CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

NOMBRE DEL ALUMNO: _______________________________________

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
QUINTO SEMESTRE GRUPO “A”
SEMESTRE: AGOSTO-DICIEMBRE 2022

Nombre del profesor que imparte el curso:

M. EN ED. ZULLY VENECIA MACÍAS DURÓN
M. EN N. MIRIAM JAZMÍN ESPARZ ARAIZA

Técnico de apoyo: T.Q. BERTHA OROZCO LÓPEZ

ACTUALIZADO POR: ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

FECHA DE ACTUALIZACIÓN: JUNIO 2022

PROFESOR: M. EN ED. ZULLY VENECIA MACÍAS DURÓN
M. EN N. MIRIAM JAZMÍN ESPARZA ARAIZA
APOYO TÉCNICO: T. Q. BERTHA OROZCO LÓPEZ
MATERIA: PROGRAMA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
CENTRO ACADÉMICO: CIENCIAS BASICAS
DEPARTAMENTO
MICROBIOLOGIA
ACADÉMICO:
PROGRAMA EDUCATIVO: INGENIERÍA BIOQUÍMICA
AÑO DEL PLAN DE CLAVE DE LA
2019 SEMESTRE 5° ”A” 27424
ESTUDIOS: MATERIA:
MICROBIOLOGÍA Y PERIODO EN QUE AGOSTO-DICIEMBRE
ÁREA ACADÉMICA:
PARASITOLOGIA SE IMPARTE: 2022

DESCRIPCION DEL CURSO:

Las sesiones de laboratorio se llevarán a cabo los jueves de 13 a 15 horas y los viernes de 13 a 14 horas. Se
proporcionará un manual de prácticas como apoyo didáctico durante la primera sesión y este deberá ser leído
previamente a la realización de la práctica correspondiente.

REQUISITOS:
Para poder cursar la materia de laboratorio se debe ser alumno regular e inscrito en la materia. Se deberá
portar bata blanca en todas las sesiones, incluyendo la sesión de reporte. El tiempo de tolerancia será de 10
minutos posteriores a la hora de entrada incluyendo la sesión de reporte. No se justifican faltas. La asistencia al
laboratorio deberá ser del 100% de las sesiones prácticas, incluyendo la sesión de reporte.

OBJETIVO GENERAL
Que el alumno conozca las técnicas básicas en el laboratorio de microbiología para el aislamiento e
identificación de bacterias y hongos.

CALENDARIZACIÓN DE PRÁCTICAS
NOTA. Este programa podrá sufrir algunos cambios, los cuales siempre se notificarán con una semana
de anticipación.
FECHA NÚMERO Y NOMBRE DE LA PRÁCTICA

11-ago Presentación. Lineamientos Generales: Reglamento, Criterios de Evaluación,

Organización del grupo.
18-ago 1. USO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
25-ago 2. FROTIS Y TINCIONES BÁSICAS
26-ago 3. TINCIONES ESPECIALES
1– sep 4. TÉCNICAS DE SIEMBRA Y MEDIOS DE CULTIVO
8 – sep 5. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
15– sep PRIMER EXAMEN PARCIAL
29-30 sep 6. AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMOS
21-23 sep Congreso de Ciencias Naturales
6- 7oct 7.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE
13-14 oct 8. ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA
20-21 oct 9. ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS
27- 28 oct 10. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus.
3 –4 nov 11.EL SOMA O CUERPO DE LOS HONGOS: ESTRUCTURAS ESPECIALIZADAS
10 - 11nov 12.CONTROL DE MICROORGANISMOS CON AGENTES FISICOS Y QUÍMICOS
17-18 nov 13 AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS
 24 - nov EXAMEN FINAL TEÓRICO-PRÁCTICO ACUMULATIVO

EVALUACION DEL CURSO:

 Aplicación de examen diagnóstico al inicio del curso en la parte teórica, que no tendrá valor curricular,
pero deberán presentarlo todos y cada uno de los estudiantes.

 Para acreditar la materia se tomarán los siguientes rubros:

Valor Valor total
TEORÍA
- 4 Exámenes parciales* 16.8% c/u 67.2%
- Actividades de integración teórica 7.8% 7.8%
LABORATORIO
- 2 Exámenes parciales* 11.0% c/u 22.0%
- Reportes y Actividades de integración de laboratorio 3% 3%
TOTAL 100%
* Se incluirán en los exámenes algunas preguntas en inglés.

NOTA IMPORTANTE: SI SE REPRUEBA LA MATERIA, EN EL EXAMEN EXTRAORDINADIOR SE

EVALUARÁ TEORÍA Y LABORATORIO.

LINEAMIENTOS DE TRABAJO DURANTE LAS SESIONES TEÓRICAS Y PRÁCTICAS DEL CURSO

 Al inicio de la clase el profesor podrá realizar a algunos alumnos elegidos al azar preguntas relacionadas
con el conocimiento aprendido en las clases anteriores. Si el alumno no sabe contestar adecuadamente, se
le considerará como parte de su calificación en las actividades de integración teórica, o en su caso como
parte de calificación en reporte o actividades de laboratorio.
 No está permitido que los alumnos usen celulares o grabadoras, ni la realización de grabaciones de audio o
video en el salón durante las clases. El uso de tabletas o computadoras está autorizado únicamente para
tomar notas durante las clases.

3
 REGLAMENTO DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA

1. Los alumnos deberán presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, habiendo consultado

previamente en su manual la práctica correspondiente. El alumno deberá leer con detenimiento la
técnica a seguir y elaborará un esquema a manera de diagrama con los pasos a seguir, presentándolo
al profesor al inicio de la sección, contará como participación.
2. Los alumnos deberán usar bata de preferencia blanca y de manga larga para ingresar al laboratorio.
3. Ser puntuales a la hora de ingreso al laboratorio
4. Seguir los lineamientos señalados por el profesor
5. Está prohibido ingerir alimentos y fumar dentro del laboratorio.
6. Mantener orden dentro del laboratorio.
7. Conservar limpio el laboratorio y las mesas de trabajo
8. Desechar el material Biológico bajo las normas establecidas por la institución para los residuos
peligrosos Biológicos e infecciosos. (En caso de no saber cómo manejar un producto Biológico
preguntar al personal del laboratorio)
9. Notificar a los técnicos y/o profesor del laboratorio en caso de derrames de materiales biológicos o
reactivos, para que ellos tomen las medidas necesarias para llevar a cabo la descontaminación.
10. Notificar a los técnicos y/o profesor del laboratorio en caso de daño y/o mal funcionamiento de algún
aparato, encontrado al inicio de su uso o generado durante el mismo.
11. Manejar adecuadamente todo el material y equipo que se utilice en el laboratorio.
12. El material y/o equipo dañado por negligencia tendrá que ser repuesto por el responsable del daño.
13. Lavarse las manos con agua y jabón al término de la práctica
 PRACTICA 1. USO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO (OBSERVACIÓN DE ORGANISMOS VIVIENTES)

OBJETIVOS:
1. Que el alumno realice preparaciones húmedas para observar microorganismos mediante el uso del
microscopio.
2. Que el alumno practique el manejo del microscopio mediante la observación e identificación de diferentes
organismos (procariotes y eucariotes) microscópicos presentes en agua de charca.
FUNDAMENTO
El microscopio compuesto y el estereoscopio son instrumentos muy importantes para la observación,
identificación y estudio de microorganismos. Mediante el uso de un microscopio simple (de una sola lente) o
compuesto (de varias lentes) fue posible que los primeros investigadores en microbiología dieran un gran
avance en todas las áreas de la biología relacionadas al estudio de los microorganismos. Es muy importante
que los estudiantes del curso Microbiología sepan manejar en forma correcta este instrumento ya que de no ser
así se les dificultarán las observaciones a realizar en las siguientes prácticas. Por otra parte, en un medio
acuático (por ejemplo, agua de estanque o charca) se pueden encontrar muchos tipos de organismos vivientes
micro o macroscópicos. Entre estos organismos se pueden observar diferentes tipos y tamaños de bacterias,
algas, protozoos y hongos. Además, se pueden observar organismos multicelulares como nematodos, rotíferos,
planarias y algunos crustáceos como pulgas de agua, entre otros.

MATERIAL:
1. Laminillas portaobjetos y cubreobjetos.
2. Gotero o pipeta Pasteur con bulbo de plástico.
3. Frasco con agua de estanque (o charca).
4. Microscopio.
5. Cámara fotográfica
METODO:
1. Coloque, en el centro de la laminilla portaobjetos, una gota de agua de estanque y cúbrala con la laminilla
cubreobjetos. Se recomienda manejar ambas laminillas por los bordes para no ensuciarlos y que esto no
estorbe en las observaciones. Además, no debe colocar exceso de líquido para evitar que éste se derrame
de la laminilla portaobjetos y ensucie la platina.
2. Observe las preparaciones únicamente con los objetivos secos débil y fuerte (10 X y 40 X).
3. Con el auxilio de dibujos de diferentes organismos que se encuentran en agua de estanque, trate de
identificar a aquellos que usted observe. Compare el tamaño, movimiento, velocidad, etc.
4. Realice esquemas a diferentes aumentos de los organismos observados.

CUESTIONARIO:
1. ¿Qué importancia tiene el agua en la transmisión de microorganismos importantes en la agroindustria y
salud humana?
2. Señale cinco ejemplos de estos microorganismos.
3. ¿Cuál es la diferencia entre una levadura y una bacteria?
4. ¿Que son las diatomeas y de que está compuesta la tierra de diatomeas?

5
 A B C

E F
D

G H I

Figura 2.1 A) Paramecium, B) Protozoo ciliado, C) Stentor, D) Stylonychia, E) Stentor, F) Vorticella,, G) Stylonychia, H) Amoeba, I)
Radiolario.

6
 A
B

C D

E F

G H

Figura 2.2 A) Chlamydomonas, B) Oedogonium, C) Ulothrix, D) Spirogyra, E) Zygnema, F) Desmiduim, G) Scenedesmus, H)

Pediastrum,

7
 A B

C D

Figura 2.3. Géneros de diatomeas: A) Diatoma, B) Nitzschia, C) Navicula, D) Fragillaria

A B C

D F
E

Figura 2.4 A) Tardigrado, B) Gastotrico C) Rotifero, D) Nematodo, E) Cyclops sp. F) Daphnia sp.

8
 PRACTICA 2. TINCIONES BÁSICAS

2.1. PREPARACION DE UN FROTIS Y TINCION SIMPLE DE BACTERIAS

OBJETIVOS:

1. Que el estudiante realice un frotis bacteriano y que lo fije.

2. Que el estudiante observe la morfología y agrupación de las bacterias.

FUNDAMENTO

Roberto Koch (1843-1910) fue quien por primera vez experimentó que si se extienden las bacterias en una capa delgada sobre
una laminilla de vidrio (portaobjetos) y se le añade algún colorante estas células bacterianas, que normalmente son incoloras,
adquieren el tinte y se veían con mayor claridad al observarlas al microscopio. La tinción simple de bacterias se llama así porque
sólo se aplica un colorante, el cual lo adquieren las bacterias. En contraste, hay tinciones que en las que se utilizan dos tintes con los
cuales podemos observar la diferencia entre diferentes tipos de bacterias o partes de las mismas. A estas últimas se les llaman
tinciones diferenciales. La realización de un frotis bacteriano, el procedimiento de fijar éste en la laminilla portaobjetos y la tinción
simple del mismo es una técnica sencilla, pero importante, que se realiza en los estudios de estos microorganismos con la finalidad de
conocer su morfología, tamaño y agrupación, los cuales tienen importancia taxonómica para identificarlos.

