ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BIOAKTIF STEROID MIKROALGA Chlorella sp.

SEBAGAI ANTIOKSI DAN DAN AKTIVITAS TOKSISITAS.

Jumlah penyakit yang meningkat pesat membuat masyarakat memperhatikan

kesehatannya. Untuk mencegah penyakit tersebut, masyarakat mengkonsumsi obat tradisional
atau suplemen alami. Saat ini, konsumsi obat dari bahan alam lebih disukai daripada obat
sintetik. Masyarakat meyakini konsumsi obat sintetik dalam jangka panjang dapat menimbulkan
efek samping yang tidak diinginkan bagi tubuh manusia. Penggunaan obat herbal menawarkan
solusi untuk mengurangi kekhawatiran masyarakat terhadap efek obat sintetik. Eksplorasi bahan
alam untuk aplikasi farmasi menjadi penting dan esensial. Keanekaragaman hayati Indonesia
menyediakan sumber daya alam yang tidak terbatas terutama dari tumbuhan laut. Berdasarkan
hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa Chlorella sp. berpotensi sebagai sumber biodiesel
dan memiliki beberapa bioaktivitas seperti toksisitas, antibakteri dan antioksidan.
Mikroalga adalah mikroorganisme fotosintetik dengan morfologi sel yang bervariasi, baik
uniseluler maupun multiseluler (membentuk koloni kecil). Salah satu jenis mikroalga tersebut
adalah Chlorella sp.. Chlorella sp. merupakan tumbuhan tingkat rendah dari genus alga hijau
dengan sel tunggal berukuran mikroskopis kecil yang telah banyak ditemukan. Warna hijau dari
Chlorella sp. disebabkan karena sel dominan mengandung klorofil A dan B, karotenoid dan
xantrofil. Keunggulan mikroalga Chlorella sp. diantaranya dapat berkembang biak dengan cepat
dan mudah dalam budidaya. Selain itu Kehidupan mikroalga chlorella sp. tidak tergantung pada
musim, tidak memerlukan tempat yang luas, dan tidak memerlukan waktu yang lama untuk
pemanenan. Beberapa penelitian mengungkapkan adanya senyawa steroid dalam Chlorella sp.

Steroid merupakan metabolit sekunder yang memiliki berbagai aktivitas farmakologis

terhadap kanker. Konishi (1985) menjelaskan bahwa steroid memiliki sitotoksisitas terhadap sel
myeloma (tumor ganas). Skrining awal untuk mengetahui Chlorella sp. Memiliki potensi
sebagai antikanker adalah toksisitas dan aktivitas antioksidan. Untuk mengetahui tingkat
toksisitas ditentukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menggunakan larva
udang Artemia salina L dan aktivitas antioksidan diukur dengan DPPH (1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil). Fasya dkk (2013) untuk melakukan isolasi steroid dari Chlorella sp. Dilakukan
dengan cara maserasi menggunakan metanol, dihidrolisis menggunakan asam klorida dan
dipartisi menggunakan kloroform, difraksinasi menggunakan pelarut organik, kemudian
senyawa steroid dipisahkan menggunakan KLT Preparative. Isolat diidentifikasi menggunakan
spektrofotometer FTIR dan UV-Vis.
 METODE

1. Ekstraksi mikroalga Chlorella sp. dengan maserasi

Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik pada temperatur
ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi bioaktif mikroalga karena akan terjadi
pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel
sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan
ekstraksi senyawa dapat sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan
(Indrayani, 2006).
(Megawati, 2020) ekstraksi chlorella sp. dengan maserasi yaitu, Tiga puluh gram
biomassa kering dimaserasi dengan metanol 150 mL selama 24 jam dan dikocok dengan
kecepatan 120 rpm selama 5 jam pada suhu kamar. Sampel dipisahkan menggunakan Buchner
Funnel dan Residu yang diperoleh dimaserasi kembali hingga 5 kali proses ekstraksi. Semua
filtrat dikumpulkan dan diuapkan dengan rotary vacuum evaporator hingga terbentuk ekstrak
pekat Chlorella sp. ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang kemudian dihitung rendemen ekstrak
yang dihasilkan.
% Rendemen= Berat ekstrak x 100 %
Berat sampel

2. Identifikasi Kandungan Senyawa Steroid dengan Uji Reagen

Fraksi etil asetat Chlorella sp. dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dilarutkan dalam 0,5
mL kloroform lalu ditambah dengan 0,5 mL asam asetat anhidrat. Selanjutnya ditambah dengan
1 - 2 mL H2SO4 pekat melalui dinding tabung tersebut. Jika hasil yang diperoleh terbentuk
warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid.

