vvvy Reboutrusurt 14, PICORNAVIRIDAE Mancarea facuti in casa, chiar dacé-i rece, E mai bund decit la orice cérciuma. A.P. Cehov: Vreme urdtd. Familie de virusuri cuprinzand patogeni importanji pentru plante, animale si om. Sunt virusuri cu genom ARNss, cu polaritate pozitiva, de talie mica (~30 nm) si neanvelopate. Lipsa anvelopei explicd rezistenfa picomavirusurilor la dezinfectante, la pH-ul acid al sucului gastric, la sarurile biliare etc, Trei genuri sunt implicate in patologia umand: Enterovirus cu trei subgenuri: polio, ECHO si Coxsackie; Rhinovirus gi Hepamavirus (vezi virusul hepatitei A). Unal patrulea gen grupeaza patogeni majori pentru medicina veterinara — virusurile febrei aftoase — care determina epidemii la toate speciile importante economic: porci, oi, cai, bovine etc. Enterovirusurile se transmit pe cale fecal-orala si pot coloniza, adesea asimptomatic, tractul digestiv. Epidemiile hidrice cu enterovirusuri sunt fie urmarea consumului apei sau bauturilor contaminate, fie a scaldatului in ape nesupravegheate sanitar. in ultimul caz, afectiunile nu sunt numai digestive ci si dermatologice, oftalmologice, neurologice. Enterovirusurile cuprind peste 70 de serotipuri grupate astfel: Poliovirus: 3 serotipuri (1,2,3); Coxsackievirus: grupul A (24 serotipuri) si grupul B (6 serotipuri); ECHOvirus (enteric citopatogen human orphan) (33 serotipuri) si Enterovirusurile neclasificate (68 - 71). Imparfirea de mai sus corespunde tropismului: polio infecteaz4 numai primatele; Cox infecteazi gi soarecele nou-nascut iar ECHO numai culturile de celule. Alte clasific&ri iau in considerare receptorii virali. De exemplu, polio are ca receptor moleculele ICAM (intercellular adhesion molecule-1) din superfamilia imunoglobulinelor iar unele virusuri ECHO molecule din familia 43Riboutrusurt integrinelor. Poliomielita infantil, afectiune caracterizaté de paralizitflasce prin leziuni de neuron motor periferi, est rezultatulinfecfeisistemice cu cele rei tipuri de polio. Prin selectie din izolatele sdlbatice de polio au fost cobfinute tulpinile atenvate Sabin, Acestea din urm& sunt lipsite de neurotropism si au fost folosite ined din 1960 in producfia vaccinului polio viu atenuat, administrat oral (VPO). Stabilitatea atenuri este relativa datorité numrului mic de substitu care determin pierderea neurotropismulu. In special tulpinite atenuate depolio 3 pot da "revertanti neurotropi" care sunt cauza poliomiclitei paralitice asociate vaceiniril- PPAV -(incidenté 1 la 1 milion doze de vaccin administrat), Romania a fost confruntatéin anit 1960-1985 cu 0 incidenta de 10-15 oFi smai mare a cazurilot de PPAV comparativ eu Europa occidental. Riscul paraliziilor asociate vaccinia fost atribuit numarutui excesiv de tratamente injectabile apiate copiilor in perioada campaniilor de vaccinare. fn concluzie, exista trei tipuri antigenice de poliovirus jar in cadrul fiecarui subtip trei feluri de tulpini: salbatice (neurotrope), atenuate (nonneurotrope) si revertanti ai ultimelor. Diagnosticul inte tipurileantigenicese face prin seroneutalizae, diagnosticul intre tulpini se face prin biologie moleculara (RFPCR) sau prin utilizarea unor anticorpi monoclonal Acoperirea vaccinala excelenta (peste 95% din copii, vaccinati) a condus la eradicarea poliomielitei ia America de Nord si de Sud. Uliimele cazuri de polio eu virus silbatic au fost diagnosticate in Romania in intervalul noiembrie 1990 - aprilie 1992, in judetul Constanta. De atunci, desi existé o alenta supraveghere a paraliziilor flasce acute (PAV) nu au mai fost izolate virusuri