MATERIALES:

Cultivos de Escherichia coli,, Bacillus subtilis, Streptococcus y/o Staphylococcus sp., mechero, asa de inoculación o de siembra
bacteriológica, portaobjetos, soluciones colorantes para tinción (cristal violeta al 1 % y de safranina al 0.5 %) y aceite de inmersión.

METODO:

1. Si el cultivo bacteriano se encuentra en medio líquido, en condiciones asépticas, con el asa de inoculación tomar una
muestra, colocarla en una laminilla portaobjetos y realizar un frotis en una superficie de 1 cm de diámetro. Si el cultivo
bacteriano se encuentra en medio sólido, colocar una gota pequeña de agua estéril o solución salina en un portaobjetos
limpio. Con el asa de inoculación, previamente esterilizada por incandescencia, transferir una pequeña cantidad del cultivo
bacteriano del medio sólido a la gota. Homogenizar la muestra y extenderla en un área de 1 cm de diámetro. Esperar a que
el frotis se seque. No poner la preparación al fuego pues las células bacterianas pueden deformarse.
2. Fijar las bacterias al vidrio portaobjetos pasando la laminilla sobre la flama del mechero 3 a 4 veces.
3. Cubrir el frotis con un colorante y déjelo actuar 1 minuto. Puede hacer dos frotis y cubrir un frotis con cristal violeta y otro con
safranina con la finalidad de observar que el frotis adquiere el colorante que aplica.
4. Enjuagar las preparaciones con agua de la llave aplicando un chorro ligero de agua en un extremo del portaobjetos inclinado
y permitiendo que pase suavemente sobre el frotis. No aplicar el agua directamente en el frotis ya que puede desprender y
arrastrar al frotis bacteriano.
5. Eliminar el exceso de agua del portaobjetos pegando de canto en la orilla de lavabo y esperar a que el agua restante se
evapore. El secado se puede acelerar colocando el portaobjetos entre dos papeles secantes. Sin embargo, no debe frotar el
portaobjetos en el papel.
6. Observar la preparación en el microscopio compuesto. Primero use y enfoque con el objetivo seco débil (10 X) y fuerte (40
X), posteriormente mover el objetivo seco fuerte, colocar una gota de aceite de inmersión y colocar en posición de trabajo el
objetivo de inmersión (100 X). Seleccionar un buen campo y realice dibujos de la morfología y agrupación de las bacterias.

CUESTIONARIO:

1. Que morfología y agrupación tienen los cultivos de E. coli, B. subtilis y Staphylococcus sp.
2. Señale que ventajas y desventajas tiene la tinción simple respecto del examen en fresco.
3. Con los resultados de una tinción simple, ¿se puede saber si la muestra teñida es un cultivo puro?

9
RESULTADOS:

10
 PRACTICA 2.2 TINCION DIFERENCIAL DE GRAM PARA BACTERIAS

OBJETIVO:

1. Que el estudiante realice la tinción de Gram para diferenciar a bacterias Gram positivas de Gram negativas.

FUNDAMENTO

Las tinciones que demuestran diferencias entre células bacterias o las partes de una célula bacteriana se conocen como técnicas
de coloración diferenciales. La tinción de Christian Gram (1884) es una de ellas y nos permite diferenciar entre las bacterias Gram
positivas, si las células bacterianas se tiñen de color violeta, y las Gram negativas, si las células se tiñen de color rojo. Esta técnica de
tinción es una de las más utilizadas en los laboratorios de diagnóstico para la clasificación de bacterias. En esta tinción se utilizan
cuatro reactivos: 1) el cristal violeta (= violeta de genciana) es el primer colorante que tiene la función de colorear a todos los
microorganismos, sean Gram positivos o negativos, en un frotis; 2) el segundo reactivo es una solución de yodo (lugol) el cual
actúa como un mordente, sustancia que incrementa la unión entre el colorante y los componentes químicos de la pared de las
células bacterianas Gram positivas; 3) el tercer reactivo es el alcohol-acetona (en proporción 70% y 30 %, respectivamente) el cual
actúa como un decolorante porque diluye y elimina al cristal violeta de las bacterias Gram negativas, acción que no se realiza en las
Gram positivas debido a la composición química de su pared celular; 4) el cuarto reactivo es la safranina la cual realiza la función de
tinte de contraste ya que las bacterias Gram negativas desteñidas adquieren este colorante.

MATERIALES:

Cultivos bacterianos, de 24 horas de edad, de Staphylococcus sp., Bacillus subtilis, Escherichia coli y de Streptococcus sp.
Soluciones de cristal violeta 1 %. Solución de safranina al 0.5 %. Solución diluida de lugol (1 % de I 2 + 2 % de IK). Alcohol-acetona
(1:1) (7:3). Microscopio, laminillas portaobjetos, asa de inoculación o siembra bacteriológica, aceite de inmersión y papel seda para
limpiar las lentes del microscopio compuesto.

METODO:

1. En condiciones asépticas (cerca de la flama del mechero) y con el uso del asa de inoculación previamente esterilizada por
incandescencia, tome una muestra del cultivo bacteriano y realice un frotis de 1 cm de diámetro sobre la laminilla portaobjetos.
Recuerde que si el cultivo bacteriano procede de un cultivo sólido hay que poner una pequeña gota de agua estéril en el
portaobjetos. Si el cultivo procede de un cultivo líquido no es necesario este paso.
2. Esperar a que seque el frotis y fijarlo al calor, pasando CON CUIDADO, el portaobjetos sobre la flama del mechero 3 a 4 veces.
Coloque la preparación a teñir en el soporte metálico sobre la tarja de la mesa.
3. Añadir cristal violeta en cantidad suficiente para que cubra el frotis bacteriano y dejar actuar durante 1 minuto y lavar con agua
permitiendo que el chorro ligero de la llave caiga en un extremo del portaobjetos inclinado y que suavemente arrastre el tinte.
Escurrir el exceso de agua. No hay necesidad de esperar a que seque el agua para aplicar el lugol.
4. Cubra el frotis con la solución de lugol por 1 minuto y enjuague con agua de la llave.
5. Decolorar el frotis aplicando, gota a gota, el alcohol-acetona sobre un extremo del portaobjetos hasta que ya no salga más
colorante del frotis (no hay que esperar a que seque la preparación para añadir el alcohol-acetona). Enjuague con agua de la
llave.
6. Cubra el frotis con safranina permitiendo actuar durante 1 minuto y enjuague con agua de la llave.
7. Secar la preparación, y observar al microscopio compuesto. Enfocar con objetivo 10 X, luego con el 40 X. Luego, mover el
objetivo de 40 X y antes de poner en posición de trabajo el objetivo 100 X colocar una pequeña gota de aceite de inmersión sobre
el frotis bacteriano.
8. Realizar dibujos de los resultados de la tinción que observe. Se recomienda tomar fotos a color de las preparaciones realizadas.

CUESTIONARIO:

1. Explique cuál es la composición de las paredes celulares de bacterias Gram positivas y negativas que influyen en las reacciones
químicas de los tintes.
2. Menciona tres especies de diferente género de bacterias Gram positivas y tres de Gram negativas que tengan importancia en el
área bioquímica. Explique por qué son importantes.

11
RESULTADOS:

12
 PRACTICA 3. TINCIONES ESPECIALES
PRACTICA 3.1. TINCION DE ESPORAS (ENDOESPORAS) BACTERIANAS

OBJETIVOS:

1. Que el estudiante aprenda la técnica para la tinción de esporas bacterianas.

2. Que el estudiante observe la ubicación intracelular de las esporas de algunos ejemplos de bacterias.

FUNDAMENTO

Algunas bacterias, entre los que destacan los géneros Clostridium y Bacillus, tienen la facultad de
producir cuerpos de resistencia, ovales y de pared gruesa llamados endosporas o más comúnmente esporas.
La espora es formada por la célula vegetativa bacteriana cuando las condiciones del ambiente son
desfavorables a estos microorganismos, por ejemplo: escasez de nutrientes, altas o bajas temperaturas,
radiaciones, o compuestos químicos que pueden destruir a la bacteria, entre otros. La resistencia de estas
esporas se debe a que su pared celular contiene cantidades grandes de peptidoglucano y de calcio. Cuando la
célula vegetativa muere la espora sobrevive a las condiciones adversas del ambiente por semanas o meses, y
cuando se presentan condiciones favorables las esporas absorben agua, se abren y permiten germinar o salir a
una célula vegetativa.

MATERIAL:

Cultivo (en agar), de 48 a 72 horas, de Bacillus subtilis. Cultivo (en caldo tioglicolato), de 48 a 72 horas, de
Clostridium sp. Solución acuosa, al 5%, de Verde de Malaquita. Solución acuosa, al 0.5%, de Safranina (no es
la misma que la safranina de Gram). Azul de metileno, portaobjetos, asa bacteriológica, bandeja de coloración,
mechero, aceite de inmersión y microscopio compuesto

METODO:

A) DEMOSTRACIÓN DE ENDOESPORAS MEDIANTE METODO DE TINCIÓN SIMPLE. CON AZUL DE

METILENO O CRISTAL VIOLETA:

1. Con un lápiz graso divida el porta objeto en dos secciones. (Eliminar este paso)
2. En condiciones asépticas y con el auxilio del asa de inoculación bacteriológica, tome una muestra del
respectivo cultivo realizando un frotis de la manera habitual. Fijar el frotis como ya lo realizado en prácticas
anteriores.
3. Cubrir el frotis con suficiente cristal violeta o azul de metileno y dejarlo reaccionar por 3 a 5 minutos para
lograr su tinción.
4. Lave el exceso de colorante con agua
5. Examínelo con el objetivo de inmersión
6. Dibuje un campo, muestre las endosporas.

B) METODO DE TINCION DIFERENCIAL DE SCHAEFFER - FULTON:

1. Prepare un frotis al igual que el A

2. Báñelo con verde de malaquita, déjelo reaccionar por un minuto
3. Caliente la preparación hasta que el colorante empiece a emitir vapores, hasta por 5 minutos, reponer el
colorante evaporado. Dejar enfriar durante cinco minutos.
4. Lave el frotis con agua durante medio minuto hasta que ya no arrastre colorante
5. Agregue solución de safranina al 0.5% y déjela reaccionar por medio minuto.
6. Lavar con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión
7. Haga dibujos de lo observado. Las esporas son verdes y las células vegetativas o restos de células son
rojas.

CUESTIONARIO:

13
1. Enliste tres organismos, fuera de los proporcionados, que formen espora
2. ¿En qué forma las esporas pueden aumentar la infectividad?
3. Esquematice el proceso de germinación de una espora
4. ¿Cuál fue el primer microorganismo patógeno que se demostró que tiene esporas

RESULTADOS:

14
PRACTICA 3.2. TINCION NEGATIVA PARA LA DEMOSTRACIÓN DE LA CAPSULA BACTERIANA

OBJETIVOS:

1. Que el estudiante reconozca la presencia de la cápsula en las bacterias.

2. Que el estudiante practique otra técnica de “coloración”.
3. Que el estudiante discuta la importancia de la cápsula desde el punto de vista médico e industrial

FUNDAMENTO

Algunas bacterias están rodeadas por una sustancia viscosa que forma una cubierta o envoltura
alrededor de la célula. Esta estructura se denomina cápsula o capa mucosa.

No todas las especies bacterianas producen fácilmente cápsulas detectables y el volumen de ésta está
notablemente influido por el medio donde la bacteria se cultiva.

El tratar de visualizar la cápsula es un problema algo difícil, ya que se compone de material soluble en
agua, además de estar compuestos de sustancias no iónicas generalmente polisacáridos. Como se sabe, las
técnicas de tinción se basan en una interacción química entre componentes ionizados. De hecho el mejor
modo de visualizar las cápsulas, consiste en usar el microscopio de fase para observar los organismos en un
medio que proporcione un fondo adecuado. En los laboratorios, donde no se cuenta con este equipo, es
posible duplicar los resultados mediante un método no específico muy simple denominado TINCIÓN
NEGATIVA.