3. Hidrolisis dan partisi ekstrak metanol mikroalga Chlorella sp.

Sebagian ekstrak pekat dihidrolisis dengan menambahkan 5 mL asam klorida (HCl) 2 N

dan diaduk menggunakan magnetic stirrer hot plate selama 1 jam pada suhu 40 oC lalu
didinginkan (Tensiska, dkk., 2007). Hidrolisat yang diperoleh ditambahkan dengan natrium
bikarbonat sampai PH-nya netral, Kemudian ditambahkan 12,5 mL pelarut kloroform, dikocok
dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan yaitu lapisan organik dan lapisan air. Selanjutnya
masing-masing lapisan dipisahkan. Proses partisi dilakukan sebanyak 5 kali. Lapisan organik
kemudian dipekatkan dengan gas N2 dan ekstrak pekat kemudian ditimbang dan dihitung
rendemennya.

4. Pemisahan Senyawa Steroid dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (PTLC)

Pemisahan Senyawa Steroid dengan Analytical Thin Layer Chromatography (ATLC)

Pemisahan senyawa steroid dengan KLT analitik menggunakan plate silika gel GF254
diaktivasi dalam oven pada suhu 100 °C selama 30 menit untuk menghilangkan air dari plate
kemudian didinginkan selama 15 menit dalam desikator. Selanjutnya masing-masing plate
diberi ukuran 1 x 10 cm Chlorella sp. yang difraksi dengan kloroform dan telah dilarutkan
dengan pelarut diteteskan pada jarak 1 cm dari tepi bawah plate dengan tabung kapiler,
kemudian ditiriskan dan dielusi menggunakan eluen gradien n-heksana: etil asetat (4,75:0.25;
4.5:0.5 ; 4.25:0.25, 4:1; 3.75: 1.25 dan 3.5: 1.5) (Kusmiati, 2010). Pewarnaan hasil pemisahan
kemudian diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.

5. Uji Toksisitas Senyawa Steroid Terhadap Larva Udang Artemia salina Leach
Uji toksisitas dilakukan terhadap isolat senyawa steroid, kemudian dikerok dan
disentrifugasi. Pisahkan filtrat yang diambil, kemudian diuapkan pelarutnya. Isolat yang
dihasilkan ditimbang dan dilarutkan menggunakan pelarut yang sesuai. Dibuat larutan stok
dengan cara pengambilan sampel isolat hasil PTLC sebanyak 2,9 mg dilarutkan dalam 5 mL
pelarut untuk mendapatkan larutan stok. Pelarut digunakan sesuai dengan sifat kelarutan sampel.
Isolat steroid dari larutan stok dibuat dengan tiga konsentrasi. Kemudian dimasukkan ke dalam
setiap gelas baker yang telah disiapkan. Pelarut diuapkan sampai kering, larutan ragi dibuat
dengan melarutkan 3 mg dalam 5 mL air laut. Setetes larutan ragi roti dan 50 mL DMSO
ditambahkan ke dalam gelas baker yang berisi isolat kemudian dikocok hingga larut. 10 Larva
Artemia salina L dimasukkan ke dalam gelas baker (Megawati, 2020).
Kontrol yang digunakan adalah kontrol DMSO dan kontrol air laut. Semua gelas baker
diletakkan di bawah lampu pijar selama 24 jam dan diamati kematian larva udang. Kemudian
hitung jumlah larva udang yang mati.

6. Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH

Pengukuran antioksidan dalam sampel

Etanol 95% dipipet 4,5 mL kemudian ditambahkan larutan DPPH 0,2 mM, 1,5 mL,
ditambahkan ke dalam kuvet hingga penuh. Selanjutnya, Sampel isolat steroid dibuat berbagai
konsentrasi (1, 2, 3, 4 dan 5 ppm). Ekstrak setiap pipet dari 4,5 mL dan 1,5 mL DPPH
ditambahkan 0,2 nM kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama periode stabilitas. Pengukuran
absorbansi menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 515,0 nm. Data absorbansi
diperoleh masing-masing konsentrasi masing-masing ekstrak dihitung nilai persen aktivitas
antioksidan dengan menggunakan persamaan (Borowitzka, 1988).
Aktivitas Antioksidan = AK – AS X 100
AK
Dimana AK adalah absorbansi kontrol dan AS adalah absorbansi sampel. Kontrol yang
digunakan adalah larutan DPPH 0,2 mM sebanyak 1,5 mL dalam 4,5 mL etanol 95%.