salbatice. Aceasta confirma alinierea Roméniei intre jatile "polio-free”. Statutul potio free poate fi menfinut numai cu condijia imunizarii continue a noilor generafii de copii. © tulpina de polio 1 silbatic a fost izolata in 1999 de la un copil in China, la granija cu Nepalul, dup cinci ani de "polio free status", Accasta demonstreaza necesitatea continuarii administrarii vaccinului. Cazul pare a fi fost importat din India, desi tulpina prezinté numai aseminari departate cu tulpinile din Nordul Indiei (97,6% identitate in secven{a). in general, . eral, se 4Ribovirueuré considera inrudite tulpinile care nu prezint& diferenfe mai mari de 1% in secventa. Virusurile Coxsackie, ECHO gi celelalte enterovirusuri neclasificate au fost puse in eviden{a in cursul supravegherii epidemiologice a poliomielitei. Practic, de la subiecti sindtogi, fara simptomatologie manifest, se izolau frecvent enterovirusuri, ulterior clasificate. Totusi, virusurile Coxsackie produc uneori afectiuni care vizeaz SNC, inima, musculatura scheleticd, pielea, ete. (meningite, miocardite, pancreatite etc) Virusurile Cox sunt patogene pentru goarecele nou-nascut (spre deosebire de ECHO gi de polio). Cele din grupul A produc la soarecele inoculat sub 2 zile de la nastere miozite difuze § pareze flasce, cele din grupul B produc miozite focale si pareze spastice, miocardite, pancreatite, etc. . Diagnosticul infecjiilor enterovirale se face prin izolarea virusului in culturi de celule si identificarea prin seroneutralizare (cu pooluri de seruri de referinta, prin tehnica in “tabla de sah”). Afectiuni produse de uncle enterovirusuri Virusul Boala freevent determinata: Virusurile Cox A Herpangina, diarei minore de vara, meningite aseptice Virusurile Cox B Mialgie epidemica sau pleurodinia Bornholm, moarte subitd a nou-nascufilor, meningite aseptice, miocardite, pancreatite, hepatite, etc. Virusurile ECHO Meningite aseptice, guturai, conjunctivite, exanteme Enterovirusurile 68-71 Encefalite, mieloradiculonevrite. Virusurile ECHO produc uneori epidemii extinse de meningite aseptice. Astfel, in vara anului 1999 o epidemie (cu virusul ECHO 33, Cemescu si colab, 2000) de peste 5000 cazuri a afectat judejele din Moldova extinzandu-se ulterior gi in restul farii, Cazurile s-au datorat consumului apei infectate sau scAldatului in ape contaminate si au prevalat la grupa de varsté 5-15 ani, Impactul economic al meningitelor virale (meningite aseptice sau cu lichid cefalorahidian clat) este considerabil fiind estimat la cheltuieli in jur de 5000 $ per caz (costuri directe) si 8 zile de 4sRibouirusurt 18. VIRUSUL RABIC Un tinbaj comun foce desigur 0 aliantl me! usoari Cu toate acestea, nu trebuie si ultatt cat ‘face si cearta mai usoara. G.B. Shaw: Conversafie cu GBS Rabia sau turbarea este o infectie intini Ia mai multe speci de animale domestice —cfine, pisica, bovine - sau salbatice (lupi, vulpi, lilieci-vampiri) de la care omul se poate contamina ocazional. data stabilité infeotia in SNC finalul este totdeauna devesul Rabia este 0 zoonoz8, boala nu disemineazi de la om Ia om decat exceptional. Severitatea muscaturii determin& riscul infectiei si durata ineubatiei (siptimani sau luni). Virusul rabic (lyssavirus) face parte din familia Rhabdoviridae — virusuri ARNss cu polaritate negativa — in forma de glont. Virusul rabic salbatic este numit "de strada” si are o incubatie variabila; pasaje repetate la aceiasi specie stabilizeaza si scurteaza ineubatia, tulpinile fiind etichetate ca “virus rabic fix". Leziunile citopatice sunt exclusiv intracitoplasmatice si au aspeetul unor