MATERIAL:

Cultivos de 24 horas de Klebsiella pneumoniae o de Aerobacter aerogenes, en caldo glucosado

Tinta china o nigrosina
Safranina o cristal violeta
Porta objetos
Asa bacteriológica
Mechero
Microscopio
Bandeja de coloración

METODO:

1. Coloque varias asadas de cultivo en un porta objetos bien limpio y sin grasa, cerca de uno de los bordes
2. Coloque un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
3. Mezclar bien con el asa y luego extender la mezcla a lo largo del porta objetos utilizando la técnica descrita
en el dibujo
4. Dejar secar
5. Cubrir con safranina o cristal violeta durante un minuto, luego enjuagar con cuidado y secar.
6. Observar el frotis teñido y anotar los resultados

La cápsula se aprecia como un halo alrededor del organismo el cual estará coloreado de color rojo (por la
safranina) o morado (por el cristal violeta) según el colorante empleado.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué función desempeñan las cápsulas en la infectividad de un organismo?

2. ¿Cuál es la importancia de la cápsula en la industria?

15
RESULTADOS:

16
 PRACTICA 4. TECNICAS DE SIEMBRA Y MEDIOS DE CULTIVO
4.1. TÉCNICAS DE SIEMBRA

OBJETIVOS:

1. Conocer la aplicación de las diversas técnicas de siembra (picadura, estrías, agitación, etc.)
2. Realizar la siembra de un microorganismo mediante la aplicación correcta de distintas técnicas de
siembra.
3. Realizar el aislamiento de un microorganismo a partir de una mezcla de ellos.
4. Diferenciar las características coloniales de crecimiento bacteriano.

FUNDAMENTO

Las técnicas de siembra son importantes para el microbiólogo ya que mediante estas podemos inocular
diferentes tipos de medios de cultivo (líquidos, semisólidos y sólidos) para estudiar el crecimiento, desarrollo,
características de cultivo y pruebas bioquímicas, entre otros, para la identificación de los microorganismos.

MATERIAL:

Mechero, asa bacteriológica, tubos con caldo nutritivo, agar inclinado, agar semisólido. Caja Petri con agar
nutritivo. Cultivo de bacterias en medio líquido.

METODO:

A) Siembra por Agitación (Inoculación de caldo).

1. Coloque frente a usted el mechero bunsen y ponga todo el material a ocupar en posición adecuada para
que se pueda alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse.
2. Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y con la otra mano el asa de inoculación, flamear el
asa completamente al rojo vivo para esterilizarla.
3. Quitar el tapón del tubo de cultivo, con el dedo meñique de la misma mano con la que se tiene el asa,
teniendo cuidado de no acercar demasiado los tapones al mechero.
4. Flamear los bordes de los tubos (antes y después de insertar el asa de inoculación), tomar una asada (con
el asa previamente enfriada), del cultivo que se desea inocular, flamear los bordes del tubo y tapar.
5. Tomar el tubo con el caldo nutritivo estéril, quitar tapón, flamear los bordes del tubo e introducir el asa con
el microorganismo a inocular, AGITAR el asa dentro del caldo nutritivo.
6. Retirar el asa de inoculación del tubo, tocando la superficie interna del tubo para eliminar cualquier exceso
de inoculo.
7. Flamear de nuevo los bordes del tubo y volver a colocar el tapón.
8. Flamear de nuevo el asa de inoculación al rojo vivo para esterilizarla.
9. Marcar los tubos con los datos correspondientes.
10. Incubar los tubos a 37° C durante 24 horas.
11. Hacer observaciones, anotando resultados obtenidos.

B) Inoculación en agar inclinado (Siembra por estría y picadura)

1. Efectuar los pasos preliminares (flamear el asa de inoculación, quitar los tapones y flamear los bordes de
los tubos).
2. Insertar el asa de inoculación (recta) dentro del tubo que contiene el cultivo y tomar una asada de este.
3. Flamear los bordes del tubo de cultivo y colocar el tapón.
4. Inocular el tubo con agar inclinado, deslizando suavemente el asa de inoculación sobre la superficie del
agar, al término realizar una picadura casi hasta el fondo del medio contenido en el tubo.
5. Flamear los bordes del tubo de cultivo y colocar el tapón.
6. Esterilizar el asa.
7. Marcar los tubos.
8. Incubar a 37 °C durante 24 horas.
17
9. Hacer observaciones, anotando resultados obtenidos.

C) Siembra por picadura (Medio semisólido).

1. Utilizando el asa recta estéril y fría como en los pasos anteriores tomar muestra, introducir el asa al medio
semisólido realizar una picadura recta casi hasta el fondo del medio, teniendo cuidado de no agrandar el
área de inoculación, sacando el asa por el mismo sitio de inoculación.
2. Flamear el borde de los tubos y colocar el tapón.
3. Marcar los tubos.
4. Incubar a 37 °C durante 24 horas.
5. Hacer observaciones, anotando resultados obtenidos.

D) Técnica de estriado en placa.

1. Siguiendo las condiciones de asepsia, tomar una asada (asa circular) y sembrar la caja con agar nutritivo,
como se indica a continuación.
2. Tomar con la mano izquierda la caja Petri, de manera que la base de la caja repose sobre la palma de la
mano izquierda y la tapa pueda manipularse hacia arriba y abajo con el dedo pulgar y el dedo medio.
3. Levantar la cubierta de la caja Petri y colocar el inoculo en el borde del agar opuesto a usted.
4. Hacer estrías cerradas con el inoculo de lado a lado, trazando líneas paralelas que cubran
aproximadamente una tercera parte de la caja.
5. Bajar la tapa de la caja y flamear el asa de inoculación.
6. Girar la caja de Petri un cuarto de vuelta, eleve la tapa y enfríe el asa de inoculación, tocando la superficie
del conjunto de estrías recién hechas.
7. Tocar dos o tres veces la superficie del conjunto de estrías, con el asa y hacer un nuevo grupos de estrías
(teniendo cuidado de no cruzar las estrías originales).
8. Repetir los pasos 4, 5 y 6.
9. Marcar las cajas e incubar a 37 °C (las cajas invertidas) durante 24 horas.
10. Después de incubar examine las cajas. Hacer dibujos de lo observado, reportando características coloniales
de crecimiento y realizar tinción de Gram a las colonias observadas. Anotar resultados.

CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se flamean los bordes antes y después de realizar la siembra?

2. ¿Por qué se debe flamear el asa bacteriológica al rojo vivo cada vez que se va a realizar una siembra?
3. Generalmente a que temperatura deben inocularse los tubos y las cajas inoculadas ¿Por qué?
4. Explique los fines que se persiguen en cada una de las técnicas de siembra
5. ¿Qué condiciones deben tener los medios de cultivo y el material de laboratorio empleado para la siembra?
6. ¿Por qué deben evitarse corrientes de aire, reírse, hablar, etc. al efectuar la siembra?

18
 PRACTICA 4.2. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

OBJETIVOS:

1. Que el estudiante pueda describir y aplicar la técnica para aislar una determinada especie bacteriana.
2. Que el estudiante explique los fundamentos físico-químicos de los medios de cultivo selectivos y
diferenciales.

FUNDAMENTO

Como se señaló anteriormente hay medios de cultivo, por ejemplo agar nutritivo, papa dextrosa agar, agar
cuenta estándar, entre otros, que permiten el desarrollo de muchos tipos de microorganismos, sean bacterias,
levaduras, hongos y chromistas. Sin embargo, también existen muchos medios de cultivo que permiten el
desarrollo de ciertas especies (fluorescentes o no de Pseudomonas), géneros o grupos de bacterias
(grampositivos o negativos) u otros microorganismos de interés con fines de estudio y análisis. Al respecto, es
de suma importancia conocer los ingredientes con los que se elabora un medio de cultivo (y/o utilizar un pH
apropiado), los cuales pueden ser manipulados a nuestra consideración y conveniencia para permitir o no el
desarrollo de un microorganismo o distinguirlo de otro mediante el uso de medios selectivos y diferenciales.

MATERIAL:

Cajas de Petri con medios de cultivo Agar MacConkey, Müller-Hinton o Agar nutritivo, Agar Sal manitol.
Cultivos de Staphylococcus epidermidis, St. aureus, Escherichia coli y Salmonella, asa bacteriológica, mechero.

METODO:

1. Con un lápiz graso, divida cada caja en cuatro secciones, el primero etiquételo E. coli, el segundo
Staphylococcus epidermidis, el tercero St. aureus y el cuarto como Salmonella.
2. Con el asa estéril y fría, inocule cada sector con el cultivo correspondiente.
3. Incúbelos por 24 horas a 37 °C y observe los resultados
4. Compare sus resultados y haga esquemas

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál de los tres medios es selectivo y cual es diferencial? Explique porque.

2. ¿Qué principio físico se aplica en el Agar Sal Manitol?

19
PRACTICA 5. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

FUNDAMENTO

A estas alturas el estudiante deberá tener una idea clara de que existen muchas maneras de
caracterizar a los microorganismos. Por supuesto tal procedimiento requiere de algo de conocimiento sobre la
clasificación de los microorganismos, diferenciación morfológica, modos de reproducción, ya que para algunos
son idénticos o similares. Debido a esto desde hace ya tiempo que los microbiólogos se han visto forzados a
emplear una clasificación de tipo “claves” donde para diferenciar un grupo de organismos de otro se emplean
factores bioquímicos observables. Con las pruebas bioquímicas se estudian un gran número de características
metabólicas como por ejemplo: asimilación de carbono, nitrógeno, fermentación, cuadros de deficiencia
bioquímica, capacidad para crecer a diferentes presiones osmóticas, licuefacción de la gelatina, hidrólisis de
almidón, formación de esteres, etc. Acciones realizadas por la presencia o ausencia de enzimas (endoenzimas
y exoenzimas) en los microorganismos. De esta forma las pruebas bioquímicas nos sirven para la identificación
de determinado grupo bacteriano mediante sus reacciones químicas al estar presente en un sustrato y con la
ayuda de indicadores de pH.

OBJETIVOS:

El alumno será capaz de identificar un microorganismo problema, haciendo uso de tablas que indican
principalmente la acción enzimática sobre los sustratos (pruebas bioquímicas.
Conocerá algunos de los medios de cultivo usados para la identificación bacteriana.
Explicará el fundamento y uso de las principales pruebas bioquímicas.

MATERIAL:

1. Mechero
2. Asa bacteriológica recta
3. Medios de cultivo para pruebas bioquímicas: MIO, LIA, TSI
4. Cultivo de bacterias puras
5. Reactivo de Kovacs

METODO:

NOTA: Evite al máximo la contaminación de la cepa, ya que de esto depende los resultados que obtenga.
Flamee el asa y los bordes de los tubos antes de la toma de muestra y después de la inoculación. Además
asegúrese de trabajar cerca del mechero.

Con una asa estéril recta, se toma una colonia aislada del cultivo. Con esta colonia se trabaja toda la batería de
pruebas bioquímicas.

El medio MIO (Movilidad-Indol-Ornitina). Es un medio semisólido, se inocula por picadura.

Medio LIA (lisina-Hierro-Agar). Medio sólido inclinado, se siembra por picadura medio centímetro antes del
fondo y siembra por estría en el pico de flauta (superficie).
Medio TSI (Triple Azúcar-Hierro). Medio sólido inclinado, se siembra por picadura y estría en la superficie.

Incubar los tubos 24 horas a 37 °C. Observar y anotar los resultados.