7. Identifikasi senyawa steroid Mikroalga Chlorella sp. Dengan Spektrofotometer

UV-VIS.
Masing-masing sampel murni yang diperoleh dari pemisahan dan pemurnian secara
kromatografi kemudian dilarutkan dengan pelarut petroleum eter (PE) dan etil asetat hingga 9
mL. Selanjutnya dimasukkan kedalam kuvet hingga sepertiganya dan dianalisis pada panjang
 rentang gelombang 200 – 800nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis, sehingga akan
diperoleh spektrum dan panjang gelombang maksimum.

8. Identifikasi Senyawa Steroid Mikroalga Chlorella sp. dengan spektrofotometer

FTIR

Isolat hasil KLT preparatif steroid kemudian diidentifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis
merk Varian Carry pada panjang gelombang 200-800 nm serta spektrofotometer Infra Merah
merk varian tipe FT 1000. Pada FTIR isolat diteteskan pada pellet KBr, dikeringkan
kemudian dianalisis dengan spektrofotomrter Infra Merah merk varian tipe FT 1000 pada
rentang gelombang 4000-400 cm-1.

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Ekstraksi mikroalga Chlorella sp. dengan maserasi

Ekstraksi dari senyawa aktif Chlorella sp. mikroalga menggunakan maserasi dengan
senyawa methanol pada Steroid yang merupakan senyawa aktif dalam Chlorella sp. Mikroalga
umumnya berikatan dengan glikosida yang cenderung bersifat polar, sehingga senyawa aktif
yang akan diekstraksi menjadi pelarut yang polaritasnya memiliki sifat yang sama dengan
metanol. Hasil maserasi, kemudian dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator. Dari 8,4 g
biomassa dihasilkan 2,0387 g ekstrak pekat dan rendemennya 24,29%.
Menurut Borowitzka (1988), ekstraksi beberapa senyawa metabolit sekunder dari alga
menggunakan ekstraksi maserasi. Ekstraksi maserasi pada mikroalga Chlorella sp. dilakukan
dengan pelarut metanol perbandingan 1:5. Metanol digunakan karena kebanyakan senyawa
aktif metaboli tsekunder yang terdapat di alam masih terikat dalam bentuk glikosidannya
sehingga digunakan pelarut polar seperti metanol. Penggunaan metanol bertujuan untuk
mengekstrak senyawa aktif yang bersifat polar di dalam mikroalga Chlorella sp. Proses
maserasi dilakukan sampai filtrat dari mikroalga Chlorella sp. yang awalnya berwarna hijau
kehitaman berubah menjadi lebih terang dan sampel berwarna hijau pucat. Hal ini diasumsikan
bahwa senyawa aktif yang terdapat pada sampel mikroalga Chlorella sp. sudah terekstrak
secara maksimal. Filtrat yang dihasilkan di saring dengan kertas saring menggunakan corong
buchner dan dikumpulkan menjadi satu. Filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan rotary
evaporator vacum untuk menguapkan pelarutnya. Ekstrak pekat mikroalga Chlorella sp. dialiri
gas N2 untuk menghilangkan sisa-sisa pelarut yang masih terdapat pada sampel. Menurut
(Sukadana, 2011) ekstrak metanol mikrolga Chlorella sp. berwarna hijau tua dan pekat. Hal ini
diduga karena kandungan klorofil yang terdapat pada mikroalga Chlorella sp. bersifat polar,
sehingga saat maserasi klorofil kontak dengan metanol dan ikut terekstrak.