incluzit granulare numite corpii Babes ‘Negri, Tulpinile de virs fix dau ineluaii mii. Corpii Babes Negri predomina in neuronii din cornul Ammon din hipocamp sin celulele Purkinje din eerebel. Acesteleziuni corespund: situsurilor replicarii virale, Interesant, in celulele glandelor salivare virusul se replica si se elibereaza prin inmugurire la nivelul membranei celulare ceea ce reprezinta o adaptare eficienta pentru propagarea infectiei la onoua gazda. In afara neuronilor si celulelor glandelor salivare antigenul rabic mai poate fi evidentiat in comee, piele, mucoasa bucala - elemente care au valoare diagnostica. Patogenia infectiei este conditionati de diseminarea septinevritic& centripeta a virusului de la nivelul plicutelor neuromusculare periferice cdtre SNC. Din SNC virusul se propaga centrifug pe calea filetelor senzitive (septinevritd) si se secretd in saliva. Rezervorul de infectie este in Europa “silvatic” —la animalele silbatice (vulpi in special). in alte tari rezervorul este reprezentat de sacali, lupi, raccooni sau vampiri. De la acestia din urma ' in urmi rabia se poate propaga si prin aerosoli,Riboutr Dignosticul se referd la animalul suspect sila omul muscat. La caine sau pisica se urmareste comportamentul animalului izolat in cused ~ dac& supravietuieste fard simptome peste 8 zile mu este rabie, Dack animalul a fost sacrificat se urmiresc leziunile din hipocamp sau se fac reactii de imunofluorescent’. Aceaste leziuni, localizate intt-o regiune a SNC dedicata comportamentului, au justficat afiramatia “adaptariicinice” a virusului rabic la gazda paravitata intrucat modificand afectul animalului (care devine agresiv) se favorizeaza transmiterea infecfiei. La om diagnosticul este dificil si se recurge imediat la vaccinare si seroprofilaxie. in biopsiile din jurul pligii sau pe amprente comeene se poate incerca diagnostic prin imunofluorescenta. Vaceinul antirabic actual se prepara in culturi de celule diploide umane gi este un vaccin inactivat administrat in patra, cinci doze succesive. in afara vaccinirii se face toaleta chirurgicala si dezinfectia plagii precum si administrare de imunoglobuline in jurul muscaturii (imunizare pasiva). 19. ARBOVIRUSURT Fiecare graunte al acestui munte plin de intunerie aledtuieste 0 lume. A. Camus: Mitul lui Sisif Arbovirusurile sunt virusuri cu genom ARNss, anvelopate, transmise, in primul rind, dar nu exclusiv, prin muscdtura insectelor hematofage (vectori). Exist peste 400 specii din care numai o parte sunt clasificate in patru familii distincte: toga-, flavi-, bunya- si arena-viridae. Toate arbovirusurile sunt fragile si depind de gazda vector (fanfari, cApuse, purici) care functioneaz adesesea ca amplificator al concentrajiei virale, Arealul lor de rispindire este conditionat de nisa ecologica a vectorului. Ciclul de viata al arbovirusurilor trebuie urmirit in trei tipuri de gazde: - rezervorul de virus (pasari si mamifere, salbatice sau domestice); 7bitin gi finand seama de frecventa recidivelor herpetice in antecedente. Virusul Varicela zoster (VZV) Copii si batranii trebuie atent monitorizati asupra riscului infectiei varicela zoster (VZV). Evaluarea serologica inainte de transplant se impune. Vaccinarea copiilor seronegativi este © masura infeleapta, Profilaxia recdderilor dispune de mai multe alternative: imunoglobuline specifice, antiherpetice, imunorestaurare. 