RESULTADOS E INTERPRETACION:

Medio MIO es un medio semisólido y permite observar movilidad, producción de Indol a partir del triptófano y la
descarboxilación del aminoácido Ornitina. Emplea como indicador de pH el púrpura de bromocresol.
 La descarboxilación de la ornitina. Se produce por la presencia de la enzima ornitina descarboxilasa, dando
como producto final putrescina más dióxido de carbono. Lo que ocasiona un vire en el pH hacia la
alcalinidad (K), desarrollando un tono púrpura más intenso. La reacción es anaerobia lo que significa que
ocurre en el fondo del tubo. Se reporta como descarboxilación de la ornitina positivo. Cuando no se
20
 presenta la enzima, se fermenta la glucosa como fuente de energía, ocasionando un vire de pH hacia la
acidez, se produce un color amarillo, esto es, descarboxilación de la ornitina negativo.

 Movilidad. Si una bacteria es móvil se observa turbidez a través de todo el medio. Se reporta como
movilidad positiva. Si la bacteria es inmóvil se observa crecimiento únicamente en el trayecto de la
picadura. Se reporta como movilidad negativa.

 La producción de indol. Ocurre tras el desdoblamiento del aminoácido triptófano realizado por la enzima
triptofanasa. El indol es un gas incoloro. Su presencia se denota mediante el empleo del reactivo de Kovacs
(p-dimetilaminobenzaldehído) que forma una quinona de color rojo en la parte superior del medio de cultivo
(anillo). Se reporta como indol positivo. Si la bacteria no presenta la enzima triptofanasa no se desdobla el
triptófano, por lo tanto no hay producción de indol. Al añadir el reactivo de Kovacs no existe la formación del
anillo rojo, el color del reactivo permanece amarillo. Se reporta como indol negativo.

Medio LIA. Es un medio sólido inclinado. Permite observar la descarboxilación del aminoácido lisina para
formar amina y producir alcalinidad en el medio. Contiene sales de hierro y amonio para la detección de
ácido sulfhídrico y glucosa. Emplea como indicador de pH el púrpura de bromocresol.

 Descarboxilación de lisina. Ocurre por la enzima lisinadescarboxilasa dando origen a la cadaverina y

bióxido de carbono. Produciendo un vire de pH hacia la alcalinidad (K). Esta reacción es anaerobia (fondo
del tubo). Se reporta como descarboxilación de lisina positiva, fondo alcalino. Si la bacteria no es capaz de
descarboxilar la lisina, puede ocurrir una reacción llamada desaminación, produciendo putrescina y amonio
lo que ocasiona un viraje de color de púrpura a rojo-café. Esta reacción es aerobia (superficie del tubo). Se
reporta como descarboxilación de lisina negativa, superficie roja (R).
 Desamiación de lisina. Ocurre por la acción de la enzima lisinadesaminasa dando origen a la formación de
putrescina y amonio, lo que ocasiona un vire de color del medio de purpura a color rojo (R). Esta reacción
es aerobia (superficie del medio) y se reporta como desaminación positiva. Si no se encuentra la enzima
lisinadesaminasa la coloración de la superficie del medio permanecerá purpura o amarilla lo cual indica una
dasaminación negativa.

Nota: Si una bacteria descarboxila, no puede desaminar la lisina, y si desamina no puede descarboxilar la lisina,
solamente puede realizar una de ellas a la vez o ninguna de ellas.

 Fermentación de glucosa. Cuando la bacteria no es capaz de descarboxilar, utiliza la glucosa como fuente
de carbono. Lo que ocasiona un vire de pH hacia la acidez. Esta reacción ocurre en el fondo del tubo (A). Si
puede desaminar (K). Superficie roja/fondo ácido (R/A).
 Producción de ácido sulfhídrico. Este proceso es realizado si la bacteria es capaz de liberar azufre de
aminoácidos u otros compuestos que contienen azufre (por ejemplo tiosulfato), mediante sistemas
enzimáticos. Ocurre un acople del sulfuro (S –2) con un ion Hidrogeno (H+) para formar H 2S, que al unirse al
hierro producen sulfuro de hierro insoluble que se observa como un precipitado negro lo cual es reportado
como producción de ácido sulfhídrico positiva. Si no se observa la producción del precipitado negro se
reporta como producción de ácido sulfhídrico negativo.

Nota: En ocasiones se llega a enmascarar las reacción de descarboxilación, si esto ocurre la reacción de
descarboxilación se considera positiva, reporte como alcalina (K).

Medio TSI. En el medio TSI se puede observar la capacidad de atacar (fermentar) hidratos de carbono
(lactosa, sacarosa y glucosa), además se puede denotar la producción de ácido sulfhídrico y la producción
de gas (bacterias aerogénicas). La fermentación de carbohidratos sigue el ciclo de Krebs desencadenando
en la producción de ácido pirúvico y ácido láctico. El medio contiene tres carbohidratos (glucosa, lactosa y
sacarosa), citrato férrico, peptonas, tiosulfato de sodio y como indicador de pH el rojo de fenol.

 Fermentación de glucosa. Es una reacción anaerobia, por lo tanto ocurre en el fondo del tubo. Se produce
un vire de pH hacia la acidez, cambiando el color de rojo a amarillo claro en el fondo (A). Se reporta como
fermentación de la glucosa positivo, fondo ácido (A).

21
 Fermentación de sacarosa y lactosa. Ocurre en la superficie del tubo, lo que indica que es una reacción
aerobia. La reacción de fermentación vira el pH del medio hacia la acidez el medio toma una coloración
amarilla en la superficie (A). Se reporta como fermentación de lactosa y sacarosa positivo, superficie ácida
(A).

Notas:
- Si una bacteria no fermenta glucosa (tampoco puede fermentar lactosa ni sacarosa).
- Algunas bacterias pueden fermentar glucosa sin fermentar lactosa o sacarosa. Lo que ocasiona que el
medio de cultivo se observe amarillo en el fondo (ácido) y rojo en la superficie (K/A). Se reporta como
fermentación de glucosa positiva, lactosa y sacarosa negativo (K/A).
- La superficie roja indica utilización de peptonas como fuente de carbonos, el pH es alcalino(K)

 Producción de gas. Se caracteriza por la formación de burbujas a través del medio o por el desprendimiento
del mismo del fondo del tubo. Ocurre por la presencia de enzimas capaces de degradar ácido fórmico que
deriva del ácido pirúvico durante la fermentación de carbohidratos produciendo CO 2 y H+. Se reporta como
gas positivo.

Nota: la presencia de ácido sulfhídrico en el medio TSI ocurre como en el medio LIA, si enmascara la
reacciones de fermentación, se consideran positivas y se reportan como reacciones ácidas (A).

RESULTADOS
De acuerdo a las reacciones observadas en todos sus medios y, con la ayuda de la tabla anexa, reporte
el nombre de la bacteria, reacciones observadas en todos los medios. Puede auxiliarse de la tabla de la
siguiente página

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es una prueba bioquímica?

2. ¿Cuál es el fin de realizar pruebas bioquímicas?
3. ¿Qué prueba bioquímica nos sirve para observar la capacidad de una bacteria de descarboxilar o
desaminar un aminoácido?
4. ¿Qué azucares son fermentables en el TSI y que otros datos nos puede proporcionar este medio?
5. ¿Qué medios nos permiten determinar si una bacteria es capaz de producir ácido sulfhídrico?

Ejemplo de algoritmo para la identificación presuntiva de enterobacterias y especies relacionadas. a

22
a
En la tabla Salmonella enterididis corresponde a la especie S. enterica con varios serotipos Salmonella serotipo
Enteritidis (S. Enteritidis) y serotipo Typhi (S. Typhi). Nótese que el segundo nombre se escribe con mayúscula, y no
corresponde a nombre científico sino al serotipo.

23
PRACTICA 6. AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO

Que el estudiante realice la técnica de diluciones usada para el aislamiento y conteo de microorganismos.

INTRODUCCIÓN

El aislamiento de microorganismos es importante porque (en caso de ser un patógeno) nos permite realizar una
identificación y control de una enfermedad, nos permite conocer si un microorganismo peligroso se encuentra en nuestros alimentos,
vivienda, suelo, etc., podemos purificarlo y utilizarlo para inyectarlo en animales de laboratorio e inducir la formación de anticuerpos, en
la inoculación de diversos hospedantes para saber el rango al que afecta, utilizarlo para un proceso de fermentación y producción de
diversas bebidas alcohólicas y alimentos o en la producción de diversos ácidos orgánicos, antibióticos, entre otros ejemplos. Por otra
parte, el conteo de microorganismos también es importante para conocer la calidad microbiana de alimentos y bebidas, para inocular
un número conocido de microorganismos en un hospedante y conocer la reacción de este último, para inocular un número conocido
en un tanque o cubeta de fermentación para producir un alimento u otros productos de interés industrial. Hay diferentes técnicas para
el aislamiento y conteo de microorganismos.

MATERIAL

Cultivo mixto de microorganismos, Juego de tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril c/u, pipetas graduadas estériles,
cajas de Petri vacías y estériles, agar nutritivo a 45 °C, baño María, Mechero, Incubadora.

METODO

1. En condiciones de asepsia (junto al mechero) y con el uso de una pipeta estéril, tomar un mililitro de la muestra original,
colocarla en el primer tubo de ensayo con 9 ml de agua estéril y homogenizar la suspensión.
2. Repita la misma operación con el resto de los tubos con agua estéril a partir de la dilución realizada (observar el esquema
adjunto). La pipeta siempre debe estar sostenida junto a la flama del mechero mientras se utiliza.
3. Iniciando con el tubo de la última dilución, tomar un mililitro de la suspensión y colocarlo en una caja de Petri vacía y estéril.
Repita este procedimiento para el resto de los tubos de ensayo. La pipeta puede ser desechada ahora.
4. Coloque 20 ml de agar nutritivo a cada una de las cajas con la suspensión microbiana y, con suavidad, agite en círculos
concéntricos para homogenizar. Dejar solidificar el medio.
5. Incubar las cajas a 37 °C por 24 a 48 horas, realizar conteo de las UFC y anotar los resultados y realizar los cálculos necesarios
para reportar el total de UFC/ ml.

24
 PRÁCTICA No. 7. ANALISIS BACTERIOLOGICO DE LECHE

OBJETIVO:

Evaluar la calidad bacteriológica de una muestra de leche.

INTRODUCCIÓN:

La leche y sus derivados tienen una gran importancia desde el punto de vista de la alimentación
humana. Por esta razón es indispensable que exista un excelente control de calidad en este producto y sus
derivados lácteos. La presencia de microorganismos en la leche es uno de los principales factores que afectan
la calidad de la misma por lo tanto el estudio bacteriológico se hace indispensable para tener un adecuado
control de calidad. La leche está constituida principalmente de los siguientes componentes: agua, sales
minerales, lactosa, grasas, vitaminas, proteínas (ejemplo: caseína, albúmina, globulinas) y enzimas.
Las enzimas que podemos llegar a encontrar en una muestra de leche nos indican algunas condiciones
a las que la leche ha sido expuesta. La presencia de fosfatasa nos indica, que el proceso de pasteurización se
llevó a cabo a una temperatura menor a la adecuada. La ausencia de peroxidasa nos indica que la
pasteurización se llevó a cabo a temperaturas superiores a 80 0C. La enzima lipasa provoca la hidrólisis parcial
de los ácidos grasos ocasionando con esto olores y sabores desagradables, esta enzima puede ser fácilmente
inactivada mediante un proceso adecuado de pasteurización. La presencia de la enzima catalasa en grandes
cantidades indica que la leche proviene de vacas enfermas de mastitis (causada por microorganismos). La
reductasa no es una enzima láctea por lo tanto su presencia indica una contaminación microbiana.

