Manual del Laboratorio de Genética Version 2019-11 M en Marisa Hernandez Barrales, QFB. Rusland Enrique Torres Orozco. Dr. en C. Jorge Luis Ayala Lujan PRACTICA. CORPUSCULO DE BARR “a OBJETIVO Observar la evidencia citologica del cromosoma X inactivo en células somaticas femeninas en interfase a través de la observacion del Corpusculo de Barr en preparaciones de células de descamacin de la mucosa oral y en neutréfils de un frotis sanguine INTRODUCCION La cromatina es el conjunto de ADN histonas y proteinas no histonicas que se encuentra en el nucleo de las células eucariotas. Las unidades basicas de la cromatina son los ucleosomas. Estos se encuentran formados por aproximadamente 146 pb de longtud, asociados @ un complejo especifico de 8 histonas ileosémicas (octémero de _histonas).Este octémero forma un nicleo proteico alrededor del enroll la hélive de ADN. Entre cada una de las asociaciones de ADN e histonas existe un ADN libre llamado ADN “espaciador’, que garantiza flexibilidad 2 la fibra de cromatina. Este tipo de organizacién da lugar a una estructura parecida a un ‘collar de cuentas”. Posteriormente, un segundo nivel de organizacién de orden superior lo constituye la “fibra de 30nm’ compuestas por grupos de nucleosomas empaquetados uno sobre tros adoptando disposiciones requlares gracias a la accion de la histona H1. Finalmente continia el incremento det empaquetariento del ADN hasta obtener los cromosomas que observamos en la metafase, el cual es el méximo nivel de ‘condensacién del ADN (Figura 1). “ vey Figura 1. Representacion de los diferentes niveles dde condensacion de ADN.(!) Hetra simple de ADN. (2) Hebra de cromatina (ADN con histonas, “cuenta de cola’) (3) Cromatina durante laintriase con ceromero (4) Cromatna condensada durante la profase (Dos copias de ADN estan Dresenes). (6) Cromosoma durante la metatase. La cromatina se puede encontrar en 2 formas: © Heterocromatina: es una forma transcripcionalmente —inactiva. condensada de la cromatina que se localiza sobre todo en la periferia del ncleo y que se tile fuertemente con las Coloraciones. La heterocromatina puede ser, a su vez, de dos tipos diferentes: © Heterocromatina constitutiva idéntica para todas las células dol organismo y estable durante todas las etapas del desarrollo, Carece de informacién genética, incluye a los telometos ‘centrémeros del eromosoma,Manual del Laboratorio de Genética Versién 2019-1 Men C. Marisa Hernandez Barrales, QFB, Rusland Enrique Torres Orozco. Dr. en C. Jorge Luis Ayala Lujan. ‘© Heterocromatina facultativa: su estado depende de la etapa del desarrollo y del tipo celular. La heterocromatina facultativa es reversible y contiene genes que no se expresan o que pueden expresarse en. algin momento. Un ejemplo de este tipo de heterocromaina es el cromosoma X inactive (cuerpo de Barr) de las células somaticas femeninas, © Eucromatina: es una forma de la cromatina ligeramente compactada con una gran concentracién de genes, y a menudo (no siempre) se encuentra en transcripcionalmente activa Generalmente se observa como bandas de color claro cuando es tefido el nicleo en interfase (Figura 2) Figura 2.- Cromatina. La cromatina tiene un aspecto ‘ranulaso y heterogéneo, con regiones claras (Euomatina Euc) y oscuras (Heterocromatna, Hic). La presencia de diferentes nimeros de cromosomas X en los machos y las hembras constituye un problema especial en el desarrollo Dado que las hembras poseen dos copias de cada gen ligado al X y los machos s6lo una, la cantidad de producto génico (proteina) de los genes ligados al X diferiria en ambos sexos: las hembras sgenerarian el doble de producto génico que los machos. Los animales contrarrestan este problema ppotencial mediante la compensacion de la dosis, que iguala la cantidad de proteina producida por los genes ligados al X en ambos sexos. En las moscas de la fruia (Drosophila melanogaster), ta ‘compensacién de la dosis se alcanza al duplicar la a de los genes del cromosoma X de los gusano Caenorhabaitiselegans, la ‘compensacion se logra al disminuir @ la mitad la actividad de los genes de ambos cromosomas K en ta hembra. Los mamiferos placentarios uiizan olro mecanismo de compensacion de la dosis: los genes de uno de los cromosomas X de las hemibras se inactivan completamente. En 1949, Murray Barr observo cuerpos condesados que se tefian intensamente en los niicleos de las células de gatos hembras. Esta estructura oscura comenz6 @ conocerse como Corpisculo de Barr. En 1961, Mary Lyon propuso que el corpisculo de Barr era un cromosoma X inactivado y su hipétesis (ahora probada) se conocid como la hipétesis de Lyon. Esta investigadora sugiri que dentro de cada célula de