36. ALGORITM DE DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC ‘Nu fi primul in testarea noului Nici ultimul in renuntarea la vechi. Alexander Pope: Eseu despre om Diagnosticul virusologic ~ de la recoltarea corecta a produselor patologice pana la alegerea metodei si interpretarea rezultatelor este tributar cunostiinfelor asupra patogeniei infectiei. De aceea vom prezenta succint o suita de reguli generale pentru fiecare etapa a protocolului, urmand ca diagnosticul propriu zis sa fie tratat pe sindroame. Recoltarea produselor patologice. Succesul diagnosticului virusologic depinde in mod absolut de recoltarea probelor de la locul si la momentul potrivit. Urmatoarele lucruri trebuie atent considerate: 1. Cantitatea de virus este maxima la aparitia simptomatologiei, dar virusul este deseori prezent si inainte de debut, in cursul incubafiei. De aceea in toate cazurile in care se trimit probe pentru diagnostic virusologic, este util ca, in afara prelevarilor de la bolnavi, sa se recolteze si probe de la contacti. Acestia pot fi in incubafie sau la debutul bolii, cand sansa izolarii virale este crescuta. 2. Organul finta nu este totdeauna locul de predilectie al replicarii virale (de exemplu, in multe encefalite acute determinate de enterovirusuri, produsele de electie pentru izolare sunt materiile fecalele, in febrele eruptive - fracfia leucocitara a singelui, etc.) 3. Gravitatea unor afectiuni nu este proporfionala cu sansa de izolare (cantitea de virus nu este proportionala cu virulenta sa) Prezenta anticorpilor scade sansa izolarii, insa argumenteaza indirect implicarea virala in etiologia unor boli. In cazul unor maladii extrem de periculoase, analiza serologica 131Aopecte neater alte spetaizal medicals nt soi ei jdenfierea anticorpilor $1 cuantificarea Jor dinamica) capata 0 important majora in lipsa n| : i ‘ent de bine dotate pentru a asigura securitatea personalului care en lor, Un bun principiu este de chiar in camera de garda gi de a stoca in misura poratoarelor sufic! ° ‘ os area virusuril 1a face 0 priz& de sange la primul incearca izolarea Vil examen clinic al oricarai febril, posibilitijilor aceste esantioane. ‘Alegerea si interpretarea lor trebuie sa disceama coos ce este semnificativ pentru un anumit pacient precizarea etiologiei, monitorizarea tratamentului, stabilirea unor elemente de predictie pentru evolufia bol ‘Transportul gi receptia produselor patologice 1. Transportal se realizeaza cat mai rapid cu putin, in edteva ore de la recoltare. 2. Transportul produselor patologice se face ta rece (termos cu gheata), respectind permanent lantul de fig. Congelarea este contraindicata pentru unele virusuri Decongelarile si cu atit mai mult congelarile si decongelarile repetate, ca si transportul la temperatura camerei sau a mediului ambiant pot compromite infectivitatea virala si sansa de izolare. Pentru transportul pe distante mari, in cursul caruia intarzierile sunt previzibile, trebuie optat pentru o solu sigura de mentinere constanta a temperaturii, in functie de examenul solicitat. Probele de ser uscate (de exemplu rondele de hartie impregnate cu sange) pot fi transportate la temperatura camerei. Probele continand celule infectate in vederea izoleii se transporta la 4° C (pe gheata) fara a fi insa congelate. Probele care se stocheaza mai mult timp trebuie menginute la - 20° C iar cele cu celule se congeleaza sub - 70° C cu agent crioprotector (glicerina sau DMSO). 