En la leche se pueden localizar una gran variedad de microorganismos (aún después de la

pasteurización), los cuales la mayoría de las veces no son patógenos, pero debido a su proliferación pueden
ocasionar alteraciones en la constitución de la leche, confiriéndole sabores desagradables.
Los géneros que normalmente se encuentran en la leche incluyen entre otros a: Micrococcus,
Pseudomonas, Alcaligenes y Lactobacillus. Dependiendo de las condiciones a que se exponga la leche se
favorecerá el desarrollo de uno u otro tipo de microorganismos. A temperaturas bajas se desarrollan
principalmente bacterias fermentadoras responsables del agriamiento, mientras que a temperaturas más
elevadas proliferan bacterias putrefactivas que confieren mal olor.

Existen varios análisis bacteriológicos para determinar la calidad de la leche para consumo humano o
derivados lácteos.

A) Métodos directos:
Examen microscópico (Técnica de Breed, Levowitz, etc.)

B) Métodos indirectos:

1.- Reducción del azul de metileno: Esta técnica nos permite determinar la densidad microbiana en una
muestra de leche y el método está basado en la reducción (observada como decoloración) del azul de
metileno, que es un indicador del consumo de oxígeno. El consumo de oxigeno está en relación con el
número de microorganismos presentes en una muestra, y a su vez con el tiempo de crecimiento o exposición.

2.- Recuento de colonias en placa. Este método además de indicarnos densidad microbiana nos permite
identificar grupos bacterianos específicos mediante el uso de medios selectivos y diferenciales. Algunos de los
grupos bacterianos que podemos cuantificar son los siguientes:

a) Recuento de mesófilos aerobios

b) Recuento de termofílicos aerobios
c) Recuento de anaerobios totales
d) Recuento de coliformes totales
e) Determinación de coliformes (NMP: totales y fecales)
25
 f) Determinación de bacterias enteropatógenas
g) Determinación de Staphylococcus aureus
h) Cuantificación de esporas

MATERIALES:

Tubos con agar cuenta estándar, tubos con agar rojo violeta bilis, azul de metileno (1:30,000), tubos
con 9 mL de solución salina estéril, placas Petri estériles, pipeta serológica de 10 mL, pipeta serológica de 1
mL, mechero, baño María, muestra de leche.

PROCEDIMIENTO:
REDUCCION DEL AZUL DE METILENO

1. Con una pipeta estéril tomar 10 mL de la muestra de leche por analizar y colocarlos en un tubo de ensayo
estéril.
2. Agregar a éste tubo, 1 mL de la solución de azul de metileno (1:30,000) y mezclar hasta que el color sea
uniforme.
3. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 °C durante el tiempo necesario para que se lleve a cabo la
decoloración.
4. Observar cada 20 minutos teniendo cuidado de no agitar.
5. Anotar el tiempo requerido para que se lleve a cabo la decoloración (reducción del azul de metileno).
6. Clasificar la leche de acuerdo la siguiente tabla:

EXCELENTE No se decolora en 8 horas de incubación

MUY BUENA Se decolora en periodo de 5 ½ a 8 horas.
DM= 500, 000 UFC/mL
MEDIANA Se decolora en un periodo de 2 a 5 ½ horas.
DM= 500,000 a 4,000,000 UFC/mL
Se decolora en un periodo de incubación de 20 min a 2 horas.
MALA DM= 4,000,000 a 20,000,000 UFC/mL
PESIMA Se decolora en 20 minutos o menos
DM mayor a 20,000,000 UFC/ mL
DM= Densidad microbiana aproximada

RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA:

1) RECUENTO DE MESOFILICOS AEROBIOS:

1. Agitar la muestra para homogenizar bien la leche.

2. En condiciones asépticas tomar 1 ml de la muestra y transferirla a un tubo de ensayo que contiene 9 mL
de solución salina estéril y homogenice (marcar como dilución 1:10).
3. Tomar 1 mL de esa solución y transferirlo a otro tubo que contiene 9 mL de solución salina estéril y
homogenice (marcar como dilución 1:100).
4. Repita el mismo procedimiento con otro tubo que contenga 9 mL de solución salina estéril (marcar como
dilución 1:1000).
5. Con otra pipeta estéril tomar 1 mL de la dilución 1:1000 y transferirlo a una placa de Petri estéril.
6. Con la misma pipeta repetir el procedimiento anterior, pero ahora con la dilución 1:100 y finalmente con la
dilución 1:10.
7. Marcar cada una de las cajas Petri con las diluciones correspondientes.
8. Vaciar en cada caja un tubo de agar cuenta estándar previamente licuado y enfriado a una temperatura de
45°C.
9. Mezclar el contenido de las placas girando suavemente en sentido de las manecillas del reloj y luego en
sentido contrario (aproximadamente 8 a 10 veces)
10. Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 37 °C durante 24 horas.

26
11. Con la ayuda de un contador de colonias de Quebec contar el número de colonias de cada una de las
placas y calcular el número de unidades formadoras de colonia (UFC) /mL de leche.

2) RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA:

Con las mismas diluciones preparadas repetir el mismo procedimiento de siembra, sustituyendo únicamente el
medio de cultivo, empleando ahora el medio de cultivo “Agar rojo de violeta bilis”. Reporte de la misma forma
que para mesofílicos.

RESULTADOS:

Conforme a los resultados obtenidos en cada prueba, determine la calidad de la leche y explique cuál sería el
destino de la leche: consumo, proceso industrial, desechar, entre otros.

CUESTIONARIO:

1. ¿De los análisis realizados en esta práctica cual considera usted el mejor? Explique.
2. ¿Cómo podría demostrar que la pasteurización de la leche no se efectúo eficientemente?
3. ¿Cuáles son las fuentes de microorganismos patógenos que de manera más común contaminan la
leche (de ejemplos de ellos)?
4. ¿Mencione algunos microorganismos de aplicación en la industria de lácteos, presentes en la leche?
5. ¿Qué entiende por recuento total de bacterias y qué nos indica éste?

CONCLUSIONES:

27
 PRACTICA No. 8. ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA.

OBJETIVO:

Que el estudiante sea capaz de:

1. Determinar cuándo una masa de agua está contaminada con materia fecal a través del estudio
cuantitativo y cualitativo.
2. Cuantificar la carga bacteriana de una muestra de agua a través del conteo bacteriano, para calificar
"la calidad sanitaria del agua”.
3. Conocer los principales indicadores de contaminación microbiológica de agua, e interpretarlos de
acuerdo a la normativa vigente.

INTRODUCCIÓN:
El agua es un recurso natural renovable de gran importancia por sus diferentes usos: Industrial,
Comercial, Agrícola, deduciéndose de ello lo importante que es controlar su calidad física química y
microbiológica.
Para que sea potable, es necesario que el agua sea limpia, fresca, sin sabores u olores desagradables
y sin sustancias químicas o microorganismos nocivos.
La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como Salmonella spp. Y
Shigella spp. puede ser difícil de realizar ya que el número de estas bacterias es relativamente escaso, por lo
que se tiene que recurrir a pruebas bacteriológicas del agua potable que demuestren la presencia de
microorganismos indicadores que siempre estén presentes en materia fecal, fácil de demostrar y que sirva de
guía para conocer el grado de contaminación fecal.
Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal", el cual será utilizado para la
valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo anterior, se ha adoptado con
carácter general, el "Grupo Coliforme" como indicador más digno de confianza.
Las aguas contaminadas con materias fecales siempre contienen organismos coliformes los cuales
fermentan la lactosa produciendo ácido y gas. La presencia de estos organismos se demuestra fácilmente,
porque muy pocos microorganismos de los que pueden estar presentes en el agua, fermentan la lactosa.
La OMS incluye dentro del grupo coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram
negativos, no esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la lactosa, a 35 – 37 °C. Las especies
clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El microorganismo indicador más
comúnmente utilizado es Escherichia coli, considerando la OMS preferible emplear la expresión "Coliforme
fecal" que comprende un número ligeramente mayor de variedades, todas ellas de claro origen fecal e
indicadores de contaminación fecal reciente.
Para los efectos del análisis sanitario del agua, se define el Coliforme fecal como un bacilo aerobio o
anaerobio facultativo, Gram negativo, no esporulado, que fermenta la lactosa con producción de ácido y gas a
44 °C (±0.5 °C) en menos de 24 horas.
La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del Número Más Probable
(NMP) supone la utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua y las cantidades
de tubos sembrados en una ó más series.
Series de tubos con caldo lactosado desarrollan ácido y gas después de ser inoculados con una muestra
de agua, podemos asumir que esta fermentación se debe a la presencia de bacterias coliformes, y es
indicativo de que el agua está contaminada con heces fecales y por consiguiente, la posibilidad de tener
también organismos patógenos.

INVESTIGACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES:

a) PRUEBA PRESUNTIVA
Material:
1. Tubos de fermentación Durham con caldo lactosado o Caldo base rojo de fenol lactosa) (9) (3 tubos con
lactosa doble y 6 tubos lactosa simple).
2. Muestras de agua numeradas; contaminadas con E. coli y otras sin contaminar.
3. Pipetas de 1 mL y de 10 ml.
4. Mechero

28
PROCEDIMIENTO:
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.
1. Preparar tres series sucesivas de 3 tubos con caldo lactosado, una de doble concentración y las otras dos
de concentración sencilla.
2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 mL.
3. Agitar vigorosamente adecuadamente (de acuerdo la norma oficial) la muestra por lo menos 10 veces
antes de tomar el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar.
4. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco que contiene la muestra de la muestra
deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación.
5. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo de doble
concentración, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra en la segunda serie de tubos con
concentración sencilla.
6. Con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 mL de muestra.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es
decir, turbidez y producción de gas en la campana Durham. Al hacer esta verificación es importante
asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa en cuyo caso se
observará turbidez en el medio de cultivo y no confundir con burbujas de aire. Para evitar este tipo de
confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculación y
desechar aquellos que contengan burbujas de aire ó de alguna manera eliminar éstas y así poder
utilizarlos.
9. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias
para coliformes totales y coliformes fecales.
10. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos, continuarán
en incubación 24 horas más.
11. Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
12. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se toman como
negativos.

INTERPRETACION:
- Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
- Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se
procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.

b) PRUEBA CONFIRMATORIA
Material:
1. Tubos positivos de la prueba anterior
2. Tubos Durham con caldo bilis verde brillante
3. Asa bacteriológica
4. Mechero

DESARROLLO:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos
previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde
Brillante.
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.

INTERPRETACION:
- Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el
número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
- Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando observe turbidez: Se
consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.

29
Se reporta como AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES

2) Prueba confirmatoria para coliformes fecales.

MATERIAL
1. Tubos positivos de la prueba anterior
2. Tubos Durham con Caldo EC
3. Mechero

DESARROLLO:
1) A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas los tubos conteniendo caldo E.C.
2. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de turbidez y gas.

INTERPRETACION:
- Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el
número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
- Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la AUSENCIA DE
COLIFORMES FECALES.

CÁLCULOS.
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales: Establecer
los códigos correspondientes para calcular por referencia en la tabla estadística correspondiente (tabla I), el
NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua.

C) PRUEBA FINAL. Prueba de identificación (Identificación de organismos coliformes)

MATERIAL:
1. Placas de Petri con medio EMB.
2. Juego de pruebas bioquímicas IMViC (Indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y Citrato de Simmons).

DESARROLLO:
1. Inocule una caja con medio EMB con inoculo de los tubos positivos de caldo brila con la técnica de
dilución por estrías.
2. Incube 24 horas a 37°C.
3. Buscar colonias típicas de fermentadores de lactosa. Pueden ser colonias verdosas con brillo metálico y
centro negro-azulado, rojas, moradas o nucleadas (Escherichia spp y Enterobacter spp), o mucosas de
color rosa- púrpura (Klebsiella spp).
4. De estas colonias aisladas, y con ayuda del asa bacteriológica, inocule las pruebas bioquímicas IMViC
5. Interprete con ayuda de la tabla anexa II.

