirar el contenedor de discos del refrigerador. Antes de abrir el contenedor, permita que los discos se equilibren a la temperatura ambiente durante una a dos horas para minimizar la condensacin y reducir la posibilidad de que la humedad afecte la concentracién de los agentes antimicrobianos. 4. Colocar las placas con el agar Mieller-Hinton dentro de la incubadora de 10 a 15 minutos con la finalidad de que estas se calienten a la temperatura ambiente y favorecer la absorcién del exceso de humedad dentro del medio. 5. Sumergir un hisopo estéril en la suspensién bacteriana, y antes de retirarlo eliminar el ‘exceso de liquido haciendo girar el hisopo contra la pared interna del tubo. 6. Inocular en toda la superficie del medio, en por lo menos en tres direcciones (estria masiva), dando rotacién a la placa. 7. Secar el inoculo incubando la placa 15 minutos a 35°C. 8. Sacar la placa de la incubadora y colocar los discos con los agentes antimicrobianos con ayuda de una pinza estéril, sobre la superficie del medio de Mieller-Hinton. Los sensidiscos deben presionarse suavemente contra la superficie con la misma pinza para asegurar un contacto firme con el medio. Evitar mover los discos una vez colocados. Incubar las cajas de Petri a 35°C durante 18 horas en posicién invertida. 10. Medir los halos de inhibicién con una regla marcada en milimetros por la parte posterior de la caja. La lectura se reporta en milimetros. 2. COMPETENCIA Realiza el antibiograma para determinar la sensibilidad bacteriana de las colonias aisladas a partir del exudado faringeo. 3. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS Manual de procedimientos Asa bacteriologica Hisopos estériles Tubos de ensaye con solucién salina 0.85%. Cajas de Petri con Agar de Mideller- Hinton Sensidiscos con antibiéticos para Gram negativos y Gram positives. Estufa bacteriolégica Estandar 0.5 del nefelémetro de MoFarland (1x10 UFC/mL) 4. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES 1. El docente da las instrucciones para efectuar el antibiograma de las colonias potencialmente patogenas que se aislaron del exudado faringeo. 2. El estudiante realiza el antibiograma de acuerdo a las instrucciones. Mide el diametro del halo de inhibicién y lo anota en la tabla siguiente. Compara los resultados con lo reportado 16en latabla anterior y anota si el microorganismo es sensible (S), intermedio (I) 0 resistente (R) alantibistico. 5.REGISTRO DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES a) Resultados del antibiograma Nombre del antibvotico ‘Sigas_] Concentracion | Didmetvo det halo Sy Ty]R De inhibicién (mm) 6. CUESTIONARIO 1. {Cuando se indica la realizacién de un antibiograma? 2. éMenciona dos limitaciones de este método? Explica, 3. {Qué otros métodos a parte del visto en la préctica existen para determinar la sensibilidad microbiana? 14.- ,.Qué ocurre si se excede el tiempo de incubacién indicado en este método? 5. {Qué ocurre si el agar de Mieller-Hinton en las cajas de Petri es demasiado profundo? 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 8INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS 15 “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY “ ACADEMICA DE: TECNICO LABORATORISTA CLINICO LABORATORIO DE: BACTERIOLOGIA CLINICA NOMBRE DE LA PRACTICA No.14 SIEMBRA DE UROCULTIVO Clave: BC-P14| Revision: 15/02/21 | Fecha de emision: 21/02/21 | Pagina: 79 de 97 1. MARCO TEORICO Generalidades. La infecci6n del tracto urinario (ITU) es la enfermedad mas frecuente del aparato urinario. En el Ambito hospitalario es la infeccién més usual y en el comunitario sigue a las infecciones respiratorias La ITU se define como la presencia y proliferacién de gérmenes en el tracto urinario Habitualmente es bacteriana y excepcionalmente, micética o virica. Se pone en evidencia mediante el cultivo de la orina (urocultive) en medios de crecimiento apropiados. Si hay bacterias, creceran formando colonias que pueden ser contadas como unidades formadoras de colonias por millitro (UFC/ml). En la mayor parte de los casos, el crecimiento de mas de 105 UFC/ml en una muestra de orina adecuadamente recogida puede significar infeccién. En los afios 50, Kass defini el recuento de 100.000 o mas colonias por mL de orina (105 UFCimL) como criterio de bacteriuria (presencia de bacterias en la orina) significativa, Los critetios de Kass se refieren a la orina obtenida por miccién media directa, tras la limpieza cuidadosa con agua y jabén de los genitales externos, lo cual involucra la existencia de una contaminacién con flora bacteriana existente en los genitales extemnos, en este caso lleva implicito la existencia de una contaminacién con flora bacteriana a nivel de uretra, vulva, 0 prepucio, de esta forma recuentos inferiores a 10000 UFC/ mL se consideran contaminacién fisiolégica, es decir negativos, y los recuentos intermedios mas de 10 000 y menor de 100 000 son considerados como sospechosos de infeccién y obliga a nuevas determinaciones, teniendo en cuenta que la infeccién urinaria es mono bacteriana por lo que cultivos con dos 0 ms gérmenes no deben de ser considerados significativos aunque el recuento sea superior a 100 000 UFC/mL. Etiolégicamente, Escherichia coll causa el 80% de las ITU no complicadas, Proteus mirabilis, Klebsiella spp. y Staphylococcus saprophyticus (en mujeres menores de 50 afios) son responsables de la gran mayoria de los episodios restantes. El espectro de bacterias que causan ITU complicadas es mucho mas amplio, aunque E. colisigue siendo el principal agente causal En os nifios varones es particularmente frecuente la infecoién por Proteus mirabilis. 