la hembra uno de los dos cromosomas X se inacivaria aleatoriamente, El cromosoma que se inactiva se superhelicoidiza formando una heterocromatina facultatva a la que se le llama Corpisculo de Barr, cromatina sexual 0 cromatina X (Figura 3). Figura 3. Corpiisculo de Barr. Ticén de Papanicolau de células enitelales en la cual se puede observar el Corpiscula de Bar como una masa asociada al borde intemo superior de la membrana nuclear (pequefio cuerpo iniranuclear) que se tite itensamente, Si la célula contuviera mas de dos cromosomas X se inactivaria todos menos uno. En pacientes con cromosomas X supemumerarios, todos los cromosomas en exceso (excepto uno) son inactivados y forman cuerpos de Barr. En ocasiones se observan cuerpos de Barr de tamafio © forma anormal y esto se debe @ anomalias esiructurales de uno de los cromosomas X. La técnica para la observacion del Corpiisculo de Barr en células de la mucosa oral y en neutrofilos puede realizarse a través técnica répida y sencila, se realza enno requiere cultivo celular y proporciona informacion preliminar del estado de los cromosomas sexuales de forma inmediata, Como resultado de la inactivacién det ‘cromosoma X, las hembras son funcionalmente hemicigoticas a nivel celular para los genes ligados ese cromosoma, En las hembras que son heterocigéticas para un locus ligado al x, aproximadamente el 50% de las células expresara un alelo y el 50% restante expresard el otro alelo; por lo tanto, en las hembras heterocigaticas se producen las proteinas codificadas por ambos alelos, aunque no dentro de la misma célula, Esta hemicigosidad funcional significa que en las hembras las células no son idénticas con respecto a la expresion de los genes del cromosoma X; las hembras son mosaicos para la expresion de estos genes. La inactivacion del cromosoma X tiene lugar en una etapa temprana del desarrollo; en los seres humanos dentro de las primeras semanas. Cuando un cromosoma X se inactiva en una celula, éste permanece inactivo para siempre y, ademas, esta inactivo en todas las células somaticas que descienden de esa célula. Por consiguiente, las células vecinas tienden a tener el mismo cromosoma X inactivado, lo que produce un patrén en parches (mosaico) de la expresion de las caracteristicas ligadas al cromosoma X en las hembras heterocigaticas. Esta distribucién en parches puede verse €n los gatos tortoiseshello carey. Aunque muchos genes contribuyen al color y al patron del petaje en los gatos domésticos, un nico focus ligado al cromosoma X determina la presencia del color marron, Existen dos alelos posibles en este locus: X*, que produce un color de pelaje distinto del marron (generalmente negro), y X®, que produce el peelaje color marron. Los machos son hemicigoticos y, por lo tanto, pueden ser negros (X*Y) 0 marron (K®Y) pero no negros y marrén (aunque es muy Taro, pueden surgir gatos carey machos por la presencia de dos cromosomas X; XSX8Y), Las hembras pueden ser negras (X*, X!), marron (XS, 8) 0 carey (XA, X®) (este tltimo patron proviene de la mezcla en parches de pelaje color negro y color ‘Cada parche marrén es un clon de células una célula original con el alelo negro Parche negro es un clon de ‘una célula original con el alelo 3 La hipdtesis de Lyon siguiere presencia de nimero variables de comes ‘no debe ser perjudicial en los mamiferos cuando existe mas de un cromosoma’ inactivan todos menos uno. Sin em Personas con sindrome de Tumer (45, X) difieren de las mujeres normales, y las personas con sindrome de Kiinefelter (47, XXY) differen de los hombres normales. Estos trastornos genéticos pueden probablemente surgir, como consecuencia de que algunos genes X escapan de la inactivacion. De hecho, la naturaleza de la inactivacién del cromosoma X es mas compleja de lo que originalmente se pens6. Los estudios realizados con genes individuales han revelado que sélo alrededor del 75% de los genes ligados al X en humanos se hallan inactivados en forma permanente, Aproximadamente un 15% escapa completamente a la inactivacion, lo cual significa que en las hembras, estos genes producen el doble de proteina que en los machos. El 10% restante se hallan inactivados en algunas hembras pero no en otras. Se desconoce las razones de esta Variacion en la activacion de algunos genes ligados al X en las mujeres, La inactivacién del eromosoma X requiere del gen XIST (X-Inactivation Specific Transcript) que se encuentra en ese cromosoma, XIST coditica para un mensajero grande que contiene entre 17 y 19 kb en los seres humanos. El RNA de XIST se acumula a lo largo del cromasoma X y procede a inactivar a todos (0 casi todos) los genes de ese cromosoma. Durante las primeras