RESULTADOS:
Señalar el resultado del cálculo del NMP (Tabla anexa I), y los resultados e interpretaciones de las pruebas
IMViC (Tabla anexa II).

CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué los coliformes se emplean como indicativo de contaminación microbiológica del agua?
2. ¿Qué características distinguen a los coliformes fecales de los coliformes totales?
3. Investigue qué requisitos se deben tener en cuenta para la toma de muestra de agua para el control
microbiológico

CONCLUSIONES:

30
Tabla I. Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y
negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 cm 3, 3 con porciones de 1 cm3 y 3 con
porciones de 0.1 cm3.

Tabla II. Identificación de E. coli por medio de IMViC

Organismo: PRUEBAS:
INDOL ROJO DE VOGES CITRATO
METILO PROSKAUER
E. coli Tipo I + - -
Tipo II - + - -
Intermedia Tipo I - + - +
Tipo II + + - +
E. aerogenes
Tipo I - - + +
Tipo II + - + +
E. cloacae
Tipo I + + - -
Tipo II - + - +
Tipo IV - - + +

31
 PRACTICA No. 9
ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA

OBJETIVO
1. Analizar un alimento para detectar Salmonella usando un procedimiento estándar.
2. Identificar las características en cultivo de Salmonella sobre varios medios selectivos y diferenciales.

INTRODUCCIÓN
Salmonella, es un género de varias bacterias patógenas descubiertas por el veterinario Elmer
Salmon en 1885. Se transmite por determinados alimentos contaminados como carne de ave, huevos, y
carnes rojas. Se divide en dos especies: Salmonella bongori y S. enterica. Ésta última presenta seis
subespecies y más de 2500 variedades antigénicas distintas. El serotipo Tiphi (S. typhi) produce la fiebre
tifoidea. Otros serotipos de S. enterica producen gastroenteritis (salmonelosis)que son intoxicaciones
alimentarias que producen dolor abdominal, fiebre, náuseas, vómito y diarrea. El periodo de incubación varía
entre 8 y 48 horas, y su duración de los síntomas dura de 3 a 7 días, Los casos leves se tratan con dieta y
limonada alcalina (rehidratan reponiendo las pérdidas de electrolitos); no se deben usar anti diarreicos,
porque pueden transformar al enfermo en portador crónico de salmonellas. Los casos graves deben
hospitalizarse y tratarse con rehidratación intravenosa, y en ocasiones, con antibióticos. La prevención de
estas infecciones pasa por extremar la higiene, la limpieza cuidados y el aumento de tiempo y la temperatura
en la preparación de los alimentos. Las salmonellas se encuentran de forma natural en el intestino de hombre
y de los animales, por lo que las heces son un foco de contaminación de los alimentos y del agua.

Los alimentos implicados de forma más frecuente en esta infección suelen ser huevos crudos
(mayonesa, clara batida, sopas o leche con yema) o poco cocinados, aves mal cocidas y alimentos
cocinados que se han dejado sin refrigerar durante varias horas. Los huevos se contaminan con las heces de
las aves al pasar por la cloaca. La salmonella se encuentra en la cáscara, pero puede pasar al interior si no
se mantienen unas condiciones de conservación adecuadas. Por ello, no se deben lavar nunca los huevos
antes de meterlos a la nevera, ya que como la cáscara es porosa, la humedad favorece la penetración de las
bacterias al interior. Sin embargo, si los huevos van a ser utilizados en ese preciso momento no implica
mayor riesgo. La yema es el medio en donde se desarrollan más rápidamente. No compre huevos rotos, con
restos de plumas o heces, pues son factores de contaminación. No necesitan condiciones especiales de
conservación. Guárdelos en el refrigerador para aumentar su vida útil. El recipiente donde se ha batido el
huevo no debe contactar con la tortilla u otros platos ya elaborados. Las carnes (principalmente aves) y
productos preparados a base de carnes picadas se deben cocinar a fondo. La temperatura y el tiempo serán
suficientes para que estos elementos no queden poco cocidos en su parte central, si están crudos no los
ponga en contacto con los ya cocinados para evitar la contaminación cruzada.

Los síntomas que caracterizan esta infección son: nauseas, dolor abdominal, diarrea y fiebre alta; en
las siguientes 8 a 36 horas. La hospitalización no es extraña si persiste la fiebre elevada y la diarrea, ya que
se produce gran deshidratación causada por la importante pérdida de líquidos.

MATERIAL

 Matraz con caldo lactosado  Mechero

 Tubo con caldo de  Licuadora
Tetrationato Tubo con caldo  Cuchillo, tijeras o espátula
Selenito

32
  Yodo para Tetrationato
 Placa Agra bismuto-sulfito
 Placa Agar SS
 Placa Agar verde brillante
 Juego de pruebas bioquímicas (MIO.
TSI, LIA, UREA)
 Sueros tipificadores para salmonella
(grupo A, B, CB, 2, D, E, Vi)
 Pipeta serológica de 1 ml.
 Asa bacteriológica
 Portaobjetos
 Juego de Tinción de Gram
 Solución salina fisiológica

PROCEDIMENTO
1) Preparar la suspensión de la muestra en el caldo de pre enriquecimiento

a) Pesar 25 g de muestra y adicionar a 225 ml de Agua peptonada bufferizado o caldo nutritivo y

homogeneizarlo por 1 minuto (en licuadora si es necesario).
b) Transferir a un frasco de boca ancha y tapa de rosca e incubar a 35 o 37 0 C durante 18 a 24 horas con
tapa floja
2) Enriquecimiento selectivo:
a) Adicionar a 10 ml de caldo Selenito, 1.0 ml de muestra y a 10 ml de caldo Tetrationato, 1.0 ml de la
muestra. (Añadir dos gotas de yodo al caldo tetrationato previo a la inoculación)
b) Incubar a 35- 37° C por 24 horas a 48 horas con la tapa floja.
3) Sembrar en medios selectivos:

a) Después de 24 horas a 48 horas de incubación, tomar inóculos de los medios de enriquecimiento, y

subcultive en placas de Agar verde brillante, Agar SS y Agar verde-bismuto
b) Incubar a 35-37° C por 18 a 24 horas.
c) Observar las características de las colonias crecidas.
4) Pruebas Bioquímicas:

a) Seleccionar colonias típicas de Salmonella, y proceder a sembrar en Agar Mc-Conkey para purificar las
colonias y confirmar con pruebas bioquímicas consistentes en los siguientes medios.
(a) Agar TSI: Sembrar por picadura y estría
(b) Agar UREA: Sembrar por picadura y estría
(c) Agar MIO: Sembrar por picadura
(d) Agar LIA: Sembrar por picadura y estría
b) Incubar las pruebas por 24 horas a 37° C, y proceder a su lectura e interpretación. En caso de
corresponder al género Salmonella, proceder a realizar las pruebas serológicas.
c) 5) Pruebas Serológicas:
a) En un portaobjetos limpio mezclar una gota de solución salina estéril y un poco del crecimiento de un tubo
de Agar LIA para dar una suspensión de esta pero bien emulsionada. Repetir para dar una emulsión
similar para propósitos de control.
b) Añadir a la prueba una asada de antisuero flagelar polivalente de Salmonella (H) y mezclar.
c) Agitar el portaobjetos suavemente y examinar para ver si hay aglutinación. Esto requiere una fuente de luz
adecuada y tal vez una lente manual.
d) Anotar positivos todos aquellos cultivos que hayan mostrado aglutinación en la prueba, pero no en el
control. Si tanto en control y la prueba muestran aglutinación subcultive a partir del LlA en una placa de
Agar Sangre, e incubar por 24, hrs a 35° C y repetir la prueba usando crecimiento de la placa Agar
Sangre.
e) Repetir con el Antisuero Somático Polivalente.

RESULTADOS: Reportar los cultivos confirmados de Salmonella presentes en los 25 g de la muestra.

CUESTIONARIO

33
1. ¿Cuáles de los alimentos de mayor consumo en su comunidad tienen alto riesgo de contaminación por
Salmonella?
2. ¿Qué otras bacterias pueden causar problemas gastrointestinales en el hombre?

34
 PRACTICA No. 10
DETERMINACION Y AISLAMIENTO DE Staphylococcus aureus

OBJETIVOS
1. Determinar y cuantificar la presencia de estafilococos en alimentos de acuerdo a la Norma oficial
mexicana nom-115-ssa1-1994, bienes y servicios (Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos).
2. Determinar la producción de toxinas por aplicación de pruebas de coagulasa y termonucleasa a
estafilococos aislados de alimentos.

INTRODUCCIÓN
La presencia de S. aureus en un alimento se interpreta por lo general, como indicativo de
contaminación a partir de la piel, boca, fosas nasales y de las personas que manejan los alimentos, si bien el
material y equipo no están limpios pueden ser de origen de una contaminación ya que muchas cepas de estos
microorganismos tienen la capacidad de producir enterotoxinas que pueden provocar una intoxicación al ser
ingeridas con los productos que son contaminados con ellos.

Diversos autores han desarrollado colateralmente, pruebas indirectas que señalan la presencia de S. aureus
entre ellos están las pruebas de Termonucleasa y Coagulasa. La prueba de la coagulasa, caracteriza a S.
aureus, sin embargo, no siempre puede ser demostrada citándose además mutantes que pudieran dar la
prueba positiva.

Se han encontrado cepas de Staphylococcus que dan negativa la prueba de la coagulasa y son
productoras de enterotoxinas, originándose así, el estudio de otras pruebas que ayudaran a la investigación de
las cepas enterotoxigénicas, encontrándose una nucleasa termoestable (termonucleasa), que ha sido descrita
como una enzima que se encuentra íntimamente relacionada a la multiplicación de S. aureus.

El medio Baird-Parker posee una gran capacidad para impedir el desarrollo de la flora asociada e incluso de
cepas coagulasa negativa. Algunos Enterococos y Corinebacterias llegan a desarrollar y formar colonias
negras, pero ninguna clarifica la yema de huevo. Las levaduras y bacilos grampositivos que llegan a crecer en
este medio forman colonias grises; puede considerarse que las colonias típicas desarrolladas a las 24 horas en
este Baird Parker pertenecen a cepas de S. aureus coagulasa positiva.

Cuando se encuentra un número grande de estafilococos en un alimento significa que la temperatura de

conservación no ha sido adecuada, así como también la limpieza y la desinfección de utensilios. El recuento de
estafilococos se lleva a cabo por tres razones fundamentales:

a) En el análisis de los alimentos sospechosos de haber producido intoxicación alimentaria ya que, si en

los mismos se demuestra la presencia de gran número de estafilococos coagulasa positivos, puede
sospecharse que hayan sido la causa determinante de tales procesos.
b) Para demostrar el riesgo que existe de que el alimento pueda determinar casos de intoxicación
alimentarla si se mantienen en condiciones que permiten la formación de la toxina, o si se utiliza como
ingredientes de otros alimentos.
c) Para demostrar que ha tenido lugar una contaminación peligrosa posterior a la elaboración de los
alimentos.

MATERIAL
- Frascos con 99 mI de diluyente (agua peptonada) estéril.
- Pipetas de 1 mI. y 10 mI. estéril.
- Licuadora con vaso y tapa estériles.
- Platillo para pesar y cuchillo estéril.