3. De regula, recoltarea tampoanelor si a biopsiilortisulare se face in medii de transport ec a eae neti, Pe de alta parte, miesoreaa risa contaminarii aes te we sa contina 0 concentrajie de antibiotice care $4 acteriene, precum si o concentrafie proteica corespunzatoare unei : pein bare une! conservari de durata, Cel mai comun mediu de transport folosit - inat unui transport dé . port de durata scurta - este constituit din: solutie Hanks + solufie 2-4% albumina bovina + antibi ; antibiotice. Cantitatea de mediu de transport nu trebuie’sa determine 0 jetermi 132: Arpecte uirusoloyice in alte spectatitart medteale dilvare a probei mai mare de 1/2. Probele trebuie recoltate si transportate in containere sterile evitind contaminarea cu germeni din surse externe. Este preferabil ca recipientele sa fie din plastic, iar daca sunt din sticla sa fie robuste si etanse. Containerele trebuie inchise ermetic asigurandu-se evitarea oricarui incident care ar putea conduce la poluarea mediului. Precautii speciale trebuie luate in cazul specimenelor cu "risc inalt", Aceste precaujii se definesc in raport cu germenii particulari implicati, Pentru evitarea scurgerii accidentale a materialului infectant din container se foloseste un al doilea container extern compartimentat astfel incat flacoanele cu probe sa ramina in pozifie verticala. Acest al doilea container este din metal sau plastic gi trebuie sa poata rezista la autoclavare sau la actiunea dezinfectantilor chimici. Containerele exteme se decontamineaza cu regularitate. FORMULAR DE TRIMITERE PENTRU DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC ‘Adresa spitalului/ policlinicii cabinetului) Numele medicului caruia i se care trimite produsul patologic. va comunica rezultatul .. Numele si prenunele pacientului.......SeX......Varsta......COds... Diagnostic de suspiciune.... Data debutului simptomatologiei Tipul de produs patologic....... Data si ora recoltarii Tipul de tratament sub care se afla dd Alte date epidemiologice relevante pacientul, Analiza solicitatata.... ‘Semnatura si parafa... 4, Marcarea vizibila a containerelor cu produse infectioase face parte din regulile practicii microbiologice corecte. Tuburile trebuie obligatoriu etichetate clar cu numele sau codul pacientului si tipul de produs patologic continut. Se vor alege markeri (creioane) care inscripfioneaza clar si care sunt rezistenti la cele mai variate condifii (umezeala, inghet, Ex pean Eran grea fae fierbere). Expedifia substantelor infecfioase neidentificabile gi neetichetate este interzisa, 5. Recoltarea, transportul si manipularea probelor de la bolnavi se fac numai de catre Personal instruit in tehnicile practicii microbiologice corecte. Orice proba provenita de la bolnav trebuie sa fic insotita de un formular de trimitere. Acesta nu trebuie lipit in jurul containerului, ci plasat separat intr-o anvelopa de plastic. Un diagnostic util, cu alegerea testului optim si interpretarea corecta a rezultatelor nu poate fi realizat in lipsa unui/minim de date clinice si de identificare. De asemenea, este bine sa se 133,Aspecte uirusatogice tu alte specalitatt medicale precizeze exact examenul solicitat sau tipul de trimitere tip este redat in tabel. ILUI VIRUSOLOGIC DIRECTIILE PRINCIPALE ALE DIAGNOSTIC! or_in_sisteme_vil_virus-gazda corespunzatoare i_identificarea Izola reprezinta examenul de baza al diagnosticului virusologic, Sistemele vii pe care se poate realiza cultivarea sunt: animalul de laborator; oul de gaina embrionat culturile de cellule - substratul predilect pentru izolarea virusurilor. Principial, protocolul este similar, independent de sistemul virus - gazda: se inoculeaza irale. Reusita izolarii depinde de multi steril si se urmareste aparifia efectului replicar parametrii, insa un rezultat pozitiv este totdeauna important. Cuantificarea virusurilor se realizeaza prin tehnica plajelor (plaque assay) - test cantitativ - in care numarul plajelor corespunde numarului virionilor infectanti. Aceasta tehnica este mai sensibila decat metoda dilufiilor suecesive care evalueaza particulele infectante in urma prelucrarii statistice a rezultatelor (end point dilution technique). Demonstrarea prezentei virusului sau componentelor virale (antigene si acizi nucleici) direct in probele recoltate de la pacienti. Diagnosticul direct este cel mai rapid si economic, dar si cel mai putin sensibil. Aici includem evidenfierea: * ‘virionului infectant complet - prin tehnici de microscopie electronica si imunoelectronomicroscopie, ca si a unor incluzii celulare patognomonice pentru uncle virusuri (corpii Babes Negri in rabie, corpii Guarnieri in infectia cu poxvirusu Tzank in herpes, celulele Warthin-Finkelday in rujeola) © antigenelor virale cu ajutorul serurilor imune de referinta ce contin anticorpi antivirali specifici marcati (cu fluorocromi- reacfia de imunofluorescenfa; cu enzime- reacfia imunoenzimatica; cu izotopi radioactivi- reacfia radioimunoenzimatica, etc) © — genomului viral, cu sau fara amplificare genomica prealabila, utilizind tehnici de hibridizare cu sonde moleculare specifice marcate. Diagnosticul serologic presupune evidenfiere raspunsului imun al gazdei infectate viral. El 134Aupecte utrusologice tn alte spectatitatt medieale se refera la determinarea prezentei si/sau titrului anticorpilor antivirali specifici in sangele pacientului, fie pentru precizarea etiologiei unei viroze, fie pentru aprecierea statusului imun al pacientului in raport cu diferite virusuri. Se poate realiza : «prin detectia rispunsului imun primar - anticorpi specifici antivirali de tip IgM- care demonstreaza o infectie recenta (acuta), «prin demonstrarea seroconversiei - 0 crestere semnificativa (de peste 4 ori) a titrului anticorpilor specifici antivirali de tip IgG in 2 probe de ser recoltate de la acelasi pacient: la debutul virozei (proba de ser de faza acuta) si dupa 14-21 zile de evolutie (proba de ser din convalescenta). Modalitatea cea mai oportuna de diagnostic se stabileste in raport cu stadiul de boala. [Astfel, in incubatie sau in faza acuta se opteaza pentru izolarea de virus sau examen direct, iar spre finalul afectiunii sau in convalescenfa se prefera analiza serologica. Introducerea tehnologiilor modeme trebuie sa reprezinte o optiune informata, care sa a in calcul atat rapiditatea obtinerii rezultatelor, cat si selectarea metodelor avantajoase economic cu cost scazut si eficienta ridicata. Criteriile esentiale ale unui bun diagnostic virusologic raman: specificitatea, sensibilitatea, reproductibilitatea si minimelizarea riscului de contaminare a operatorilor gi a mediului. Laboratorul de diagnostic virusologic trebuie sa fie construit gi sa functioneze de asa maniera incat bioriscul pentru personal si pentru populafia generala sa fie minim,Codul tunei practic’ de laborator si tehniile microbiologice corecte trebuie aplicate pe tot parcursul Iucrului. 37. VIRUSURILE SI BIOTERORISMUL Better safe than sorry Bioterorismul desemneaza potenfiala utilizare criminala sau amenintarea folosii unor uunor agenti infectiogi ca arme bacteriologice. Centrul pentru Controlul si Prevenirea bolilor Infectioase CDC, Atlanta, din SUA are o pagina speciala de Internet asele A-C, functic de rata de diseminare, rata de dedicata clasificarii acestor agenti in 3 mari categorii: cl morbiditate si mortalitate si masurile necesare pregatirii unui plan de actiune in vederea asigurarii_sanatafii publice. ht vivcww,btede.gov). Intre agentii incadrati in clasa A, care 135