2. Identifikasi Kandungan Senyawa Steroid dengan Uji Reagen

Uji reagen atau uji fitokimia merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk
mengidentifikasi adanya senyawa steroid yang terkandung dalam mikroalga Chlorella sp..
 Pada penelitian ini, identifikasi menggunakan reagen Liebermann- Burchard (Sukadana,
2011). Terbentuknya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya senyawa steroid (Hayati dan
Nur, 2010). Perubahan warna disebabkan karena terjadi reaksi oksidasi melalui pembentukan
poliena terkonjugasi (ikatan rangkap terkonjugasi) sehingga memiliki panjang gelombang pada
daerah visibel (sinar tampak). Hasi uji fitokimia terhadap fraksi etil asetat dan petroleum eter
mikroalga Chlorella sp. menunjukkan adanya kandungan senyawa steroid yang ditandai
perubahan warna menjadi hijau kebiruan pada larutannya.

3. Hidrolisis dan partisi Chlorella sp. ekstrak metanol mikroalga

Hidrolisis dilakukan untuk memutuskan ikatan glikosida yang dilakukan dengan

penambahan asam untuk diambil senyawa steroidnya. Proses hidrolisis dilakukan dengan
penambahan HCl 2 N sebagai katalis asam, kemudian dinetralkan dengan natrium bikarbonat
(NaHCO3). Netralisasi ini berfungsi untuk menghentikan reaksi hidrolisis yang bersifat
reversibel. Kebanyakan metabolit sekunder berupa glikosida (mengandung komponen gula dan
bukan gula). Komponen gula disebut glikon dan komponen bukan gulanya merupakan metabolit
sekunder yang disebut aglikon. Pemutusan ikatan glikosida dapat dilakukan dengan reaksi
hidrolisis. Hidrolisis ekstrak pekat metanol mikroalga Chlorella sp. dilakukan dengan
menambahkan larutan HCl 2 N pada ekstrak pekat (Handoko, 2006). Penambahan natrium
bikarbonat bertujuan untuk menetralkan suasana larutan yang menjadi asam setalah penambahan
larutan HCl 2 N. Hidrolisat yang diperoleh dilakukan partisi menggunakan pelarut kloroform.
Hasil partisi ekstrak pekat diperoleh warna hitam kehijauan. Rendemen yang diperoleh dari
partisi menggunakan kloroform adalah sebesar 32,80% .

Tabel 1. Hasil hidrolisis dan partisi.

Fraksi Berat dari ekstrak Berat dari Fraksi % Hasil
Kloroform 1.8564 g 0.5610 g 32.80

4. Pemisahan senyawa steroid dengan Kromatografi Lapis Tipis

a. Pemisahan senyawa steroid dengan Analytical Thin Layer Chromatography (A-TLC).

Hasil ilustrasi pola separasi variasi eluen A-TLC bila diamati di bawah lampu UV
diilustrasikan pada Gambar 1 dengan menunjukkan bahwa pola separasi 3,75:1,25 menghasilkan
noda yang paling banyak dibandingkan eluen lainnya. Jadi, eluen 3,75:1,25 digunakan untuk
pemisahan lebih lanjut menggunakan P-TLC.

Gambar 1.Ilustrasi A-TLC Chlorella sp. fraksi kloroform.

b. Pemisahan Senyawa Steroid dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (P-TLC).

Fase gerak untuk KLT Preparatif dimana n-heksana:etil asetat (3.75:1.25) merupakan
eluen terbaik untuk memisahkan steroid pada Chlorella sp. mikroalga. Identifikasi senyawa
yang dipisahkan pada plate KLT menggunakan pewarnaan yang tampak dan nilai Rf. Senyawa
yang memiliki Rf rendah bersifat lebih polar karena tertahan oleh fase diamnya yang
merupakan silika gel yang bersifat polar dari eluen. Sedangkan noda yang memiliki Rf yang
lebih tinggi bersifat kurang polar karena cenderung terikat pada fase geraknya sebagaimana
prinsip like dissolves like. Pereaksi uji yang umum digunakan untuk steroid adalah reaksi
Lieberman – Burchard dengan memberikan warna hijau – biru (Harborne, 1987). Hal tersebut
didukung dengan penelitian Aprelia dan Suyatno (2013) yang menunjukkan bahwa warna
hijau kebiruan menunjukkan adanya senyawa steroid yang diperkuat dengan penentuan
struktur isolat menggunakan UV-Vis, IR dan MS. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 2 dan
Tabel 2. Pada Tabel 2, pewarnaan 1, 4 dan 5 (C1, C4 dan C5) dengan warna hijau, hijau dan
biru diduga senyawa steroid dengan Rf 0,6869, 0,7670 dan 0,9400.
 Gambar 2. Hasil P-TLC Chlorella sp. fraksi kloroform

Tabel 2. Hasil KLT fraksi kloroform Chlorella sp. Mikroalga.

Tabel 3. LC50 nilai masing-masing ekstrak dan isolat mikroalga steroid Chlorella sp.

5. Uji Toksisitas

Senyawa Steroid Terhadap Larva Udang Artemia salina Leach

Uji toksisitas untuk mengekstrak metanol, dan mengisolasi steroid dari fraksi kloroform
dan fraksi etil asetat. LC50 masing-masing ekstrak tercantum pada Tabel 3. Tabel 3
menunjukkan bahwa isolat steroid memiliki nilai LC50 lebih rendah daripada ekstrak metanol.
Data tersebut menjelaskan bahwa senyawa steroid Chlorella sp. lebih beracun daripada ekstrak
metanol. Suatu sampel memiliki aktivitas yang sangat toksik jika ekstraknya dapat membunuh
50% hewan uji pada konsentrasi kurang dari 30 ppm (Meyer et al, 1982) Senyawa steroid
Chlorella sp. mikroalga memiliki potensi farmakologis sebagai antikanker dan anti tumor.

6. Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH

Pengukuran aktivitas antioksidan isolat hasil pemisahan KLT secara preparatif

menggunakan metode DPPH dengan variasi konsentrasi. konsentrasi kontrol DPPH adalah 0,2
mM dan diukur pada panjang gelombang 515 nm. Metode DPPH berdasarkan pengukuran
absorbansi DPPH sisa isolat yang tidak bereaksi dengan hasil pemisahan KLT Preparatif.
Pengurangan jumlah radikal DPPH ditandai dengan perubahan warna dari ungu menjadi
kuning. Perubahan warna tersebut terjadi karena reaksi antara radikal bebas DPPH oleh atom
hidrogen dari senyawa steroid pada isolat KLT Preparatif menjadi 1,1difenil-2-pikrilhidrazin.
Parameter yang digunakan untuk menentukan potensi antioksidan. yaitu persen (%)
aktivitas antioksidan dan nilai EC50. EC50 adalah konsentrasi larutan sampel yang akan
menyebabkan penurunan aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil nilai EC50, semakin
tinggi aktivitas antioksidannya (Siti., et al 2013). Aktivitas antioksidan isolat KLT Hasil
preparatif kemudian dianalisis menggunakan perangkat lunak GraphPad prisma dengan
persamaan regresi non-linier Regresi untuk menganalisis data dosis-respons. Nilai EC50 isolat
dapat dilihat pada Tabel 4 yang menunjukkan bahwa isolat steroid C5 mikroalga Chlorella sp.
memiliki potensi antioksidan yang kuat. Antioksidan sangat kuat jika Nilai EC 50 kurang dari
50, dikatakan kuat jika nilai EC50 antara 50-100, dikatakan sedang jika nilai EC50 antara 100-
150, dan dikatakan lemah jika nilai EC50 antara 151-200.

Tabel 4. EC50 nilai masing-masing ekstrak dan isolat steroid Chlorella sp.

7. Identifikasi Senyawa Steroid Mikroalga Chlorella sp. dengan Spektrofotometer UV-

VIS

Berdasarkan spektrum UV-Vis, terdapat tiga puncak pada panjang gelombang 250.50,
270.50 dan 281 nm. Menurut Susilawati (2010) isolasi dan pemisahan senyawa steroid dalam
daun solanum torfum yang menghasilkan steroid dengan panjang gelombang 271 dan 281
nm.

8. Identifikasi senyawa steroid mikroalga Chlorella sp. dengan spektrofotometer

FTIR

Spektrum FTIR Chlorella sp. isolat steroid fraksi kloroform ditunjukkan pada Gambar 3
dan Gambar 4. Analisis spektrofotometer FTIR pada Gambar 3 menunjukkan serapan pada

bilangan gelombang 2957,6 cm-1, 2926,0 dan 2857,0 cm-1 adanya gugus metil (CH3) dan
 metilen (CH2), C=O karbonil pada 1723.9cm-1. C = C penyerapanluas 1600,9 cm-1. Dugaan
ini diperkuat dengan adanya vibrasi C-H yang mengindikasikan adanya gugus dimetil
geminal yang banyak ditemukan pada kerangka senyawa steroid (Astuti, 2004). Getaran C-H

terdapat pada pita serapan 1459,3 dan 1381,0 cm-1. Puncaknya pada 1271,73 cm-
1menunjukkan adanya vibrasi C-O [25]. Penyerapan pada bilangan gelombang 855,0 cm -

1adalah serapan gugus alkena C-H dengan intensitas lemah. Berdasarkan hasil tersebut maka

isolat diduga merupakan steroid yang memiliki C=C, C=O, C=OH tersier, OH dan gem
dimetil. Menurut Sukadana (2011) dan Saleh (2010) senyawa steroid memiliki gugus fungsi
karakteristik seperti O-H, C-H, C=C dan C=O.