35
- Varilla de vidrio en forma “L" estéril.
- Portaobjetos limpios y desengrasados.
- Asa de platino.
- Placas con Agar Azul Toluidina DNA.
- Placas con medio de Agar Baird-Parker.
- Tubos con Caldo de Triptona de Soya (conteniendo 10 % de NaCl).
- Plasma de Conejo díluido 1:3 con SSF.
- Baño María.
- Termómetro.

PROCEDIMIENTO.
1. Pesar 11 gr. de la muestra y adicionar 99 mI. de diluyente, depositarlos en el vaso de la licuadora y moler
aproximadamente 30 seg.
2. A partir de la muestra licuada, preparar diluciones decimales hasta 10 -5.
3. A partir de la serie de diluciones transferir 0.1 ml de cada dilución sobre la superficie de las placas de agar
Baird-Parker y extender la muestra con varilla en forma de “L”.
4. Incubar las placas a 35 –37 °C por 48 horas.
5. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus y contar. Las
colonias típicas de S. aureus son negras, brillantes convexos de 1.0 – 1.5 mm de diámetro, con un margen
blanco y delgado rodeado por una zona clara de 2-5 mm de ancho.
6. Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de catalasa,
coagulasa y termonucleasa.

CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus.

Cuenta total de colonias sospechosas en una Colonias sospechosas a caracterizar

caja representativa: bioquímicamente:

Menos de 50 UFC 3
51-100 UFC 5
101-150 UFC 7

7. De las colonias típicas, efectuar un frotis con la técnica de Gram y realizar la prueba de la catalasa.

PRUEBA DE LA CATALASA
1.Colocar una gota de peróxido de hidrógeno en una laminilla portaobjetos limpia.

2.Mezclar con la gota anterior un pequeño inoculo bacteriano tomando con un aplicador de madera.

3.Determinar si hay producción de catalasa o no.

INTERPRETACIÓN:
Catalasa positiva: abundante burbujeo en la mezcla, que indica que el peróxido se ha transformado en
agua y oxigeno libre (liberado como gas).

Catalasa negativa: no se presenta burbujeo.

PRUEBAS CONFIRMATORIAS
Sembrar el número de colonias positivas en forma individual según el cuadro número 1, en tubos que contienen
3 ml de caldo Tripticasa de soya con 10 % de NaCl, Incubar a 35-37°C por 18 a 24 horas.' De estos tubos
realizar la prueba de coagulasa y la prueba de la termonucleasa.

36
PRUEBA DE LA COAGULASA:
1. Inocule con 0.5 Ml de medio de los tubos anteriores, tubos con plasma citratado de conejo diluido 1:3.
Uno para cada tubo.
2. Incube durante 2 horas a 37°C.
3. Observe si hay formación de un coágulo bien formado para cada tubo y determine cuantos tubos son
positivos a la presencia de la enzima coagulasa,

PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA:
1. En una placa de Petri con agar azul toluidina DNA, se efectuarán orificios de 2 mm de diámetro.
2. Del resto del cultivo de los mismos tubos utilizados del caldo Soya tripticasa en la prueba anterior. calentar
a ebullición 10 min, cada uno de ellos.
3. Colocar una gota de cultivo con una pipeta Pasteur después del calentamiento en un orificio hechos en el
agar Azul de toloidina, cada orificio se llenará con medio de un tubo diferente.
4. Incubar a 36°C por 24 horas
5. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica
como positiva
Nota. Como guía metodológica visualizar los diagramas de abajo y la explicación del profesor.

Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMStaphylococcusaureus_17365.pdf

37
RESULTADOS

Reportar S. aureus, coagulasa positiva y Termonucleasa positiva UFC /gr (o mL) de alimento.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué factores favorecen la contaminación de los alimentos por S. aureus?

2. ¿Explique el fundamento bioquímico del crecimiento selectivo y diferencial de S. aureus en Agar Baird
Parker?

38
PRACTICA 11. EL SOMA O CUERPO DE LOS HONGOS: ESTRUCTURAS ESPECIALIZADAS

FUNDAMENTO

Los hongos verdaderos (Zygomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes y Basidiomycetes) son organismos

eucariontes, aclorofílicos, portadores de esporas, que se reproducen sexual y asexualmente y que tienen un
cuerpo, generalmente filamentoso, con paredes celulares compuestas por quitina y glucanos. Ellos, a diferencia
de las bacterias, animales y plantas, tienen una estructura y morfología muy diferente razón por la cual forman
el reino Fungi. Los hongos inferiores se considera pertenecen al Reino Protozoo (Myxomycetes y
Plasmodiophoromycetes) o al Reino Chromista (Oomycetes, que se caracterizan por poseer 2 flagelos, talo
diploide y pared celular con celulosa, glucano y pequeñas cantidades de hidroxiprolina).

OBJETIVOS:

1. Que el alumno conozca que es el micelio, hifas cenocíticas, hifas septadas, y los diferentes tejidos
(prosénquima y seudoparénquima) que forman los hongos.
2. Que el alumno observe y dibuje como son los rizoides, estolones, conidióforos, esterigmas, conidios,
esporangióforos, columela, esporangios, esporangiosporas, rizomorfos y levaduras.

MATERIALES:

Cultivos de Rhizopus stolonifer, Aspergillus spp., y/o Penicillum sp. y el cultivo o preparaciones permanentes
de una levadura. Microscopio, mechero, porta y cubreobjetos, aguja de disección, asa bacteriológica, navaja de
afeitar, solución de azul de algodón lactofenol, cristal violeta, alcohol, hidróxido de potasio al 5%

METODO:

A. Para observar los rizoides, estolones, esporangióforos, esporangios y esporangiosporas de Rhizopus

stolonifer puede utilizar el microscopio estereoscópico. Observar estas estructuras adheridas al cristal
de las cajas Petri o en el medio de cultivo. Hacer dibujos de lo que observe al microscopio.

B. Para observar estructuras fúngicas con más detalle (al microscopio compuesto) de Rhizopus stolonifer,
Aspergillus spp. y Penicillum spp. Con el auxilio de una aguja de disección, previamente esterilizada al
mechero y en condiciones asépticas, tomar un fragmento del medio de cultivo con las estructuras del
hongo a estudiar, de aprox. 3 X 3 X 2 mm, colocarlo entre porta y cubreobjetos con una gota de azul de
algodón lactofenol y calentarlo CON CUIDADO como lo indicará el maestro, para permitir que salgan
las burbujas de aire y para aclarar el micelio y estructuras. Dejar enfriar 30 segundos y luego observarlo
al microscopio. Realizar esquemas de lo observado.

C. Para observar las levaduras. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada y en condiciones
asépticas, tomar una muestra de levaduras del cultivo líquido, realizar un frotis en el portaobjetos (si la
levadura procede de un medio de cultivo sólido debe de realizar el frotis agregando al portaobjetos una
gota de solución salina), fijarlas al calor y teñirlas con Cristal Violeta durante un minuto. Enjuague,
seque y observe al microscopio compuesto. Realizar dibujos de lo observado. Observar preparaciones
permanentes, en su caso

D. Para realizar cortes histológicos. Con el auxilio de un microscopio estereoscópico y una navaja de
afeitar, realizar cortes histológicos. Para esto, si los tejidos vegetales están frescos y suaves, corte una
sección de tejido (que incluya las estructuras o cuerpos fructíferos a estudiar) de aproximadamente 10
X 5 mm. Colocar esta sección en un portaobjetos y sosteniéndolo con el ápice del dedo índice
(observando al estereoscopio) con la navaja realice los cortes, lo más finos o delgados posibles,
precisamente donde se encuentra la estructura y/o cuerpo fructífero (observar la demostración del
maestro). Si los tejidos vegetativos fueron prensados y secos, hay que rehidratarlos colocándoles un
poco de alcohol y luego un poco de hidróxido de potasio 5 %. Esperar unos 3 – 4 min. para que los
tejidos se suavicen y luego proceda a realizar los cortes histológicos como ya se indicó con
39
 anterioridad. Colocar los cortes histológicos entre porta y cubreobjetos con una gota de azul de algodón
lactofenol, calentarlos para aclarar los tejidos y eliminar las burbujas de aire. Dejar enfriar unos 30
segundos y observar al microscopio compuesto. Realizar dibujos de lo observado.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué aplicaciones bioquímicas o industriales tienen los hongos Rhizopus stolonifer , Aspergillus sp. y
Penicillium sp?

40
 PRACTICA 12. CONTROL DE MICROORGANISMOS CON AGENTES FISICOS Y QUÍMICOS

PRÁTICA 12 A. CONTROL DE MICROORGANISMOS CON AGENTES FISICOS

FUNDAMENTO

Los agentes físicos son otra forma en la que podemos controlar a los microorganismos. Los agentes físicos
son: la aplicación de temperaturas altas (calor húmedo o seco), la aplicación de temperaturas bajas
(refrigeración o congelación), radiaciones (luz ultravioleta, rayos x, rayos gamma), la presión osmótica
(concentraciones altas de azúcar o sal), la desecación o deshidratación (liofilización), la aplicación de
microondas, ondas sonoras intensas (sonicación) y la filtración.

OBJETIVO:

Que el alumno practique algunos procedimientos físicos para el control de microorganismos.

MATERIAL:

Cultivos, de 24 horas, de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, cajas Petri con agar
nutritivo. Tubos de ensayo con caldo nutritivo con sal (NaCl) a concentraciones de 2, 4, 6, 8 y 10 %. Tubos de
ensayo con caldo nutritivo con sacarosa a concentraciones de 5, 10, 15 y 20 % 25%, mechero, vaso de
precipitados, asa de inoculación, hisopos, lápiz graso o marcador y lámpara de luz ultravioleta.

METODO:

Efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano

1. Con un lápiz graso o marcador, divida en 8 secciones la base de la caja Petri con agar nutritivo y escriba los
números 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 (tiempo en minutos), un número por cada sección.
2. A partir de un cultivo de E. coli tomar, con el asa de inoculación y en condiciones asépticas, una muestra
(asada) y siémbrela por estría en la sección 0 del agar nutritivo.
3. Coloque el tubo del cultivo de E. coli en un vaso de precipitado con agua hirviendo y tomar muestras
(asadas) a los 5, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos, sembrando por estriado en cada uno de las secciones de
la caja de agar nutritivo con el tiempo respectivo.
4. Repetir el procedimiento anterior con Bacillus subtilis utilizando otra caja de Petri.
5. Incubar a 37 °C por 24 a 48 horas.
6. Observar el crecimiento formado y anotar los resultados.

Efecto de la luz Ultravioleta

1. En una hoja de papel de su cuaderno o libreta, recorte diferentes figuras, tales como letras, cuadros,
círculos, estrellas, etc., etc.
2. En condiciones de asepsia, siembre E. coli y extienda uniformemente sobre la superficie del medio de agar
nutritivo en dos cajas Petri. Repita lo mismo con Bacillus subtilis
3. Quitar la tapa de la caja Petri del cultivo de E. coli y coloque la hoja con la figura recortada, sin que toque el
agar, y expoga a luz ultravioleta por 5 minutos. Realizar el mismo procedimiento con la otra caja sembrada
con E. coli, pero exponer durante 10 minutos.
4. Repetir la misma operación con los cultivos de Bacillus subtilis
5. Tapar las cajas e incubar a 37 °C por 24 a 48 horas.
6. Observe los efectos de la luz ultravioleta en el crecimiento bacteriano.

Efecto de la presión osmótica.

1. En condiciones asépticas, tomar una muestra (asada) de E. coli e inocular el tubo de ensayo con caldo
nutritivo con NaCl al 2 %. Repita la misma operación para los tubos de 4, 6, 8, y 10 % de sal. Inocule otro
juego de tubos con caldo nutritivo y diferentes concentraciones de sal, con S. aureus.
41
2. En condiciones asépticas, tomar una muestra (asada) de E. coli e inocular el tubo de ensayo con caldo
nutritivo con sacarosa al 5 %. Repita la misma operación para los tubos con 10 y 25 % de sacarosa. Inocule
otro juego de tubos de ensayo con caldo nutritivo y diferentes concentraciones de sacarosa con S. aureus.
3. Incubar a 37 °C por 24 a 48 horas.
4. Observe y discuta los resultados.