19Casos en los que se solicita el urocultivo. ‘© Atodas las mujeres embarazadas entre la semana 12 a la 16. ‘+ En personas con insuficiencia renal, hipertensién, sospecha de infeccién sistémica, con fiebre de origen desconocido y/o ardor al orinar. ‘+ En pacientes diabéticos y de edad avanzada, * Problemas para vaciar completamente la vejiga. ¢ CAlculos renales. * Tras una cirugia u otro procedimiento en las vias urinarias. Indicaciones para el paciente para la toma de muestra. ‘+ Con objeto de obtener resultados confiables, no deben olvidarse algunas precauciones basicas en la toma de la muestra, tales como: ‘+ No tomar antimicrobianos 0 suspender el tratamiento entre cinco a diez dias previos a la realizacion del examen. + Debe ser la primera orina de la mafiana. ‘+ Recoger la muestra y llevarla al laboratorio maximo en las dos horas después de su recoleccién. Sino fuera posible debe conservarse en refrigeracién hasta un maximo de 24 horas, pero nunca se debe congelar. ‘+ Colectar la muestra de orina a partir de la porcién media de la miccién con objeto de desechar los microorganismos estacionados en la uretra. ‘+ Colectar las muestras en recipientes estériles y sembrarlas lo mas pronto posible, para evitar la reproduccién o muerte de las bacterias. ‘+ Recoger la primera orina de la mafiana. ‘+ Previo aseo (con agua y jabén) de las areas genitourinarias. ‘+ Llevar la muestra al laboratorio lo antes posible. Si no puede ser enviada al laboratorio en las 2 horas después de su recoleccién debe conservarse en el refrigerador hasta un maximo de 24 horas, pero nunca se debe congeler. ‘+ Recolectar la orina en un recipiente de plastico estéril, de boca ancha, el paciente debe cerrar correctamente después de la micci6n, evitando tocar el interior delrecipiente. + Mujeres: deben mantener los labios mayores separados mientras se recoge la orina. Se desecha la primera parte de la miccién y, sin interrumpir el flujo de la orina, se recoge la miccién media, y se desecha también la miccién terminal. La recogida de la orina por miccién media debe evitarse durante la menstruacién. ‘+ Hombres: deben mantener el prepucio retraido mientras comienzan la miccién. Al igual que las mujeres, deben recoger sélo la miccién media, sin interrumpir el flujo de laorina. Procedimiento para el aislamiento e identificacién de microorganismos patégenos. 1, Homogenizar la muestra y tomar una porcién con el asa calibrada. En caso de no contar con calitrador, tomar un asa y hacer un circulo de 4 mm de didmetro, esto equivale a tomar 0.01mL de muestra. Sembrar haciendo una estria sobre el diametro de la placa y luego pasar el asa perpendicularmente a esta linea cubriendo el resto del campo. Hacer 80esto en cada una de las placas con medio de agar comenzando por el de gelosa sangre, después EMB y finalmente agar sal y manitol, excepto Biggy. 2. Incubar a 35°C de 24 a 48 horas. En el caso del agar gelosa sangre conviene incubarlo en atmésfera himeda y CO. (técnica de la vela) a fin de lograr un buen desarrollo de estreptococos beta hemoliticos, en caso de estar presentes. 3. Colocar en condiciones asépticas, en un tubo vacio y estéril de 8 a 10 ml. de orina, 4. Centrifugar a 3,000 rpm, 10-15 minutos, decantar, resuspender el sedimento y sembrar en el medio de Biggy. Incubar hasta 72 horas a 35°C. 5. Realizar el examen en fresco, colocar con una pipeta Pasteur una gota del sedimento en tun portaobjetos, y encima de la gota un cubreobjetos, observar a 40 X. 6. Efectuar con el sedimento urinario un frotis y tefir con la técnica de Gram. En caso de investigar M. tuberculosis realizar la técnica de Ziehl-Neelsen. 7. Realizar el examen fisico de la muestra. Considerar el color, olor, aspecto densidad y pH 8.- Si es necesario realizar pruebas bioquimicas o antibiograma. Urocaltivo : Protocolo de rutina ~ PO ¢ coe Thing Oran > Chenrvar wert, Oram y nim aprexinad de bactoriat hpieativa: «SOB UEC Ze Concept on pen spe apibien ‘® seeso fh shpieative: «10 URC Ceveepto on pncn spr apitiea) Reaurte. Louies: 103 10* urc/m (Sigietive on oesinet) teen cesar Siietve: 210° uscd = = s f i : i ; sane oie Hl 1 eC sien cherie Cae : Oxidase ~ —T Coe = a Al hacer el recuento de colonias en placa, es importante utilizar los datos obtenidos de placas en que haya entre 30 y 300 UFC, si se desea lograr una estimacion aproximada del numero de bacterias en la muestra original de orina. Sin embargo, en caso de obtener némeros mayores de este limite, esto nos puede indicar una cuenta elevada que concuerda con una infeccién activa. 2.COMPETENCIA Realiza la técnica de urocultivo para el aislamiento de patégenos causantes de infecciones de las vias urinarias. 81