fases del desarrollo embrionario de la hembra el locus XIST se expresa en ambos cromosomas X pero répidamente se inactiva en uno y permanece en ‘otro, La trascripcion continua en uno de los ‘cromosomas lo que lleva a la acumulacion de XIST RNA convirliendo a ese cromosoma en un corpisculo de Barr. La transcripcién de XIST cesa en el otro cromosoma X permitiendo que sus genes. se expresen, El ‘apagado’ del locus XiST en el cromosoma X activo es realizado por la metilacion de las secuencias reguladoras del XIST. La ‘metilacin cominmente resulta en la represion gen, de modo que, la metilacion permanentemente la expresion del gen permite la continua expresion de al oro cromosoma X. :Manual del Laboratorio de Genética Version 2019-11 Men C. Marisa Hemandez Barrales, QFB, Rusland Enrique Torres Orozco, Dr. en C. Jorge Luis Ayala Lujan. MATERIAL Y REACTIVOS REACTIVOS MATERIAL Alcohol 95%. 3 Portaobjetos Algodon Acetorceina 1 Cubreobjetos Mechero Colorante de Wright 1 Abatelenguas Microscopio optico Buffer de Wright 1 Lanceta Aceite de inmersion Aceite de inmersion PROCEDIMIENTO |, Identificacién del Corpiisculo de Barr en células de la mucosa oral. 1. Enjuagar la boca repetidamente de quien donara la muestra 2. Lavar el portaobjetos y el cubreobjetos con alcohol al 95% y secar. 3. Hacer un primer raspado de la mucosa interna de la mejila, con un extremo del abatelenguas (Eliminar el primer raspado, este procedimiento permite limpiar la zona de toma de muestra). 4. Repetir la operacién (hacer un segundo raspando) en el mismo sitio con el extremo opuesto del abatelenguas. 5. Extender sobre el portaobjetos el segundo raspado y fijar fas células con calor (teniendo cuidado de no quemar las células) 6. Afadir una gota'de acetorceina y cubrir la muestra con el cubreobjetos. Observar a seco débil hasta encontrar un campo en donde se localicen células. Observar después a inmersion para identificar el corpusculo de Barr. En las células epiteliales de la mucosa oral el corpisculo de Barr aparece en forma de un granulo pequefio, generalmente unido a la membrana nuclear (en la periferia). Con la tincién con el colorante Oreeina, observaremos el niicleo de la célula teftido de color rosa y a nivel de la membrana nuclear una masa obscura adherida a la membrana nuclear tefida de color rosa oscuro. Il, Identificacion del Corpusculo de Barr en neutréfilos de un frotis sanguineo. 1. Lavar los portaobjetos con alcohol al 95% y secar. 2. Desinfectar con alcohol el dedo indice de la mano izquierda (0 dedo del cual extraeremos el frotis sanguineo) Hacer una puncion con la lanceta. Poner una gota de sangre sobre uno de los extremos del portaobjetos Hacer un frotis sanguinéo con ayuda de otro portaobjetos. Dejar secar el frotis al aire Tefir con Wright cubriendo toda la laminilla(incubar durante el tiempo indicado por el maestro). 8, Agregar el buffer para Wright (incubar durante el tiempo indicado). 9. Lavar al chorro de agua y dejar secar. 10. Observar 40% hasta encontrar un campo en donde se localicen neutréfilos. Observar después a inmersion para identiticar el corplisculo de Barr. Noose Enel ffotis sanguineo el Corpusculo de Barr aparece como un palillo de tambor (borde de la envoltura ‘nuclear con un apéndice pequefio), en los nicleos de los Neutrofilos.¢Cuales son las diferencias funcionales y estructurales de la Hi facultativa) y Eucromatina? En qué fase del ciclo celular son visibles los corpsculos de Barr? . 2A qué tipo de cromatina comesponde el corpiisculo de Bart? . {Quin y cémo descubrié el corpisculo de Barr? 8. 2En qué consiste la hipdtesis de Lyon? ¢Cuantos corpisculos de Barr esperaria encontrar en los siguientes organismos? Cromosomas Nimero de sexuales | Corpusculos de Barr por célula YO ee XX pron KON XXXY, XXXX_ XXY. Explicar el mecanismo de inactivacion de un cromosoma X. BIBLIOGRAFIA Guizar-Vazquez J Jesis. Genética Clinica. Diagnéstico y manejo de las enfermedades hereditarias. El Manual Moderno. 1988 pag. 88-96 Jorde Lynn B, Carey John C, Bamshad Michael J, White Raymond L, Genética Medica. Herencia ligada al sexo y herencia mitocondral. 3a. edicion. ELSEVIER. 2005 pag, 88-108 John Bernard Henry. Clinical diagnosis and management by laboratory methods, 20th ed. Martin, 2005 p 1304-1331 Avner P, Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nat Rev Genet, 2001; 2:59-67 Brian P, Chadwick and Huntington F. Willard. Chromatin of the Barr body: histone and non- histone proteins associated with or excluded from the inactive X chromosome. Human Molecular Genetics, 2003; 12:2167-2178. Departamento de Programas Audiovisuales. Facultad de Ciencias Quimicas. 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