RESULTADOS:

Efecto de la temperatura. Colocar en cada cuadro desarrollo de microorganismos: 0 = no hay desarrollo, X =

poco desarrollo, XX = Moderado desarrollo, XXX = Mucho desarrollo.

T I E M P O EN M I N U T O S
BACTERIA 0 5 10 20 30 40 50 60
E. coli
B. subtilis

Efecto de la luz ultravioleta. Colocar en cada cuadro desarrollo de microorganismos: 0 = no hay desarrollo, X
= poco desarrollo, XX = Moderado desarrollo, XXX = Mucho desarrollo.

TIEMPO DE EXPOSICION EN MINUTOS

BACTERIAS 5 10
E. coli
B. subtilis

Efecto de la presión osmótica (sal). Colocar en cada cuadro el desarrollo (turbidez en el caldo) de
microorganismos: 0 = no hay desarrollo, X = poco desarrollo, XX = Moderado desarrollo, XXX = Mucho
desarrollo.

Efecto de la presión osmótica (sal) en los microorganismos.

Bacterias Concentración (%)
2 4 6 8 10
E. coli
S. aureus

Efecto de la presión osmótica (sacarosa). Colocar en cada cuadro el desarrollo (turbidez en el caldo) de
microorganismos: 0 = no hay desarrollo, X = poco desarrollo, XX = Moderado desarrollo, XXX = Mucho
desarrollo.

Efecto de la presión osmótica (sacarosa) en los microorganismos

Bacteria 5% 10 % 25 %
E. coli
S. aureus

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el efecto de la luz ultravioleta sobre las bacterias y cuáles son sus limitaciones como agente
antimicrobiano?
2. ¿Cuál de los microorganismos resistió más al calor? ¿Por qué?

42
 PRÁCTICA 12 B. CONTROL DE MICROORGANISMOS CON AGENTES QUÍMICOS

FUNDAMENTO

Los agentes químicos con los que puede controlar microorganismos incluyen a los alcoholes (etílico,
metílico), el fenol y compuestos del fenol (hexaclorofeno), los detergentes (aniónicos y catiónicos), los
compuestos ácidos y alcalinos, los compuestos a base de los halógenos (iodo, cloro, bromo), los metales
pesados (compuestos a base de cobre, plata, mercurio), el formaldehido (formol), glutaraldehído, y
quimioestabilizadores gaseosos (como el óxido de etileno). Estos agentes químicos se pueden manipular para
lograr la inhibición en el desarrollo de los microorganismos presentes o para desinfectar objetos variados (por
ejemplo, quirúrgicos o de laboratorio).

OBJETIVO:

Observar el efecto de varios agentes químicos tales como fenol, cloruro de mercurio, violeta de
genciana, alcohol, rayos ultravioletas y pH, en la viabilidad de los microorganismos.

MATERIAL:

Cepa bacteriana de E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis

Caldo nutritivo en tubos ajustados a un pH de 3, 5, 7, 9 y 11
Cajas Petri con agar nutritivo
Discos de papel filtro estériles de 6mm de diámetro
Pinzas estériles
Hisopos estériles
Mechero
Regla con escala milimétrica
Soluciones de alcohol etílico al 70%, bicloruro de mercurio (o nitrato de plata) 1:1000, fenol al 3% y 5%, cristal
violeta a 1:10 000, 1:50 000n y benzal a 1:100 000.

METODO:

Efecto de alcohol etílico al 70%, bicloruro de mercurio (o nitrato de plata) 1:1000, fenol al 3% y 5%, y del
benzal

1. En una caja Petri conteniendo agar nutritivo, inocular y extender uniformemente con un hisopo estéril la
cepa de E. coli
2. Repetir la operación con la cepa S. aureus
3. Impregnar los discos con las soluciones preparadas de alcohol, cloruro de mercurio, fenol y benzal
4. Colocar los discos sobre el medio inoculado tanto en el sembrado con E. coli como con S. aureus
5. Incubar las cajas a 37°C por 24 a 48 horas
6. Observe los resultados midiendo el halo de inhibición del crecimiento que rodea a los discos impregnados
con las diferentes sustancias.

Efecto de los colorantes sobre las Bacterias

1. En una caja Petri conteniendo agar nutritivo, inocular y extender uniformemente con un hisopo estéril la
cepa de E. coli
2. Repetir la operación con la cepa de S. aureus
3. Impregnar los discos con las soluciones preparadas de cristal violeta a las diluciones mencionadas.
4. Colocar los discos sobre el medio inoculado tanto en el sembrado con E. coli como con S. aureus
5. Incubar las cajas a 37°C por 24 a 48 horas
6. Observe los resultados midiendo el halo de inhibición del crecimiento que rodea a los discos impregnados
con las distintas diluciones.

Efecto del pH en el crecimiento de las bacterias.

43
1. Inocular una asada de E. coli en una serie de cinco tubos con caldo nutritivo a los cuales previamente se le
ha ajustado el pH a 3, 5. 7, 9 y 11
2. Repetir la operación con S. aureus
3. Incubar las cajas a 37°C por 24 a 48 horas
4. Observar la turbidez formada y anotar los resultados

Efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano

1. A Partir de un tubo con caldo nutritivo previamente inoculado con E. coli, se toma una asada y
se estría en una caja de agar nutritivo (tiempo 0) previamente dividida en 8 segmentos.
2. Coloque el tubo en un vaso de precipitado con agua hirviendo y tomar asadas a los siguientes
tiempos: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos, estriando en los siguientes segmentos de la caja de
agar nutritivo en el tiempo respectivo
3. Repetir el procedimiento anterior con B. subtilis
4. Incubar a 37°C por 24 a 48 horas
5. Observar el crecimiento formado y anotar los resultados

Efecto de los metales pesados en el crecimiento de las bacterias

1. Inocular y extender uniformemente sobre la superficie del medio de agar nutritivo, una caja con E. coli y
otra con S. aureus
2. Colocar en el centro de la caja un alambre de cobre limpio y estéril, ayudándose con una pinza de disección
estéril.
3. Incubar de 24 a 48 horas a 37°C
4. Observe el halo de inhibición formado alrededor del alambre.

RESULTADOS:

Efecto de desinfectantes y colorantes

BACTERIAS ETANOL 70% FENOL 3% CLORURO DE CRISTAL VIOLETA BENZAL

MERCURIO (1:1000)
1:10000 1:50 000 1:100 000 1:1000
E. coli
S. aureus

Efecto pH

BACTERIA pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
E. coli
S. aureus

Efecto de metales pesados

BACTERIAS INHIBICION (-) POR EL COBRE INHIBICION (+) POR EL COBRE

E. coli
S. aureus

CUESTIONARIO:
1. En la práctica realizada ¿qué efectos tubo el alcohol sobre el crecimiento de los Gram positivos y los Gram
negativos?
2. ¿Qué efecto causo el cristal violeta sobre los Gram positivos y los Gram negativos a las diferentes
concentraciones
3. ¿El pH ácido inhibió más el desarrollo ácido que el alcalino? ¿Por qué?
4. ¿Qué otros metales se usan como antimicrobianos?

44
 PRACTICA 13. AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS (ANTIBIOGRAMA)

FUNDAMENTO

Las técnicas de susceptibilidad a los antimicrobianos son exámenes de laboratorio realizados in vitro
que permiten conocer la sensibilidad o resistencia de las bacterias ante diferentes fármacos, por lo que son
útiles al médico en la selección y manejo de la terapéutica antimicrobiana.
Básicamente existen tres tipos de técnicas: difusión en agar (Kirby-Bauer), dilución en agar o medio
líquido y las automatizadas, siendo la primera la más utilizada; para sus realización se requiere de un medio de
cultivo denominado Müeller-Hinton así como discos de papel filtro (sensidiscos) impregnados con una
concentración de antimicrobiano determinada. Los sensidiscos se colocan sobre la superficie del medio de
cultivo previamente inoculado con la bacteria que se desee probar (la turbidez del inóculo debe ser ajustada con
respecto al tubo número 5 de la escala de MacFarland.

OBJETIVOS:

1. Realizar la técnica de difusión en agar para determinar la susceptibilidad y,o resistencia a los
antimicrobianos
2. Interpretar los resultados del método utilizado

MATERIAL:

1. Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp, Klebsiella oxytoca en medio
líquido.
2. Placas de agar Müeller-Hinton
3. Sensidiscos
4. Tubos (15x15) con solución salina estéril 0.9%
5. Tubos de la escala de MacFarland
6. Hisopos estériles
7. Pipetas Pasteur con bulbo
8. Pinzas de disección sin dientes estéril
9. Mechero
10. Hojas de interpretación

MÉTODO:

1. Ajustar la turbidez del cultivo bacteriano agregando solución salina estéril 0.9% hasta igualar con la del tubo
no. 5 de la escala de MacFarland. Comparar visualmente ambos tubos con buena luz y contra fondo blanco.
2. Sumergir en el tubo de cultivo un hisopo estéril y presionarlo contra la pared interna para eliminar el exceso
de líquido
3. Sembrar en una placa de agar Müeller-Hinton, pasando el hisopo por toda la superficie. Repetir este
procedimiento dos veces más, rotando la placa 60°C en cada ocasión.
4. Tapar la caja Petri y dejarla reposar durante no más de 15 minutos para que se absorba el exceso de
humedad.
5. Con una pinza estéril distribuir los sensidiscos sobre la placa sembrada presionándolos suavemente contra
la superficie del agar.
6. Tapar, invertir la placa e incubar a 37°C durante por lo menos 18 horas (máximo 24 horas)
7. Tomar la medida de los diámetros de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano (sea con regla o
plantilla especial)
8. Interpretar los resultados

45
RESULTADOS:

Nombre del Antimicrobiano Tipo de susceptibilidad

CUESTIONARIO:

1. Mencione y ejemplifique por lo menos tres mecanismos de acción de los antimicrobianos utilizados
2. Explique por qué algunos antimicrobianos que son efectivos contra bacterias grampositivas son ineficaces o
poco útiles contra bacterias gramnegativas. Mencione un ejemplo donde aplique este hecho.

BIBLIOGRAFÍA

1. Barnett, H.L. and Hunter, B.B., 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Fourth Edition. APS Press. St.
Paul, Minnesota, U.S.A. 218 p. Ubicación física: Biblioteca Posta Zootécnica_579.55 B2617i,
2. Díaz, R., Gamazo,C. López-Goñi,I. (1999). Manual Práctico de Microbiología. Masson, Barcelona,
España. Ubicación física: Biblioteca Central / General. 579 M2946
3. Herrera, T. y Ulloa, M. 1990. El reino de los hongos. UNAM. Fondo de cultura económica. México. 552 p.
Ubicación física: Biblioteca Central_589.2 H565r,
4. Koneman,W.E., Allen,S.D., Dowell,V.D., Janda,W.M, Sommers, H.M. (1999). Diagnóstico Microbiológico.
Ed. Panamericana, México. Ubicación física: Biblioteca Norte y Central 616.01 D536,
5. Mac Faddin, Jean F. (2003). Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3ª ed. Buenos Aires, Madrid; Médica Panamericana Ubicación física: Biblioteca central. 616.01
M1432p. ua.000199515
6. Madigan, Michael T., 2015; Brock. Biología de los Microorganismos. Ed Pearson Prentice Hall, Inc.
Ubicación física: Biblioteca Central / General 579 B8641, (CP).

46
47