Gambar 3. Spektrum FTIR C4 Chlorella sp. isolat steroid fraksi kloroform.

C C C
5 1 4

Gambar 4. Spektrum FTIR C1 (biru), C4 (hijau) dan C5 (merah) Chlorella sp. isolat steroid.

DAFTAR PUSTAKA

Aprelia, Fitria dan Suyatno. 2013. Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak Etil Asetat
Tumbuhan Paku Christella arida dan Uji Pendahuluan Sebagai Antikanker. journal
of Chemistry Vol. 2 No. 3. Surabaya: UNESA.

Astuti M D, Maulana A and Kuntowati E M 2004 Prosiding Seminar Nasional Kimia.

(Surabaya:Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya).
Borowitzka, M. A. dan Lesley, J. B. 1988. Microalgae Biotechnology. London: Cambridge
University Press.

DS Megawati., AG Fasya., RA Pratiwi., N Maghfiroh. 2020. Potensi farmakologi isolat steroid

kromatografi lapis tipis Chlorella sp. fraksi kloroform. Jurnal IOP.
Fasya, A. G., Umi, K., Suci, A., Siti Khairul, B. dan Romaidi. 2013. Uji Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Metanol Mikroalga Chlorella sp. Hasil Kultivasi dalam Medium Ekstrak Tauge
(MET) pada Fase Pertumbuhan. ALCHEMY. Vol. 2, No. 3: 162-169.

Handoko, D.S.P. 2006. Kinetika Hidrolisis Maltosa pada Variasi Suhu dan Jenis Asam sebagai
Katalis.SIGMA.Vol.9 No.1.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.

Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: Penerbit ITB.

Hayati, E.K. dan Nur Halimah. 2010. Phitochemical Test and Brine Shrimp Lethality Test
Against Artemia salina Leach of Anting-anting (Acalypha indica Linn.) Plant Extract.
ALCHEMY. Vol. 1, No. 2: 53-103.

Konishi, F., Tanaka, K. dan Himeno, K. 1985. Antitumor Effect Induced by a Hot Water Extract
of Chlorella vulgaris (CE): Resistence to Meth-A Tumor Growth Mediated by CE-
Induced Polymorphonuclear Leukocytes. Cancer Immunol Immunother, 19: 73-78.

Kusmiati, Agustini, N. W. S., Tamat, S. R. dan Irawati, M. 2010. Ekstraksi dan Purifikasi
Senyawa Lutein dari Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Galur Lokal Ink. Jurnal Kimia
Indonesia, 5 (1): 30 – 34.

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnarn, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E. and Mc Laughlin, J.L.
1982. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents.
Planta Medica. Vol. 45: 31-34.

Siti K,B., A. Ghanaim, F., Munirul, A., a. Hanapi. 2013. Uji aktivitas antioksidan terhadap
DPPPH dan identifikasi golongan senyawa aktif akstrak kasar mikroalga Chlorella sp.
hasil kultivasi dalam medium ekstrak tauge. ALCHEMY. 2 (3): 150-204.

Sukadana, I. M. 2011. Kandungan Senyawa Steroid-Alkaloid Pada Ekstrak n- Heksana Daun

Beringin (Ficus benjamina L.). Jurnal Kimia. Vol. 8, No. 2: 169-174.

Susilawati, H. 2010. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Steroid dari Daun Rimbang (Solanum
Torvum). Jurnal Repository university of Riau. Tensiska, Marsetio, Silviah, Oktaviah,
N.Y. 2007. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar
Isoflavon Dari Ampas Tahu. Bandung: Universitas Padjadjaran.

Tensiska, Marsetio, Silviah, Oktaviah, N.Y. 2007. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Kasar Isoflavon Dari Ampas Tahu. Bandung: Universitas
Padjadjaran.